DIAGNOSTIKA ALERGIÍ NA MOLEKULÁRNÍ ÚROVNI

Transkript

1 DIAGNOSTIKA ALERGIÍ NA MOLEKULÁRNÍ ÚROVNI Mgr. Manuela Trojáčková Ph.D. a kolektiv Laboratoř klinické imunologie a alergologie Laboratoře AGEL a.s., Nový Jičín

2 ALERGIE epidemie 21. století Alergická onemocnění (astma, alergická rýma, atopický exém, potravinová alergie) řadíme mezi civilizační choroby, jejichž výskyt v populaci stále narůstá. asi 20 % světové populace trpí alergickým onemocněním výskyt alergických onemocnění má stále rostoucí trend multifaktoriální charakter (genetika + prostředí) důležitou roli hrají změny životního stylu Papuánci

3 Monitoring alergických onemocnění u dětí v ČR Systém monitorování zdravotního stavu obyvatelstva ČR (SZÚ) 18 měst asi 7000 dětí (5, 9, 13, 17 let) za 10 let stoupl v ČR počet dětských alergiků na dvojnásobek V ČR některou z mnoha alergií trpí přibližně 2,5 milionu obyvatel

4 Není alergie jako ALERGIE Jsem alergický na to, jak si neustále stěžuješ na svou alergii

5 Co je to ALERGIE? Alergie je přehnaná, nepřiměřená reakce imunitního systém na látky, se kterými se běžně setkáváme v našem prostředí. Alergická reakce probíhá ve dvou fázích. 1. fáze - SENZIBILIZACE 2. fáze - ALERGICKÁ REAKCE

6 ALERGENY inhalační pyly, prach, plísně, roztoči, látky produkované domácími zvířaty potravinové ořechy, mořské plody a ryby, mléko, vejce, ovoce, zelenina, obiloviny kontaktní kovy, kosmetika, latex, produkty zvířat a rostlin léky hmyzí jed

7 Příznaky a projevy alergie Závisí na vnímavosti jedince (atopie), množství daného alergenu a na cestě jeho vstupu do těla. Projevy - na sliznicích dýchacího a gastrointestinální traktu - na kůži - systémové (anafylaxe)

8 Jak lze alergii diagnostikovat? 1. podrobná anamnéza a klinická vyšetření 2. in vivo testy expoziční testy prick testy 3. in vitro testy laboratorní diagnostika

9 LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA 1. Krevní obraz eosinofily, bazofily 2. celkové IgE 3. alergen specifické IgE (sige) a IgG4 alergen specifické IgE (sige) 4. funkční testy - bazofily aktivační test, CAST ELISA, test uvolnění histaminu 5. ECP, sérová tryptáza

10 Alergen specifické IgE (sige)

11 Stanovení alergen specifického IgE Jednoanalytové metody: umožňují stanovit jeden analyt = alergen (resp. směs alergenů) Multiplexové metody: umožňují stanovit až několik desítek analytů (sige) v jedné reakční nádobce nebo reakční ploše Mikročipy: umožňují stanovit několik stovek analytů (sige) v jedné reakční nádobce nebo reakční ploše současně

12 FEIA - vysokoafinitní fluoroenzymoimunoanalýza Alergen navázán na pevný nosič LEIA - chemiluminiscenční enzymová imunoanalýza Alergen v kapalné fázi ELISA - enzymová imunoanalýza s alergenem na papírovéme nosiči (disku)

13 OPTIGEN multiplexová metoda UNIVERZÁLNÍ panel POTRAVINOVÝ panel ATOPY panel INHALAČNÍpanel

14 MIKROČIPY - ImmunoCAP ISAC (Imunosolid Solid-phase Allergen Chip)

15 ALERGENOVÉ EXTRAKTY směs druhově specifických i zkříženě reagujících komponent získány extrakcí z přírodního biologického materiálu (pyl, srst, potraviny) variabilita zdroje = velmi obtížná standardizace vedle hlavních alergenů přítomnost vedlejších alergenů + dalších nealergenních látek (proteiny, glykoprotieny, sacharidy) problém se stabilitou (enzymy)

16 ALERGENOVÉ KOMPONENTY druhově specifické X zkříženě reagující nativní, purifikované (izolovány z přírodních zdrojů) nebo produkovány rekombinantně přesně definované = snadná standardizace precizní charakteristika na molekulární a imunochemické úrovni možnost přesnější diagnostiky a léčby

17 Alergenové extrakty x alergenové komponenty EXTRAKT = nelze rozlišit mezi primární senzibilizací a imunologickou zkříženou reaktivitou KOMPONENTY = umožňují přesnou identifikaci zdroje, který je skutečně zodpovědný za alergickou reakci Zkříženě reagující komponenty = molekuly s podobnou strukturou (50-70% homologie) přítomné v celé řadě často i velmi odlišných druhů

18 Orálně alergický syndrom - pyl-potravina až 80% pacientů s alergií na pyl břízy má také potravinovou alergii na ovoce, ořechy a zeleninu = orálně alergický syndrom (OAS) Bet v 1 (PR-10) homologní s Mal d1 (jablko), Pru p 1 (broskev) Cor a 1 (lísk.ořech Ara h 8 (arašíd) Dau c 1 (mrkev) Api g 1 (celer) Act d 8 (kiwi)

19 NÁZVOSLOVÍ alergenových komponent alergenová databáze on-line na Alergenové komponenty jsou pojmenovány podle jejich latinského rodového a druhového jména, přidělená čísla rozlišují různé alergeny téhož druhu a odpovídají pořadí, v jakém byly identifikovány. bojínek luční - Phleum pretense (Phl p 1, Phl p 2) bříza bradavičnatá - Betulla verucosa (Bet v 1, Bet v 2) včela medonosná Apis mellifera (Api m 1, Api m 2)

20 KLASIFIKACE alergenových komponent Jednotlivé alergenové komponenty lze seskupovat na základě jejich struktury PROTEINOVÉ RODINY Profiliny PR-10 (Bet v 1 homologní) LTP Zásobní proteiny Polcalciny Sérové albuminy Tropomyoziny podobná struktura a funkce = podobné biochemické vlastnosti IgE protilátky proti proteinům ze stejné rodiny zkříženě reagují

21 Využití rekombinanantích alergenů v diagnostice 1. rozlišení zkřížené reaktivity od skutečné dvojí senzibilizace 2. výběr vhodných pacientů a specifických alergenů pro alergenovou imunoterapii 3. odhad rizika systémové reakce

22 Rozlišení zkřížené reaktivity od skutečné dvojí senzibilizace přesnější identifikace vyvolávajícího zdroje = umožní určit, co je primárním zdrojem alergické reakce a co je pouze důsledkem zkřížené reaktivity Alergie na jed blanokřídlého hmyzu až 60 % pacientů testovaných extrakty - i1 (včela), i3 (vosa) vykazuje pozitivitu na oba jedy skutečná dvojí pozitivita asi u 6-24% pacientů ve většině případů z důvodu zkřížené reaktivity

23 Rozlišení zkřížené reaktivity od skutečné dvojí senzibilizace Včela medonosná (Apis mellifera) Api m 1 fosfolipáza A2 Api m 2 Hlavní alergen specifický pro včelu hyaluronidáza sekvenční shoda mezi Api m2 a Ves v 2 je 52% = příčina zkřížené reaktivity Vosa obecná (Vespula vulgaris) Ves v 1 fosfolipáza A1 Ves v 2 Ves V 5 Hlavní alergen specifický pro vosu hyaluronidáza specifický pro vosu

24 Alergenové extrakty Včela (i1) + Vosa (i3) + Včela (Api m1) - negat Vosa (Ves v1, Ves v5) + alergenové komponenty specifické pro vosu Včela medonosná (Apis mellifera) Vosa obecná (Vespula vulgaris) Api m 1 fosfolipáza A2 Hlavní alergen specifický pro včelu Ves v 1 fosfolipáza A1 Hlavní alergen specifický pro vosu Api m 2 hyaluronidáza Ves v 2 hyaluronidáza Ves V 5 specifický pro vosu

25 POLYSENZIBILIZACE Rozlišení skutečné senzibilizace od zkřížené reaktivity.

26 Alergen-specifická imunoterapie (AIT) jediná léčba, která řeší příčinu alergických onemocnění podávání vysokých dávek alergenů s cílem navodit toleranci vůči alergenům injekční, kapková, tabletová imunoterapie dochází ke vzniku alergen-specifických regulačních T-lymfocytů pro účinnou imunoterapii je klíčové přesně identifikovat druhově specifické komponenty, které jsou zodpovědné za klinické projevy alergie

27 Alergen-specifická imunoterapie (AIT) Bříza bradavičnata (Betula verucosa) Bojínek luční (Phleum pratense) Symptomy alergie na pyl břízy extrakt břízy t3 T3 (+) T3 (-) Molekulární alergeny Bet v 1 (PR-10), Bet v 2 (profiln) Phl p 1 Phl p 2 Phl p 4 Phl p 5b Phl p 7 Phl p 12 skuteční alergie na pyl trav = vhodnost imunoterapie pylem trav zkřížená reakce Bet v 1 (+) Bet v 2 (-) IMUNOTERAPIE Bet v 1 (-) Bet v 2 (+) 90 % pacientů senzibilizovaných na pyl trav má protilátky proti Phl p 1 a/nebo Phl p 5b.

28 Odhad rizika systémové reakce Alergeny odolné vůči teplu a trávení (LTP, zásobní proteiny) s větší pravděpodobností způsobí těžké klinické reakce, zatímco tepelně a vůči trávení labilní molekuly (profiliny, PR-10) způsobí pravděpodobně mírnější, obvykle jen lokální reakce anebo budou zcela tolerovány

29 Alergická reakce na arašídy Podzemnice olejná Arachis hypogea

30 Alergická reakce na arašídy

31 Stanovení sige proti alergenovým komponentám LKIA Nový Jičín singleplex (ImmunoCAP) x multiplex (ISAC) Výsledek vyšetření Třída pozitivity Hladina specifického IgE Jednotky: ku/l Metoda: FEIA (Phadia) Odběr: venózní srážlivá krev, sérum Doba odezvy: do měsíce 0-0,34 0 negativní 0,35-0,69 1 nízká 0,70-3,49 2 střední 3, vysoká 17,50 52,49 4 velmi vysoká 52,5 99,99 5 velmi vysoká velmi vysoká

32 ŽÁDANKA na vyšetření sige proti alergenovým komponentám

33 Děkuji za pozornost