Genetické aspekty dvoudomosti u rostlin

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Genetické aspekty dvoudomosti u rostlin Diplomová práce Vedoucí práce: RNDr. Roman Hobza, Ph.D. Odborný konzultant: RNDr. Jitka Žlůvová, Ph.D. Vypracoval: Veronika Obšívačová Brno

2 Zadání 2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Genetické aspekty dvoudomosti u rostlin vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta. 3

4 Tímto bych ráda poděkovala své odborné konzultantce RNDr. Jitce Žlůvové, Ph.D. za vedení diplomové práce a vedoucímu diplomové práce RNDr. Romanu Hobzovi Ph.D. Dále bych ráda poděkovala RNDr. Martině Talianové a RNDr. Bohuslavu Janouškovi, Ph.D. za cenné připomínky a rady při vypracování této práce. Neméně bych chtěla poděkovat prof. Borisu Vyskotovi DrSc. za poskytnutí možnosti práce v Laboratoři vývojové genetiky rostlin Biofyzikálního ústavu AV ČR. 4

5 ABSTRAKT Okolnosti, které vedou ke vzniku dvoudomosti u rostlin, jsou předmětem mnoha studií. Pomocí fylogenetických analýz bylo možné navrhnout různé mechanizmy vedoucí k vývoji odděleného pohlaví, které se u rostlin vyskytuje poměrně vzácně. K těmto účelům se velice dobře hodí studium rodu Silene. A to především z důvodu výskytu rozmanitých rozmnožovacích systémů, které zahrnují hermafroditizmus, gynodioecii a dvoudomost. Naše fylogenetické analýzy založené na více genetických markerech potvrdily, že se dvoudomost u rodu Silene vyvinula dvakrát nezávisle na sobě a to pravděpodobně z jaderně-cytoplazmatické gynodioecie. Z druhového rozložení vyplývá, že okolnosti vzniku dvoudomosti se u těchto skupin liší. O tom svědčí vznik pohlavních chromozómů, které jsou odlišné a v každé sekci vznikaly odlišným způsobem. Sekce Elisanthe je striktně dvoudomá, zatímco v sekci Otites existují různá přechodná stádia. Rozdíly mezi sekcí Elisanthe a Oties mohou být vysvětleny dvěma způsoby. Buď v sekcích působily rozdílné selekční tlaky vyvolané ekologickými podmínkami, nebo dvoudomost v sekci Elisanthe vznikla dříve, než v sekci Otites. ABSTRACT Accounts which have risen to dioecy in plants are the subject of many studies. Using phylogenetic analysis to be able to design different mechanisms leading to the evolution of separate sexes, which occurs relatively rarely in plants. For these purposes genus Silene is very suitable. The reason is presence of various reproductive systems which include hermafroditism, gynodioecy and dioecy. Our phylogenetic analysis based on multiple genetic markers reveal that dioecy has evolved twice independently in the genus Silene possibly by nucleo-cytoplasmic gynodioecy. The species distribution shows that the conditions of dioecy evolution differ in these groups. This indicated the sex chromosomes development which were created in a different way in each section. Section Elisanthe is strictly dioecy but in section Otites various intermediate stages exist. Differences between the sections Elisanthe and Oties can be explained in two ways. One way is convergence of selective pressures caused by environmental conditions or in section Elisanthe dioecy arose before the section Otites. 5

6 OBSAH 1 ÚVOD Rozmnožování organismů LITERÁRNÍ PŘEHLED Pohlavní rozmnožování Třídění gonochoristů Rozmnožování u rostlin Modely vzniku dvoudomosti Vnější vliv na determinaci pohlaví u krytosemenných rostlin Původ a evoluce pohlavních chromozómů Klasické modely dvoudomých rostlin Rod šťovík (Rumex) Bažanka roční (Mercurialis annua) Tykvovité (Cucurbitaceae) Chmel otáčivý (Humulus lupulus) Konopí seté (Cannabis sativa) Papája obecná (Carica papaya) Rod silenka (silene) Molekulární fylogenetika Konstrukce fylogenetických stromů Data pro konstrukci fylogenetických stromů Matematické modely pro konstrukci fylogenetických stromů Metody konstrukce fylogenetických stromů CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODY Použitý materiál Používané roztoky Používané chemikálie Používané komerční sady Přístrojové vybavení Použitý software Použitý rostlinný materiál Homogenizace rostlinného materiálu pomocí oscilačního mlýnu MM301 (Retsch) Izolace DNA z rostlinného materiálu pomocí DNeasy Plant Mini Kit (QIAgen) Polymerázová řetězová reakce (PCR) Long polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce s postupným snižováním Ta "touchdown" Gelová elektroforéza

7 4.8 Příprava DNA pro sekvenování Extrakce PCR produktů z gelu pomocí kitu QIA Gel Extraction Kit (QIAgen) Klonování PCR produktů Transformace kompetentních buněk Escherichia coli PCR na koloniích Izolace plazmidů pomocí QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAgen) Stanovení koncentrace plazmidové DNA Sekvenace PCR produktů Analýza získaných sekvencí Fylogenetické analýzy VÝSLEDKY Volba genů pro analýzy Analyzované geny Získávání sekvencí pro fylogenetické analýzy Gen CCLS Gen EiF Ribozomální DNA Spermidin syntáza Men Příprava dat k fylogentickým analýzám Vytvoření fylogenetického stromu Fylogenetické analýzy DISKUZE POUŽITÁ LITERATURA PŘÍLOHA

8 1 ÚVOD 1.1 Rozmnožování organismů Rozmnožování je základním smyslem života všech živých organizmů. Umožňuje udržení a rozšíření daného druhu v přírodě. U organizmů existují dva základní způsoby reprodukce. Při nepohlavním (amixis, vegetativním) rozmnožování je rodičem jediný organizmus a ten sám předává potomkům kopie svých genů. Nedochází ke splývání vajíčka a spermie tedy k oplození a meióze. Nepohlavní rozmnožování je zastoupeno několika mechanizmy. Nejběžnější mitotické dělení se vyskytuje u jednobuněčných organizmů, jako jsou archaea, bakterie a protista. Pučení je známé jak na jednobuněčné, tak na mnohobuněčné úrovni. Příkladem mnohobuněčného živočicha rozmnožujícího se pučením je nezmar (Hydra), příbuzný medúzám. Další možností je vegetativní reprodukce, která dává u rostlin vznik jedincům bez produkce semen nebo spór. Příkladem je tvorba malých klíčních rostlin na listech rodu kolopejka (Kalanchoe). Při partenogenezi se nový jedinec vyvíjí z neoplodněného vajíčka. Vyskytuje se u bezobratlých, obratlovců, u rostlin se označuje spíše jako apomixie. Tento způsob rozmnožování je považován za evolučně nejmladší, odvozený od pohlavního rozmnožování. Nový jedinec vzniká bez splynutí samčích a samičích gamet a nevyvíjí se tedy ze zygoty. Apomixie se vyskytuje nejen u některých kapraďorostů s nezávislým gametofytem, ale i u mnoha semenných rostlin (smetánka lékařská Taraxacum officinale, jeřáb Sorbus). Pohlavní (amfimixis, generativní) rozmnožování je podmíněné odděleným pohlavím. Potomstvo vzniká splýváním haploidních gamet za vzniku zygoty, která je diploidní. Pohlavní rozmnožování zvyšuje genetickou variabilitu potomstva díky vytváření jedinečných kombinací genů zděděných od dvou rodičů. Příslušníci pohlavně se rozmnožující populace vděčí za své genetické rozdíly unikátním kombinacím existujících alel, které každý jedinec přijímá od svých rodičů. Během meiózy homologní chromozómy, zděděné po jednom od každého z rodičů, vyměňují některé ze svých genů pomocí crossing-overu a poté se homologní chromozómy a jimi přenášené alely náhodně rozdělují do různých gamet. V procesu crossing-overu vznikají díky 8

9 zlomům rekombinantní chromozómy, které nesou geny od obou rodičů. Dochází tak k výměně části nesesterských chromatid. Gamety jednoho jedince se v genetické povaze výrazně mění a každá zygota, vytvořená příslušným párem, má unikátní uspořádání alel. Populace obsahuje obrovské množství kombinací. Tato alelová proměnlivost má základ v minulých mutacích. Pohlavní míšení alel a jejich náhodné rozdělení určuje individuální genotypy. Je charakteristickým rysem u eukaryotních organismů. V případě, kdy se samčí i samičí gamety nacházejí u jednoho jedince, jedná se o hermafroditismus. V případě oddělených jedinců jde o gonochorismus nebo dvoudomost. 9

10 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Pohlavní rozmnožování Základním rysem pohlavnosti jsou u všech eukaryotických organizmů shodné. Vyvinuly se dva typy pohlaví, tedy pohlavních orgánů a v nich vznikajících gamet. Na volbu pohlaví mají vliv dva mechanizmy. Jako původní mechanizmus determinace pohlaví se označuje vliv faktorů vnějších podmínek. Nejznámější je vliv teploty, která působí na vývoj plodu během embryonální fáze. Tento mechanizmus je možné pozorovat u ryb (Schartl, 2004). Dále je proces determinace pohlaví podmíněn působením genů, které se vyskytují na pohlavních chromozómech nebo autozómech. Chromozómové sady jsou u samců a samic odlišné. Somatické diploidní buňky jednoho pohlaví mohou mít dva morfologicky totožné pohlavní chromozómy, pak jsou označovány za homogametní. Druhé pohlaví má pak somatické buňky s morfologicky odlišnými pohlavními chromozómy, které je označováno jako heterogametní. Heterogametní nebo homogametní může být buď pohlaví samčí nebo samičí. Podle tohoto dělení rozeznáváme tři systémy třídění gonochoristů. Existence pohlavního rozmnožování a evoluce pohlaví představuje hlavní strategii zachování genetické informace. Největší výhodou je udržování výhodných znaků a potlačování nefunkčních genů. Dochází k vytváření nových genotypů. Pohlavní rozmnožování může představovat i určité nevýhody. Při meióze a splynutí samčích a samičích pohlavních buněk je nutná energie, která není při nepohlavním rozmnožování nutná. Hlavní nevýhodou je, že samci neposkytují nové jedince, tak ze dvou jedinců vzniká pouze jeden nový jedinec. Zatímco u hermafroditů z každého jedince může vzniknout nový jedinec Třídění gonochoristů Typ Drosophila (savčí) Vyskytuje se u savců, většiny řádů hmyzu, u některých druhů ryb, obojživelníků a plazů. Samice (homogametní pohlaví) má genotyp AAXX. 10

11 Samec (heterogametní pohlaví) má genotyp AAXY. Pohlavní determinace u savců U savců je pohlaví determinováno systémem XX/XY. Pár pohlavních chromozómů se vyvinul z páru autozómů (Ohno, 1967). Lidský chromozóm Y tvoří asi 5 % pseudoautozomální oblasti PAR (pseudo-autosomal region, Graves et al. 1998), která je lokalizována na obou terminálních koncích pohlavních chromozómů. Během meiózy u samců dochází k rekombinaci mezi pseudoautozomálními oblastmi chromozómu X a Y. Většina identifikovaných pseudoautozomálních genů byla nalezena na krátkém rameni. Velká zbývající část chromozómu Y nerekombinuje ani s chromozómem X ani jinými chromozómy. Tato nerekombinující oblast (NRY non-recombining region) obsahuje velké množství vysoce repetitivních sekvencí, které jsou bohaté na transpozony. Ze 60 megabází nerekombinující oblasti lidského chromozómu Y je 35 megabází euchromatických, které se vyznačují přítomností aktivních genů. Zbytek na dlouhém rameni je tvořen heterochromatinem, který je málo transkribovaný a patří sem i centromera (Erlandson et al. 2000). V euchromatické části NRY bylo identifikováno 21 odlišných genů, které byly rozděleny do tří tříd. První třída obsahuje osm genů, které tvoří homology s chromozómem X. Druhá třída obsahuje také osm genů, které jsou exprimovány pouze ve varlatech. Ve třetí třídě se vyskytuje gen SRY (sex-determining region Y), který je zodpovědný za vývoj varlat (Stevanovic et al. 1993). U samic nedochází z důvodu nepřítomnosti chromozómu Y k expresi genu SRY, tedy nedochází ke vzniku varlat. Jelikož ženy mají geny na chromozómu X ve dvou kopiích, dochází k náhodné inaktivaci jednoho ze dvou chromozómů X a tím ke kompenzaci dávky genů u muže. Geny vázané na X tak mohou být rovnoměrně dávkovány mezi samci a samicemi (Lyon, 1961). V buňkách je s 50% pravděpodobností inaktivován chromozóm parentálního původu a se stejnou pravděpodobností maternálního původu. Stáří lidských pohlavních chromozómů se odhaduje na 240 až 320 milionů let. Za tu dobu došlo ke značné degeneraci a ztrátě většiny genů na chromozómu Y (Lahn a Page, 1999) Pohlavní determinace u druhu Drosophila melanogaster (octomilka obecná) 11

12 Drosophila má sysytém XY/XX, avšak pohlaví je určováno poměrem X/A:X. (XXY fertilní samičky a X0 sterilní samci). Důležitá je exprese genu sex-lethal (Sxl), která je aktivní u samic a inaktivní u samců. Exprese je řízena transkripčními faktory, které jsou kódovány čtyřmi numerátorovými geny (vázané na X) a jediným denominátorovým genem (autozomální). Jedinci s poměrem jedna nebo více jsou pak samice a jedinci s poměrem 1:2 nebo méně jsou samci. Jedinci s hodnotou mezi těmito poměry vykazují charakteristiky jak samce, tak samice (Vyskot, 1999). Typ abraxas (ptačí) Vyskytuje se u ptáků, motýlů, některých ryb, obojživelníků a plazů, ale také rostlinného druhu jahodník (Frgaria). Samice (heterogametní pohlaví) má genotyp AAZW. Samec (homogametní pohlaví) má genotyp AAZZ. Typ habrobracon u diplo-haploidních jedinců (včely), kdy samice mají diploidní počet chromozómů a samci haploidní počet (vznik z neoplozených vajíček). 12

13 2.2 Rozmnožování u rostlin U rostlin se vyskytují různé strategie reprodukce. Většina rostlinných druhů je hermafroditních. Tyto rostliny mají květy oboupohlavné, které jsou vybaveny pestíkem i tyčinkami. Přesto většina z nich upřednostňuje opylení jinými jedinci. Tímto způsobem je možné zabránit inbrední depresi a tak zvýšit genetickou variabilitu v populaci. Nebezpečí inbrední deprese spočívá právě ve snižování genetické variability populace křížením příbuzných jedinců. Z hermafroditních květů původních krytosemenných rostlin se během evoluce vyvinuly květy jednopohlavné. Květ má buď prašník nebo pestík, je tedy samčí nebo samičí. Pokud jsou oba druhy květů na jedné rostlině, pak se označují jako jednodomé (monoecie). Vyskytují-li se květy oddělené na různých jedincích, jedná se pak o druhy dvoudomé (dioecie). Možný je i případ výskytu květů oboupohlavných a jednopohlavných na jedné rostlině. Takové se označují jako mnohomanželné (polygamie). Mnohomanželné druhy mohou být v různých kombinacích a představují následující varianty: trimonoecie na jedné rostlině květy samčí, samičí a oboupohlavné (šťovík tupolistý, Rumex obtusifolius). gynomonoecie na jedné rostlině květy samičí a oboupohlavné, samčí chybí (sedmikráska chudobka, Bellis perennis). andromonoecie na jedné rostlině jsou samčí a oboupohlavné květy, samičí chybí (hadí kořen větší, Bistorta major). gynodioecie rostliny s oboupohlavnými květy a jedinci se samičími květy (chrastavec rolní, Knautia arvensis). andordioecie rostliny s oboupohlavnými květy a jedinci se samčími květy (koniklec jarní, Pulsatilla vernalis). trioecie (trojdomost) jedinci s oboupohlavnými květy, jedinci samčí a samičí. 13

14 Celkem tvoří hermafroditní druhy 72 % rostlinných druhů, 7 % jednodomé a 4 % dvoudomé druhy. Zbývající část je složena z 10 % andromonoecických a gynomoecických druhů (Yampolski a Yampolski, 1922). Podobně jako u živočichů je pohlavní determinace rostlin ovlivněna geneticky a hormonálně. Existuje pouze několik druhů, u kterých se vyvinuly pohlavní chromozómy Modely vzniku dvoudomosti Nejběžnější rozmnožovací strategie u živočichů je gonochorismus. U rostlin se naopak nejčastěji vyskytuje hermafroditismus. Jako původní reproduktivní systém je považováno cizosprášení, které se vyskytuje nejčastěji u jednodomých nebo dvoudomých rostlin. Tento reproduktivní systém nalézáme u kapraďorostů, mechorostů a nahosemenných rostlin, předků dnešních krytosemenných rostlin. Následnou evolucí vznikly rostliny krytosemenné, u kterých převládají spíše oboupohlavné květy. A tak zde převládá spíše samosprášení. Z tohoto druhového rozložení vyplývá, že se dvoudomost vyvinula několikrát nezávisle na sobě (Charlesworth, 2002). Jelikož se dvoudomost u rostlin vyvinula několikrát nezávisle na sobě, je málo pravděpodobné, aby tento pohlavně determinující systém měl stejný základ (Weiblen et al. 2000). Samosprášení s sebou nese řadu nevýhod, jako je inbrední deprese, při které dochází ke zvýšení mutantních alel v homozygotním stvavu. Dochází ke snižování vitality populace. Jednou z možností zabránění inbrední deprese je využití autoinkompatibilty přes polyploidizaci (např. druhy rodu kustovnice, Lycium, Miller a Venable, 2000), která zabrání opylení vlastním nebo příliš příbuzným pylem. Dalším možným mechanizmem je proteandrie, kdy pyl dozrává dříve než blizna nebo protogynie, kdy naopak dozrává dříve blizna než pyl. Dalším mechanizmem je vznik dvoudomosti. Při vývoji odděleného pohlaví se uplatnily dvě dráhy (obr. č. 1). V první, dvoudomost vznikla z hermafroditismu přes gynodioecii, kde se v hermafroditní populaci, na základě vzniku mutace způsobující samčí sterilitu, rozšířily samičí rostliny. K vytvoření dvoudomosti je zapotřebí genetické změny nejméně ve dvou genech, které jsou ve vazbě. Jeden gen způsobuje zastavení vývoje samičího orgánu, pak dojde k tvorbě samičích rostlin a druhý gen podporuje pouze tvorbu samčích orgánů, které produkují samčí rostliny (Charlesworth a Charlesworth, 1978). Recesivními mutacemi, které 14

15 zabránily tvorbě samčích orgánů, došlo k tvorbě gynodioecických rostlin (rostliny samičí a hermafroditní: shrnuto v Delpf a Wolf, 2005). Následně vytvoření modifikačních genů způsobilo potlačení samičí fertility u hermafroditů (Charlesworth a Charlesworth, 1978). Tito rekombinanti obsahovali alelu pro samčí sterilitu a modifikační alely, což vedlo ke vzniku samic s potlačenou fertilitou. Silným evoluční tlakem se docílilo těsné vazby mezi geny pro samčí sterilitu a modifikačními geny. Tímto došlo k vytěsnění těchto rekombinantů. Druhou možností je vývoj dvoudomosti z jednodomosti. Tato dráha je méně prostudovaná, nicméně předpokládá vznik selekce, která má za následek rozdělení oboupohlavných květů na jednopohlavné. Dochází tak k tomu, že někteří jedinci měli více samčích nebo samičích květů. Tato schopnost byla determinována geneticky a pak se tyto rostliny stávaly více samčí nebo samičí, až v populaci došlo ke vzniku samčích nebo samičích rostlin (Westergaard, 1958). Obrázek č. 1: Dvě dráhy vzniku dvoudomosti (Barrett 2002). Další možností vzniku dvoudomosti je přes cytoplazmatickou samčí sterilitu. Rostliny se sterilní cytoplazmou opylené normálním pylem z jiných rostlin mají opět potomstvo 15

16 se sterilním pylem a tím se samčí sterilita rozšíří v celé populaci. Za vznik samčích jedinců je zodpovědný obnovitel fertility rf, který je jaderného původu. Pokud se sterilní cytoplazma rozšíří v celé populaci je za vznik samčích jedinců zodpovědný obnovitel fertility, který je jaderného původu. Následně se může objevit mutace v jaderném genu, která způsobí samičí fertilitu. Pokud bude obnovitel fertility a mutace způsobující samičí fertilitu ve vazbě, vzniknou samičí a samčí rostliny. Další možností je vznik dvoudomosti z autoinkompatibility přes polyploidii následným vznikem gynodioecie a konečně dvoudomosti. Tento způsob vzniku dvoudomosti byl studován u severoamerického druhu Lycium (kustovnice), u kterého se z diploidního druhu vyvinul druh polyploidní. Polyploidie přerušila autoinkompatibilitu, což vedlo k inbrední depresi. Nálsedně došlo ke vzniku gynodiecie a dvoudomosti (Miller a Venable, 2000) Vnější vliv na determinaci pohlaví u krytosemenných rostlin Působení prostředí, jako jsou intenzita světla, délka dne, teplota a minerální výživa, mohou mít vliv na pohlaví jednodomých a dvoudomých druhů. Příklady takto citlivých rostlin jsou kukuřice, okurka, špenát a konopí. Ovšem účinky mohou být u různých druhů opačné (Heslop-Harrison, 1957). Dalším významným faktorem může být vliv rostlinných hormonů. U mnoha druhů s jednopohlavnými květy byly nalezeny rozdíly v hladinách fytohormonů v květech samčích a samičích. Opět není účinek hormonů u různých rostlinných druhů shodný. Například cytokininy podporují u špenátu, konopí setého a bažanky roční tvorbu samičích květů (Durand, 1990), ovšem daný účinek nebyl pozorován u okurky. Aplikace giberelinů u kukuřice přeměňuje samčí květy v samičí (Hansen et al. 1976), avšak u okurky vede k přeměně samičích květů v samčí (Wittwer a Bukovac 1958) Původ a evoluce pohlavních chromozómů Vznik dvoudomosti má často za následek také vznik pohlavních chromozómů. Jedním modelem může být lokalizace genu determinujícího pohlaví na jednom lokusu primitivního chromozómu Y (obr. č. 2). Vzniká tak dominantní alela determinující pohlaví. Dochází ke kumulaci genů, které jsou výhodné pouze pro samčí pohlaví. Následným potlačením rekombinace dále pokračuje evoluce chromozómu Y. Pohlaví 16

17 determinující lokus M+ pak představuje dominantní alelu, která zakládá vývoj samčích pohlavních orgánů (samec M+M, samice M M ). Geny, které podporují vznik samčího pohlaví, se kumulují v blízkosti M+ a tyto geny mutují nebo translokují. Po úplném zastavení rekombinace vznikla samčí specifická oblast. Chromozómy nesoucí alelu M zachovávají rekombinaci a mění jedince v samici. Zatímco alela M+ a vázající geny na samčím specifickém chromozómu vytvoří kompletně oddělené pohlaví (Rice, 1996). Obrázek č. 2: Rozšíření samčí specifické oblasti na chromozómu Y. Jedinci mohou mít pohlavní chromozómy homomorfní, pak nejsou morfologicky odlišitelné (XX), nebo heteromorfní (XY). Pokud se v jednom jedinci nachází více jak dva typy pohlavních chromozómů, nazývá se polymorfní. Příkladem takové rostliny je šťovík kyselý (Rumex acetosa samec XY 1 Y 2, samice XX) a chmel otáčivý (Humulus lupulus var. cordiflorus samec X 1 X 2 Y 1 Y 2, samice X 1 X 1 X 2 X 2 ). Z evolučního hlediska je možné předpokládat, že relativně mladý jednoduchý systém pohlavní determinace spadá do kategorie homomorfních pohlavních chromozómů. Inverze, delece a duplikace, které mohou být součástí degenerativních procesů, které se vyskytují na chromozómu Y, mohou vést k dalšímu evolučnímu kroku, vzniku heteromorfního XY (shrnuto v Vyskot a Hobza, 2004). Vznik odděleného pohlaví je spojené se vznikem pohlavních chromozómů, které ovšem mohou být v různém stádiu vývoje. Tímto vzniká variabilita v pohlavních chromozómech u různých druhů, u kterých se vyskytují. Na obrázku č. 3 jsou 17

18 znázorněny pohlavní chromozómy čtyř rostlinných druhů, které jsou v různých stádiích vývoje. Obrázek č. 3: Schéma čtyř hlavních kroků evoluce pohlavních chromozómů u rostlin od nejprimitivnějšího vlevo po evolučně pokročilý a degenerovaný vpravo. a) Tykvice stříkavá (Ecballium elaterium), u které není pozorována blokace genetické rekombinace a pohlavní determinace je založena na jednom lokusu. b) Papája (Carica papaya) s homomorfními pohlavními chromozómy X a Y s krátkou nerekombinující oblastí na chromozómu Y. c) Knotovka bílá (Silene latifolia) s velkými pohlavními chromozómy. d) Šťovík kyselý (Rumex acetosa) má polymorfní chromozómy s dvěma odlišnými chromozómy Y, které jsou heterochromatické. (Vyskot a Hobza 2004) Klasické modely dvoudomých rostlin Dvoudomé druhy jsou zastoupeny jak u jednoděložných, tak dvouděložných rostlin (Renner a Ricklefs, 1995, Yampolsky a Yampolsky, 1922). V následujících kapitolách jsou uvedeny významné studované dvoudomé druhy Rod šťovík (Rumex) Reproduktivní systém šťovíku je velmi variabilní a zahrnuje hermafroditismus, mnohomanželnost, gynodioecii, jednodomost a dvoudomost (shrnuto v Navajas-Pérez et al. 2005). U dvoudomých druhů šťovíku byly popsány dva různé systémy pohlavních chromozómů a mechanizmy pohlavní determinace. První je založen na systému XX/XY 18

19 s aktivním chromozómem Y (šťovík menší, Rumex acetosella) a druhý má systém XX/XY 1 Y 2, kde pohlavní determinace závisí na poměru X/A (šťovík kyselý, Rumex acetosa, shrnuto v Navajas-Pérez et al. 2005). Dále se zde vyskytuje jeden zvláštní druh Rumex hastatulus, který má dvě chromozomální dráhy. Jedna s chromozómy XX/XY a druhá s XX/XY 1 Y 2. Pohlavní determinaci zde ovlivňuje poměr X/A, ale přesto je pro samčí fertilitu nezbytná přítomnost chromozómu Y (Smith, 1963). Podobnost repetitivních sekvencí u obou chromozómů Y druhu R. acetosa dokazuje, že došlo ke štěpení centromery a tak došlo ke vzniku dvou metacentrických chromozómů, které mají identická ramena (izochromozómy). Tyto izochromozómy podstupují řadu delecí (Rejón et al. 1994). Fylogenetické analýzy dokazují (Navajas-Pérez et al. 2005), že všechny dvoudomé druhy rodu Rumex, se vyvinuly ze společného hermafroditního předka. Z toho vyplývá, že pohlavně determinující systém se zde mění z aktivní úlohy chromozómu Y na mechanismus založený na poměru X/A. K této změně došlo nejméně dvakrát nezávisle na sobě (Navajas-Peréz, 2005) Bažanka roční (Mercurialis annua) U dvoudomého druhu bažanka se vyskytuje složitý a variabilní systém pohlavní determinace. Byly popsány tři lokusy, které ovlivňují pohlaví. Dominantní alela vyskytující se na lokusu A společně s nejméně jedním ze dvou lokusů (B 1 a/nebo B 2 ) způsobí samčí fenotyp. Recesívní alela přítomná na lokusu A bez ohledu na lokusu B 1 a B 2 má za následek vznik samice (Louis, 1989). Je možná teorie, že lokus A je původní pohlavně determinující lokus a lokusy B 1 a B 2 jsou modifikátory, které se vyvinuly později. V pohlavní determinaci u druhu bažanka hrají významnou roli rostlinné hormony, které mají vliv na pohlavní dimorfisimus. Auxiny mají maskulinizační účinky na samičí rostliny a cytokininy naopak feminizační účinky na samčí rostliny (Hamdi et al. 1987). Přizpůsobivost pohlavního fenotypu je v rozporu s výrazným pohlavním dimorfismem, který vzniká jako výsledek specifické genové exprese (Khadka, 2005). Tudíž u druhů, u nichž pohlavní determinace vznikla poměrně nedávno, by měl být pohlavní dimorfismus minimální. Tyto studie tak mohou odhalit mechanizmy ovlivňující pohlavní dimorfismus a jeho evoluci. 19

20 2.3.3 Tykvovité (Cucurbitaceae) Čeleď tykvovité je na rozdíl od ostatních krytosemenných rostlin charakteristická přítomností jednopohlavných květů. Z přibližně 800 druhů této rodiny je 460 jednodomých a 340 dvoudomých. Některé druhy tvoří populace andromonoecické, androdioecické, gynomonoeciciké i gynodioecické (shrnuto v Kocyan et al. 2007). Mezi nejprostudovanější druh čeledi tykovité patří dvoudomý posed dvoudomý (Bryonia dioica), jehož pohlavně determinující systém je tvořen chromozómy X a Y (Correns, 1907). Fylogenetické studie dokazují, že čeleď tykovité má jako původní způsob rozmnožování dvoudomost (Zhang et al. 2006). Během vývoje se zde vystřídala jednodomost, ale také ostatní reprodukční systémy jako androdioecie. Z toho důvodu je obtížné určit jak jsou pohlavní chromozómy v tomto rodě staré (Renner, 2007) Chmel otáčivý (Humulus lupulus) Samec je heterogametní a samice homogametní. Pohlavní determinace je dána poměrem X/A (Shephard et al. 1999). Chmel má nejméně pět typů pohlavních chromozómů, kdy nejběžnější je typ jednoho páru pohlavních chromozómů s devíti páry autozomálními (Winge, 1923). Přídavek auxinu má za následek produkci samčích květů na samičích rostlinách (Patzak et al. 2002) Konopí seté (Cannabis sativa) Konopí seté je další zástupce dvoudomých druhů s heteromorfními pohlavními chromozómy. Genom tvoří devět párů autozómů a jeden pár pohlavních chromozómů, kdy samice má XY a samec XX. Ovšem pohlavní determinace je založena na poměru autozómu a chromozómu X (Mittwoch, 1996). Chromozóm Y má velké množství repetitivních sekvencí a je dvakrát větší než chromozóm X (Sakamoto et al. 2000) Papája obecná (Carica papaya) Papája se stala významným modelovým organizmem díky malému genomu (372Mbp) s počtem chromozómů 2n=18 a mladým pohlavním chromozómům (Liu et al. 2004, Yu et al. 2008). Jedná se o hojně pěstovanou tropickou a subtropickou rostlinu, u které se můžeme setkat s jedinci samčími, samičími a hermafroditními. Pohlaví papáji je 20

21 determinováno jedním genem se třemi typy alel (M 1 samec, M 2 hermafrodit a m samice: Hofmeyr, 1938, Storey, 1938). Vyskytuje se zde pohlavně determinující systém XY, kdy samci jsou heterogametní a samice homogametní Rod silenka (silene) Pro studium vzniku pohlavních chromozómů je vhodný rod Silene, protože jsou oproti savčím podstatně mladší a přesto je mechanizmus evoluce pohlavních chromozómů shodný (Nicolas et al. 2005). Je pak možné sledovat evoluční proces degenerace chromozómu Y. Dvoudomé druhy se nachází v sekci Elisanthe a Otites. Sekce Elisnathe vznikla před miliony lety (Desfeux et al., 1996). Do sekce Elisanthe patří druhy S. heuffelii, S. dioica, S. latifolia, S. diclinis a S. marzii, u kterých se předpokládalo, že u těchto velmi příbuzných druhů jsou morfologicky podobné pohlavní chromozómy (Nicolas et al. 2005). Dvoudomost a pohlavní chromozómy se tak pravděpodobně vyvinuly uvnitř této skupiny (Desfaux et al.1996). Tento rod je modelový pro studium pohlavních chromozómů především z důvodu jejich poměrně nedávnému vzniku (Filatov et al. 2000, Desfaux et al. 1996). Chromozóm Y nepodléhá rozsáhlé degeneraci, jak je tomu u savců. Rod Silene je využíván jako model evoluce pohlavních chromozómů a reprodukce, protože zahrnuje různé způsoby rozmnožování, od hermafroditismu, přes gynodioecii, až po dvoudomost (Ainswotrh, 2000). Pohlavní chromozómy se vyvinuly z páru autozómů, které prodělaly mutace zodpovědné za vznik pohlavního monomorfismu a došlo ke vzniku prvotních pohlavně determinujících genů (shrnuto v Charlesworth, 1991) Silenka širolistá (Silene latifolia) Tento modelový druh pro studium pohlavních chromozómů má 2n = 24 chromozómů, které se vyvinuly z páru autozómů. Samičí rostlina má 11 párů autozómů a dva velké submetacentrické chromozómy X a samčí rostlina má jeden X a jeden metacentrický chromozóm Y, který je v poměru o 40 % větší než X (Ciupercescu et al 1990). Na q rameni chromozómu Y je krátká pseudoautozomální oblast (Lengerová et al. 2003), která během metafáze I samčí gametofytické meiózy nerekombinuje s chromozómem X 21

22 (Westergaard, 1948). Nerekombinující oblasti chromozómu Y, které tvoří většinu délky a podléhají degenerativním procesům, ztrácejí důležité geny a akumulují repetitivní DNA (Lengerová et al. 2003). Částečné mutace na chromozómu Y u S. latifolia ukázaly, že se v nerekombinující oblasti vyskytují tři oblasti kontrolující různé pohlavní funkce (obr. č. 4). Jedna oblast potlačuje vývoj samičích pohlavních orgánů (deleční kmen poskytuje hermafroditní květy; Westergaard, 1946, Lardon et al. 1999). Delece v dalších dvou oblastech pozastavuje vývoj prašníku nebo způsobuje pozdější samčí sterilitu (deleční kmen má asexuální květy, u nichž se základ samčích pohlavních orgánů podobá samičím; Donninson et al. 1996, Farbos et al. 1999). Oblast zajišťující samčí fertilitu se vyskytuje na q rameni (Žlůvová et al. 2007). Obrázek č. 4: Pohlavní chromozómy Silene latifolia a model pohlavní determinace podle Negrutiu at al a Charlesworth Přestože systém pohlavní determinace je u tohoto druhu založen na aktivní úloze chromozómu Y, je náchylný ke změnám, které jsou způsobené dominantní autozomální mutací. Tyto mutace způsobují přeměnu samců v androhermafrodity (jedinci samčí a hermafroditní, Lardon et al. 1999). Zvlášť hojný výskyt androhermafroditů (Taylor 1994) je v oblasti severní Ameriky, odkud tento druh pochází (Wolfe, 2002). 22

23 Silene diclinis Pohlavní chromozómy S. diclinis prodělaly značné změny, jejichž výsledkem je poměrně složitý systém neo-pohlavních chromozómů. Na základě molekulárních analýz byla mezi původním chromozómem Y a atozómem zjištěna oboustranná translokace, která měla za výsledek vznik Y 1 a Y 2 samčích specifických chromozómů. Y 1 se páruje s chromozómem X a s autozómem (neo-x). Y 2 se páruje pouze s neo-x a tvoří řetězec X-Y 1 -neox-y 2. Přestože u S. diclinis vznikly neo-pohlavní chromozómy poměrně nedávno, jejich výskyt je prokázán u všech zmapovaných jedinců tohoto druhu. Teorií evoluce neo-pohlavních chromozómů u tohoto druhu může být reprodukční izolace (Howell et al. 2009). Alternativní možností vzniku oboustranné translokace je selekce, která zajistí ochranu proti inbrední depresi. Tvorba dvou balancovaných chromozomálních sad by mohla zajistit ochranu heterozygotnosti (Darlington, 1958) Sekce Otities Do sekce Otites náleží skupina morfologicky podobných dvoudomých druhů (Wrigley, 1986), které jsou od Silene latifolia evolučné odlišné (Desfeux et al. 1996, Mráčková et al. 2008). Podle Corrense (1928) a Sansome (1938) je pohlavně determinující systém u nejprostudovanějšího druhu této sekce S. otites založen na ZW/ZZ. Ovšem další práce Warmkeho (1942) poukazuje na XX/XY pohlavně determinující systém. Genetické mapování provedené u příbuzného druhu S. colpophylla odhalilo, že pohlavní chromozómy se na rozdíl od dvoudomých druhů sekce Elisanthe vyvinuly z odlišného páru autozómů (Mráčková, 2008). 2.4 Molekulární fylogenetika Prvním osekvenovaným živým organizmem byla v roce 1995 gramnegativní bakterie Haemophilus influenzae, která způsobuje onemocnění horních cest dýchacích. Tímto byla odstartována významná etapa molekulární biologie. Brzy nato byly osekvenovány eukaryotické organizmy, např. Saccharomyces cerevisiae a Methanococcus jannaschii, které se řadí do skupiny Archaea. Sekvence biologických makromolekul pak poskytují bohatý zdroj informací o příbuzenských vztazích mezi organizmy a jejich geny. S takto rychle narůstajícím 23

24 množstvím biologických dat bylo nutné vyvinout techniky, které umožní tyto informace zpracovat. Metody molekulární fylogenetiky jsou využívané nástroje v mnoha výzkumných oblastech, jako jsou evoluční biologie, systematika, epidemiologie genomika a další (Talianová, 2007). Studium evolučních procesů pomocí fylogenetiky umožní nejen určit vztahy mezi druhy, ale také poskytuje předpověď strukturálních, fyziologických a biochemických vlastností biomolekul (Chambers et al. 2000). Biologické sekvence jsou zdrojem genetické variace, které jsou způsobeny změnami (genové, chromozómové a genomové) ve struktuře DNA sekvence nebo horizontálním přenosem genetické informace (shrnuto v Arber, 2000), kde jeden organizmus přejímá genetický materiál jiného jedince, ačkoliv není jeho potomkem Konstrukce fylogenetických stromů Výsledkem většiny technik, které využívají fylogenetické analýzy, jsou fylogenetické stromy, které představují historii vývoje sledovaných druhů nebo genů. Sestavovaní molekulárně fylogenetických vztahů je proces skládající se ze čtyř kroků: 1. vytvoření alignmentu z homologických sekvencí, 2. výběr metody k sestavení stromu s ohledem na analyzovaná data, 3. je-li nutné, výběr vhodného matematického modelu popisujícího evoluční procesy, 4. vyhodnocení a interpretace získaného výsledku (Steel, 2005) Data pro konstrukci fylogenetických stromů Data pro molekulární fylogenetiku, převážně sekvence DNA, RNA a aminkyseliny, jsou získány buď v laboratoři z daného materiálu nebo mohou být vyhledány v databázích. Z těchto sekvencí se vytvoří alignment, který je pro sestavení fylogenetického vztahu nezbytný (Harrison a Langdale, 2006). Pro účely molekulární systematiky organizmů je žádoucí, aby studované sekvence byly ortologní, což je specifická homologie mezi geny. Jako homologní jsou označovány geny odvozené z jednoho společného (ancestrálního) genu. Již v roce 1970 bylo navrženo dělení homologiích genů na dva typy: geny paralogní a geny ortologní. 24

25 Paralogní geny jsou výsledkem duplikace ancestrálního genu. Ortologní geny existují v genomech v jediné kopii, která u všech zkoumaných organizmů vykonává tutéž funkci. Obrázek č. 5: Geny paralogní a ortologní Fylogenetický strom je matematická struktura, která je používána jako model skutečné evoluční historie skupiny sekvencí nebo organizmů. Strom se skládá z uzlů, které spojují jednotlivé větve. Terminální uzly, zvané také jako operační terminální jednotky (OTUs Operational Taxonomic Units), představují sekvence nebo organizmy, buď existující nebo vyhynulé, ze kterých jsou data získána. Uzly spojující jednotlivé větve předpokládají hypotetické předky a hypotetický předek všech sekvencí tvoří kořen stromu, určující správný směr evoluce. Délka větví může vyjadřovat různé informace, nejčastěji se jedná o evoluční vzdálenost (Cvrčková, 2006) Matematické modely pro konstrukci fylogenetických stromů Některé metody pro sestavování fylogenetických stromů vyžadují matematický model. Parametry matematického modelu popisují do různé míry skutečnost evolučních procesů. Na základě matematických modelů se buď vypočítají vzdálenosti mezi sekvencemi (množství změn, stejných nebo odlišných substitucí) nebo pravděpodobnost změn mezi nukleotidy nebo aminokyselinami. Nejjednodušší Jukes- Cantorův model (Jukes a Cantor, 1969) předpokládá shodnou frekvenci substituce mezi všemi nukleotidy. Reálnější modely jsou HKY model (Hasegawa et al. 1985), General Time Reversible model (GTR) (Rodríguez et al. 1990), Gamma-distributed model (Wakeley, 1994, Yang, 1994). Další modely jsou na úrovni aminokyselin (JTT model; 25

26 Jones et al. 1992, VT model; Muller a Vingron, 2000, WAG model; Whelan a Goldman 2001) Metody konstrukce fylogenetických stromů Metody pro sestrojování fylogenetických stromů se dělí do dvou skupin. První skupina používá alignment sekvencí jen na výpočet evolučních vzdáleností. Patří sem metoda nejmenších čtverců (Cavalli-Sforza a Edwards, 1967, Fitch a Margoliash, 1967), která se dnes již nepoužívá. V dnešní době je nejrozšířenější technikou metoda nejbližšího souseda (Neighbour-joining - NJ, Saitou a Nei, 1987). Druhá skupina metod, která je založená na znacích, pracuje přímo s alignmentem. Do této skupiny patří metody Maximum parsimony (Edwards a Cavalli-Sforza, 1963, Fitch, 1977), maximální věrohodnost (Cavalli-Sforza a Edwards 1967, Felsenstein 1981) a Bayesovské metody (Rannala a Yang, 1996) Neighbor-joining (NJ, Saitou a Nei, 1987, Oota a Saitou, 1999) Algoritmus vychází z konstrukce hvězdicovitého, nerozlišeného stromu, v němž z jediného centrálního uzlu vycházejí větve ke všem koncovým operačním taxanomickým jednotkám. Algoritmus postupně spojuje dvojice uzlů tak, aby co možná nejvíce minimalizoval součet délek větví. Spojená dvojice je v každém kroku nahrazena hypotetickým předkem, což sníží počet větví o jednu a tento postup se opakuje, dokud z jednoho uzlu nevychází pouze jedna větev (Cvrčková, 2006) Maximální parsimonie (Edwards a Cavalli-Sforza, 1963, Fitch, 1977, MP) Metoda hledá dendrogram (jedná se o druh diagramu, používaný ke znázornění jednotlivých kroků) odpovídající minimálnímu úhrnnému počtu mutací nezbytných k dosažení pozorovaného stavu. Výsledný strom vzniká jako konsensus stromů pro jednotlivé pozice, nejlepších stromů může být i více. V úvahu jsou brány pouze fylogeneticky informativní pozice, to jest pozice, které umožňují konstrukci jednoznačných stromů. Program tedy využívá jen zlomku dostupných dat. Této metody se používá málo, protože je dost náchylná ke vzniku artefaktů, jestliže od evolučního oddělení zkoumaných sekvencí uplynula dlouhá doba, a tudíž se nahromadilo mnoho mutací. Citlivá je na rozdílnou rychlost evoluce v jednotlivých liniích. 26

27 Maximální věrohodnost (ML, Cavalli-Sforza a Edwards, 1967, Felsenstein, 1981) Hledání nejvěrohodnějších stromů patří z hlediska spolehlivosti mezi nejlepší metody. Metoda prohledává všechny možné dendrogramy a pro evoluční scénář odpovídající každému z těchto stromů stanovuje pravděpodobnost, s jakou mohl generovat daný znak, odpovídající vloženým datům. Bere potom na rozdíl od metody maximální parsimonie v úvahu všechny pozice. Podstatnou nevýhodou je velká výpočetní náročnost (Cvrčková, 2006) Bayesovské metody (Rannala a Yang 1996) Jedná se o velmi používanou metodu, která se hojně využívá v systematické a evoluční biologii. Je velmi podobná metodě maximální věrohodnosti. Je velice efektivní pro velké množství dat protože využívá alignmentu MCMC (Monte Carlo Markov Chain). Při zpracovávaní stromů by se mělo používat více jak jedné metody. Správnost vyhodnocení fylogenetických stromů se provádí různými testy. Nejčastějším je tzv. bootstrap test (Felsenstein, 1985), který udává frekvenci, s jakou byla daná topologie nalezena při příslušném počtu opakování. Tzn. do jaké míry je seskupení sekvencí pravděpodobné. Další možností, která je použita u Bayesovských metod využívá posteriorní pravděpodobnosti (shrnuto v Huelsenbeck et al. 2001). Oba způsoby (bootstrap i ohodnocení poteriorní pravděpodobností) jsou výsledkem velice odlišných algoritmů, proto nemusí vždy znamenat stejnou statistickou významnost. 27

28 3 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo klonování a sekvenování analyzovaných genů u vybraných druhů rodu Silene za účelem sestrojení fylogenetického stromu. Ověření příbuznosti dvoudomých druhů. Zjištění postavení dvoudomosti mezi ostatními hermafroditními, gynodioecickými, gynomono-gynodioecickými a trioecickými druhy. Zjištění příbuznosti dvoudomých druhů rodu Silene s ostatními analyzovanými druhy. 28

29 4 MATERIÁL A METODY 4.1 Použitý materiál Používané roztoky TAE pufr: ph 7,5 7,8 Tris acetát...0,4 M (0,84 Tris báze, 0,114% kys. octová) EDTA...0,001 M TE pufr: ph 8 Tris-HCl mm EDTA... 1mM LB médium (Luira-Bertani) k 950 ml deionozované vody přidat: trypton...10 g kvasnicový extrakt...5 g NaCl...10 g Pevné LB médium (Luira-Bertani) typton...10 g kvasnicový extrakt...5 g NaCl...10 g Agar...20 g 29

30 4.1.2 Používané chemikálie RNáza A, izopropanol (Sigma-Aldrich) Taq polymeráza + pufr (TopBio) LA DNA Polymerases Mix (výrobce) směs dntp (Promega) Extrakční pufr RNA Blue (Top Bio) Restrikční endonulkeáza EcoRI a pufr (New Englad Biolabs) Standardy pro gelovou elektroforézu Gene Ruler TM 100bp DNA Ladder a Gene Ruler TM 1kb DNA ladder (MBI Fermentas) Loading Dye (MBI Fermentas) Agaróza (Serva) Ethidium bromid (Sigma-Aldrich) ampicilin (Serva) Používané komerční sady izolace DNA Dneasy Plant Mini Kit (QIAgen) extrakce PCR produktů z gelu QIA Gel Extraction Kit (QIAgen) ligace pgem-t Easy Vector (Promega) ligace pdnr-cmv linearized Vector Information (Clontech) izolace plazmidů QIA Prep Spin Miniprep Kit (QIAgen) Přístrojové vybavení homogenizace rostlinného materiálu oscilační mlýn MM301 (Retsch) 30

31 termocykler PTC 200 (NJ Research) termocykler T3 (Biometra) inkubační třepačka C24 Incubator Shaker (New Brunswick Scientific) centrifuga Spectrafuge 24D (Labnet International) termoblok Dry Bath Incubator MD02 (Major Science) váhy Ohaus No.S200 (Ohaus Corporation) vortex Vortex-Genie 2 (Scientific Instruments) mikropipety Pipetman P (Gilson) geldokumentační systém (kamera, transiluminátor) In Genius (SynGene) Použitý software GeneTools, GeneSnap (SynGene) BLAST ( Altschul et al. 1997, Basic Local Alignment Search Tool) BioEdit ( GBlocks (Talavera a Catresavna, 2007) T-COFFEE (Notredame et al. 2004) Tree Puzzle (Schmidt et al. 2007) Phyml (Guindon and Gascuel, 2003) MrBayes - (Rannala a Yang 1996) MrAic (Burnham a Anderson, 2002) 31

32 4.1.6 Použitý rostlinný materiál K analýzám byla použita genomická DNA, která byla získána z durhů rodu Silene, u kterých se vyskytují různé způsoby rozmnožování od hermafroditismu, gynodioecie, gynomonogynodioecie, trioecie až po dvoudomost (tab. č. 1). Jako dvoudomé druhy byly vybrány druhy, které náleží do sekce Elisanthe a Otites. Jako vnější člen, který určuje směr evoluce, byl použit druh mydlice bazalkovitá (Saponaria occymoides), Petrocoptis glaucifolia a kohoutek chalcedonský Lychnis chalcedonica, (čeleď Caryophyllaceae, hvozdíkovité). Rozmnožování Druh - latinsky Druh - česky Dvoudomé Silene diclinis nemá český ekvivalent Silene latifolia silenka širolistá Silene dioica knotovka červená Silene heuffelii nemá český ekvivalent Silene otites silenka ušnice Silene colpophylla silenka záhybolistá Silene marizzii nemá český ekvivalent Silene acaulis silenka bezlodyžná Hermafroditní Silene viscosa silenka lepkavá Silene zawadskii nemá český ekvivalent Silene noctiflora silenka noční Silene conica silenka kuželovitá Gynodioecie Silene saxifraga nemá český ekvivalent Silene nutans silenka nící Silene vulgaris silenka obecná Gynomonodioecie Silene pendula nemá český ekvivalent Trioecie Silene dichotoma nemá český ekvivalent Tabulka č. 1: Druhy rodu Silene použité k analýzám. 32

33 4.2 Homogenizace rostlinného materiálu pomocí oscilačního mlýnu MM301 (Retsch) Držáky mikrozkumavek příslušející k oscilačnímu mlýnu se předmrazí asi na 20 C. Do 2ml plastových mikrozkumavek se dá společně s mlecími kuličkami 100 mg čerstvého rostlinného materiálu a zamrazí se v tekutém dusíku. Homogenizace se spustí na 1 minutu při 30 Hz, po uplynutí času se držáky obrátí a znovu se spustí cyklus na 1 minutu při 30 Hz. 4.3 Izolace DNA z rostlinného materiálu pomocí DNeasy Plant Mini Kit (QIAgen) Metoda je založená na technologii silikagelových membrán a jednoduché centrifugační techniky. Pro rozrušení buněčných stěn a membrán se do zhomogenizovaného materiálu přidá 400 μl pufru AP1 a 4 μl RNázy A (100 mg/ml) a řádně protřepe. Lyze buněk se provede inkubací směsi při 65 C 10 minut. K vysrážení detergentů, proteinů a polysacharidů se přidá 130 μl pufru AP2 a inkubuje 5 minut na ledu. Centrifugace. Vzniklý supernatant se odpipetuje a přemístí na kolonku, centrifugace. K vysrážení DNA se do frakce z předešlého kroku přidá 1,5 objemu pufru AP3/E a opatrně promíchá, aby nedošlo k poškození DNA. Na novou kolonku se přemístí 650 μl směsi. Centrifugace. Opakuje se se zbytkem směsi. Pro eluci DNA z kolonky se přidá 500 μl pufru AW. Centrifugace. Přidá se 500 μl pufru AW. Centrifugace. V posledním kroku se napipetuje 100 μl pufru AE přímo na membránu kolonky. Inkubuje se 5 minut při pokojové teplotě. Centrifugace. 4.4 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Reakce se prováděly na termocyklerech PTC 200 (MJ Research) a T3 (Biometra). Úseky, které se mají namnožit, musí být ohraničeny na začatku a na konci tzv. primery (krátkými oligonukleotidy DNA).Složení reakční směsi je v tabulce č

34 Složení reakční směsi 10x reakční pufr dntp (datp, dctp, dgtp, dttp) levý primer (forward) pravý primer (reverse) Taq polymeráza DNA templát Deionizovaná voda Výsledné koncentrace 1krát 200 µm 200 nm 200 nm 0,4 U 5-100ng genomické DNA doplnit na výsledný objem 20 μl Tabulka č. 2: Složení reakční směsi Reakční směs rozpipetovaná v mikrozkumavce se přenese na termocykler a zvolí se reakční profil, jehož obecný charakter je v tabulce č. 3. počáteční denaturace denaturace nasedání primerů elongace finální extenze 94 C/3 minuty 94 C/30 vteřin T a C/1 minuta 72 C/ t e minu Tabulka č. 3: Obecný reakční profil Krok 2. až 4. se opakuje 35krát. Parametry T a a t e jsou závislé na použitém primeru a jsou uvedeny v tabulce č.4. Součástí PCR je i negativní kontrola, která obsahuje pouze master mix bez DNA templátu. 34

35 Gen Plazmid CCLS1 Sperm. syntáza Specifický primer SP6-R T7-F CCLS1R1 CCLS1F1 Sapon F1SS SSR17 Sekvence (5-3 ) ATTTAGGTGACACTATAG TAATACGACTCACTATAGGG TGGCCTCGATAAACCAATGGCA GCATATTGCTGAATGCTGATCTCC AGCTCGTCATTCATCAGTGGAGC AGCCCTTGAAAATCTCGCGGCAG SaponklonF1 AAGTTATCAGTCGACAGCTCGTCATTCATCAGTGG AGC R1spermklon ATGGTCTAGAAAGCTTCCCTAGTGTCGACT EIF EIF-F AAGGTTATGCGAGCTCTTGG EIF-R TTCTTCCTTGTCCACGTTC Men524 Men524 R1 AAGGTAAGCTAGCCTCTAGG Men524 F1 CACCATTAAGAACATACTGGCTCG rdna 18Sforw AAGGTTTCCGTAGGTGAAC 26Srev TATGCTTAAACTCAGCGGG Tabulka č. 4: Použité primery, sekvence a podmínky. 4.5 Long polymerázová řetězová reakce Metoda se pužívá pro přesnou amplifikaci fragmentů DNA až 20 kb dlouhých. Reakce se provádí za speciálních reakčních podmínek (tab. č. 6). Při amplifikaci delších fragmentů je metoda náročnější na kvalitu templátu, podmínky denaturace, správnou koncentraci dntp/mg a paramtery cyklu. Účinná denaturace DNA se zajistí přidáním směsi DMSO 2+ o koncentraci 1-4 %.V tabulce č. 5 je uvedeno složení reakční směsi a v tabulce č. 6 obecný reakční profil. 35

36 Složení reakční směsi Konečná koncentrace 10x LA PCR pufr 1krát DMSO 2% PCR dntp Mix 500 µm každý nukleotid 5 primer 300 nm 3 primer 300 nm DNA templát 10 µg/ml LA DNA polymerases Mix 50 U/ml Deionizovaná voda Doplnit na výsledný objem 20 µl Tabulka č. 5: Složení reakční směsi "Long" PCR. počáteční denaturace denarurace nasedání primerů elongace finální extenze 94ºC/60 vteřin 94ºC/15 vteřin 60ºC/30 vteřin (optimální teplota podle složení primerů) 68ºC/1 25 minut (podle délky amplifikovaných fragmentů, na 3kb fragmentu 2 minuty 68ºC/15 minut Tabulka č. 6: Obecný reakční profil pro Long PCR. 4.6 Polymerázová řetězová reakce s postupným snižováním T a "touchdown" Metoda, která umožní amplifikaci PCR produktů v případě, kdy je obtížné předem stanovit optimální teplotu nasedání primerů. Během reakce se v každém cyklu snižuje teplota nasedání primerů. 36

37 Program použité touchdown PCR: Touchdown od 55 C do 50 C - 94 C/3 minuty počáteční denaturace - 94 C/30 vteřin denaturace - 55 C/1 minuta nasedání primerů; -1 C/cyklus 5 cyklů; - 72 C/2 minuty elongace - 94 C/30 vteřin - 50 C/1 minuta 15 cyklů 72 C/2 minuty 4.7 Gelová elektroforéza Jde o separační metodu, která k dělení látek využívá jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Metoda je používána k separaci a detekci PCR produktů, stanovení koncentrace a přípravu fragmentů ke klonování. Koncentrace gelu se stanoví podle očekávané délky DNA fragmentů (tab. č. 7; dle Sambrook a Russel, 2001). Rozsah separace Koncentrace lineárních agarózy (% molekul DNA [w/v]) (kb) 0, , ,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2 Tabulka č. 7: Koncentrace agarózy podle délky separovaných fragmentů. 37

38 Agaróza se rozvaří v TAE pufru. Ihned po rozvaření se přidá fluorescenční barvivo ethidium bromid (výsledná knocentrace gelu 0,5 μl/ml), které slouží pro zviditelnění průběhu elektroforézy. Do vzorků se přidá nanášecí pufr 6x Loading Dye Solution (MBI Fermentas). Jako délkový standard se použil GeneRuler 100bp DNA Ladder nebo Gene Ruler 1kb DNA TM ladder. Gel se ponoří do TAE pufru tak, aby byl celý pod hladinou. Elektroforéza probíhá při voltáži nastavené podle vzdálenosti elektrod (5 10 V/cm gelu). Po ukončení elektroforézy se gel snímá CCD kamerou (SynGene) s využitím Gene Snap softwaru na UV transiluminátoru. Následně se výsledek zdokumentuje a upraví v programu Gene Tools. 4.8 Příprava DNA pro sekvenování Extrakce PCR produktů z gelu pomocí kitu QIA Gel Extraction Kit (QIAgen) Metoda slouží k odstranění primerů a nespecifických produktů PCR ze studovaných PCR produktů. Je založena na schopnosti DNA se v koncentrovaném roztoku chaotropní soli guanidin hydrochloridu vázat na silikagelovou matrix, která se nachází na kolonkách. DNA se uvolní roztokem soli o nízké iontové síle. V prvním kroku dochází k vazbě DNA na silikagelovou matrix. Na jeden objem gelu se přidají 3 objemy pufru QG (1 gram představuje 1 ml gelu). Inkubace při 50 C 10 minut. Protřepávat. K 1 objemu gelu se přidá 1 objem isopropanolu. Roztok se přepipetuje do dodávané kolonky. Centrifugace. K odstranění zbytků agarózy se přidá 0,5 ml QG pufru. Centrifugace. Na kolonku se přidá 0,75 ml PE pufru. 2 5 min inkubace při pokojové teplotě. Centrifugace. Pro eluci DNA se do středu kolonky přidá 6x zředěný EB pufr, nechá stát 1 minutu. Centrifugace Klonování PCR produktů pgem - T Easy (Promega) Tato metoda slouží ke klonování PCR produktů. Vektor má schopnost přijmout cizorodou DNA, 38