BD CHROMagar Orientation Medium

Transkript

1 POKYNY K POUŽITÍ MÉDIA NA MISKÁCH K OKAMŽITÉMU POUŽITÍ PA Rev.: Sep 2011 BD CHROMagar Orientation Medium ÚČEL POUŽITÍ BD CHROMagar Orientation Medium (=Orientační médium BD CHROMagar) je neselektivní médium určené k izolaci, přímé identifikaci, rozlišení a výpočtu patogenů v močových cestách. BD CHROMagar Orientation Medium umožňuje rozlišit a identifikovat kmen Escherichia coli a Enterococcus bez nutnosti provádět ověřovací testy. ZÁSADY A VYSVĚTLENÍ POSTUPU Mikrobiologická metoda. Escherichia coli, enterokoky a skupiny Klebsiella-Enterobacter-Serratia a Proteus-Morganella- Providencia jsou nejčastější organismy způsobující infekce močových cest. 60 až 70 % infekcí močových cest je způsobeno kmenem E. coli v čisté kultuře nebo v kombinaci s enterokoky. Kmeny Staphylococcus saprophyticus a Streptococcus agalactiae způsobují, i když ne tak často, infekce močových cest u žen. Vzhledem k různým úrovním antimikrobiální citlivosti jednotlivých složek je pro účinnou antimikrobiální léčbu nezbytná identifikace druhů pomocí řady biochemických testů. Jedná se o jeden z časově nejnáročnějších úkolů laboratoře při zpracování vzorků moči. Nejčastěji izolované druhy nebo skupiny organismů produkují charakteristické enzymy. Proto lze tyto organismy identifikovat na úrovni druhů omezeným počtem fermentačních nebo utilizačních testů substrátů. 1,2 Některé organismy produkují enzymy při rozkladu laktózy či glukosidů nebo laktózy i glukosidů. Některé organismy však neprodukují žádné z těchto enzymů. Kmen E. coli například produkuje enzymy při rozkladu laktózy, ale je negativní na ß-glukosidázu. Další druhy rodu Enterobacteriaceae jsou pozitivní na ß-glukosidázu, ale neobsahují enzymy nezbytné pro fermentaci laktózy. Jiné druhy tohoto rodu pak obsahují oba typy enzymů, nebo žádný z nich. Beta-glukosidázy se také nacházejí u grampozitivních koků, například u Enterococcus spp. nebo Streptococcus agalactiae. Tryptofan deamináza (TDA) je enzym, který se obvykle nachází ve skupině organismů Proteus-Morganella-Providencia. Vyhodnocením účinnosti bylo prokázáno, že BD CHROMagar Orientation Medium je pro izolaci, rozlišení a výpočet patogenů typických pro infekce močových cest vhodnější než běžně používaná diferenční média, například agar CLED nebo kombinace krevního agaru a agaru MacConkey. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium umožňuje identifikaci kmene E. coli a enterokoků přímo na izolační misce; dále je pomocí zbarvení kolonie a média možno provést pravděpodobnou identifikaci většiny kmenů Staphylococcus saprophyticus a S. agalactiae a skupin Klebsiella-Enterobacter-Serratia (= KES) a Proteus-Morganella-Providencia (= PMP). Jelikož je BD CHROMagar Orientation Medium neselektivní, rozmnoží se zde i jiné patogeny typické pro infekce močových cest, ale pro jejich identifikaci bude zapotřebí provést biochemické testy. BD CHROMagar Orientation Medium vyvinul A. Rambach a společnost BD je prodává na základě licenční smlouvy se společností CHROMagar, Paříž, Francie. Výživné látky do BD CHROMagar Orientation Medium dodávají speciálně vybrané peptony. Chromogenní směs se skládá z umělých sloučenin (chromogenů), které po rozkladu určitými mikrobiálními enzymy způsobí zabarvení média, čímž zajišťují přímé rozlišení některých druhů nebo detekci některých skupin organismů s nutností provést minimální množství ověřovacích testů. PA

2 REAGENTY BD CHROMagar Orientation Medium Množství* na jeden litr deionizované vody Chromopepton 16,1 g Směs chromogenů 1,3 Agar 15,0 ph 6,9 +/- 0,2 *Upraveno nebo doplněno dle požadavků tak, aby byla splněna kritéria výkonu. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ. Pouze k odbornému použití. Pokud misky vykazují známky mikrobiální kontaminace, změny zabarvení, vysušení, popraskání nebo jiné známky poškození, nepoužívejte je. Pokyny pro aseptickou manipulaci, informace týkající se biologického nebezpečí a pokyny pro likvidaci použitého produktu naleznete v dokumentu VŠEOBECNÉ POKYNY K POUŽITÍ. SKLADOVÁNÍ A ŽIVOTNOST Po převzetí skladujte misky až do doby těsně před použitím v originálním pouzdru, v temnu a při teplotě 2 až 8 C. Systém nesmí zmrznout nebo se přehřát. Misky lze očkovat až do data platnosti (viz štítek na obalu) a inkubovat je lze po doporučenou dobu inkubace. Misky z otevřených sad po 10 kusech lze použít po dobu jednoho týdne, pokud jsou uloženy v čistém prostředí při teplotě 2 až 8 C. KONTROLA KVALITY UŽIVATELEM Inokulujte reprezentativní vzorky následujícími kmeny (podrobné informace naleznete v dokumentu VŠEOBECNÉ POKYNY K POUŽITÍ). Aerobně inkubujte misky v obrácené poloze při teplotě 35 až 37 C po dobu 20 až 24 hodin. Kmeny Výsledky růstu Escherichia coli Růst dobrý až výborný; kolonie středně velké až velké, tmavě ATCC růžové až růžové zbarvení, průhledné Enterobacter cloacae Růst dobrý až výborný, kolonie středně velké, tmavě modré ATCC Proteus mirabilis ATCC Enterococcus faecalis ATCC Streptococcus agalactiae ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus saprophyticus ATCC (=NCTC 10516) Slepý vzorek zbarvení s fialovými kruhy nebo bez nich Růst dobrý až výborný; kolonie středně velké, bledé až béžové zbarvení se žlutým až hnědým lemováním; v oblastech masivního růstu může být veškeré médium zcela žluté až hnědé. Plazivý růst je částečně až úplně inhibován. Růst dobrý až výborný; kolonie malé, modrozelené až modré zbarvení Růst slabý až dobrý; kolonie nepatrné až malé, světle modrozelené až světle zelené zbarvení s kruhy nebo bez nich Růst dobrý až výborný, kolonie středně velké až malé, přirozené zbarvení (bílé až krémové) Růst slabý až dobrý; kolonie malé, matné, světle růžové až růžové zbarvení Bezbarvý až velmi světle žlutý, průhledný POSTUP Dodané materiály BD CHROMagar Orientation Medium (90mm misky Stacker ). Mikrobiologicky kontrolováno. Materiál, který není součástí dodávky Pomocné živné půdy, činidla a laboratorní vybavení dle potřeby. PA

3 Druhy vzorků Toto médium se používá výhradně k výpočtu a rozlišení bakterií v moči. Lze použít moč ze středního proudu nebo katétru nebo moč odebranou suprapubickou punkcí močového měchýře (viz také ÚČINNOST A OMEZENÍ POSTUPU). Při odběru vzorků moči dodržujte aseptické postupy. Moč je nutno inokulovat přímo na médium nejpozději 2 hodiny po odběru nebo ji uchovávat v chladu (nejdéle 24 hodin), aby před inokulací tohoto média nedošlo k přemnožení původců infekce nebo nečistot. Provedení testu K získání izolovaných kolonií s typickým zabarvením a tvarem je nezbytné použití kalibrovaných smyček nebo jiných postupů, které se běžně používají při nátěru vzorků moči na miskách. Pomocí kalibrované smyčky odeberte vzorek neředěné, dobře promíchané moči (0,01 nebo 0,001 ml). Zkontrolujte náležité naplnění smyčky vzorkem. Proveďte inokulaci středem misky směrem dolů formou jediného nátěru, ze kterého rozetřete další nátěr. 6,7 Aerobně inkubujte inokulované misky v obrácené poloze při teplotě 35 až 37 C po dobu 20 až 24 hodin. Během inkubace minimalizujte působení světla, neboť může zničit chromogeny. Po zbarvení kolonií již může k působení světla dojít. Výsledky Po inkubaci by se na miskách měly objevit izolované kolonie v oblastech, kde bylo inokulum řádně zředěno. K identifikaci, rozlišení a jako vodítko pro další ověřovací testy použijte tabulku 1 a schéma 1. Pro potvrzení výsledků lze použít Gramovo barvení a mikroskopii. Tabulka 1 Pokyny pro identifikaci na základě různého zbarvení kolonií Organismus Vzhled na BD CHROMagar Orientation Medium Ověřovací testy (nezbytné pro další rozlišení) E. coli a Středně velké až velké, tmavě růžové až růžové, průhledné kolonie s kruhy nebo bez nich Skupina KES b Skupina PMP c Enterococcus S.agalactiae S. saprophyticus (většina kmenů) Další (včetně kvasinek) Středně velké, modré až tmavě modré kolonie s fialovými kruhy nebo bez nich Bledé až béžové kolonie obklopené hnědými kruhy d Poznámky pod čarou a-h naleznete ve schématu 1. Malé modrozelené kolonie Světle modrozelené až modré, nepatrné až malé kolonie s kruhy nebo bez nich Světle růžové až růžové, malé matné kolonie s kruhy nebo bez nich Přirozená (krémová) pigmentace PA BBL CRYSTAL E/NF pro rozlišení v rámci druhu Indol, H 2 S e, ODC f, BBL CRYSTAL E/NF pro rozlišení v rámci druhu PYR g 5µg miska s novobiocinem h Odpovídající biochemické nebo sérologické identifikační testy Ověřovací testy Ověřovací testy proveďte podle pokynů v tabulce 1 a schématu 1. Na kolonie na BD CHROMagar Orientation Medium neaplikujte přímo žádné detekční činidlo. Proveďte testy raději na filtračním papíru podle růstu jednotlivých kolonií. Pro kolonie kmene E. coli, které jsou tmavě růžové až růžové a nepatrné až malé, nepoužívejte Kovacsovo činidlo pro prokázání indolu, jelikož může dojít k interakci zbarvení kolonií tohoto kmene a červeného zbarvení pozitivního indolového testu; použijte raději indolové činidlo dimethylaminocinnamaldehyd (DMACA; zelená barva = pozitivní). Pokud použijete jiné ověřovací testy nebo biochemické identifikační systémy, dodržujte pokyny uvedené u těchto testů nebo systémů.

4 Ověřovací testy pro kmen Enterococcus proveďte pouze v případě, že je zapotřebí rozlišení nad úrovní rodu. Schéma 1: Pokyny pro provedení identifikačních testů na zvolených organismech Vzhled kolonie Malé, růžové, matné citlivé Bezbarvé až béžové kolonie, oranžovohnědé médium 5µg miska s novobiocinem skupina PMP PA S. intermedius, S. simulans rezistentní S. saprophyticus, S. xylosus indolový test DMACA i zelená barva (pozitivní) H 2 S pozitivní e H 2 S negativní e BBL CRYSTAL GP pro rozlišení v rámci rodu P. vulgaris Providencia spp., Morganella spp. bezbarvé až světle růžové (negativní) ODC pozitivní f ODC negativní f P. mirabilis P. penneri a Viz část Omezení postupu. b KES = skupina Klebsiella-Enterobacter-Serratia c PMP = skupina Proteus-Morganella-Providencia d Žluté až hnědé zbarvení je způsobeno pozitivitou na tryptofan deaminázu (TDA), která je společná všem organismům skupiny PMP. Přibližně 50 % kmene P. vulgaris vytváří na žlutém až hnědém médiu modré kolonie. e Standardní sirovodíkový test f Standardní test na ornitin dekarboxylázu g Pyroglutamátový test na pyrrolidonyl arylamidázu h Izolát rozetřete na misku s agarem Mueller Hinton II. Umístěte na inokulovaný nátěr novobiocin (5µg misku). Inkubujte po dobu 18 až 24 hodin při teplotě 35 až 37 C a určete velikost inhibiční zóny. (Rezistence: 16 mm, citlivost: > 16 mm) i DMACA= činidlo dimethylaminocinnamaldehyd pro tvorbu indolu. Aplikujte činidlo na filtrační papír a rozetřete jednu kolonii do oblasti, kde se nachází činidlo na filtračním papíru. Vyčkejte sekund. Zelená barva je znakem tvorby indolu (červená barva nebo bezbarvost = negativní). Výpočet a interpretace výsledků 6,7 Spočítejte počet kolonií (CFU) na misce. Pokud byla použita smyčka o objemu 0,01 ml, odpovídá každá výsledná kolonie 100 CFU/mL moči. Pokud byla použita smyčka o objemu 0,001 ml, odpovídá každá kolonie 1000 CFU/mL moči. 7 Moč ze středního proudu a katétru: Současné pokyny uvádějí, že u jednoho izolátu odpovídá hustota 10 5 CFU/mL infekci, hustota <10 5 CFU/mL kontaminaci v močové trubici nebo pochvě a při hustotě 10 4 až 10 5 CFU/mL je nutno provést přehodnocení na základě klinických informací. 7 Kontaminující bakterie se obvykle objeví v malých počtech, které se budou lišit v morfologii kolonií. Moč odebraná suprapubickou punkcí močového měchýře: Jelikož močový měchýř neinfikovaných jedinců je sterilní, ukazuje na infekci libovolný počet CFU. Patogeny v močových cestách budou většinou ve velkých počtech s jednotnou morfologií kolonií a jednotným zbarvením na tomto médiu. ÚČINNOST A OMEZENÍ POSTUPU BD CHROMagar Orientation Medium je chromogenní médium určené pro přímou identifikaci, rozlišení a výpočet běžných patogenů v močových cestách. Médium je vhodné pro izolaci mnoha aerobně se množících mikroorganismů, například Enterobacteriaceae, Pseudomonas a dalších nefermentujících gramnegativních tyček, enterokoků, stafylokoků a mnoha dalších bakterií ze vzorků moči. Vyhodnocením účinnosti bylo prokázáno, že BD CHROMagar

5 Orientation Medium má ve srovnání s jinými diferenčními médii používanými k izolaci, rozlišení a výpočtu patogenů typických pro infekce močových cest (například s agarem CLED nebo kombinací krevního agaru a agaru MacConkey) mnoho výhod. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium umožňuje rozlišovat a identifikovat kmen E. coli a enterokoky bez nutnosti provádět ověřovací testy na základě identifikačních kritérií stanovených normou CLSI M35-A Abbreviated Identification of Bacteria and Yeast; Approved Guideline (Zkrácená identifikace bakterií a kvasinek; schválené pokyny). 8 Pravděpodobnou identifikaci kmene S. saprophyticus a skupin S. agalactiae, Klebsiella-Enterobacter-Serratia (KES) a Proteus-Morganella-Providencia je možno provést na základě morfologie kolonie, pigmentace a změny zabarvení média. Jelikož je většina běžných infekcí močových cest způsobena kmenem E. coli nebo enterokoky, snižuje použití tohoto média výrazně pracovní zatížení a čas potřebný k inokulaci a odečtu identifikačních systémů, které jsou zapotřebí při použití standardních médií. Výsledky účinnosti 4,9,10 Mikrobiologická účinnost BD CHROMagar Orientation Medium a chromogenního konkurenčního média byla porovnána s mikrobiologickou účinností agaru Columbia s 5 % ovčí krve a agaru MacConkey bez krystalové violeti pro výpočet a přibližnou identifikaci bakterií způsobujících infekce močových cest. 4 Z celkového počtu 658 klinických vzorků moči, nevykázalo žádný růst 118 vzorků, 402 vzorků vykázalo růst s počtem buněk 10 5 CFU/mL a 138 vzorků prokázalo růst s počtem buněk <10 5 CFU/mL. Z celkového počtu vzorků s počtem buněk 10 5 CFU/mL bylo 163 vzorků čistými kulturami a 239 vzorků smíšenými kulturami. Celkem 266 izolátů kmene Escherichia coli bylo získáno na obou chromogenních médiích, 260 vzorků bylo izolováno na krevním agaru a 248 vzorků bylo izolováno na agaru MacConkey. U jednoho kmene (0,4 %) nebylo prokázáno očekávané růžové zbarvení na BD CHROMagar Orientation Medium a u 23 kmenů (8,7 %) nebylo prokázáno očekávané růžové zbarvení na konkurenčním médiu. Enterokoky (BD CHROMagar Orientation Medium, n = 266; konkurenční médium, n = 265) vytvořily na obou chromogenních médiích malé modrozelené kolonie. 50 smíšených kultur obsahovalo enterokoky, které byly zjištěny pouze na chromogenních médiích. Skupiny organismů Klebsiella-Enterobacter-Serratia (KES) a Proteus-Morganella-Providencia (PMP) bylo možné identifikovat na obou chromogenních médiích. U 63 z 66 izolátů skupiny KES bylo prokázáno očekávané zbarvení na BD CHROMagar Orientation Medium a u 58 z 64 izolátů bylo prokázáno očekávané zbarvení na konkurenčním médiu. U ostatních mikroorganismů bylo zapotřebí provést další identifikační testy. Ve druhém vyhodnocení účinnosti s celkovým počtem 421 klinických vzorků moči (u 286 z nich byl prokázán růst bakterií nebo kvasinek) bylo porovnáno BD CHROMagar Orientation Medium s agarem BD Columbia s 5 % ovčí krve. 9 Na chromogenním médiu bylo získáno 483 izolátů a na krevním agaru bylo izolováno 447 kmenů. Kmeny byly identifikovány biochemicky. Z kmenů E. coli bylo 95 % správně identifikováno podle růžového zbarvení kolonie; zbývající kmeny E. coli zbarvené nebyly. Všechny izoláty kmene Enterococcus spp. vykazovaly typické modré až modrozelené zbarvení kolonií. Izoláty kmene Streptococcus agalactiae vytvořily drobné, světle modré až modrozelené kolonie a od enterokoků byly odlišeny negativním testem PYR. Všechny izoláty kmene Staphylococcus saprophyticus a S. simulans vytvořily malé růžové matné kolonie a byly rozlišeny na základě novobiocinového testu a identifikovány na úrovni druhů biochemickými testy. V interním slepém pokusu, jehož součástí byly testy více než 900 bakteriálních kmenů naočkovaných v moči, činila citlivost a specificita identifikace kmene E. coli pomocí BD CHROMagar Orientation Medium pouze na základě zbarvení a morfologie kolonie 97 % (citlivost) a 99 % (specificita); citlivost a specificita identifikace kmene Enterococcus činila 99 % (citlivost) a 97 % (specificita; viz tabulku). 10 PA

6 Organismus Procento citlivosti (s 95% jistotou) E. coli 277/286 96,9 % ( ,6 %) Enterococcus 319/324 98,5 % (96,4 9,5 %) Procento specificity (s 95% jistotou) 638/645 98,9 % (97,8 99,6 %) 603/ % (95,3 98,2 %) Omezení postupu Jelikož je toto médium neselektivní, budou se zde množit i jiné patogeny typické pro infekce močových cest. Kolonie, které vykazují své přirozené zbarvení a nereagují s chromogenními substráty na BD CHROMagar Orientation Medium, je nutno dále rozlišit pomocí odpovídajících biochemických nebo sérologických testů. Viz odkazy. 1,2 U kolonií kmene E. coli, které jsou tmavě růžové až růžové a nepatrné až malé, je nutné provést další ověřovací testy, například indolový test (indolové činidlo DMACA). Gramnegativní tyčky, které nepatří ke skupině organismů KES, mohou na BD CHROMagar Orientation Medium vytvářet velké modré kolonie a k jejich identifikaci bude zapotřebí provést další biochemické testy. 11 Ve velmi vzácných případech se mohou v moči nacházet Listeria monocytogenes nebo jiné druhy kmene Listeria (například po potratu vyvolaném těmito činiteli). Kmen Listeria bude vytvářet malé modré až modrozelené kolonie, které budou negativní při testu PYR a podobné kmenu Streptococcus agalactiae. Proto bude zřejmě vhodné připravit Gramovo barvení u všech kmenů, které na tomto médiu vytvářejí drobné až malé, modré až modrozelené PYR-negativní kolonie. Výskyt grampozitivních tyček může označovat přítomnost druhů kmene Listeria, ale k potvrzení této identifikace je zapotřebí provést další biochemické testy. Ve velmi vzácných případech mohou izoláty kmene Aeromonas hydrophila vytvářet růžové kolonie. Lze je odlišit od kmene E. coli pomocí testu na oxidázu (Aeromonas = pozitivní; E. coli = negativní). V některých případech mohou stafylokoky negativní na koagulázu jiné než S. saprophyticus, například S. simulans, S. xylosus a S. intermedius, vytvářet malé růžové matné kolonie. Z toho důvodu je na těchto izolátech nezbytné provést další testy (viz schéma 1). BD CHROMagar Orientation Medium nepodporuje množení náročných organismů, například Neisseria, Haemophilus nebo Mycoplasma spp. Použití tohoto média pro neklinické či klinické vzorky, které nepocházejí z moči, nebylo doloženo. Před prvním použitím BD CHROMagar Orientation Medium doporučujeme procvičit si typický vzhled kolonií na definovaných kmenech, například kmenech uvedených v části KONTROLA KVALITY UŽIVATELEM. ODKAZY 1. Isenberg, H.D. (ed.) Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol. 1. American Society for Microbiology. Washington, DC. 2. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld Bailey & Scott s diagnostic microbiology, 10th ed. Mosby, Inc., St. Louis. 3. Merlino, J., S. Siarakas, G. J. Robertson, G. R. Funnell, T. Gottlieb, and R. Bradbury Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiation and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J. Clin. Microbiol. 34: Hengstler, K.A., R. Hammann, and A.-M. Fahr Evaluation of BBL CHROMagar Orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 35: Samra, Z., M. Heifetz, J. Talmor, E. Bain, and J. Bahar Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 36: PA

7 6. Clarridge, J.E., M.T. Pezzlo, and K.L. Vosti Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of urinary tract infections. Coordinating ed., A.S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Forbes, B.A., and P.A. Granato. Processing specimens for bacteria In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved Guideline M35. Abbreviated identification of bacteria and yeast, CLSI, Wayne, PA.Search for latest version at 9. Data on file. BD Diagnostic Systems Europe, Heidelberg, Germany. 10. Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 11. Abbott, S.L Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. BALENÍ/DOSTUPNOST BD CHROMagar Orientation Medium Kat. č Médium na miskách k okamžitému použití, 20 kusů v balení Kat. č Médium na miskách k okamžitému použití, 120 kusů v balení DALŠÍ INFORMACE Další informace vám poskytne místní zástupce společnosti BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com CHROMagar is a trademark of Dr. A. Rambach. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company BD PA