U niverzita Karlova v Praze. Stanovení virové rezistence na ganciclovir dané bodovými mutacemi v CMV fosfotransferáza genu UL97

Transkript

1 U niverzita Karlova v Praze 2. lékařská fakulta Ústav lékařské mikrobiologie Bakalářská práce Zdravotní laborant Molekulárně genetické metody a jejich uplatnění v současné mikrobiologické diagnostice (virové, bakteriální a mykotické infekce) Stanovení virové rezistence na ganciclovir dané bodovými mutacemi v CMV fosfotransferáza genu UL97 Jana Nedbálková Školitel: MUDr. Jana Matějková

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně, pod vedením školitele MUDr. Jany Matějkové, a že jsem všechny použité prameny řádně citovala. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. V Praze dne 16.dubna 2007 /.;~ /v'.e-cti~.j" podpis

3 OBSAH OBSAH Seznam použitých zkratek a symbolů Teoretický úvod Izolace nukleových kyselin Štěpení DNA Sekvenování DNA Hybridizace nukleových kyselin Amplifikační metody..., Polymerázová řetězová reakce (PCR) PCR v reálném čase (Real-time) DNA čipy Cytomegalovirus Obecný úvod Charakteristika cytomegaloviru Epidemiologie a patogeneze Infekce CMV Diagnostika Léčba Charakterizace virové rezistence na gancic10vir dané bodovými mutacemi v CMV fosfotransferáza genu UL Charakterizace virové rezistence na virostatika dané bodovými mutacemi v CMV DNA polymerázy genu UL Faktory buněčné rezistence Cíl práce Metody Pacienti Izolace materiálu a amplifikace Izolace DNA PCR Štěpení restrikčními enzymy Detekce pomocí agarózové elektroforézy Experimentální část a výsledky Amplifikace UL Databáze pacientů a vzorků Produkty štěpení Hodnocení výsledků Tabulky a obrázky... : Diskuse Závěr Seznam použité literatury Přílohy... 40

4 1. Seznam použitých zkratek a symbol ů AD169 AIDS Ala A-T bp CD4+ CMV DNA dntp dsdna EBV EDTA ELISA G-C GVH HhaI HHV6 HinlII HIV HPA IgA IgG IgM in silu Leu MOR Met run OKT3 typový kmen CMV syndrom získané imunodeticience alanin adenin-thymin počet párů bazí diferenciační antigen T lymfocytů cytomegalovirus deoxyribonukleová kyselina deoxyribonukleosid trifosfát dvouřetězcová (dvoušroubovice) DNA virus Epsteina-Barrové kyselina ethylendiaminotetraoctová enzymová imunoanalýza na imunosorbentech guanin-cytosin reakce štěpu proti hostiteli restrikční enzym z Haemophilus haemolyticus lidský herpetický virus 6 restrikční enzym z Haemphilus influenzae RFL-l virus lidské imunodeticience hybridization protection assay imunoglobulin A imunoglobulin G imunoglobulin M na místě leucin mnohočetná léková rezistence methionin nanometr protilátky proti T lymfocytům 5

5 PCR pp65 RNA RT-PCR Ser ssdna TaqI TBE TKD TMV Tx ÚHKT UL Val JlI polymerázová řetězová reakce virový antigen 65 v leukocytech ribonukleová kyselina reverzně transkriptázová polymerázová řetězová reakce serm jednořetězcová DNA restrikční enzym z Thermus aquaticus YT-1 pufr obsahující Tris, kyselinu boritou, EDTA transplantace kostní dřeně vir tabákové mozaiky transplantace Ústav hematologie a krevní transfuze dlouhé segmenty virové DNA valin mikrolitr 6

6 2. Teoretický úvod Molekulárně-genetické metody umožňují manipulaci s nukleovými kyselinami, především s DNA, která nese dědičnou informaci v podobě genů. Po zjištění, že je genetická informace uložena v pořadí nukleotidů DNA, vědci toužili stanovit tuto sekvenci a poznat funkci genů na molekulární úrovni [1]. 2.1 Izolace nukleových kyselin Pro izolaci nukleových kyselin je k dispozici pestrá škála metod. Mezi dvě nejpoužívanější metody patří fenol-chloroformová extrakce nukleových kyselin a adsorpce na silikát. U obou je prvním krokem lýza buněk, ze kterých chceme nukleové kyseliny získat. U běžných buněk stačí obvykle rozpuštění biomem brán a denaturace proteinů detergentem. Pro lýzu pevných tkání nebo houbových či rostlinných buněk s buněčnou stěnou může být použita nějaká forma mechanické síly, např. protřepáváním na vortexu se skleněnými kuličkami, drcením tkáně zmrazené tekutým dusíkem v třecí misce apod. Pro zvýšení čistoty izolované DNA se někdy k lyzačmírnu roztoku přidává enzym proteináza K, který štěpí bílkoviny, včetně hi stonů vázaných na strukturu DNA. Buněčný obsah včetně nukleových kyselin se z lyzovaných buněk uvolní do pufrovaného roztoku, který kromě detergentů obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA). Ta vyvazuje inoty vápníku, které jsou potřebné jako kofaktor nukleáz. Nukleázy bez vápníku nepracují, takže vazbou vápníku zabráníme degradaci čerstvě uvolněné DNA nukleázami, které se z lyzovaných buněk také uvolní. Jako inhibitor nukleáz :fungují také některé detergenty, které se používají při lyzi buněk - zejména laurylsíran sodný a N-laurylsarkosin [2]. 2.2 Štěpe ní DNA Pokud je DNA izolována z buněk šetrně, pak je představována celými chromosomy, tedy mimořádně dlouhými molekulami. Pro mnoho molekulárněgenetických technik je proto nejdříve nutné takové molekuly naštěpit na menší úlomky (fragmenty), se kterými lze lépe pracovat. Takové techniky jsou obecně nazývány metody restrikce DNA [1]. 7

7 vlákna k ukončení (tenninaci) syntézy. Vznikají tak nedokončené úseky komplementárního vlákna, jejichž délku lze zjistit pomocí elektroforézy v gelu. Reakce funguje tak, že k ukončení (terminaci) reakce dojde, když se v templátovém vlákně vyskytne určitý nukleotid. Délka nedokončeného úseku, zjištěná elektroforézou v gelu, pak odpovídá vzdálenosti od začátku nukleotid [2]. vlákna, ve které se vyskytl určitý 2.4 Hybridizace nukleových kyselin Jako hybridizaci chápeme komplementární spojení dvou vláken nukleových kyselin různého původu. Jedním je vyšetřovaná nebo též cílová DNA. Druhým vláknem je sonda (probe), tj. značený usek DNA nebo RNA umožňující lokalizaci příslušné komplementární sekvence. Hybridizační metody mají v molekulární biologii velmi široký význam. V klasickém provedení se však jedná o tzv. molekulární hybridizaci, tj. spoj ení dvou předem izolovaných molekul nukleové kyseliny, tzn. k vyšetření se používá pouze DNA, která byla z biologického materiálu separována. V mikrobiologii se využívají různé metody založené na hybridizaci, např. hybridizace v roztoku, HPA (Hybridization protection Assay), hybridizace na pevném nosiči, hybridizace in silu. Při hybridizace in situ je cílová nukleová kyselina přítomna stále v biologickém materiálu, kterým jsou zpravidla chromozomy, interfázní jádra, někdy i celé buňky. Pokud je cílová sekvence přítomna, je místo vazby sondy patrné jako hybridizační signál. Podoba hybridizačního signálu závisí na způsobu značení sondy [5]. 2.5 Amplifikač ní metody Sensitivita diagnostických testů založených na hybridizačních sondách se pohybuje kolem 10 4 molekul nukleové kyseliny/ml vzorku. Pokud chceme prokázat původce infekčního onemocnění přímo v matriálu odebraném pacientovi, nemusí být citlivost metody dostačující. Řešením jsou tzv. amplifikační techniky [3] Polymerázová řetězová reakce (per) Pomocí polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction, per) může být rychle a vysoce selektivně namnožena konkrétní nukleotidová sekvence obsažená v jakékoliv DNA [A]. V případě infekčního agens se jedná o specifický úsek nukleové 9

8 kyseliny. Pro rutiill1í testy je důležité, aby byl tento úsek konzervativní, neměill1ý, tj. aby v něm nedocházelo k bodovým mutacím. Izolovaná DNA uvolněna z infekčního agens je nejprve tepelně denaturována. Při teplotě nad 90 C jsou rozvolňovány vodíkové můstky spojující purinové a pyrimidinové baze vzájemně komplementárních nukleotidů, čímž jsou od sebe oddělovány jednotlivé řetězce DNA. Výsledkem tohoto procesu je jednořetězcová DNA (ssdna). Ta v další fázi slouží jako matrix pro syntézu nového komplementárrubo řetězce. Tato syntéza je enzymatickým procesem, jenž začíná navázáním (annealing) tzv. primeru na komplementární sekvenci matricového řetězce. Primery jsou syntetické oligonukleotidy. Od jejich 3' konce začíná syntéza nového řetězce. Jednotlivé oligonukleotidy jsou přiřazeny podle komplementarity bazí (A-T, C-G), propojení cukrů fosfodiesterickou vazbou do páteřního řetězce zajišťuje polymeráza. Nasednutí primerů probíhá obvykle při teplotě okolo 60 C, pro polymeraci řetězce je optimální teplota 72 C. Výsledkem procesu je novotvořený úsek dvouřetězcové DNA (dsdna), tzv. amplikon. Protože se amplifikují oba řetězce matricové DNA, vzniknou v průběhu jednoho cyklu z jedné výchozí molekuly dsdna dva amplikony. Druhý cyklus začíná také denaturací dsdna, následuje nasednutí primerů a od jejich 3' konce elongace řetězců. Ze 2 výchozích molekul vzniknou 4 novotvořené amplikony. Každý další cyklus počet amplikonů zdvojnásobl Nebezpečí vzniku chyb je tím větší, čím delší je amplifikovaný úsek. Ze 2 vláken získáme po 30 cyklech teoreticky celkem 2 30 = kopií (tj. 107 milionů kopií). V závislosti na detekční technice se amplikony buď ponechají v ds formě (elektroforéza), nebo se chemicky denaturují na ss formu (hybridizace se záchytnými sondami) [3,10] per v reálném čase (Real-time) Množství produktu, vytvořeného amplifikací, závisí v každé PCR na množství templátové DNA, kter~ je přidána do reakce. Reakce tedy probíhá tzv. kvantitativně. Hrubé určení množství produktu je možné posouzením intenzity pruhu, který se objeví po rozdělení výsledku PCR na gelu. Přesné určení tohoto množství je možné pomocí sondy označené fluorescenčním kalibrační křivky [4]. barvivem a absolutní kvantifikace zkonstruováním Speciální termocyklery, určené pro kvantitativní PCR v reálném čase (RQpeR), jsou schopny v průběhu PCR ozařovat vzorek excitačním zářením, které vybudí 10

9 fluorescenci uvolněného barviva. Tuto fluorescenci přístroj po každém cyklu změří a výsledek předá řídícímu softwaru, který zobrazuje průběžně - v reálném čase - množství uvolněné fluorescence. To odpovídá množství vzniklého produktu. Výsledek reakce tak známe často dřív, než proběhnou všechny cykly. Kromě tohoto urychlení a vypuštění zdlouhavé detekce produktu na gelu je tato technika hlavně výhodná tam, kde potřebujeme znát přesné množství vstupní templátové DNA jako např. při sledování nálože patogenu v reakci na léčbu [6,10]. 2.6 DNA čipy DNA-čipy, DNA-microarrays (tzv.mikrosoubory) JSou pozoruhodným výsledkem bouřlivého vývoje metod molekulární genetiky. K pevnému podkladu je přichycena jednovláknová sonda, se kterou je možné hybridizovat vzorek nukleové kyseliny. Takto lze na malou plochu pevného podkladu vedle sebe připevnit různé sondy. DNA-čip je tedy zjednodušeně řečeno malá destička, na které je vedle sebe připevněno nmoho sond současně. Když na čip naneseme vzorek vyšetřované DNA, můžeme současně provést mnohonásobné vyšetření s celým souborem různých sond (proto také častěji používaný název DNA-microarrays = DNA-mikrosoubory). Systém je vylepšen ještě tím, že speciální vícevrstevná struktura umožňuje odečítat intenzitu vazby vyšetřované nukleové kyseliny na automatizovaných čtečkách (angl. microarray reader). Detekce vazby je relativní a zobrazuje se odlišnou barvou jednotlivých "skvrn" v místě hybridizace. DNA-microarrays se dnes používají především ve výzkumu při sledování exprese genů. Jejich budoucnost je ale především v lékařské diagnostice. Měly by umožnit velmi efektivní současné vyšetření přítomnosti různých alel genů (především chorobných) v jediném vzorku DNA od pacienta. Otevřely by tak cestu k účinnému včasnému vyhledávání dispozic k různým chorobám s dědičnou komponentou a k časné diagnostice rakoviny. [4,7,9,10]. 11

10 2.7 Cytomegalovirus Obecný úvod První virus byl popsán ruským vědcem Dimitrijem Ivanovským v roce 1892 jako "patogenní" agens, které nelze odstranit filtrováním. Ivanovský použil šťávu z listů tabáku napadených vírem tabákové mozaiky (TMY) a přefiltroval j i přes porcelánový filtr, který byl v té době používán na odstraňování bakterií. Filtrát však nadále obsahoval substanci způsobující infekci na pokusných rostlinách tabáku. V roce 1898 tuto substanci menší než bakterie označil nizozemský mikrobiolog Martinus Beijerinck jako virus. V dalších pokusech pak tito vědci prokázali, že viry se nedokáží rozmnožovat na živných půdách používaných pro kultivaci bakterií a že ke svému růstu potřebují buňky hostitelského organismu. Viry mají vlastní genom, jsou schopny reprodukce, vytvářejí v1astní proteiny a replikují vlastni DNA nebo RNA. Nic z toho však nedokáží bez hostitelské buňky, nemají žádný vlastní metabolismus, žádný zdroj energie, nemnoží se dělením, ale syntézou svých složek a tato syntéza je závislá na riboso mech hostitelské buňky [11]. Viry se velmi liší svou velikostí, tvarem a symetrií. Všechny virové částice však musí obsahovat dědičnou výbavu viru - genom. Právě na základě velikosti a složení virového genomu jsou viry klasifikovány. Rozlišujeme tak viry s DNA genomem, viry s RNA genomem a jako samostatnou skupinu pak rozeznáváme viry s RNA genomem schopné reverzní transkripce do DNA a integrace do hostitelského genomu. Virový genom obsahuje od několika málo genů až po několik tisíc. Viry způsobují velké množství významných infekčních chorob. Proti některým z těchto onemocnění je k dispozici účinná vakcína, nebo byla vyvinuta léčiva specificky blokující některý virový enzym, tzv. virostatika. Na virová onemocnění však nemá nejmenší vliv léčba antibiotiky, přestože jsou tato často u virových onemocnění nasazována [ll] Charakteristika cytomegaloviru V této práci jsem se zaměřila na lidský cytomegalovirus (CMY), který má stejné vlastnosti jako ostatní herpetické viry. První doložená zpráva o CMY infekci u lidí pochází pravděpodobně z roku 1881 od Ribberta. V roce 1920 Goodpasture a 12

11 Talbot vyslovili podezření, že popisovaná infekce je způsobena VIrem. Podle typického histologického nálezu buněk s obrovskými jádry v poškozených tkáních jej nazvali cytomegalovirem. Lidský cytomegalovirus napadá pouze člověka [14]. CMV (lidský herpesvirus 5) je DNA virus, největší z rodiny herpetických virů. Je řazen do podrodiny betaherpesvirů, pro které je typický velmi pomalý růst. Patří k největším živočišným virům, v průměru měří 200 nm. Zralý virionje složen z 64 nm jádra, které je obklopeno kapsidou, skládající se z 162 kapsomer. Vše je obklopeno lipidovým obalem (obr , obr ). Jádro obsahuje lineární dvouvláknovou virovou DNA, která má zhruba kilobazí a je uspořádána do zvláštních krátkých a dlouhých sekvencí oddělených repetitivními motivy. DNA kóduje zhruba 200 otevřených čtecích rámečků. Zatím je však známo pouze 33 strukturálních proteinů a některé proteiny produkované infikovanou buňkou [1 2]. Genová sekvence typového kmene AD169 je známa a je dostupná v databázi Gen Bank (NC ). Po vstupu viru do buňky je spuštěna řada aktivačních procesů. Po infekci kompletním virem prostupuje genom rychle do jádra a začíná transkripce a replikace virové DNA. Replikace je pomalá a trvá zhruba hodin. [13] Virus encodet! Caps id ť ll v e\op e glycoproteins Genome _-..;~~~~~ Mau'ix (l gum nt) Enve lore Obr Struktura cytomegaloviru 13

12 Obr Cytomegalovirus pod elektronovým mikroskopem Epidemiologie a patogeneze Jediným zdrojem CMV je člověk. Díky vysoké citlivosti na podmínky zevního prostředí je pro přenos viru nutný těsný kontakt mezi osobami. Infikované osoby vylučují virus do téměř všech sekretů a tělních tekutin - slin, moči, stolice, sekretu děložního hrdla, ejakulátu, mateřského mléka, plodové vody, krve. Nejčastější cesta přenosu je orofaryngeá1nimi a genitálními sekrety a transplacentárně [15,16]. Inkubační doba u primo infekce je 6-8 týdnů, při reaktivaci je o něco kratší. Po infekci virus celoživotně perzistuje v organismu hostitele pravděpodobně v monocytech a makrofázích. K reaktivaci infekce dochází v období oslabení organismu. Zhruba 1-2,4 % novorozenců se rodí infikováno CMV [17,18], do puberty je promořeno % dětí a během dospělosti % populace. Zvýšené riziko infekce je v časném dětství,,. adolescenci a fertilním věku [19,20]. Díky dlouhodobému soužití se svým hostitelem získal CMV schopnosti bránit se jeho imunitním reakcím a tak v něm trvale přežívat, což svědčí o dobré adaptaci viru k hostiteli. Primární CMV infekce imunokompetentního jedince většinou nezpůsobí závažné onemocnění, ale virus není imunitní reakcí zničen a z těla vyloučen, je již navždy usídlen v některých hostitelových buňkách v latentní podobě. 14

13 Imunitní reakce proti CMV začíná obranou vrozenými imunitními mechanizmy - tvorbou interferonu, aktivací komplementu, NK buněk. Poté nastupuje adaptivní imunita - protilátky jsou tvořeny proti strukturálním (pul32, pul83, pul80a) i ne strukturálním (pul57, pul44) proteinůin [21]. Jednoznačně nejdůležitější roli hrají cytotoxické lymfocyty. Antigeny jim musí být předkládány ještě před zahájením časné replikační fáze, ve které jsou virem tvořeny imunosupresivní, blokující proteiny, nebo musí být tyto antigeny k dispozici i v době, kdy nedochází k replikaci viru [22] Infekce CMV Cytomegalovirová mononukleóza Primární infekce CMV u imunokompetentního jedince většinou probíhá inaparentně, zřídka může vyvolat syndrom infekční mononukleózy. Onemocnění se projevuje horečkou, celkovou slabostí, bolestmi kloubů, hepatopatií. Faryngitida a tonzihtida je na rozdíl od EBV infekce ojedinělá. V periferní krvi je atypická lymfocytóza, polyklonální hypergamaglobulinémie. Mohou být přechodně pozitivní i antinukleámí protilátky. Komplikace v podobě intersticiální pneumorne, myokarditidy, perikarditidy, hemolytické anémie, trombocytopenie, artritidy, postižení gastrointestinálního traktu, těžké hepatitidy, meningoencefalitidy a Guillain-Barré syndromu jsou vzácné. Nejčastěji dochází k nákaze orofaryngeálními nebo genitálními sekrety, při těsnějším kontaktu v kolektivu, mezi partnery nebo v rodině. Je možná také nozokomiální nákaza transfuzí krevních derivátů. Tato infekce je někdy nazývána posttransfuzní nebo postperfuzní syndrom. Průběh bývá podobný infekční mononukleóze. Vgraviditě Až u 40% žen s primární infekcí v graviditě může dojít k přenosu infekce na plod, a to v jakékoli fázi gravidity. Desítky procent infikovaných žen vylučují CMV v mléce, vzácně v kolostru. Je-li CMV izolován z mléka, je riziko přenosu na dítě vysoké. Infekce CMV je vedoucí příčinou intrauterinních infekcí s incidencí kongenitálni infekce 0,5-2% zživě narozených dětí [17,18]. CMV infekce může 15

14 vyvolat multiorgánové postižení s následujícími klinickými projevy hepatosplenomegalií, protrahovaným novorozenec kým ikterem, trombocytopenickou purpurou, mikrocefalií, poškozením mozku včetně intracerebrálních kalcifikací, chorioretinitidou, mentální retardací, neurosenzorickou hluchotou, zpomalením růstu a vzácně s podezřením [15,21] intersticiální pneumonií z aspirace cervikovaginálního sekretu. Dítě z kongenitální infekce je sledováno pediatrem, event. infektologem. U imunokompromitovaných pacientů CMV infekcí jsou nejvíce ohroženi imunodeficientní jedinci. Patří k rum zejména pacienti po transplantacích a nemocní AIDS nebo primární buněčnou imunodeficiencí. U všech těchto pacientů je výrazně oslabená buněčná imunita, která je právě pro obranu proti CMV nejdůležitější: U HIV pozitivních pacientů CMV infekce HIV pozitivních pacientů je velmi častá, většina HIV pacientů je CMV serologicky pozitivních ještě před infekcí HIV. Nejčastěji se tedy jedná o reaktivaci latentní infekce. CMV onemocnění jednoznačně souvisí s celkovým počtem CD4+ lymfocytů, rozvíjí se u pacientů s méně než 50 CD4+ lymfocytů/mm3 [25]. Nejčastějším projevem CMV infekce u těchto pacientů je retinitida. Klinicky se projevuje obvykle jako ztráta zrakové ostrosti, provázená bolestí, způsobená krvácením do sítnice s následnou fibrózou a slepotou. Invazivní CMV infekce dále postihuje hlavně plíce, centrální nervový systém a gastrointestinální trakt. U nemocných po transplantacích Z transplantovaných jsou nejrizikovějšími pacienty seronegativní příjemci seropozitivního štěpu. Infekce seropozitivního příjemce - reinfekce nebo reaktivace - má většinou mírnější průběh. Riziko infekce je u těchto pacientů závislé na typu imunosuprese - vysoké je pří léčbě OKT3 protilátkami [26], na interkurentní bakteriální nebo virové (např. HHV6 infekci), na funkci štěpu - fulminantní CMV hepatitis se může rozvinout při rejekci transplantovaných jater, graft versus host (GVH) reakce kostní dřeně také zvyšuje riziko CMV infekce. Klinické projevy jsou 16

15 horečka, leukopenie, při orgánovém postižení - hepatitida, pneumonitida, pankreatitida, kolitida, meningoencefalitida, myokarditida, zřídka chorioretinitida. Časté je postižení štěpu, které může někdy vést k akutní či chronické rejekci [27]. Velmi důležité je proto monitorování virové nálože u pacientů po transplantaci, které umožňuje včasné zahájení léčby cytomegalovirové infekce Diagnostika Průkaz CMV infekce je možný mnoha metodami: kultivací a izolací viru, histologickým vyšetřením, serologickými metodami (v krvi a likvoru) - stanovením IgG, IgM protilátek, průkazem virového antigenu pp65 v leukocytech a průkazem virové DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) [23]. Přítomnost protilátek ve tříde IgM a IgA svědčí o akutně probíhající infekci. Imunoglobuliny ve třídě G jsou ukazatelem proběhlé infekce, přetrvávají v organismu celoživotně, i když mohou kousat. V samém začátku imunitní reakce mají protilátky IgG nízkou aviditu, tzn. že se s antigenem nevážou dostatečně pevně. Prokážeme-li tedy IgG protilátky o nízké aviditě, svědčí to pro čerstvou infekci. Naopak vysoká avidita svědčí o infekci již proběhlé. V současné době se v laboratořích využívají ELISA metody a nepřímá imunofluorescence. Nejcitlivějším průkazen CMV infekce vůbec je detekce virové DNA v krvi pomocí PCR. Množství viru v organismu většinou velmi dobře koreluje s klinickým průběhem onemocnění. Semikvantitativní nebo kvantitativní stanovení virových antigenů nebo DNA je proto v současnosti nejperspektivnější metodou. Při hodnocení výsledků je vhodné určit hranici klinicky významného množství viru. I u zdravých nosičů CMV dochází totiž k občasné reaktivaci a omezenému množení viru, které ale nezpůsobí manifestní onemocnění a nemá klinický význam [24]. Ke stanovení diagnózy CMV onemocnění je tedy při typických klinických známkách nutné prokázat přítomnost viru v or&anismu, nejlépe kvantitativně, nebo prokázat dynamiku serologické odpovědi. U imunosuprimovaných pacientů ale není serologická diagnostika spolehlivá. 17

16 2.7.6 Léč ba Léčba imunokompetentních jedinců je symptomatická. Existují terapeutické možnosti i chemoprofylaxe ve formě virostatik (gancic1ovir, foscarnet, cidofovir) a hyperimunních globulinů. Terapeutické možnosti dostupnými virostatiky jsou pro jejich závažné vedlejší účinky značně limitovány. Foscamet se pro svou výraznou nefrotoxicitu prakticky u osob s transplantovanou ledvinou nepoužívá stejně jako cidofovir. Gancic10vir s sebou přináší riziko myelosuprese, což jeho použití značně limituje především u dětských pacientů a rovněž zanedbatelná. [28]. i jeho nefrotoxicita není rozhodně Tato virostatika představují vedle specifického hyperimunního imunoglobuhnu a symptomatologické terapie jedinou možnost léčby závažných klinických manifestací infekce lidským cytomegalovirem. Z uvedených důvodů je proto velmi znepokojující v poslední době zaznamenaný nárůst CMV kmenů rezistentních vůči užívaným virostatikům. Experimentálně se zkouší podávání aktivovaných cytotoxických lymfocyid [28]. 2.8 Charakterizace virové rezistence na ganciclovir dané bodovými mutacemi v CMV fosfotransferáza genu UL97 Virová proteinkináza nazývaná také fosfotransferáza je specifický protein kódovaný genem UL97, čítajícím 2124 párů bazí, jehož kompletní nukleotidová sekvence je plně osekvenovaná a je plně přístupná v genetické bance GenBank (A Y ). Tato proteinkináza kódovaná UL97 genem je esenciální pro aktivaci gancic10viru na gancic10vir monofosfát, který je dále fosforylován na svou aktivní trifosfátovou formu buněčnými kinázami. Po vazbě gancic10viru na aktivní vazebné místo této specifické fosfotransferázy dochází k jeho fosforylaci. Alterací terciální struktury tohoto v~ebného místa dochází ke znemožnění vazby gancic10viru na tento enzym, což má za následek selhání léčby, neboť je znemožněna jeho aktivace. Tato změna struktury je dána substitucí aminokyselin uvnitř v řetězci této proteinkinázy, která je zapříčiněna bodovými mutacemi eventuelně delecí v UL97 genu kódujícího specifickou virovou fosfotransferázu. Rezistence vůči gancic10viru může být dále dána kombinací bodových mutací v UL97 a UL54 genu, přičemž v podstatě platí, že 18

17 citlivost vůči gancicloviru je silněji potlačena u virových kmenů vykazujících bodové mutace v obou výše jmenovaných genech [28,8]. 2.9 Charakterizace virové rezistence na virostatika dané bodovými mutacemi v CMV DNA polymerázy genu UL54 Mnohé specifické bodové mutace v UL54 genu kódujícím DNA polymerázu lidského cytomegaloviru jsou spojeny se sníženou citlivostí cytomegaloviru na antivirovou chemoterapii a v konečném důsledku s klinickým selháním léčby. Experimentálně byla hodnocena role mutací v UL54 genu v rezistenci na antivirovou chemoterapii na rekombinantních UL54 mutantních virových kmenech použitím kotransfekce devíti kritických CMV DNA fragmentů do permisivních fibroblastů. Citlivost těchto rekombinantních kmenů na antivirovou léčbu byla poté determinována konkrétními bodovými mutacemi ev. změnami sekvence odpovídající rezistenci na daná antivirotická agens [28]. aminokyselinové 2.10 Faktory bu něčné rezistence Na závěr je třeba zmínit možnost vzniku tzv. mnohočetné lékové rezistence. Mnohé klinické zkušenosti a pozorování, založené na in vitro studiích na experimentálních modelech, vypovídají o buněčných faktorech odpovědných za selhání antivirové terapie. Mechanismy buněčné rezistence vůči cytostatickým antineoplastikůid jsou dobře známy, jakožto důsledek dlouhodobé protinádorové chemoterapie. In vitro studie hovoří o analogii s protinádorovou chemoterapií, o vzniku tzv. mnohočetné lékové rezistence - MDR, buněčné rezistenci k celé řadě strukturálně různorodých léčiv, která může hrát roli v selhání dlouhodobé antivirové chemoterapii. MDR je typem tzv. pleiotropní rezistence, při níž dochází k urychlenému vypuzování cytostatika či jiného chemoterapeutického agens ven z buňky [28]. V budoucnu lze očekávat, především u onkologických pacientů, AIDS pacientů a v neposlední řadě i u transplantovaných pacientů a pacientů v imunosupresi, kteří jsou obvykle vystaveni dlouhodobému selektivnímu tlaku virostatik, nárůst buněčné mnohočetné lékové rezistence a proto lze počítat i s nutností monitoringu tohoto pro nás dosti nepříjemného fenoménu. V tomto směru mají velké 19

18 perspektivy molekulárně biologické metody, především metody založené na amplifikaci genetického materiálu jako např. per apod. [28]. 20

19 3. Cíl práce 1. Amplifikace genu UL97 lidského cytomegaloviru 2. StanoveIÚ virové rezistence na ganciclovir dané bodovými mutacemi v CMV fosfotransferáza genu UL97 21

20 4. Metody 4.1 Pacienti Bylo sledováno celkem 21 pacientů (po transplantaci kostní dřeně, plic a ledvin) a z toho 34 vzorků plné krve, 1 vzorek likvoru a 1 vzorek plasmy. 4.2 Izolace materiálu a amplifikace Izolace DNA Izolace DNA byla provedena ze vzorků plné krve, likvoru nebo plasmy pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) podle návodu výrobce per [29,30]. K amplifikaci části genu CMV UL-97 byly použity 2 sady primerů l.sada prime rů (amplifikuje produkt o velikosti 532 hp) primer CPT ' -acg gtg ctc acg gtc tgg at-3' primer CPT1619 5' -aaa cgc gcg tgc ggg tcg cag a-3' 2. sada primerů (amplifikuje produkt o velikosti 118 hp) primer CPT1713 5' -cgg tct gga cga ggt gcg cat-3' primer CPT1830M 5' -aat gag cag aca ggc gtc gaa gca gtg cgt gag ctt gcc gtt ctt-3 ' 22

21 následovně: Reakční směs pro polymerázovou řetězovou reakci byla připravena 32,4 f.!l H20 (Aqua pro injectione, Biotika, Slovenská Lupča, SR) 0,5 f.!l dntp (25 mm každý, deoxynuc1eotide set, Sigma) 0,3+0,3 f.!l primer 50 pmol/f.!l + primer 50 pmol/f.!l (sada 1 nebo sada 2) 1,5 f.!l Combi Taq polymeráza (hot-start, konc. 1 U/f.!l, Top-Bio, Praha, ČR) 10x reakční pufr bez MgCh (Top-Bio, Praha, ČR) MgCh (25 mm, Top-Bio, Praha, ČR) glycerol 50% původní izolovaná DNA (vzorek) Podmínky PCR [29,30] byly modifikovány a reakce PCR byla provedena dle následujícího programu na termocykleru Tgradient (Biometra): 95 C - 5 min :7 94,5 C - 30 s 59 C - 30 s 40x 72 C - 45 s 72 C - 5 min 4.3 Štěpe ní res tri.l<čními enzymy Bylo provedeno štěpení amplifikované DNA pomocí 3 různých restrikčních enzymů: 23

22 1) Produkt o velikosti 118 bp jsem štěpila enzymem TaqI (konc. 10 U/Ill, Fermentas) Štěpící místo 5' -ttcga-3' 3' -agcjt-5' ~ Štěpení tímto enzymem umožňuje odlišit mutaci v kodonu 595 2) Produkt o velikosti 118 bp jsem štěpila enzymem HhaI (konc. 10 U/Ill, Fermentas) Štěpící místo 5' -gcgtc-3' 3' -cj gcg-5' ~ Štěpení tímto enzymem umožňuje odlišit mutaci v kodonu 594 3) Produkt o velikosti 532 bp jsem štěpila enzymem Hin1II (konc. 5 U/Ill, Fermentas) Štěpící místo 5' -c a tg ~ -3' 3' -jgtac-5' ~ Štěpení tímto enzymem umožňuje odlišit mutaci v kodonu 460 Reakční směsi pro štěpení restrikčními enzymy byly připraveny následovně: 0,5 111 enzym (TaqI nebo HhaI nebo HinlII) 1,5 111.e 10x konc. pufr (pro TaqI 1 Ox pufr Taql, pro Hhal 10x pufr Tango, pro HinlII 10x pufr G, vše Fermentas) H 2 0 (Aqua pro injectione, Biotika, Slovenská Lupča, SR) izolovaná DNA (vzorek) 24

23 Štěpení probíhalo v případě enzymů HhaI a Hin1II při 37 C po dobu 16 hodin a u enzymu TaqI při 65 C po dobu 4 hodin. 4.4 Detekce pomocí agarózové elektroforézy Detekce produktů PCR reakce a následného štěpení byla provedena gelovou elektroforézou na agarózovém gelu (TopVision LE GQ Agarose, Fennentas) o koncentraci 4% (pro štěpení enzymy TaqI a HhaI) a 2% (pro štěpení enzymem HinlII) v 50% TBE pufru při napětí 9V lem. Do gelu bylo před nalitím do elektroforetické vaničky přidáno barvivo ethidium bromid v množství 0,05!ll/ml gelu (roztok ethidium bromidu 10 mg/ml, Vivantis, Malajsie). Po rozdělení molekul DNA na agarózovém gelu byly gely analyzovány a zdokumentovány pomocí dokumentačního systému Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 (Kodak Digital Science). 25

24 Štěpení probíhalo v případě enzymů HhaI a HinlII při 37 C po dobu 16 hodin a u enzymu TaqI při 65 C po dobu 4 hodin. 4.4 Detekce pomocí agarózové elektroforézy Detekce produktů PCR reakce a následného štěpení byla provedena gelovou elektroforézou na agarózovém gelu (TopVision LE GQ Agarose, Fermentas) o koncentraci 4% (pro štěpení enzymy TaqI a l-thai) a 2% (pro štěpení enzymem HinlII) v 50% TBE pufru při napětí 9V lem. Do gelu bylo před nalitím do elektroforetické vaničky přidáno barvivo etlůdium bromid v množství 0,05flVml gelu (roztok etlůdium bromidu 10 mg/ml, Vivantis, Malajsie). Po rozdělení molekul DNA na agarózovém gelu byly gely analyzovány a zdokumentovány pomocí dokumentačního systému Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 (Kodak Digital Science). 25

25 5. Experimentální část a výsledky 5.1 Amplifikace UL97 Při amplifikaci genu UL97 jsem vycházela z prací Chou S. and kol. [29,30]. Profil PCR jsem upravila pro naše podmínky. K tomu jsem provedla několik experimentů s využitím gradientu na PCR cykleru. Nakonec jsem pro naše podmínky modifikovala a optimalizovala výchozí profil reakce tak,jakje uvedeno v kapitole 4. Použila jsem dvě sady primerů. 1. sada primerů (CPT1088, CPT1619) amplifikuje produkt o velikosti 532 bp. 2. sada primerů (CPTI713, CPTI830M) amplifikuje produkt o velikosti 118 bp. Amplifikace s 1. sadou primerů a 2. sadou primerů se prováděla v oddělených reakcích. Zároveň jsem stanovila přibližnou citlivost obou amplifi kačních metod. Vycházela jsem z izolátu DNA, který obsahoval známé množství kopií CMY (stanoveno Dr. Hubáčkem v laboratoři molekulární genetiky Pediatrické kliniky 2.LF UK). Citlivost metod je uvedena v tab. 5.1, z které vyplývá, že citlivost 1. sady primerů je přibližně 100 kopií CMY/fll izolované DNA a u 2. sady primerů je to 50 kopií CMY /fll izolované DNA. tab. 5.1 primery CPTI088, primery CPT1713, kopie CMY/fll CPT1619 gel. elfo 532bp CPT1830M gel. elfo 118bp

26 5.2 Databáze pac i entů a vzorků Jak už bylo uvedeno v metodách, laboratorní část celé práce vychází z databáze pacientů, kde bylo sledováno celkem 21 pacientů a z toho bylo vyšetřeno celkem 36 vzorků. Bylo to 34 vzorků plné krve (v EDTA), 1 vzorek plasmy a 1 vzorek likvoru, odebírané v časovém období od dubna 2002 do března Jedná se o pacienty, u kterých byl v krvi prokázán CMV, byli ohroženi cytomegalovirovou infekcí a byli léčeni gancic1ovirem. Vzorky byly průběžně izolovány a zamraženy (odd. virologie, Ústav lékařské mikrobiologie 2.LF UK) a zároveň u nich byla stanovena virová nálož CMV (lab. molekulární genetiky Pediatrické kliniky 2.LF UK). Souhrn: - 14 pacientů (DĚTI) po transplantaci kostní dřeně (TKD) - 24 vzorků (Klinika dětské hematologie a onkologie 2.LF UK) - 4 pacienti (DOSPĚLÍ) po transplantaci kostní dřeně (TKD) - 6 vzorků ( Ústav hematologie a krevní transfúze, ÚHKT) - 2 pacienti (DOSPĚLÍ) po transplantaci plic - 5 vzorků (Hr. chirurgická klinika 1.LF UK) - 1 pacient (DÍTĚ) po transplantaci ledviny - 1 vzorek (Pediatrická klinika 2.LF UK)... 27

27 5.3 Produkty štěpení Vzorky izolované DNA jsem amplifikovala s oběmi sadami primerů. Produkt o velikosti 118 bp jsem štěpila restrikčními endonukleázami TaqI a Hhal. Štěpením vznikly následující produkty: Taql (mutace v kodonu 595): L595S ~ TTG kódující Leu-wild kmen CMV - gancic10vir senzitivní ~ TCG kódující Ser- gancic10vir rezistentní kmen CMV za vzniku štěpícího vzorce: Senzitivní (wild): 99bp + 19bp Rezistentní: 71bp + 28bp+ 19bp Uhal (mutace v kodonu 594): A594V ~ GCG kódující Ala - wild kmen CMV- gancic10vir senzitivní ~ GTG kódující Val- gancic10vir rezistentní kmen CMV za vzniku štěpícího vzorce: Senzitivní (wild): 50bp + 38bp + 18bp + 12bp Rezistentní: 62bp + 38bp + 18bp Produkt o velikosti 532 bp jsem štěpila restrikční endonukleázou HinlII. Štěpením vznikly následuj ící produkty: HinlII (mutace v kodonu 460): M460V ~ ATG kódující Met - wild kmen CMV- gancic10vir senzitivní ~ GTG kódující Val- gancic10vir rezistentní kmen CMV nebo M4601 ~ A TG kódující Met - wild kmen CMV - gancic10vir senzitivní ~ ATT kódující Ile - gancic10vir rezistentní kmen CMV za vzniku štěpícího vzorce: Senzitivní (wild): 198bp + 168bp + 126bp + 40bp Rezistentní: 324bp + 168bp+ 40bp 28

28 5.4 Hodnocení výs l edk ů ~ Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 5.2 a 5.3 Tabulka 5.2 zahrnuje dětské pacienty po transplantaci kostni dřeně a jednoho pacienta po transplantaci ledviny. Rezistence byla prokázána u pacienta číslo šest u vzorků 8 a 9 po štěpení restrikčnim enzymem HhaI (obr. 5.1). U obou vzorků se jedná o směs rezistentního a senzitivního kmene, přičemž u vzorku 8 převládá rezistentni kmen. Dále byla mutace způsobující rezistenci zjištěna u pacienta číslo třináct, a to u vzorků 21, 22 a 23 štěpených restrikčním enzymem TaqI (obr. 5.2). U vzorku 21 se jedná o směs senzitivního a rezistentniho kmene, kdy s postupem času na základě selektivniho tlaku byl původně senzitivni kmen vytlačen kmenem rezistentním. Tabulka 5.3 zahrnuje dospělé pacienty po transplantaci kostni dřeně a plic. Rezistence byla nalezena u pacienta číslo šestnáct u vzorků 26, 27 a 28 po štěpení restrikčním enzymem TaqI (obr. 5.3). U vzorku 26 byla prokázána směs rezistentniho a senzitivniho kmene. Dále jsem potvrdila přítomnost rezistentniho kmene CMV u pacienta po transplantaci plic číslo restrikčním enzymem T aqi. dvacet, a to u všech jeho vzorků, také po štěpeni U žádného ze vzorků jsem neprokázala rezistenci v kodonu 460 (štěpení enzymem Hinll1). Pro úplnost uvádím obrázek (obr. 5.4), na kterém je vidět štěpené produkty senzitivního kmene CMV (kodon 460). 29

29 5.5 Tabulky a obrázky Tab. 5.2 Dět.~tí pacienti po TKD a po Tx ledviny č.pac. v c.vz CMV/1l1 Dg. doba Taq Hha Hin od b ěru 1. pacient TKD S S S 2. pacient TKD S S S TKD S S S 3. pacient TKD S S S 4. pacient TKD S S S 5. pacient TKD S S S TKD S S S 6. pacient TKD S R+S S TKD S R+S S 7. pacient TKD S S S 8. pacient ll TKD S I S S 9. pacient TKD S S S 10. pacient TKD S S S 11. pacient TKD S S S 12. pacient TKD S S S TKD S S S I TKD S S S I TKD S S S I TKD S S S 13. pacient TKD S S S likvor TKD S+R S S TKD R S S pasma TKD R S S 14. pacient TKD S S S 15. pacient Tx S S S I ledviny T a b D ospe T 1 paclen. ť 1 po TKD (UHKT) apo T Xp41C r č.pa c. č.vz CMV/1l1 Dg. doba Taq Hha Hin I odběru 16. pacient TKD R+S S S TKD R S S TKD R S S 17. pacient TKD S S S 18. pacient TKD S S I S 19. pacient TKD S S S 20. pacient Tx plic R S S Tx plic R S S I Tx plic R S S Tx plic R S S 21. pacient Tx plic S S S.. s = ganciclovlf senzitivní kmen CMV, R = ganciclovu rezistentní kmen CMV 30

30 L1 L2 118 bp ' ~--34 Obr. 5.1 Obrázek agarózového gelu. Jako srovnávací vzorek byl nanesen standard "DNA Ladder " obsahující fragmenty o známých molekulových hmotnostech. Vzorky byly pipetovány v tomto pořadí (zprava): vzorky standardu Ll a L2, vzorky štěpené Hha! (mutace v kodonu 594) - vzorek Č. 8, vzorek Č. 9, vzorek Č. 10, vzorek Č. 11, vzorek Č. 12, vzorek Č. 13. Vzorek č. 8 a 9 představují sm ěs senzitivního e rezistentního kmene, zbývající vzorky představují senzitivní kmen. 31

31 L1 š n n š n L2 bp bp Obr. 5.2 Obrázek agarózového gelu. Jako srovnávací vzorek byl nanesen standard "DNA Ladder " obsahující fragmenty o známých molekulových hmotnostech. Vzorky byly pipetovány v tomto pořadí (zprava): vzorek standardu L2, neštěpený vzorek č. 21, štěpený vzorek č. 21, neštěpený vzorek č. 23, štěpený vzorek č. 23, neštěpený vzorek č. 24, štěpený vzorek č. 24, vzorek standardu Ll. Vzorky byly štěpeny enzymem TaqJ (mutace v kodonu 595). U vzorku 21 je vidět směs rezistentního a senzitivního kmene, u vzorku 23 je vidět rezistentní kmen a u vzorku 24 je vidět senzitivní kmen. 32

32 '. 29 L1 š n 26 š n š 25 n L2 bp ' bp Obr. 5.3 Obrázek agarózového gelu. Jako srovnávací vzorek byl nanesen standard "DNA Ladder" obsahující fragmenty o známých molekulových hmotnostech. Vzorky byly pipetovány v tomto pořadí (zprava): vzorek standardu L2, neštěpený vzorek č. 25, štěpený vzorek č. 25, neštěpený vzorek č. 26, štěpený vzorek č. 26, neštěpený vzorek č. 29, štěpený vzorek č. 29, vzorek standardu Ll. Vzorky byly štěpeny enzymem Taq! (mutace v kodonu 595). U vzorku 26 je vidět směs rezistentního a senzitivního kmene. Vzorky 25 a 29 představují senzitivní kmen. 33

33 š n L bp ' Obr. 5.4 Obrázek agarózového gelu, Jako srovnávací vzorek byl nanesen standard "DNA Ladder" obsahující fragmenty o známých molekulových hmotnostech. Vzorky byly pipetovány v tomto pořadí (zprava): vzorek standardu L, neštěpený vzorek č. 20, štěpený vzorek č. 20, štěpené vzorky Č, 22, 27, 31, 28. Vzorky byly štěpeny enzymem Hinl II (mutace v kodonu 460). Všechny vzorky představují senzitivního kmen CMV. 34

34 6. Diskuse Většina údajů o vzniku mutantních kmenů CMV rezistentních k gancicloviru pochází od pacientů koinflkovaných HIV a CMV, i když se zavedením účinné antiretrovirové terapie (HAART) počet pacientů s AIDS inflkovaných současně CMV význanmě poklesl [31,32]. Nicméně vzrůstá počet údajů o vzniku ganciclovir rezistentních kmenů CMV u pacientů po transplantaci, kteří jsou často podrobeni dlouhodobé profylaktické nebo preemptivní terapii tímto preparátem, což může vést k selektivnímu tlaku na vznik právě těchto rezistentních mutant [33,34, 35]. V této práci jsem se zaměřila na 3 bodové mutace genu UL97 (v kodonu 460, 594 a 595), které jsou dle literárních údajů nejčastější příčinou rezistence CMV k gancicloviru. Detekovala jsem 4 rezistentní kmeny u 4 pacientů (3x mutace v kodonu 595, lx mutace v kodonu 594). Z toho vyplývá, že zavedená metoda je vhodná k detekci mutantních kmenů CMV (rezistentních k gancicloviru). Je potřeba ovšem uvést, že tři uvedené mutace jsou nejdéle známé a jsou také uváděny za nejčastější příčinu vzniku rezistentních mutant, nicméně nyní je popsána celá řada jiných mutací, jako například mutace v kodonu 520, v kodonech Rovněž může docházet k deleci části genomu uvnitř genu UL97, např. k deleci kodonu , ke které došlo u původního prototypového kmene gancic10vir rezistentního CMV a toto vedlo původně k objevu genu UL97 jako genu fosfotransferázy [8, 36, 37]. Kromě zvolené metody založené na štěpení konkrétního amplikonu restrikčními endonukleázami existuje ještě fenotypová metoda založené na míře inhibice růstu izolátu CMV na tkáňové kultuře. Tato metoda je ale velmi zdlouhavá, pracná a pro klinické použití málo vhodná. Testovaná genotypová metoda je relativně rychlá, méně pracná, ale neumožňuje současné zachycení všech možných mutací ovlivňujících rezistenci C~V na gancic1ovir. Tato metoda je jistě použitelná a vhodná k rychlému screeningu zvolených nejčastějších mutací. V současné době s rozvojem přístrojové techniky se stále více uplatňuje analýza DNA pomocí sekvenování, která wnožňuje získat detailní informaci o sledovaném úseku genomu. Rovněž rozvoj čipové technologie může zjednodušit a urychlit detekci rezistentních mutant CMV [36, 38]. 35

35 7. Závě r Podařilo se mi amplifikovat dvě různé části genu cytomegaloviru UL97 (gen pro fosfotransferázu). Reakci PCR, ve které k amplifikaci dochází, jsem modifikovala a optimalizovala pro naše podmínky. V zniklé amplifikační produkty j sem potom štěpila třemi různými restrikčními endonukeázarni. Podle štěpného vzorce jsem potom mohla stanovit, zda se jedná o CMV senzitivní nebo rezistentní mutantu k účinku gancic1oviru. Ve sledovaném souboru pacientů a vzorků se mi podařilo identifikovat rezistentní mutantu v kodonu 594 (štěpení enzymem HhaI) a 595 (štěpení enzymem TaqI). V kodonu 460 (štěpení enzymem HinlII) se mi nepodařilo rezistentní mutantu objevit. Metoda je vhodná k rychlému stanovení nejčastějších gancic10vir rezistentních mutant lidského cytomegaloviru. 36

36 8. Seznam použité literatury 1. Alberts B, Bray D, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Základy buněčné biologie, Úvod do molekulární biologie buňky. Espero Publishing, 1998; kapitola Šmarda J, Doškar J, Pantíček R, Růžičková V, Kostíková J. Metody molekulární biologie. Brno, kapitola I-V; Pavlík E. Molekulárně biologické techniky pro mikrobiologickou diagnostiku. Labor Aktuell, kapitola 1., Kočárek E. Genetika. Praha, Karolinum Kočárek E, Pánek M, Novotná D. Klinická cytogenetika I., Vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. Praha, Karolinum Mackay I. M. Real-time PCR in the mikrobiology laboratory. Clin Microbiol Infect 2004; 10: Call D, Bakko M, Krug M, Roberts M.Identifying antimicrobial rezistence genes with DNA microarrays. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: Drew WL, Paya CV, Emery V. Cytomegalovirus (CMV) Rezistence to Antiviral. Američan Journal oftransplantation 2001;1: Baron EJ. lmplication of New Technology for Infectious Diseases Practice. CID 2006; 43: Fawley WN, Wi1cox MB. Molecular diagnostic techniques. Medcine Publishing Copany 2005; 33:3 ll Stinski MF. Cytomegalovirus and its replication In: Fields BN, ed. Virology-2nd ed. New York: Raven Press, 1990; Mocarski ES. Cytomegaloviruses and their replication ln: Fields BN ed. Fielďs Virology, Lippincot-Raven, 1996; Goodpasture EQ, Talbot FB. Concerning the nature "protozoan-like" cells II certain lesions ofinfancy. Am J Dis Child 1921; 21:

37 15. Delong MD, Galasso Gl, Gazzard B, Griffiths PD, labs Dl, Kern ER, Spector SA. Summary of the II international Symposium on cytomegalovirus. Anivir Res 1998; 39: Forbes BA. Acquisition of cytomegalovirus infection: An update. Clin Microbiol Rev 1989; 2: Alford CA, Stagno S, Pass RF, Britt Wl. Congenital and perinatal cytomegalovirus infections. Rev lnfect Dis 1990; 12: Fowler KB, Stagno S, Pass RF. Materna1 age and congenital cytomegalovirus infection: Screening of two di verse newborn populations. 1 Infect Dis 1993; 168: De-la Sema-Higuera S, Gonzales-Garcia M, Milicua 1M, Munoz V. Acute cholestatic hepatitis by cytomegalovirus in an immunocompetent patient resolved with ganciclovir. 1 Clin Gastroenterol 1999; 3: Yow MD, White NH, Taber LH. Acquisition of cytomegalovirus infection from birth to 10 years: A longitudinal study. 1 Pediatr 1987; 110: Lazarotto T, Varani L, Gabrielli P, Spezzacatena MP, Landini MP. New advances in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. lntervirology 1999; 42: Reddehase M. The immunogenicity of human and murine cytomegaloviruses. Curr Opinion lmmunol2000; 12: Van der Meer lt, Drew WL, Bowden RA, Galasso Gl, Griffiths PD, labs DA, Katalana C, Specrtor SA, Whitley Rl. Summary of the International Consensus Symposium on Advances in the Diagnosis, Treatment and Prophylaxix of Cytomegalovirus lnfection. Antiviral Res 1996; 32: II ~ Michaelson S. Human cytomegalovirus escape from unmune detection. lntervirology 1999; 42: Gallant JE, Moore RD, Richman DD, Keruly 1, Chaisson RB. Incidence and natura1 history or cytomegalovirus disease in patients with advanced human immunodeficiency virus disease treated with Zidovuline. 1 lnfect Dis 1992; 166: Portela D, Patel R, Larson-Keller 11, llstrup DM, Wiesner RH, Steers ll, Krom RA, Paya CV. OKT3 Treatment for allograft rejection is risk factor for cytomegalovirus disease in liver transplantation. 38

38 27. Poutreil-Noble C, Ecochard R, Landrivon G. Cytomegalovirus infection - an etiological factor for rejection? A prospective study in 242 renal transplant recipients. Transplantation 1993; 55: Psohlavec J, Forstl M, Horáček J, Forstlová J. Molekulárně biologické aspekty selhání antivirové terapie infekcí lidským cytomegalovirem (CMV, HCMV, HHV 5). Klin mikrobiol inf lék 2000;6(5): Chou S, Guentzel S, Michels KS, Miner RC, Drew WL. Frequency of UL97 Phosphotransferase Mutations Related to Ganciclovir Resistence in Clinical Cytomegalovirus Isolates. The Journal of Infectious Diseases 1995; 172: Chou S, Erice A, Jordan MC, VerceUoti GM, Michels KR, Talarico ChL, Stanat SC, Biron KK. Analysis of the UL97 Phosphotransferase Coding Sequence in Clinical Cytomegalovirus Isolates and Identification of Mutations Conferring Ganciclovir Resistence. The Journal oflnfectious Diseases 1995; 171 : Erice A. Resistence of human cytomegalovirus to antiviral drugs. Clin.Microbiol. Rev. 1999; 12: Drew WL. Cytomegalovirus disease in the highly active antiretroviral therapy era. Curr.Infect.Dis.Rep. 2003; 5(3): Wolf DG, Lurain NS, Zuckennan T, Hoffman R, Salinger J, Honigman A, Saleh N, Robert ES, Rowe JM, Kra-Oz Z. Emergence of late cytomegalovirus central nervous system disease in hematopoietic stem cell transplant recipients. Blood 2003; 101: Springer KL, Chou S, Li S, Miller RB, Quinones R, Shira JE, Weinberg A. How evolution of mutations conferring drug resistence affects viral dynamics and clinical outcomes of cytomegalovirus-infected hematopoietic cell transplant recipients. J.Clin.Micorbiol. 2005; 43: Limane AP. Ganciclovir-resistant cytomegalovirus in organ transplant recipients. Clin.lnfect.Dis. 2002; 35: Emery VC. Cytomegalovirus drug resistence. Antivir.Ther. 1998; 3: Chou S, Waldemar R.H., Senters AE, Michels KS, Kemble W, Miner RC, Drew WL. Cytomegalovirus UL97 phosphotransferase mutations that affect susceptibility to ganciclovir. J.Infect.Dis. 2002; 185: Chou S. Antiviral drug resistence in human cytomegalovirus. Transpl.lnfect.Dis. 1999; 1:

39 9. Př il ohy [AJ Amplifikace DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (per):, t J / ;;,, -... /' ~ ".. ~:: Q <:: '".-/ ~ ~ :: 'Č 40