Laboratorní diagnostika alergií

Transkript

1 Laboratorní diagnostika alergií Laboratory diagnosis of allergy IVO LOCHMAN 1, FRANTIŠEK KOPŘIVA 2, EVŽEN WEIGL 3, PETR PANZNER 4 1 Odbor imunologie a alergologie ZÚ se sídlem v Ostravě 2 Dětská klinika LF UP a FN Olomouc 3 Ústav imunologie LF UP Olomouc 4 Ústav imunologie a alergologie LF UK a FN Plzeň SOUHRN Laboratorní testy mají v diagnostice alergických onemocnìní a monitorování alergenové imunoterapie dùležité, ale vymezené postavení. V èlánku je diskutována problematika testù pro stanovení alergen-specifických imunoglobulinù, testù využívajících zjišśování aktivace bazofilù periferní krve po stimulaci alergenem (bazotestù, testù mìøících uvolòování histaminu a CAST), testù na monitorování pomìru Th 1 a Th 2 odpovìdi po alergenové stimulaci i testù na stanovení vybraných biologicky aktivních látek podílejících se na prùbìhu alergické reakce (ECP, tryptáza, histamin). Je upozornìno na význam standardizace alergenù používaných v tìchto testech a na význam autoprotilátek, které vznikají pøedevším v prùbìhu dlouhotrvajících a intenzivních alergických reakcí. Klíèová slova: alergie, laboratorní diagnostika, alergen-specifické Ig, bunìèné (biologické) testy SUMMARY Laboratory tests are of important but limited value in allergy diagnosis and monitoring of allergen immunotherapy. Questions linked with application of these tests for allergen-specific immunoglobulin determination, allergen-induced basophile activation (basotests, histamine-release tests and CAST), tests for monitoring of Th 1 and Th 2 response after allergen challenge and the assessment of selected allergyassociated substances (ECP, tryptase, histamine) are discussed. Importance of allergen standardization for laboratory measures and autoantibodies produced in severe allergies and under long-term allergen challenge is also discussed. Key words: allergy, laboratory diagnosis, allergen-specific Ig, cellular (biological) tests Alergie je klinická reakce pøecitlivìlosti navozená imunologickými mechanismy. Pøecitlivìlost (hypersenzitivita) je pøíèinou reprodukovaných pøíznakù nebo projevù, které jsou spouštìny kontaktem s definovaným podnìtem v dávkách, na které normální jedinci nereagují. Projevy alergické reakce však mùže mít u postižených jedincù také hyperreaktivita, která je definována jako pøehnaná reakce na normální podnìt. Pokud je alergická reakce zprostøedkována protilátkami, patøí ve vìtšinì pøípadù tyto protilátky do tøídy IgE. Sklon ke tvorbì IgE protilátek se nazývá atopie. Antigeny, které vyvolávají alergii, jsou oznaèovány jako alergeny (1,13). Alergická reakce je složitý, komplexní dìj, na jehož konci dochází k uvolnìní biologicky aktivních látek z žírných bunìk tkání a bazofilù periferní krve do tìlních tekutin. Ty pak aktivují prostøednictvím pøíslušných receptorù (napø. histaminové receptory H1-H4) další buòky tkání, což vede vìtšinou k patofyziologickým projevùm, které alergickou reakci provázejí (obr. 1) (2,3). Jen èást alergických reakcí je zprostøedkována pøes alergen-specifické IgE navázané na vysokoafinitní receptory žírných bunìk a bazofilù Fc ε RI (obr. 2). Faktory, které mohou zpùsobovat uvolòování histaminu (histamine releasing factors HRF), jsou velice heterogenní skupinou látek pùsobících rùznými mechanismy, èasto ve vzájemné kooperaci. Patøí mezi nì i øada cytokinù. Reaktivita a obsah granulí žírných bunìk rùzných tkání a bazofilù se mùže výraznì lišit a mùže být ovlivòována také prostøedím, v nìmž se tyto buòky nacházejí (4,5). Pro rutinní in vitro diagnostiku v medicínì jsou prakticky dostupné pouze bazofily získané z periferní krve. Proto i in vitro diagnostika v alergologii má jen vymezené místo a laboratorní metody patøí mezi vyšetøovací metody první volby alergologa jen v omezeném množství pøípadù (6). Pokud je to možné, jsou v alergologické diagnostice 51

2 pøi hledání alergenu, který u pacienta vyvolává alergickou reakci, upøednostòovány kožní testy. Laboratorní testy používané v diagnostice alergií v medicínì mùžeme rozdìlit na bunìèné a humorální (tab. 1). V praxi výraznì pøevažuje využívání testù humorálních a mezi nimi pøedevším stanovování celkového a spec. IgE (tab. 2). Pøitom zvláštì u chronických alergií a pøi posuzování úspìšnosti alergenové imunoterapie jsou stále èastìji doporuèovány a budou se jistì stále více uplatòovat testy stanovující také celkové IgG (8). Komerèní nabídka diagnostik pro stanovování alergen-specifických IgG je však zatím nesrovnatelnì užší než pro stanovování alergen-specifických IgE. Zdá se ale, že stanovování spec. IgG zaène postupnì nacházet uplatnìní pøedevším pøi monitorování alergen-specifické imunoterapie (ASIT). Pøínos stanovování koncentrace alergen-specifických protilátek v podtøídì IgG4, které bývá využíváno pøedevším pro monitorování pomìru Th 2 a Th 1 odpovìdi u nìkterých typù alergií, nebyl zatím jednoznaènì prokázán, a proto bývá využíván jen zøídka (25). Pøi stanovování sp. IgE je nutno mít na pamìti, že alergeny jsou vìtšinou antigeny proteinové povahy. Tak jako na každé proteinové antigeny, i na alergeny je po jejich delším intenzivnìjším pùsobení v organismu vytváøena protilátková odpovìï ve tøídì IgG, pøedevším pak v podtøídách IgG1 a IgG4. Platí to i pro atopiky, kteøí mají tendenci odpovídat alespoò na nìkteré antigenní podnìty ve zvýšené míøe ve tøídì IgE. Protilátky ve tøídì IgG a u potravinových alergenù i ve tøídì IgA, jsou však produkovány v mnohem vyšších koncentracích než protilátky ve tøídì IgE a mohou vážnì interferovat pøi jejich stanovování (tab. 3) (7). Proto by mìly být pro stanovování alergen-specifických IgE preferovány tzv. capture techniky, u nichž je na imunosorbent v prvním kroku vyvazováno veškeré IgE ze vzorku a v dalších krocích tak eliminován vliv imunoglobulinù v ostatních Ig tøídách. Ve standardních imunosorpèních vnější prostředí mechanické bariéry vnitřní prostředí cílové buňky pro alergen biologicky aktivní mediátory cílové buňky pro mediátory alergeny, fyzikálně chemické vlastnosti sliznice RT, GIT, UGT, kůže, oko, ucho tkáně a tkáňové tekutiny obsahující mj. i Ig žírné buňky, bazofily, dendritické buňky a jiné buňky s receptory pro alergen, včetně IgE receptorů histamin, heparin, hydrolázy, neutrální proteázy, ECP, chemotaktické faktory, sekundárně i LT, cytokiny aj. buňky tkání s receptory, např. H1 H4 receptory pro histamin Obrázek 1: Schéma reakce okamžité pøecitlivìlosti HRF reakce do 5 10 min. reakce do 1 min. závislé na IgE nezávislé na IgE např. MCP-1, fmpl bez přímé vazby na IgE vázající se na IgE každé IgE (IgE i IgE + ) aktivující faktory IL3, IL5, rhrf p23 podskupina IgE (IgE + ) (polymer., glykosyl. IgE?) aktivující faktory IL3, IL5, rhrf p23 podskupina IgE (IgE + ) alergeny každé IgE autoanti-ige, CD23, lektiny: εbp glykosylované IgE lektiny a ostatní faktory IgE autoprotilátky tj. AG mn, cyclofiliny, profiliny Obrázek 2: Faktory vyvolávající uvolòování histaminu (histamine-releasing factors HRF) Zpracováno podle (4). MCP-1 = monocytární chemotaktický protein 1, fmpl = N-formylmethionyl-leucyl-alanin tripeptid s chemotaktickými účinky produkovaný mnoha bakteriemi, IgE + = IgE, které zprostředkovává odpovídavost na HRF, IgE = IgE, které neindukuje odpověď na HRF; liší se strukturálně od IgE +, rhrf p23 = rekombinantní HRF, Ag mn = autoantigeny produkované mononukleáry. 52

3 Tabulka 1: Pøehled laboratorních testù využívaných v diagnostice alergií 1. Testy provádìné ze séra nebo plazmy vyšetøovaného jedince stanovení celkového IgE stanovení alergen-specifických imunoglobulinù (IgE, IgG, IgG4) stanovení ECP, tryptázy aj. mediátorù alergického zánìtu 2. Bunìèné testy využívající bazofilù vyšetøovaného jedince bazotesty (exprese aktivaèních znakù CD63 nebo CD203c) testy mìøící uvolòování histaminu z alergen-stimulovaných bazofilù testy mìøící uvolòování leukotrienù z alergen-stimulovaných bazofilù 3. Degranulaèní testy využívající alogenní nebo xenogenní bazofily nebo žírné buòky 4. Testy na mìøení Th 1 a Th 2 odpovìdi leukocytù testovaného jedince po stimulaci alergenem stanovení aktivace mrna pro vybrané cytokiny po stimulaci leukocytù testovaného jedince alergenem stanovení vybraných cytokinù charakteristických pro Th 1 (napø. IFNγ, IL12, TNFα) a Th 2 (napø. IL4, IL5, IL10, IL13) odpovìï po stimulaci leukocytù testovaného jedince alergenem technikách je alergen vázán pøímo na imunosorpèní povrch a po pøidání vzorku o nìj soutìží imunoglobuliny všech tøíd. Mezi standardními imunosorpèními technikami tak mají logicky výhodu ty techniky, které dokážou na sorbent navázat co nejvìtší množství alergenu. V tomto smìru dominuje z komerènì dostupných diagnostických systémù CAP systém firmy Pharmacia (9). Pro stanovování alergen-specifických imunoglobulinù se zaèínají stále více uplatòovat tzv. multiplexové metody, tj. metody, které stanovují nìkolik analytù v jednom reakèním objemu (jedné reakèní komùrce, na jedné reakèní ploše). Tyto metody jsou dnes již propracovány tak, že svou kvalitou a vypovídací hodnotou jsou produkty øady výrobcù srovnatelné s dnes klasicky používanými ELISA technikami. V rutinní praxi jsou nejèastìji používány tzv. line nebo dot metody, které dovolují stanovit až 30 alergen- -specifických protilátek na jednom proužku v pøíslušných tøídách RAST. Otázkou zùstává indikace a ekonomika takovéhoto vyšetøení, ponìvadž spektrum a poèet alergenù na jednom proužku je dán. Tuto nevýhodu by mohly odstranit metody založené na mikroèásticích vyhodnocované pomocí speciálnì upraveného prùtokového cytometru, které navíc potøebují ke stanovení až 100 protilátkových specifièností jen 50 µl séra ( Je otázkou, nakolik se v laboratorní alergologické diagnostice Tabulka 2: Statistika stanovování vybraných laboratorních alergologických vyšetøení v ÈR kód výkonu název výkonu frekvence vykázaných výkonù za rok 2003 VZP indikováno všemi odbornostmi indikováno odborností 207 poèet výkonù poèet bodù poèet výkonù poèet bodù celkové IgE celkové IgE FEIA sp. IgE potrav. alergeny sp. IgE inhal. alergeny sp. IgE jedn.alergeny FEIA sp. IgE smìsi FEIA sp. IgG4 potrav.alergeny sp. IgG4 inhal.alergeny sp. IgG4 jedn.alergeny FEIA IgA potravinové alergeny IgG potravinové alergeny IgM potravinové alergeny IgG inhalaèní alergeny ECP FEIA Histamin po stim. alergenem celkem Tabulka 3: Vazebné a koncentraèní pomìry metod pro stanovení spec. IgE pevná fáze vazebná kapacita pro antigen 1 (pmol) množství aplikovaného Ig 2 (pmol) medián a rozsah pomìr koncentrací IgE/IgG 2 medián a rozsah bìžný plast upr. papírový disk CAP ,016<0,002 9,1 19, , , ,295 1 Uvedeno podle údajů v práci (9) pro IgG jako antigen, 2 uvedeno podle naměřený dat v práci (7). Předpokládá se, že do reakce je aplikováno 50 μl vzorku. 53

4 uplatní microarraye, které by ve své pùvodní podobì mìly být konstruovány pro analýzu stovek až tisícù specifièností na jedné reakèní ploše. Stanovování biologicky aktivních látek typu histaminu, tryptázy, eosinofilního katonického proteinu (ECP), interleukinù a dalších v periferní krvi má v praxi jen omezený význam. Vìtšina z tìchto látek se totiž chová jako lokální hormony, tzn., že jsou z tìlních tekutin se vzrùstající vzdáleností od místa produkce velmi rychle odstraòovány nebo je alespoò eliminována jejich aktivita. Jejich zvýšené koncentrace v celém organismu by mohly zpùsobit výrazné porušení homeostázy, které by mohlo vést až k jeho zhroucení. Výjimku tvoøí tryptáza, která je významným markerem aktivace žírných bunìk (ne bazofilù), která se sice v krvi objevuje ve zvýšené koncentraci až mezi min. po stimulaci organismu alergenem, ale pøetrvává v krvi výraznì déle než histamin, je stabilní a mùže být použita k monitorování anafylaktické reakce i nìkolik hodin po interakci s alergenem, dokonce i post mortem (23,24). Pøi interpretaci výsledkù stanovení alergen-specifických Ig musíme mít na pamìti, že výsledky získané s diagnostiky rùzných producentù se mohou lišit. Nakonec podobnì je tomu i u kožních testù. Alergeny, bìžnì používané v diagnostice, jsou totiž jen více nebo ménì purifikované extrakty jejich zdrojù (pylù, døevin, prachu, roztoèù, bakterií apod.), které se mohou svým chemickým složením a biologickou reaktivitou velmi lišit, i když jsou stejnì oznaèovány. Aby se zaruèila alespoò èásteèná reprodukovatelnost jejich úèinkù u rùzných výrobcù a šarží jednotlivých diagnostických testù a léèebných preparátù, provádí se jejich standardizace. Ta mùže být buï fyzikálnì-chemická nebo biologická. Fyzikálnì-chemická standardizace je založena na koncentraèním stanovení vybraných komponent alergenu (celková navážka, celková bílkovina, bílkovinný dusík apod.) a zastoupení jednotlivých frakcí alergenù v elektroforetogramu. K identifikaci hlavních a pøedevším rekombinantních alergenù bývají dnes stále èastìji používány blotovací techniky a za tím úèelem pøipravené monoklonální protilátky. Nejèastìji je však prùkaz konkrétních alergenových komponent v elektroforeticky rozdìleném alergenu provádìn pomocí smìsného séra s obsahem sp. IgE protilátek blotovacími technikami. Biologická standardizace spoèívá v in vivo testování alergenu kožními testy u skupiny vybraných jedincù s definovanou alergií (10,11). V praxi bývají rùzné zpùsoby standardizace èasto smìšovány a zamìòovány, což vede k zbyteèným nedorozumìním. I tak však lze øíci, že standardizace pøirozených alergenù získaných extrakcí z rùzných alergenních zdrojù nemùže být nikdy dokonalá a že vždy budou nalézány rozdíly mezi výsledky získanými s alergeny dodávanými pod stejnými názvy rùznými výrobci, aś v diagnostice nebo terapii. Výrazným pøíspìvkem ke standardizaci alergenù je pøíprava rekombinantních alergenù, které mohou v budoucnosti kromì standardizace diagnostiky pøinést také zcela nové možnosti v alergenové imunoterapii (8,12). Podstatou tohoto postupu je molekulárnì biologická identifikace a posléze izolace genové sekvence kódující vybraný alergenní motiv, nejèastìji nìkterý z tzv. hlavních alergenù rostlin nebo hmyzu. Genová sekvence je pak inkorporována do expresního vektoru (plazmidu) za vhodný promotor a pøenesena do vybraného produkèního mikroorganismu (nejèastìji E. Coli). Metodami proteinové chemie je pak nasyntetizovaný protein izolován a mùže sloužit jako velmi èistá standarda pro urèení hmotnostního zastoupení konkrétního alergenního motivu v jakémkoli roztoku, napø. diagnostickém nebo terapeutickém pøípravku. I tato metoda však má své limity. Diagnostika celkového a specifických IgE je dnes monitorována pomocí SEKK, kterého by se mìly všechny laboratoøe, které tuto diagnostiku provádìjí, úèastnit. Bunìèné testy pro diagnostiku alergií se v rutinní laboratorní praxi zaèínají teprve rozšiøovat. Umožòuje to jednak postupná dostupnost jak pøíslušných diagnostik, tak také jejich cenová akceptovatelnost. Jde o testy, v nichž se mìøí buï exprese aktivaèních povrchových znakù bazofilù periferní krve nebo uvolòování biologicky aktivních látek z tìchto bunìk po interakci s alergenem. Výhodou tìchto testù je, že se mìøí aktivace alergenem jak IgE mediovanou cestou, tak také cestou na IgE nezávislou. Mají proto širší výpovìdní hodnotu než stanovování sp. IgE a vhodnì toto stanovování doplòují. Exprese povrchových znakù je mìøena pomocí tzv. bazotestù. Z uvolòovaných biologicky aktivních látek je stanovován nejèastìji histamin nebo leukotrieny (CAST test). Výhodou bazotestù je, že mohou pracovat s plnou krví a mají tedy její podstatnì menší spotøebu než CAST test, který musí pracovat s izolovanými leukocyty (buffy coat). Leukotrieny mìøené CAST testem jsou navíc ve zvýšené míøe produkovány pøi aktivaci vìtšiny leukocytù, nejen bazofilù. V bazotestech je mìøena exprese buï CD63 nebo CD203c. CD63 (gp53) patøí mezi znaky transmembrane-4 superfamily a je exprimován rùznými typy bunìk, jako jsou bazofily, žírné buòky, makrofágy, ale také krevní destièky. V malém poètu je CD63 exprimován na bazofilech alergikù i normálních jedincù zcela bìžnì. Po aktivaci bazofilù alergenem je uvolòován z intracytoplazmatických granulí, zabudováván do bunìèné membrány a zrcadlí míru aktivace bazofilu alergenem. CD203c (diferenciaèní antigen nervových bunìk E-NPP3, oznaèovaný také jako PD-1β nebo B10 nebo gp 130RB13 6 ) patøí mezi pyrofosfatázy/fosfodiesterázy ektonukleotidù, je exprimován výhradnì na bazofilech, žírných buòkách a jejich vývojových formách a jeho exprese je rovnìž zvyšována po expozici alergenu (14). Monitorování postupného pøechodu z Th 2 odpovìdi na Th 1 odpovìï, o který se snažíme pøi alergen specifické imunoterapii, je dnes již také možné, ale je metodicky i finanènì zatím pøíliš nároèné pro bìžnou rutinní diagnostiku. Testy spoèívají v tom, že leukocyty monitorovaného pacienta se kultivují s pøíslušným alergenem a zpravidla ve dvou èasových intervalech (2 a 6 7 dní) se v supernatantech kultur tìchto bunìk stanovují pomocí ELISA technik pøíslušné interleukiny a cytokiny charakterizující Th 1 (IL-2, IFN-γ, TNF-α) nebo Th 2 (IL-4, Il-5, IL-10, IL-13) odpovìï (15,16). Lze využít také molekulárnì-genetických technik, kdy se detekuje exprese mrna specifických pro výše jmenované interleukiny a cytokiny (17 19) vyvolaná interakcí leukocytù s alergenem. Øada alergenù má spoleèné epitopy s antigeny tkání. Proto mùže být alergeny vyvolána i tvorba protilátek, které 54

5

6 reagují s autoantigeny (popsáno napø. u alergenù pylù trav) a je prokázána spojitost mezi alergickou a autoimunitní reakcí (4). Záhy po objevení IgE byla prokázána také tvorba pøirozených anti-ige protilátek, které mají velmi rùznorodé biologické aktivity (4,20). V laboratorní diagnostice alergií však nejsou dosud využívány. Monoklonální anti-ige protilátky jsou naproti tomu stále èastìji používány v terapii alergií (21,22). Laboratorní diagnostika v alergologii není levnou záležitostí (tab. 2). Mnohdy však mùže výraznì pomoci nejen pøi stanovování anamnézy, ale, jak již bylo øeèeno, i v monitorování terapie alergických onemocnìní. Proto by mìla být využívána zodpovìdnì a úèelnì. RNDr. Ivo Lochman, CSc. Odbor imunologie a alergologie ZÚ, Ostrava ivo.lochman@zuova.cz LITERATURA 1. Špièák V. Revize alergologického názvosloví Stanovisko EAACI. Alergie 2002;3: (výtah z Johansson S.G.O. et al.: Allergy 2001;56, ). 2. Schneider E, Rolli-Derkinderen M, Arock M, Dy M. Trends in histamine research: new functions during immune responses and hematopoesis. Trends in Immunol 2002;23(5): MacGlashan D. Histamine. A mediator of inflammation. J Allergy Clin Immunol 2003;4(Suppl):S Kleine Budde I, Aalberse RC. Histamine-releasing factors, a heterogeneous groupof different activities. Clin Exp Allergy 2003; 33: Boyce JA. Mast cells: Beyond IgE. J Allergy Clin Immunol 2003;111: Panzner P. Doporuèení pro indikaci a provádìní stanovení koncentrace specifických IgE protilátek. Praktický lékaø 1998; 78(4): Lochman I, Kloudová A, Novák V. Stanovení specifického IgE volba metody. Alergie 2003;5(1): Valenta R. Diagnostic tests based on recombinant allergens: Assistants for the selection of allergy therapies. New Horizons Allergy 2002;1: Yman L. Die neue Generation der Allergie-Testung: Pharmacia CAP System. In-vitro Diagnostica Special 1990;2(1): Yunginger JW, Swanson MC. Quantitation and Standardization of Allergens in Manual of Clinical Laboratory Immunology, sixth edition, (Rose N.R. et al. edit.), ASM Press, Washington 2002; van Ree PR. Allergen standardization. Expressions (Stallergenes) 2002;16: Singh MB, Bhalla PL. Hypoallergenic derivates of major pollen allergens for allergy vaccination. Imunology and Cell Viology 2003;81: Johanson SGO, Bieber T, Dahl R, Friedmann PS, Lanier BQ, Lockez RF, Morala C, Martell JAO, Platts-Mills TAE, Ring J, Thien F, Van Cauwenberge P, Williams HC. Revised nomenclature for allergy for global use: Report of the Nomenclature Review Committee of the World Allergy Organization, October J Allergy Clin Immunol 2004;113: Èeský pøeklad: Alergie 2004;6(Suppl. 2 pøíloha). 14. Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH, Schuerwegh AJ, De Clerk LS, Stevens WJ. In vitro allergy diagnosis: should we follow the flow? Clin Exp Allergy 2004;34: Akdis CA, Blesken T, Wymann D, Akdis M, Blaser K. Differential regulation of human T cell cytokine patterns and IgE and IgG4 response by conformational antigen variants. Eur J Immunol 1998;28: Contreras JP, Ly NP, Gold DR, He H, Wand M, Weiss ST, Perkins DL, Platts-Mils TAE, Finn PW. Allergen-induced cytokine production. atopic disease, IgE, and wheeze in children. J Allergy Clin Immunol 2003;112: Härtel Ch, Bein G, Müller-Teinhardt M, Klüter H. Ex vivo induction of cytokine RNA expression in human blood sample. J Immunol Methods 2001;249: Ekerfelt Ch, Ernerudh J, Jenmalm MC. Detection of spontaneous and antigen-induced human interleukin-4 responses in vitro: comparison of ELISPOT, a novel ELISA and real-time RT-PCR. J Immunol Methods 2002;260: Marone G, Spadalo G, Palubo C, Condorelli G. The anti- -IgE/anti-FcεRIα autoantibody network in allergic and autoimmune diseases. Clin Exp Allergy 1999;29: Langer BQ. Anti-IgE un the real world. Ann Allergy Asthma Immunol 2002;89: Frew AJ. Anti-IgE and asthma. Ann Allergy Asthma Immunol 2003;91: Hamilton RG. Assessment of Human Allergic Diseases. In Clinical Immunology. Principles and Practice, second edition (Rich R.R. et al. edit.), Mosby, London-Edinburgh-New York-Philadelphia- -St Luis-Sydney-Toronto 2001; Schwartz LB, Yunginger JW, Miller J, Bokhari R, Dull D. Time Course of Appearance and Disappearance of Human Mast Cell Tryptase in the Circulation after Anaphylaxis. J Clin Invest 1989;83: Špièák V, Panzner P a kol. Alergologie, Galén, Praha 2004:44, 130, 306,