Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici FLAVONOIDY A JEJICH VÝZNAM PRO LIDSKÉ ZDRAVÍ Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce Ing. Petra Bábíková, DiS. Vypracovala Mgr. Simona Vachová Lednice 2012

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Flavonoidy a jejich význam pro lidské zdraví vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici, dne 4. května 2012 Podpis diplomanta

3 Poděkování Děkuji vedoucí mé bakalářské práce paní Ing. Petře Bábíkové, DiS., za množství poskytnutých informací, materiálů, rad a připomínek při zpracovávání bakalářské práce. Dále děkuji panu Ing. Michalu Kumštovi za pomoc a věnovaný čas při měření praktické části této práce.

4 OBSAH 1. ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED ROSTLINNÉ METABOLITY FENOLICKÉ LÁTKY Biosyntéza Chemická struktura a klasifikace Biologický význam FLAVONOIDY Biosyntéza a chemická struktura Klasifikace Historie poznání a objev Výskyt a role v rostlinách VÝZNAM FLAVONOIDŮ PRO LIDSKÉ ZDRAVÍ Biologická dostupnost pro lidský organizmus Výzkumné studie Zdravotní aspekty Spojení flavonoidy réva vinná zdraví Některé synergické vztahy MATERIÁL A METODY Použité chemikálie Reálné vzorky vína HPLC stanovení VÝSLEDKY DISKUSE ZÁVĚR SOUHRN SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

5 Seznam obrázků Obrázek 1 Biosyntetické vztahy mezi metabolity Obrázek 2 Schéma biosyntézy fenolických látek Obrázek 3 Chemická struktura flavanu Obrázek 4 Chemické struktury některých flavonoidů Obrázek 5 Hypotéza vazeb mezi biologickými mechanizmy flavonoidů Obrázek 6 Rulandské modré Obrázek 7 Laurot Obrázek 8 Kofranka Obrázek 9 Aurelius Obrázek 10 Auxerrois Obrázek 11 Ryzlink rýnský Obrázek 12 Zastoupení flavanolů Obrázek 13 Zastoupení flavonolů Obrázek 14 Zastoupení anthokyanidinů Obrázek 15 Zastoupení resveratrolu Obrázek 16 Obsah flavonoidů a resveratrolu v červených vínech Obrázek 17 Poměr flavonoidů a resveratrolu v červených vínech Obrázek 18 Obsah flavonoidů a resveratrolu v bílých vínech Obrázek 19 Poměr flavonoidů a resveratrolu v bílých vínech Obrázek 20 Červená a bílá vína dle obsahu flavonoidů a resveratrolu Obrázek 21 Červená a bílá vína dle poměru flavonoidů a resveratrolu Seznam tabulek Tabulka 1 Nejběžnější typy fenolických látek v rostlinách Tabulka 2 Přehled hlavních rostlinných fenolických látek Tabulka 3 Rozdělení flavonoidů a zastoupení v potravinových zdrojích Tabulka 4 Klasifikace flavonoidů Tabulka 5 Obsah flavonoidů v typických porcích potravin a nápojů Tabulka 6 Obsah flavanolů a flavonolů ve vzorcích vín různých odrůd Tabulka 7 Obsah anthokyanidinů ve vzorcích vín různých odrůd Tabulka 8 Obsah resveratrolu ve vzorcích vín různých odrůd Tabulka 9 Celkové srovnání obsahu flavonoidů a resveratrolu Tabulka 10 Červená a bílá vína dle obsahu flavonoidů a resveratrolu

6 1. ÚVOD Pro život na Zemi, tak jak ho známe, hrál klíčovou roli vliv vzniku a vývoje rostlin, jejich úloha při zajišťování neustálého koloběhu látek a udržování rovnováhy v přírodě. Význam rostlin pro náš život je neoddiskutovatelný a existence člověka je s nimi od samotného počátku velmi těsně spjata. Jsou jedinými organizmy na Zemi, které dokážou převést světelnou energii do organických a dále využitelných látek a kyslíku. V rostlinné říši již bylo popsáno několik set tisíc druhů rostlin, syntetizujících tisíce přírodních produktů s vysokou přidanou hodnotou, které jsou využívány jako zdroj ve výživě člověka. Pro lidský organizmus jsou relevantní nejen po nutriční stránce, ale také jako zdroj látek biologicky aktivních v řadě ochranných a léčebných funkcí. Po staletí lidé využívali terapeutických účinků rostlin a rostlinných výtažků k léčbě různých neduhů či chorob, a postupem času se rostliny staly neodmyslitelnou součástí tvorby léčiv. Ve dvou třetinách obydleného světa jsou často jediným dosažitelným zdrojem při léčení člověka i hospodářských zvířat a ve vyspělých státech dnes hrají roli také v oblasti alternativní medicíny. Díky rozvoji analytických metod se za posledních třicet let daří se stále větší jistotou a přesností objasňovat uspořádání rostlinných struktur i jejich nejdůležitějších biosyntetických drah. To má význam pro exaktnější a komplexnější využívání biologického potenciálu rostlin pro člověka. Mezi látky, produkované rostlinami, které příznivě působí jak na organizmus samotných rostlin, tak na organizmus lidský, patří flavonoidy, sloučeniny, které se nacházejí v naprosté většině zelených rostlin, a jejichž účinky jsou v současné době intenzivně zkoumány. Tyto organické pigmenty si lidský ani jiný živočišný organizmus sám nevytvoří, ale může je přijímat při konzumaci ovoce, zeleniny, některých semen či nápojů. Z výsledků mnoha klinických a experimentálních sledování vyplývá široké spektrum jejich účinnosti. Flavonoidy jsou spojovány především se snížením rizika kardiovaskulárních chorob a chronických onemocnění, s antioxidační aktivitou, represivním účinkem proti zánětům a růstu bakterií či virů nebo protektivním vlivem na vznik některých nádorů. Současně jsou analyzovány souvislosti mezi pozitivními zdravotními aspekty flavonoidů a jejich zvýšenou konzumací v potravě se zastoupením ovoce a zeleniny, a také v kakau, kávě, čaji či víně. Vnímání vína a jeho příznivých účinků v prevenci i léčbě nemocí je spojeno po tisíciletí s každou lidskou kulturou. Až do poloviny 20. století bývalo součástí historických 6

7 lékopisů a jako lék se dostalo do prvních lékařských knih. Vědecké studie prokázaly ve víně obsah vitamínů, minerálních, flavonoidních a dalších látek užitečných pro lidské zdraví, a přinesly dostatek důkazů podporujících zdravotní výhody spojené s pravidelnou a umírněnou konzumací vína. Celkově účinky flavonoidů v širších souvislostech zahrnují velmi poutavou problematiku, která je dlouhodobě v úhlu pozornosti jak laiků, tak odborníků. A to především z důvodu snahy poznat a využít skutečného příspěvku těchto sloučenin k zachování zdraví a k potencionální ochraně proti rozvoji lidských chorob. 7

8 2. CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo prostudovat dostupnou literaturu týkající se fenolických látek, zejména flavonoidů, a ze získaných informací vypracovat v teoretické části literární rešerši. Praktická část byla zaměřena na stanovení množství flavonoidů ve vybraných vzorcích červeného a bílého vína s využitím separační metody HPLC (high performance liquid chromatography). Účelem bylo získané výsledky vyhodnotit vhodnými grafickými metodami a dát je do kontextu s poznatky vycházejícími z literární problematiky. 8

9 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 ROSTLINNÉ METABOLITY Přírodní látky produkované rostlinami vznikají na základě metabolických procesů jako primární a sekundární metabolity. Primární metabolismus zahrnuje procesy nezbytné pro zabezpečování energie a stavebního materiálu a pro syntézu základních stavebních složek organizmu. Probíhá ve všech rostlinných organizmech a jeho produkty, primární metabolity, jsou pro tyto organizmy v podstatě totožné (VODRÁŽKA, 2002). Primární metabolismus je důležitý pro růst, vývoj a reprodukci. Především se jedná o biogenezi sacharidů, mastných kyselin a lipidů, proteinů, aminokyselin, nukleových kyselin, jednoduchých karboxylových kyselin, nukleotidů, cytochromů, chlorofylů a metabolických meziproduktů anabolických a katabolických drah (JAGANATH et al., 2009). Produkty primárního metabolismu se podílejí na udržování homeostázy, tedy stabilního vnitřního prostředí organizmu, a jsou podmínkou existence živých organizmů. Sekundární metabolity navazují na procesy primárního metabolismu a vznikají jako výsledek biochemických reakcí, které nejsou životně nezbytné a nejsou přímou součástí růstu a vývoje produkující kultury (MASÁK, 2010). Přesto u řady sekundárních metabolitů byla prokázána jejich důležitá funkce, pro rostliny nepostradatelná, např. funkce signálních molekul. K jejich nejpočetnějším a zároveň i nejvýznamnějším zástupcům patří lignany, flavonoidy, kumariny, rotenoidy a stilbeny (HARMATHA, 2005). Většina sekundárních metabolitů je tvořena biosyntetickými drahami, které se odštěpují z několika málo bodů primárního metabolismu, jejich biogeneze je tedy založena pouze na několika primárních metabolitech, kterými jsou aminokyseliny, acetylkoenzym A, mevalonová kyselina a meziprodukty biosyntézy šikimové kyseliny (SVRŠEK, 1997). 9

10 Vztahy mezi primárními a sekundárními metabolity ukazuje obrázek 1. Obrázek 1 Biosyntetické vztahy mezi metabolity (MACHOLÁN, 2003) 10

11 3.2 FENOLICKÉ LÁTKY Biosyntéza Fenolické sloučeniny jsou velmi rozsáhlou skupinou rostlinných sekundárních metabolitů a, jak uvádí HARMATA (2005), usuzuje se, že asi 40 % veškerého organicky vázaného uhlíku, cirkulujícího v biosféře, tvoří fenolické struktury. A to jak v živých rostlinných organizmech, tak v jejich odumřelých rozkládajících se částech, vytvářejících životodárnou půdu pro mnohé mikroorganizmy i pro svoji vlastní reprodukci. Většina fenolických látek je syntetizována jednak z cukerných metabolitů přes kyselinu šikimovou, tzv. drahou šikimátovou (fenylpropanovou), jednak lineární kondenzací kyseliny octové, tzn. drahou polyketidovou (fenylpropanoidacetátovou, acetogeninovou) (HARMATHA, 2005). Kyselina šikimová byla poprvé izolována z plodů badyáníku pravého Illicium verum, rostoucím v Japonsku, a japonský název rostliny sikimi-noki dal této kyselině název. Je základním prekurzorem v chloroplastech vznikajících aromatických kyselin s kyslíkovými funkcemi v ortho- a para- polohách (fenylalaninu, tyrosinu, tryptofanu), Z nich se pak tvoří další sekundární metabolity typu alkaloidů, a dále přes kyselinu skořicovou lignin, flavonoidy, kumariny, třísloviny, fenolické kyseliny, kyanogenní glykosidy a další látky (SVRŠEK, 1997). Polyketidová dráha je založena na kondenzaci kyseliny octové popř. propionové, přičemž dochází ke tvorbě poly-β-ketonického řetězce, bez redukce β-keto skupiny. Prodlužování řetězce je započato od aktivní formy iniciační kyseliny. Iniciační kyselinou může například být kyselina p-kumarová při metabolismu flavonoidů. Následně dochází k úpravám vzniklého řetězce cyklizací, která vede ke vzniku aromatického jádra. Polyketidová cesta vede k meta-substitučním derivátům. Produkty této dráhy jsou mnohem speciálnější sloučeniny významu omezeného vždy na úzkou skupinu organizmů. Mezi významné látky tohoto typu patří některá antibiotika (např. tetracykliny), flavonoidy apod. Při biosyntéze některých látek s více aromatickými cykly se mohou uplatnit obě cesty příkladem jsou 2-fenylchromony, od nichž jsou odvozeny flavony, aurony, anthokyany a katechiny (MACHOLÁN, 2003). 11

12 3.2.2 Chemická struktura a klasifikace Doposud bylo identifikováno více než 8000 přirozeně se vyskytujících fenolických sloučenin přítomných v rostlinách. Jejich struktura je tvořena aromatickým (benzenovým) jádrem nesoucím jednu nebo více hydroxylových skupin, a může zaujímat formy od jednoduchých fenolických molekul až po komplexní polymery s vysokou molekulovou hmotností (BALASUNDRAM et al., 2006). Většina fenolických látek je přítomna v rostlinách spíše ve formě esterů nebo glykosidů, než jako volné sloučeniny. Fenolické látky s více než jednou hydroxylovou skupinou připojenou k jednomu nebo více aromatickým kruhům jsou nazývány polyfenoly (VERMERRIS et al., 2006). Lze říci, že monomerní fenolické látky jsou rozšířeny v rostlinných organizmech s vysokou mírou přeměny tkání a rychlým tempem růstu, a to bývá obvykle více limitováno obsahem uhlíku než živinami. V kontrastu s tím polymerní fenoly nalezneme v rostlinách, které mají relativně trvalé tkáně a nízké tempo růstu omezované spíše množstvím živin než uhlíku (HORNER et al., 1988). Jedná se tedy o hydroxysloučeniny s vysokou rozmanitostí chemickými strukturami a také jejich klasifikace je možná z různých hledisek. MANACH et al. (2004) zařazuje fenolické sloučeniny do čtyř skupin v závislosti na počtu aromatických kruhů a způsobu vazby mezi nimi: 1. fenolové kyseliny 2. flavonoidy 3. stilbeny 4. lignany Širší rozčlenění zahrnují BRAVO (1998) a HARMATA (2005), podle kterých mohou být fenolické látky rozděleny do více než 10 různých tříd v závislosti na jejich základní chemické struktuře, jak je vidět v tabulce 1: 12

13 Tabulka 1 Nejběžnější typy fenolických látek v rostlinách seřazené podle počtu uhlíků (BRAVO, 1998; HARMATA, 2005) Třída Počet uhlíků Struktura Jednoduché fenoly, benzochinony 6 C6 Fenolické kyseliny / aldehydy 7 C6-C1 Acetofenony, fenyloctové kyseliny, benzofurany Hydroxyskořicové kyseliny, fenylpropanoidy, kumariny, izokumariny, chromony, chromany 8 C6-C2 9 C6-C3 Naftochinony 10 C6-C4 Ageratochromeny 11 C6-C5 Dibenzofurany, dibenzochinony, bifenyly 12 (C6)2 Xantony, dibenzopyrany, benzofenoly 13 C6-C1-C6 Stilbeny, antrachinony, fenantreny 14 C6-C2-C6 Flavonoidy, izoflavonoidy, chalkony, aurony 15 C6-C3-C6 Norlignany (difenylbutadieny) 16 C6-C4-C6 Norlignany (conioidy) 17 C6-C5-C6 Lignany, neolignany 18 (C6-C3) 2 Bioflavonoidy 30 (C6-C3-C6) 2 Kondenzované taniny (flavolany) n (C6-C3-C6) n Ligniny n (C6-C3) n Katecholmelaniny n (C6) n LUŠTINEC et al. (2003) dělí fenolické látky podle uhlíkových skeletů do jiných čtyř tříd, jak je uvedeno v tabulce 2: 1. jednoduché fenoly 2. kyseliny fenolkarboxylové 3. fenylpropanoidy 4. flavonoidy 13

14 Tabulka 2 Přehled hlavních rostlinných fenolických látek (LUŠTINEC et al., 2003) Biologický význam Fenolické sloučeniny hrají důležitou roli v růstu a rozmnožování rostlin, poskytují ochranu před predátory a patogeny (BRAVO, 1998). Slouží rostlinám jako jejich stavebně strukturní složky, jako obranné látky je chrání před chladem, škůdci, infekcemi, mechanickým poškozením a jiným stresem. Jako signální složky lákají opylovače a odpuzují škůdce, coby vonné, chuťové a barevné látky květů a plodů jsou podnětné pro vznik symbiózy s jinými organizmy (HARMATHA, 2005). Fenolické sloučeniny jsou přítomné ve všech vegetativních částech rostliny v různém množství (BRAVO, 1998), čímž se stávají běžnou součástí lidské stravy a centrem zájmu jak vědců, tak výrobců potravin v posledních desetiletích. Hlavním důvodem je uznání jejich antioxidačních vlastností a pravděpodobná role v prevenci řady onemocnění spojených s oxidačním stresem jako je rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní choroby (MANACH et al., 2004). S tím souvisí i skutečnost, že většina z více než 5000 přírodních látek s chemopreventivním účinkem, které byly dosud izolovány a strukturně identifikovány, jsou převážně fenolické a polyfenolické povahy (ZLOCH, 2003a). 14

15 Svůj následný význam mají také po smrti rostlinného organizmu, ve kterém mohou přetrvávat několik týdnů a měsíců, ovlivňovat rozkladné procesy v půdě a mít vliv na fungování celých ekosystémů (HORNER et al., 1988). 3.3 FLAVONOIDY Flavonoidy patří ze značné části ke skupině nejdůležitějších přírodních pigmentů, společně s karotenoidy a tetrapyroly, tj. hemovými a chlorofylovými barvivy (MERKEN et al., 2000). Jiné flavonoidní sloučeniny jsou významné pro svoji chuť nebo pro své biologické účinky (VELÍŠEK, 2002). V této velice rozsáhlé rodině přírodních fenolů je v současnosti popsáno již více než 6000 různých flavonoidů a jejich počet díky výzkumům stále roste (JAGANATH et al., 2009). Autoři ANDERSEN et al. (2006) hovoří o 6000 flavonoidech obsažených v potravě (v ovoci, zelenině, nápojích) a uvádějí celkem 8150 struktur různých flavonoidních tříd nalezených ve všech hlavních kategoriích zelených rostlin, s výjimkou třídy mechorostů Anthocerotae (hlevíky) Biosyntéza a chemická struktura Rostoucí zájem o sekundární metabolity, a tím i o rostlinné fenolické látky, je pochopitelný vzhledem k jejich četným rolím a účinkům. Biosyntetické dráhy flavonoidů patří k jedněm z nejsledovanějších metabolických systémů v rostlinách (KLEJDUS, 2004). Flavonoidní sloučeniny, jakožto složitější struktury polyfenolických látek, vznikají využitím obou metabolických drah, jak šikimátové, tak polyketidové. Při syntéze flavonoidů se vychází z aromatické aminokyseliny L-fenylalanin (případně tyrosin), který je prostřednictvím šikimátové metabolické dráhy, a za účasti enzymu fenylalaninamoniaklyasa, převeden přes kyselinu skořicovou, ta je následně hydrolyzována na kyselinu p-kumarovou. Dalšími transformacemi dochází ke změně kyseliny p-kumarové na p-kumaryl-koenzym A (kruh B) a k jeho spojení se třemi molekulami malonyl-koenzymu A (kruh A, C). Konečná biosyntéza flavonoidů je pak zahájena z kondenzace p-kumaryl-koenzymu A, to za vzniku chalkonu, a může projít řadou dalších reakcí a změn (VERMERRIS et al., 2006). Schéma biosyntézy fenolických látek vidíme na obrázku 2. 15

16 Obrázek 2 Schéma biosyntézy fenolických látek vycházející z fenylalaninu (PROCHÁZKA et al., 1998) Flavonoidy sestávají z 15 atomů uhlíku a vykazují molekulové seskupení C6-C3-C6, které je tvořeno dvěma aromatickými kruhy (fenolovými kruhy A, B) spojenými navzájem tříuhlíkovým řetězcem (pyranový kruh C) (VELÍŠEK, 2002; GROTEWOLD, 2006). Základ jejich molekulární struktury tvoří flavan (obrázek 3), heterocyklická sloučenina, skládající se ze dvou jednotek. První jednotkou je C6-C3 řetězec (kruh A, C), který je produktem šikimátové metabolické dráhy a jejím prekurzorem je kyselina skořicová. Druhou jednotkou je kruh C6 (kruh B) s navázaným atomem kyslíku, která je odvozena od acetátů, jejichž donorem je acetyl-koenzym A (LUŠTINEC et al., 2003). Obrázek 3 Chemická struktura flavanu (VELÍŠEK, 2002) 16

17 Běžně bývají všechny tři kruhy substituovány hydroxyskupinami nebo methoxyskupinami a jednotlivé deriváty se liší pouze stupněm substituce a oxidace. Flavonoidy se častěji, než ve volné formě, vyskytují vázány ve formě glykosidů, sestávajících ze složky cukerné a necukerné, tzv. aglykonu. Aglykonem bývá většinou hydroxysloučenina. Ve formě O-glykosidů je jako sacharid přítomna D-glukóza, L-rhamnóza, D-galaktóza, L-arabinóza, D-xylóza, D-apioza nebo D-glukuronová kyselina. Poměrně často se vyskytují také C-glykosidy, ve kterých je vázána D-glukóza (VELÍŠEK, 2002). Nejčastěji je připojen jeden glykosyl, někdy však jsou substituovány dva nebo tři hydroxyly polyfenolu. Aglykon nebo sacharidová složka může být dále substituována hydroxykyselinou, např. kyselinou jablečnou nebo gallovou (SLANINA et al., 2004). Flavonoidní glykosidy se nacházejí hlavně v listech, květech a vnějších částech rostliny, jako je pokožka a slupka, směrem k vnitřním strukturám se jejich koncentrace snižuje. Pouze stopová množství flavonoidů jsou přítomna v podzemních částech rostliny. Distribuce flavonoidů v rostlinách je ovlivněna mnoha faktory v závislosti na druhu rostliny. Je prováděna v závislosti na míře dostupnosti světla a na předchozím osvětlení, protože tvorba vyšších oxidovaných flavonoidů je urychlována světlem (AHERNE et al., 2002) Klasifikace Flavonoidy představují širokou škálu chemických sloučenin a můžeme se setkat s jejich rozlišnou klasifikací u různých autorů. Podle stupně oxidace pyranového kruhu (C3 řetězce) rozeznávají následující třídy flavonoidů tito autoři: MANACH (2004): Flavonoly Flavony Isoflavony Flavanony Anthokyanidiny Flavanoly (katechiny a proanthokyanidiny) 17

18 VELÍŠEK (2002) současně na obrázku 4: Katechiny (flavan-3-oly) Leukoanthokyanidiny (flavan-3,4-dioly) Flavanony Flavanonoly Flavony Flavonoly Anthokyanidiny a strukturně příbuzné: Chalkony a dihydrochalkony Aurony chalkony aurony Obrázek 4 Chemické struktury některých flavonoidů (VELÍŠEK, 2002) 18

19 BRAVO (1998) uvádí rozdělení flavonoidních látek do 13 tříd: Chalkony Dihydrochalkony Aurony Flavony Flavonoly Dihydroflavonoly Flavanony Flavanoly Flavandioly (leukoanthokyanidiny) Anthokyanidiny Isoflavonoidy Biflavonoidy Proanhokyanidiny (kondenzované taniny) WINKEL-SHIRLEY (2001) rozděluje různorodou rodinu flavonoidů do šesti hlavních podskupin, které se nacházejí ve většině organizmů vyšších rostlin: Chalkony Flavony Flavonoly Flavonony (flavandioly) Anthokyaniny Kondenzované taniny (proanthokyanidiny) Dále do dvou speciálních podskupin, které nejsou ve vyšších rostlinách všudypřítomné: Aurony Isoflavonoidy Vyčleňuje také s flavonoidy úzce příbuzné: Stilbeny 19

20 V závislosti na poloze propojení aromatického kruhu (A, B) s pyranovým kruhem (C) lze flavonoidy rozdělit do tří strukturně příbuzných tříd (GROTEWOLD, 2006): Flavonoidy Isoflavonoidy Neoflavonoidy Vlivem odlišného uspořádání hydroxy a methoxy skupin a sacharidových jednotek, a podle propojení kruhů fenolových a pyranového kruhu, člení HEIM et al. (2002) flavonoidy na třídy: Flavanoly: katechin, epikatechin, epigallokatechin gallát Flavony: chrysin, apigenin, rutin, luteolin Flavonoly: kaempferol, kvercetin, myricetin, tamarixetin Flavanony (dihydroflavony): naringin, naringenin, taxifolin, eriodictyol, hesperidin Isoflavony: genistin, genistein, daidzin, daidzein Anthokyanidiny: apigenidin, cyanidin Všechny barevné flavonoidy ovlivňují výslednou barvu rostlinného produktu a dříve se dělily na dvě velké skupiny (VELÍŠEK, 2002): červené až modré anthokyany (též nazývané anthokyaniny) název pochází z řeckého výrazu pro modrý (kyaneos) žluté anthoxanthiny název je kombinací řeckých výrazů pro květ (anthos) a žlutý (xanthos). Jejich nositeli jsou: o flavanony, flavanonoly, flavony, flavonoly, které nesou dodnes název podle latinského flavus (žlutý) o chalkony, aurony, které se dříve nazývaly anthochlory od řeckého chloros (zelený) o isoflavony O zastoupení flavonoidů v dietních zdrojích si lze udělat představu z několika příkladů uvedených v tabulkách 3 a 4. 20

21 Tabulka 3 Rozdělení flavonoidů a zastoupení v potravinových zdrojích (HIGDON, 2005) Flavonoidy - podtřídy Flavonoidy Některé běžné potravinové zdroje Anthokyanidiny Flavanoly Flavanony Flavonoly Flavony Isoflavony cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin, peonidin, petunidin Monomery: katechin, epikatechin, epigallokatechin epikatechin gallát, epigallokatechin gallát Dimery a polymery: theaflavin, thearubigin, proanthokyanidiny hesperetin, naringenin, eriodictiol kvercetin, kaempferol, myricetin, isorhamnetin apigenin, luteolin daidzein, genistein, glycitein jahody, modré hrozny, červené víno katechin: čaje (zejména zelená a bílé), čokoláda, vinné hrozny, jahody, jablka theaflavin, thearubigin: čaje (zejména černé a oolongový) proanthokyanidin: čokoláda, jablka, jahody, modré hrozny, červené víno citrusové plody a šťávy, např. pomeranče, grapefruity, citrony čaje, žlutá cibule, jarní cibulka, kapusta, brokolice, jablka, bobule petržel, tymián, celer, feferonky sójové boby, sójové výrobky, luštěniny 21

22 Tabulka 4 Klasifikace flavonoidů (MACHOLÁN, 2003) Historie poznání a objev Podíváme-li se na přehled událostí, které měly rozhodující význam pro poznání výskytu a významu flavonoidů v přírodě a pro odhalení a cílené využívání jejich účinků na lidský organizmus, dojdeme k důležitým historickým souvislostem: již ve třicátých letech 19. století byly ze dřeva akácie katechové (Acacia catechu) izolovány třísloviny, v nichž byly zjištěny mnohočetné fenolické sloučeniny, v routě zahradní (Ruta graveolens) a chmelu otáčivém (Humulus lupulus) byl objeven rutin a jeho flavonolový aglykon kvercetin. Ve druhé polovině 19. století probíhalo studium výskytu flavonoidních a dalších polyfenolických látek v různých částech rostlin, studium jejich významu z hlediska organoleptických vlastností ovoce, zeleniny, chmelu, révy, tabáku apod. Byl zkoumán jejich vliv na barvu listů a květů, jejich vliv na opylující a škodlivý hmyz. Probíhalo studium složení tříslovin a ligninu. V roce 1876 Charles R. Darwin vyslovil domněnku o vývojové funkci a významu flavonoidů v rostlinách. První dvě 22

23 desetiletí 20. století dospěla k mnoha poznatkům: z tříslovin byly izolovány a identifikovány anthokyanidiny, flavony a flavonoly, z citronové šťávy pak silně redukující látka, považovaná za formu vitamínu C s povahou rostlinného barviva (DARWIN, 1876 in ZLOCH, 2003b). Za objevitele flavonoidů je považován maďarský biochemik Albert Szent-Györgyi von Nagyrapolt ( ). Roku 1936 objevil v kůře citrusových plodů aktivní látku (směs glykosidů), aktivující působnost vitamínu C, označil ji jako citrín a analogicky ho spojil s pojmem vitaminu P. Dnes se setkáme také s názvem rutin. Za objevy týkající se procesů biologické oxidace a zvláště za výzkumy spojené s účinky vitaminu C dostal v roce 1937 Nobelovu cenu (MÁŠOVÁ, 2008). Teprve roku 1952 došlo oficiálně k zavedení pojmu Flavonoidy s jeho přesnou strukturní charakteristikou a užíváním tohoto pojmu v chemotaxonomii rostlin. V letech podléhá intenzivnímu zájmu studium farmakologických účinků flavonoidů a dochází ke vzniku a zavádění čistých preparátů na trh. Hraničním se stává rok 1968, kdy došlo k vědeckému odmítnutí vitaminové povahy flavonoidů a jejich označení jako vitaminu P, což mělo za následek stažení flavonoidních farmaceutik z trhu. Až do devadesátých let 20. století probíhala studia flavonoidů z pohledu jejich účinků na metabolismus kolagenu a elastinu, jejich vlivu na aktivitu enzymů a schopnost interakce s vitaminem C. Teprve po roce 1990 byl obnoven zájem o nutriční hodnotu flavonoidů, o jejich obsah v potravinách, bilanci jejich potravního příjmu, o průzkum vztahů mezi velikostí příjmu a zdroji flavonoidů a vývojem zdravotního stavu (ZLOCH, 2003b) Výskyt a role v rostlinách V počátcích výzkumů byly flavonoidy považovány pouze za metabolické odpadní produkty rostlin, dnes je jim přisuzováno mnoho rozmanitých funkcí důležitých k růstu a vývoji rostlin. Funkcí rozhodujících pro přežití, protože zvyšují přitažlivost rostlin pro opylovače, podněcují činnost půdních bakterií Rhizobium sp. při fixaci kyslíku, podporují růst pylové láčky a vstřebávání minerálních živin ze senescentních listů. Pro rostliny, které žijí v optimálním prostření, poskytují konkurenční výhody tím, že v nich zvyšují toleranci k různým abiotickým stresorům, fungují jako přírodní pesticidy, jako 23

24 obrana proti býložravcům a patogenům a tvoří základ pro allelopatické interakce rostlin s jinými organizmy, mezi jinými druhy rostlin nebo uvnitř druhu (KLEJDUS et al., 1999). Fungují jako ochranné prostředky proti UV záření, jako izolační materiály buněčných stěn při nepropustnosti pro vodu či plyny, a jako konstrukční materiály poskytující rostlinám stabilitu (HELDT et al., 2005). Flavonoidy jako biologické pigmenty poskytují zbarvení květinám, ovoci, zelenině a listům. Vedle toho vytvářejí bariéry proti plísním, vykazují také široké spektrum biologických vlastností včetně antimikrobiální, insekticidní a estrogenní aktivity. To jsou důvody, proč rostliny investují významné množství své metabolické energie do jejich syntézy. Tím se tyto látky promítají také do potravin rostlinného původu a nesou předpoklad potencionálního přínosu pro naše zdraví (ANDERSEN et al., 2006). Hlavními zdroji flavonoidních sloučenin jsou především ovoce, zelenina a nápoje. Nejhojněji zastoupenými flavonoidy v ovoci jsou katechiny, jejichž nejbohatším zdrojem jsou hrozny modrých odrůd révy vinné a jablka. Katechiny, flavonoly a proanthokyanidiny se nalézají v plodech ovoce, především v jejich dužnině. Jsou však druhy ovoce, např. jablka, v nichž jsou flavonoly obsaženy také ve slupce. Katechiny nalezneme poměrně hojně v peckovém ovoci, jako jsou modré švestky a meruňky. Flavanony a flavony se omezují na citrusové plody, hlavně naringenin v grapefruitech a hesperetin v pomerančích, citronech a limetkách. Z toho důvodu jsou také nazývány citrusovými flavonoidy. Proanthokyanidiny jsou obsaženy s nejvyšší koncentrací v jablkách, švestkách a broskvích, dále třešních, ostružinách, černém rybízu, hroznech, mnohem méně jich nalezneme v jahodách a malinách, nejméně pak v citrusech (ANDERSEN et al., 2006). Kvercetin je nejčastějším flavonolem v ovoci, především v bezinkách a brusinkách. Zvláště bohatým na obsah kaempferolu a myricetinu je rybíz a borůvky, dále významně slupky broskví a hrušek. V zelenině nacházíme velké množství flavonolů, a to především kvercetin a kaempferol, v rajčatech, cibuli, šalotce, v košťálové zelenině hlavně v brokolici, kapustě, zelí, v listové zelenině například v hlávkovém salátu. Detekovatelný obsah kvercetinu, katechinu, myricetinu a kaempferolu, ale také prokyanidinu, se nachází v luštěninách, obzvlášť v bobu obecném. Flavony objevíme v celeru, paprice a salátu. Nápoje, jako jsou ovocné šťávy, čaje a víno, inklinují k vysokému obsahu katechinů a flavonolů. Jablečná šťáva je jedním z nejbohatších zdrojů katechinů, brusinková šťáva obsahuje většinu flavonolů, především ve formě kvercetinu a myricetinu, zatímco 24

25 flavanony se omezují na citrusové šťávy především z grapefruitů a pomerančů. V čaji nalezneme nejhojněji katechiny a flavonoly kvercetin, kaempferol a myricetin. Víno obsahuje komplexní směs katechinů, flavonolů, flavanonů a prokyanidinů. V pivu dominují především prokyanidiny. V ovocných džemech a medu se nachází nízká hladina flavonolů a flavonů. Naproti tomu čokoláda je velmi dobrým potenciálním zdrojem prokyanidinů a katechinů. Vysoký obsah flavonů se kumuluje v bylinách, například v oreganu, šalvěji a tymiánu (ANDERSEN et al., 2006; SCALBERT et al., 2000). Ovoce, zelenina, nápoje a další rostlinné produkty jsou hlavními zdroji fenolických, tedy i flavonoidních sloučenin v lidské stravě (BALASUNDRAM et al., 2006). Flavonoidy pokrývají dvě třetiny jejich celkového příjmu, zbývající třetinu tvoří fenolické kyseliny a ostatní polyfenoly (SCALBERT et al., 2000). Přesto je příspěvek stravy k průměrnému dennímu příjmu flavonoidů maximálně několik desítek miligramů (SLANINA et al., 2004). 3.4 VÝZNAM FLAVONOIDŮ PRO LIDSKÉ ZDRAVÍ Účinky těchto látek na zdraví byly spontánně využívány po staletí ve formě bylinných čajů a formou různých praktik lidového léčitelství. Flavonoidy hrají mezi účinnými látkami přední roli, neboť jsou z přírodních sloučenin nejrozšířenější, nejpočetnější a vyskytují se ve všech rostlinách (ZLOCH, 2003b). Vzhledem k širokému rozšíření a vysoké koncentraci v rostlinách jsou flavonoidy běžnou součástí lidské stravy (SLANINA et al., 2004). Celkový denní příjem byl už v 70. letech 20. století stanoven na 1 g, což výrazně překračuje příjem antioxidantů, jako jsou β-karoteny a vitamín E. Nebyla však známa metodika stanovení tohoto množství (HERTOG et al., 1993). Pro názornou představu reálně konzumovaného množství flavonoidů lze vycházet z předpokládaných průměrných denních porcí ovoce, zeleniny, nápojů a doplňkových potravin. Osoba, která by konzumovala denně typické porce potravin a nápojů, jak uvádí tabulka 5, by účinně přijala necelý 1 g flavonoidů (822 mg) a celkem více než 1 g fenolických sloučenin (1127 mg) (SCALBERT et al., 2000). Podle doporučení Světové zdravotnické organizace by jejich průměrný denní příjem měl být rozvržen do 3 porcí zeleniny (přibližně 250 g) a 2 porcí ovoce (150 g). V České republice, podobně jako v celé 25

26 polovině ostatních evropských států, je spotřeba ovoce a zeleniny hluboko pod touto dávkou (v ČR méně než 200 kg na osobu a rok) (ZLOCH, 2003a). Tabulka 5 Obsah flavonoidů v typických porcích potravin a nápojů (SCALBERT et al., 2000) Fenolické kyseliny (mg) Flavonoidy (mg) Celkový obsah Brambory - 200g Rajčata - 100g 8 0,5 8,5 Salát - 100g Cibule - 10g 7 7 (mg) Jablko - 200g Třešně - 50g Pšeničné otruby - 10g Tmavá čokoláda - 20g Pomerančový džus - 100ml Červené víno - 125ml Káva - 200ml Černý čaj - 200ml Zájem o studium těchto přírodních látek je v posledních desetiletích intenzivní především proto, že jejich příjem v potravě je dáván do souvislostí se snížením výskytu závažných nemocí, jako je rakovina a kardiovaskulární choroby (SLANINA et al., 2004). Navíc, lidské tělo nedokáže tvořit látky s aromatickým jádrem, proto jsou i flavonoidní sloučeniny esenciální (MACHOLÁN, 2003). Jejich příjem v potravě závisí do značné míry na stravovacích návycích a preferencích konzumentů (SCALBERT et al., 2000). Konzumace velkého množství stravy bohaté na tuky s nedostatečným příjmem vlákniny, alkoholické nápoje (především destiláty), kouření, konzumace pyrolyzátů (tepelně upravených) bílkovin, a naopak nízký příjem ovoce a zeleniny a dále i vápníku, to všechno patří mezi rizikové faktory lidského zdraví. Naopak vhodným složením denní stravy lze výrazně pozitivně ovlivňovat metabolické procesy v trávicím traktu člověka (HANUŠTIAK et al., 2005). 26

27 3.4.1 Biologická dostupnost pro lidský organizmus Pro pochopení dopadu účinků flavonoidních látek na lidské zdraví je důležité poznat, jak chemická struktura flavonoidů ovlivňuje jejich biologické vlastnosti a zejména jejich biologickou dostupnost pro lidský organizmus (SCALBERT et al., 2000). Příznivý vliv rostlinných polyfenolů na zdraví člověka, dokumentovaný jak klinickými studiemi, tak pokusy na zvířatech a buněčných kulturách, podnítil zájem o studium biologické dostupnosti těchto látek. Zejména v otázkách, zda a v jakém množství jsou tyto sloučeniny resorbovány z trávicího traktu člověka, jaké je rozpětí koncentrací v krevní plazmě, jak jsou metabolizovány a vylučovány z organizmu (SLANINA et al., 2004). Studie biologické dostupnosti ukázaly, že koncentrace flavonoidů v lidské plazmě zřídka překročí 1 μm, pokud množství přijímaných polyfenolů zůstane na normách běžně přijímaných v naší stravě. Této maximální koncentrace se nejčastěji dosáhne 1-2 hodiny po požití, s výjimkou polyfenolů, které jsou absorbovány pouze po částečné degradaci činností tlustého střeva mikroflórou (SCALBERT et al., 2000). Uvedená koncentrace se v lidské plazmě projeví při příjmu 20 až 100 mg flavonoidů formou 100 až 500 g zeleniny nebo ovoce. Na druhé straně, strava s výrazně bohatším obsahem polyfenolů až 500 mg, což představuje spotřebu 300 ml červeného vína nebo několika šálků čaje či 200 mg cibule, zvýší plazmatickou koncentraci polyfenolů až na 20 μm (ZLOCH, 2003a). Biodostupnost a biotransformace jsou faktory, které významným způsobem limitují fyziologické účinky rostlinných polyfenolů. Výsledky získané v posledních letech ukazují, že po svém příjmu polyfenoly podléhají velice rozsáhlým a různorodým přeměnám jak v trávicím traktu, tak v samotném organizmu. Hlavním místem resorpce polyfenolů v trávicím traktu je tenké a tlusté střevo. Existují však důkazy, že některé polyfenoly přijímané v nápojích se mohou částečně resorbovat již v dutině ústní. Polyfenoly, které nejsou resorbovány v tenkém střevě, se dostávají do tlustého střeva, kde jsou metabolizovány střevními baktériemi. Po resorpci z trávicího traktu jsou polyfenoly dále metabolizovány enzymy přítomnými v tkáních člověka. Přeměny jsou velmi podobné metabolismu léčiv a jiných xenobiotik (SLANINA et al., 2004). Vstřebávání a metabolismus flavonoidních látek obsažených v potravinách jsou determinovány především jejich chemickou strukturou, která závisí na faktorech jako je stupeň glykosylace či acylace, spolupůsobení s ostatními fenolickými látkami, 27

28 molekulární velikost, stupeň polymerace a rozpustnost. Obrovská variabilita této skupiny látek, stejně jako jejich výskytu v rostlinném materiálu, ztěžuje studium jejich biologické dostupnosti a fyziologických i nutričních účinků (BRAVO, 1998) Výzkumné studie Právě zmiňovaná značná různorodost a složitost chemických struktur flavonoidů byla hlavním faktorem, který zpozdil cílené zaměření výzkumných studií. Výzkum flavonoidů a dalších polyfenolických látek a jejich účinků v prevenci nemocí se začal zásadně rozvíjet až po roce 1995 (SCALBERT et al., 2005). Přitom už koncem padesátých let minulého století byl pozorován dietologický paradox ve vztahu k úmrtnosti v důsledku kardiovaskulárních chorob v evropských zemích. Ten se projevil zejména srovnáním výsledků dvou zemí, Francii a Finska, zemí geograficky vzdálených, nicméně se srovnatelným příjmem cholesterolu a nasycených tuků ve stravě. Finsko vykazovalo nejvyšší úmrtnost na ischemickou chorobu srdeční ze sedmi testovaných zemí a Francie patřila k zemím s úmrtností nízkou. Srovnatelné rozdíly v úmrtnosti byly potvrzeny při dalších rozsáhlých výzkumech probíhajících ve světě celkem ve 40 zemích v letech 1950 až Ty také poukázaly, že vyšší konzumace rostlinných potravin s obsahem antioxidantů a dalších příznivých látek je v silně negativní korelaci s úmrtností na ischemickou chorobu srdeční. Až čtyřikrát vyšší spotřeba zeleniny a nenasycených tuků a současně nižší úmrtnost ve Francii vedly k úvahám o vlivu rozdílných stravovacích faktorů na rozvoj ischemické choroby srdeční (ARTAUD-WILD et al., 1993). Pozorování nízké úmrtnosti vlivem této nemoci i přes vysoký příjem cholesterolu a nasycených mastných kyselin ve Francii i jiných zkoumaných zemích bylo v roce 1980 impulsem k pojmenování termínu francouzský paradox. Ten se týká primárně prevence a životního stylu pevně zakořeněného v zemích s nízkým výskytem nemoci a mohl by být rozšířen na paradoxní koexistenci vysokého výskytu rizikových faktorů kardiovaskulárních onemocnění s jejich nízkým výskytem v zemích jižní Evropy (FERRIÈRES, 2004). Francouzský kardiolog Serge Renaud se tímto paradoxem snažil objasnit, proč Francouzi trpí atakem infarktu třikrát méně než občané USA, i když ve své stravě přijmou o 30 % více tuků, více kouří a méně cvičí. S prvními poznatky 28

29 tohoto charakteru přišel irský lékař Samuel Black, který tento nutriční paradox popsal na základě výzkumů již v roce Renaud byl přesvědčený o příčinné souvislosti s konzumací středomořské stravy a pravidelné rozumné dávky červeného vína (RENAUD, 1994 in ŠAMÁNEK, 2004). Pouze na okraj lze říci, že francouzský paradox není jediným významnějším nutričním paradoxem, který se týká výskytu kardiovaskulárních onemocnění v souvislosti se stravovacími zvyklostmi v různých zemích. Popsány byly paradox japonský, alpský, albánský, izraelský, indický, španělský a jiné, pojednávající o neobvyklých vztazích mezi kardiovaskulárními rizikovými faktory a etiologií kardiovaskulárních chorob (NYTROVÁ, 2011). Výsledky mnoha vědeckých studií ve světě ukázaly určitou míru inverzní asociace mezi vysokým příjmem flavonoidů a snížením degenerativních onemocnění (JAGANATH et al., 2009). Výzkumný tým Davida Goldberga v roce 1995 poukázal na to, že u flavonoidů byly prokázány silné biologické účinky, včetně schopnosti inhibovat patologickou agregaci krevních destiček, stejně jako schopnost inhibovat růst a rozvoj rakovinových nádorů (GOLDBERG, 1995). Podíl kvality přijímané stravy se ze všech vlivů, které se na vzniku zhoubných nádorů podílejí, odhaduje na plných 30 %, což znamená, že vliv stravy samotné je silným, nejméně třetinovým rizikovým faktorem (ŽALOUDÍK, 2008). Epidemiologické studie zkoumaly také antioxidační aktivitu flavonoidů, jejich inhibiční účinky na oxidační poškození lipidů (HALLIWELL et al., 2005; O REILLY et al., 2001; YOCHUM et al., 1999), vztah mezi příjmem flavonoidů a cévní mozkovou příhodou. Ověřována byla jejich role při snížení rizika propukající demence a zánětlivých procesů, jejich schopnost působit jako inhibitory agregace krevních destiček či přispívat k prevenci aterosklerózy a osteoporózy. Zkoumána byla dále využitelnost flavonoidů při léčbě pacientů infikovaných virem HIV, především jejich inhibiční aktivita ve fázi replikace viru (NIJVELDT et al., 2001) Zdravotní aspekty Díky různorodosti svých chemických struktur a škále chemických vlastností mohou flavonoidy na různých úrovních zasahovat do dějů v organizmu konzumenta. Odborníci na výživu a zdraví zaměřují svou pozornost na hlubší poznání jejich potenciálních biologických účinků. 29

30 V okruhu zájmu je především účinek či aktivita a role flavonoidů ve fyziologických a patologických procesech (BECHNÁ, 2009; OPLETAL et al., [b.r.]): antioxidační a antiradikálová venoaktivita (snížení patologicky zvýšené propustnosti a lomivosti kapilár) antihemorhagická (protikrvácivá) antiedematozní (proti otokům) hypotenzivní (proti sníženému krevnímu tlaku) antitrombotická (ovlivnění krevní srážlivosti) protizánětlivá a antialergická hepatoprotektivní (chránící játra) spasmolytická (uvolňující křeče) hypocholesterolemická (snížení úrovně cholesterolu) diuretická (močopudná) antibakteriální a antivirová cytostatická (inhibice růstu nádorových buněk) antifertilní (inhibice plodnosti) antiflogistická (tlumící záněty) antimutagenní a antikarcinogenní estrogenní (aktivita hormonů) ovlivnění činnosti srdce, rozšiřování cév snížení hladiny cholesterolu chelatace železa inhibice některých enzymů stimulace některých enzymových systémů Předpokládané vlivy flavonoidů ukazuje obrázek 5. Pod patronací Národního ústavu zdraví v Bethesdě (USA) byl vydán soupis bioaktivních látek obsažených v potravinách, jehož účelem je umožnit přesnější formulaci a vymezení tzv. funkčních potravin, usnadnit práci potravinářským chemikům a analytikům a poskytnout věcné podklady pro plánování a hodnocení epidemiologických a klinických výzkumů. Soupis obsahuje mj. 6 tříd flavonoidů, skupinu taninů, lignanů, fenolických kyselin a terpenů (ZLOCH, 2003a). 30

31 Obrázek 5 Hypotéza vazeb mezi biologickými mechanizmy flavonoidů a jejich vliv na onemocnění (NIJVELDT et al., 2001) Testování účinných složek flavonoidů a jejich působení na lidský organizmus vedlo k jejich začlenění do léčebného a terapeutického využití, ačkoli navzdory velkému počtu publikací o farmakologickém potenciálu těchto látek nejsou zatím ujasněna pravidla v podmínkách vztahu struktura-účinek. Flavonoidy jsou používány především k léčbě kapilárních a žilních potíží. Samotné nebo v kombinacích s jinými léčivy jsou běžnými složkami vaskulárních protektiv, venotonik a topických léčiv používaných ve flebologii, zabývající se léčbou křečových žil. U existujících léčebných přípravků s obsahem flavonoidů se můžeme setkat s následujícími indikacemi nebo předpokládaným využitím (HORÁČKOVÁ, 2008): léčba chronické cévní mozkové nedostatečnosti a jejích funkčních projevů (snížení intelektuální kapacity, poruchy paměti a sociálního chování, poruchy pohybové koordinace, bolesti hlavy) zmírnění následků po cévních mozkových příhodách léčba symptomů nedostatečnosti žilních a lymfatických cest, jako je únava dolních končetin, brnění, bolesti, syndrom neklidu dolních končetin 31

32 léčba posttrombotického syndromu po prodělané hluboké žilní trombóze léčba posttraumatických cirkulačních poruch způsobených především imobilizací dolních končetin léčba dysfunkcí způsobených akutním atakem hemoroidů zlepšení potíží s kapilární fragilitou kůže (s praskáním vlásečnic za vzniku drobných kožních výronů), jako podpůrná léčba funkčních symptomů kapilární fragility léčba chronického krvácení z dělohy mimo menstruační cyklus, způsobeného hormonálními antikoncepcí nebo nitroděložními tělísky léčba symptomů cirkulačních potíží sítnice léčba mízního otoku paží následkem radioterapie a chemoterapie rakoviny prsu Spojení flavonoidy réva vinná zdraví Réva vinná patří mezi nejstarší kulturní rostliny a lidé si ji zvolili pro svůj užitek a pěstování před více než 9000 lety. Existují archeologické důkazy a chemické analýzy, potvrzující využívání révy a jejích produktů k léčebným účelům. Po dobu více než sta let je chemické složení jednotlivých částí révy vinné předmětem nesčetných vědeckých výzkumů, které odhalily velké rozdíly mezi jednotlivými částmi rostliny a rozdíly mezi různými odrůdami révy. Flavonoidy tvoří významnou skupinu organických sloučenin, vyskytujících se v různých rostlinných částech révy vinné (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). V hroznech a ve víně lze najít tři hlavní skupiny flavonoidů - anthokyany, flavonoly a flavanoly. V bobulích jsou obsaženy především ve slupkách, kde se hromadí ve formě glykosidů prostřednictvím vakuol. Anthokyanová barviva se u některých modrých odrůd, nazývaných barvířky, nachází také v dužnině. Zastoupeny jsou především anthokyanidiny dominantně malvidin a dále cyanidin. Mezi významné flavonoly révy vinné patří kaempferol, kvercetin, myricetin a rutin. Semeno, slupka a třapina obsahují jednoduché flavan-3-oly, zejména katechin, epikatechin a epigallokatechin gallát, které v průběhu zrání hroznů polymerizují do formy proanthokyanidinů (taninů) (PAVLOUŠEK, 2011a; RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Na semena a listy révy vinné můžeme pohlížet také jako na sekundární odpadní produkty, které však současně mohou přinášet zdravotně využitelnou hodnotu prostřednictvím jejich dalšího zpracování. Myšlenka kompletního využití révy vinné je již ve světě rozšířena. 32

33 Semena jsou v dnešní době využívána k lisování rostlinného oleje, výrobě přídavné mouky do pečiva či hořčice. V České republice se této produkci již začala věnovat některá vinařství na Jižní Moravě (SOLAŘÍKOVÁ, 2012). Díky flavonoidům obsažených v semenech mohou tyto produkty snižovat riziko vzniku srdečních a mozkových příhod, posilovat vlásečnice a zvyšovat průtok krve především končetinami, účinně pomáhat při křečových žilách a brnění končetin. Výzkumy potvrdily příznivý účinek na krevní oběh v očích či snížení alergických projevů. Olej z hroznových semen má největší použití v gastronomii, snáší i vysoké teploty bez nebezpečí vzniku volných radikálů, a je také kvalitním kosmetickým preparátem (GRYGÁRKOVÁ, 2008). V listech révy vinné se kumulují ve velkém množství anthokyany, a to především na konci vegetačního období (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Již před mnoha staletími se odvar z listů doporučoval v řadě zdravotních potíží a také v současnosti je výtažek z listů modrých odrůd používán po desetiletí při léčbě žilních onemocnění, například národní lékopis ve Francii jej zaznamenává jako "Vigne rouge" pro tuto indikaci. V mnoha dalších evropských zemích jsou listy vinné révy používány pro terapeutické účely. Odvary a masti k obkladům byly připravovány z listů a z úponků, a byly s úspěchem používány při léčbě kožních onemocnění, krvácení, revmatických obtížích, ale zejména při nedostatečnosti žil dolních končetin (POKORNÝ, 2006). Léčivá hodnota hroznů révy vinné byla uznána už před více než 6000 lety. Ve starověkém Egyptě z nich byly vyráběny masti k léčbě kožních a očních potíží, jejich šťáva sloužila proti nevolnosti, zácpě, onemocnění jater i rakovinou (DOHADWALA et al., 2009). Výzkumné studie v roce 2009 v laboratorních podmínkách prokázaly pozitivní vliv zvýšené konzumace hroznů na kardiovaskulární systém, na zlepšení srdeční funkce a snížení zánětlivosti srdce (ARRBOR, 2010). V posledním desetiletí byly shromážděny výsledky výzkumů s pozitivním vlivem flavonoidních a dalších polyfenolických látek v hroznech na hypertenzi, diabetes, zvýšený cholesterol či oxidaci lipidů. Konzumace hroznů má své místo při léčbě nechutenství, úpravě žaludeční sekrece, při zánětech ledvin a průdušek, chudokrevnosti či jaterních chorobách a při rekonvalescenci. Jsou vyzkoušeny také účinky některých odrůd, které se používají při redukci váhy a k léčbě ztráty čichu (DOHADWALA et al., 2009). Příznivé účinky samotného vína lidé pocítili již před mnoha tisíciletími. Nejstarší přímý doklad využívání vína člověkem jako medicinálního prostředku poskytl chemický rozbor džbánu, pocházejícího z období počátků egyptské kultury, který prokázal stopy vína a do něj přidaných přírodních léčivých rostlin a koření (NOUZA, 2010). Obsah 33

34 flavonoidů ve víně je odlišný u červeného a u bílého vína. V červeném víně se nachází vyšší obsah fenolických látek, naproti tomu v bílém víně je 700 až 800 krát vyšší obsah antioxidačního enzymu katalázy, která chrání buňky před toxickým vlivem koncentrace peroxidu vodíku (Britannica, [b.r.]). Flavonoidy skrze víno působí jako antioxidanty, vážou molekulární kyslík, pomáhají redukovat tvorbu okysličeného lipoproteinu, který je hlavní příčinou kornatění tepen a vzniku trombóz, mají vliv na odbourávání cholesterolu, podílejícího se na ucpávání cév tukovými usazeninami. Víno se osvědčilo při ošetřování ran, při horečkách a zmírňování bolestí, přidáno do vody zlepšovalo nejen její kvalitu, ale zamezilo často infekci z kontaminované vody (NOUZA, 2010). Řada publikovaných prací se také zabývá myšlenkou, do jaké míry je protektivní účinek vína způsoben flavonoidními a dalšími látkami, mezi nimi například resveratrolu, a do jaké míry přítomností alkoholu. Konzumace vína byla jedním z faktorů, kterým bylo možno vysvětlit nízkou úmrtnost na onemocnění věnčitých tepen. Tato skutečnost vedla k domněnce, že požívání vína může působit proti účinkům stravy s vysokým obsahem tuků, a omezit tak možnost vzniku a rozsah onemocnění věnčitých tepen (ŠMIDRKAL et al., 2001). Souvislosti, vyplývající z francouzského paradoxu, přinesly předpoklad pozitivního vlivu mírné a pravidelné konzumace vína ve Francii. Studie ukázaly až trojnásobný nárůst koncentrace katechinů v plazmě lidí, kteří konzumují dostatečné množství ovoce a zeleniny bez příjmu vína, a to ve srovnání s lidmi přijímajícími stravu bez ovoce, zeleniny i vína. Na druhé straně došlo až k čtyřnásobnému zvýšení hodnot katechinů u těch, kteří přijímali dietu s červeným vínem a bez ovoce a zeleniny (FERRIÈRES, 2004). Kromě zmiňovaných pozitivních účinků konzumace vína na snížení výskytu kardiovaskulárních chorob byl vědeckými pokusy ve světě i u nás doložen vliv vína na další systémy lidského těla: výsledky prokázaly, že střídmé pití vína chrání až o 40 % proti vzniku cévní mozkové příhody, potvrdily nižší výskyt vysokého krevního tlaku, snížení výskytu onemocnění diabetes mellitus 2. typu, pozitivní vliv na mentální funkce u osob pokročilého věku, na snížení celkové úmrtnosti a prodloužení délky života (ŠAMÁNEK, 2011). Flavonoidy obsažené ve víně ovlivňují činnost trávicího traktu, zlepšují bakteriální fermentaci a tím vstřebávání vitamínů a minerálních látek, potlačují zánětlivé reakce a mají významný podíl na snížení vzniku rakoviny zažívacího traktu, pomáhají chránit plicní tkáň, omezují riziko postižení demencí a Alzheimerovou chorobou (KOLEKTIV AUTORŮ, [b.r.]). První systematická pozorování, týkající se 34

35 zdraví prospěšných účinků konzumace vína, byla získána v rámci rozsáhlého projektu MONICA, který iniciovala v roce 1983 Světová zdravotnická organizace, a do něhož se zapojila populace 21 zemí světa po dobu 10 let. Jedním z předpokladů, který ze studie vyplynul, byla perspektiva větší délky života pro ty, kteří vypili denně 20 až 40 gramů alkoholu, což odpovídá asi 0,2 až 0,4 litru vína (MORENO-ARRIBAS et al., 2009). V současnosti se na základě experimentů a zkušeností můžeme setkat jednak s názorem, že alkohol obsažený ve víně má pro zdravotní působení větší význam, než další chemicky a farmakologicky identifikované látky izolované z vína (HARMATA, 2011), jednak s myšlenkou, že některé z přítomných látek ve víně dodávají příznivý účinek příjmu malého množství alkoholu (GRØNBÆK et al., 2000), a že alkohol a flavonoidy obsažené ve víně mají pozitivní synergický efekt na některá zdravotní rizika (VERMERRIS et al., 2006). Zdravotní přínos vína i jiného alkoholického nápoje lze konstatovat pouze tehdy, pokud je jeho spotřeba střídmá a v mírných dávkách. Doporučené dávky mírného pití alkoholu jsou v různých zemích rozdílné a vycházejí nejen ze snahy zabránit vzniku chorob, ale také z kulturních zvyklostí a společenských norem. Například Francie je jedna z mála zemí s nejvyšší přijatelnou denní dávkou alkoholu, tedy 60 g pro muže a 36 g pro ženy. Světová zdravotnická organizace doporučuje hodnotu nízké denní dávky 10 až 30 g alkoholu, v České republice se odborné názory ustálily přibližně na 20 až 40 g alkoholu, nejlépe ve formě vína, tj. asi 2 až 4 dl denně pro muže, a na 20 až 30 g na den pro ženy (ŠAMÁNEK et al., 2010). Nízké, přesto účinné dávky přijímaného alkoholu jsou často dávány do souvislosti s principem hormeze, mechanizmem, díky kterému jsou buňky udržovány ve funkčním a regenerace schopném stavu (HARMATA, 2011). Dá se říct, že v organizmu, vystaveném nízkým koncentracím nepříznivých vlivů, jakým požití alkoholu může být, dojde vlivem stresu ke spuštění opravných mechanizmů (ZELENKA, 2011). Takový účinek HARMATA (2011) přirovnává k očkování, kdy malá dávka oslabených bakterií stimuluje imunitní systém, kdežto vysoká dávka má již kvalitativně jiný účinek a vyvolává chorobu. S ohledem na epidemiologické studie, které naznačují korelaci mezi vysokou spotřebou flavonoidů a snížením rizika vzniku rakoviny, kardiovaskulárních chorob a další nemocí, jeví se podpora jejich biosyntézy v plodinách jako přínosná pro lidské zdraví (VERMERRIS et al., 2006). Na druhou stranu je zapotřebí poukázat na to, že i přes intenzivní výzkum zatím nelze dát jednoznačné závěry ohledně biologických účinků 35

36 rostlinných polyfenolů v množstvích přijímaných potravou. Jejich hodnocení je značně problematické. Některé flavonoidy např. vykazují spasmolytické (křeče uvolňující), protizánětlivé a protinádorové účinky, jiné mají ochrannou funkci u rostlin proti virovým a mikrobiálním infekcím. A naopak, některé sloučeniny mají také estrogenní či karcinogenní účinky, pro které se tyto skupiny látek řadí k přirozeným toxickým složkám potravin (VELÍŠEK, 2002). Flavonoidy patří mezi chirální látky, což znamená, že nejsou totožné se svým zrcadlovým obrazem. Mohou se tedy vyskytovat ve dvou různých formách a lišit se vzájemně svými vlastnostmi, zejména biologickou aktivitou, kdy jedna z nich může vykazovat účinky pozitivní, druhá nikoliv (SRKALOVÁ et al., 2008). Přirozená ochrana rostlin proti škodlivým vlivům může přinášet svá úskalí. Člověk se snaží z plodin toxické a nepoživatelné sekundární metabolity odstraňovat pomocí molekulárních technik genetického inženýrství. Řada rostlinných složek, které jsou pro člověka škodlivé, se rozkládají při úpravě potravy. Třebaže většina z nich není tímto způsobem zničena a při vyšších koncentracích jsou karcinogenní, zkušenosti ukázaly, že lidský metabolismus obvykle poskytuje dostatečnou ochranu proti těmto přírodním látkám (HELDT et al., 2005). Navíc, množství flavonoidů, které by mohlo působit mutagenně či cytotoxicky, by nemělo být dosažitelné z běžné stravy, čímž je zřejmé, že strava bohatá na flavonoidy přináší ochranu před mnohými onemocněními (SKIBOLA et al., 2000). Vzhledem k tomu, že velké množství důkazů o pozitivních léčebných a preventivních účincích flavonoidů na lidské zdraví je odvozeno z laboratorních in-vitro výzkumů, je obtížné vyvozovat jednoznačné závěry a navrhovat systémová řešení. Sloučenina může působit například jako antioxidant v jednom ekologickém systému a naopak bude neutrální nebo dokonce prooxidační v jiné zemi (MULDOON et al., 1999). Stále existuje mnoho nezodpovězených otázek v oblasti biosyntetického vzniku rostlinných sloučenin, regulace jejich hromadění a role, kterou v rostlinách hrají. Je téměř jisté, že rostliny mají více než jednu cestu pro biosyntézu potlačovaného metabolitu, a že blokování této cesty, například snahou člověka o eliminaci vytvářené látky, bude kompenzováno zvýšeným tokem prostřednictvím cesty jiné (PAIVA, 2002). Poznatky prozatím nejsou podporovány dostatečně silnými a jednoznačnými důkazy ověřenými na reprezentativním vzorku lidských dobrovolníků ve studiích in-vivo, které by prozkoumaly intracelulární metabolismus, účinky a akumulaci flavonoidních metabolitů v lidských orgánech (MANACH et al., 2004). Podobně není k dispozici relevantní 36

37 dlouhodobý výzkum zabývající se příjmem flavonoidů z průmyslově vyráběných potravinových doplňků. Podle názorů odborníků, vysoká koncentrace a tělu nepřirozené dodání mohou vytvářet nerovnováhu a neočekávané efekty, kdy nežádoucí účinky flavonoidů převáží nad jejich blahodárnými. Obsah těchto látek v nutričních doplňcích může dosahovat množství 20 až 100 krát vyšší, než jak je tomu v přírodních potravinách (FUHRMAN, 2007). Můžeme očekávat, že integrace výsledků minulých i budoucích experimentů do různých oborů, včetně biochemie, buněčné biologie, fyziologie, epidemiologie a potravinářské chemie, přinese přesnější určení účinných flavonoidních a dalších fenolických látek a stanovení optimální úrovně jejich příjmu (SCALBERT et al., 2005). Zkoumání bioaktivity flavonoidů a ostatních fenolických látek, stejně tak hledání zdraví prospěšných sloučenin, vede k pochopení jejich vlivu na kvalitu naší stravy a jejich využitelnosti v oblasti prevence nebo léčby onemocnění Některé synergické vztahy V mnoha klinických studiích, ale i v biologických testech s tkáňovými kulturami, v pokusech na zvířatech a s lidskými dobrovolníky, se opakovaně prokázalo, že flavonoidní látky nemají pouze aditivní nebo inhibiční, ale často synergistické účinky (ZLOCH, 2003a). V této souvislosti chci zmínit některé z nich. Resveratrol Kombinace kvercetinu a katechinu s jiným polyfenolem neflavonoidní povahy, resveratrolem, dokázala v laboratorních podmínkách výrazně snížit buněčné množení a zablokovat progresi buněčného cyklu, což hraje důležitou úlohu při omezení růstu nádorů (VERMERRIS et al., 2006). Resveratrol je v takových případech zpracováván enzymem, který se nachází v množství různých nádorů, a podílí se tak na protinádorové aktivitě (POTTER et al., 2002). V tradiční japonské a čínské medicíně, extrahován v roce 1982 ze sušeného kořene Polygonum cuspidatum, tvoří hlavní účinnou látku preparátu Kojo-kon k léčbě širokého spektra postižení, včetně plísňových onemocnění, chorob srdce, jater a cév (SOUTH, [b.r.]). Resveratrol je polyfenol, derivát stilbenu, který byl nalezen ve více než 72 rostlinných druzích, včetně révy vinné. V révě vzniká ve zvýšené míře jako odpověď na stres, po napadení plísněmi nebo po expozici 37

38 UV zářením. Vyskytuje se ve vysoké koncentraci 50 až 100 mikrogramů na gram především ve slupce bobulí, a proto se díky maceraci slupek při výrobě vína dostává i do červeného vína, přibližně 1,5 až 3 mg.l -1. V bílých vínech je ho mnohonásobně méně (VERMERRIS et al., 2006). Resveratrol se stal nejvíce zkoumaným faktorem francouzského paradoxu. Existuje ve formě dvou geometrických izomerů trans- a cis-, přičemž v rostlinách převažuje biologicky aktivnější forma trans-. Ačkoli se vyskytuje také glykosidicky vázaný, v lidském organizmu dochází k jeho hladké absorpci (ŠMIDRKAL et al., 2001). U člověka se resveratrol po požití velmi dobře vstřebává, ale je také velmi rychle metabolizován a vyloučen. Aby byla tělu dodána skutečně účinná dávka resveratrolu, znamenalo by to vypít téměř 200 l červeného vína. Dosavadní experimentální výsledky jeho pozitivního vlivu proti oxidaci LDL-cholesterolu (nízkodenzitního lipoproteinu), proti shlukování krevních destiček, jeho protizánětlivého účinku a blokační schopnosti růstu viru chřipky, byly dokladovány prozatím pouze v buněčných kulturách nebo u zvířat. Jeho pomyslná úloha v tzv. francouzském paradoxu je z těchto důvodů přehodnocována (ŠAMÁNEK et al., 2010). Sirtuiny Resveratrol je jednou z látek, která je dávána do souvislosti s pozitivním vlivem na sirtuiny, proteiny umožňující buňce oddálit svůj zánik (apoptózu) nebo se lépe zotavit z poškození (SLÍVA, 2011). V laboratorních podmínkách resveratrol zvyšuje aktivitu genů, přezdívaných geny dlouhověkosti, genů produkujících sirtuin, který chrání DNA před poškozením a činí dědičnou informaci odolnější. Právě v účincích resveratrolu vidí řada vědců vysvětlení pro tzv. francouzský paradox. Nicméně, jeho aktivační účinek na sirtuiny v lidském organizmu zatím s jistotou nepotvrdila žádná vědecká studie (LI, 2008). Acutissimin A Další léčebnou látkou, která byla v nedávné době objevena v červeném víně, je acutissimin A, polyfenol, zjištěný v sudech vyrobených z dubu Quercus acutissima. Vlivem ležení a zrání vína v sudech dochází k jeho přechodu do vína. V laboratorních podmínkách se podařilo acutissimin vytvořit reakcí substance zvané vescalagin (formy taninu izolovaná z dubového dřeva) s katechinem. Acutissimin A má schopnost inhibovat u rakovinných buněk replikaci jejich DNA a tím blokovat jejich další množení. Testy prokázaly až 250 krát silnější protirakovinný účinek, než jaký má dnes klinicky užívaný protinádorový lék etoposid (QUIDEAU et al., 2003; PAZDERA, 2003). 38

39 4. MATERIÁL A METODY Praktická část bakalářské práce byla zaměřena na vyhodnocení analýzy flavonoidů ve vybraných vzorcích červeného a bílého vína. K tomuto účelu byla použita separační metoda vysoko-účinné kapalinové chromatografie HPLC, jejíž podstatou je opakovaná distribuce separovaných látek s odlišnými fyzikálními a chemickými vlastnosti mezi mobilní a stacionární fázi. Metoda je významná především při separaci a přesném stanovení komplikovaných směsí látek, proto je stěžejní metodou pro identifikaci fenolických sloučenin. Měření bylo provedeno v laboratoři Ústavu vinohradnictví a vinařství ZF MENDELU v Lednici POUŽITÉ CHEMIKÁLIE Sestavy rozpouštědel pro mobilní fázi: acetonitril (ACN) a methanol (MeOH). Standardy fenolických látek: katechin, epikatechin, kyselina vanilová, kyselina protokatechuová, kyselina 4-hydroxybenzoová, kyselina gallová, kyselina syringová, kyselina p-kumarová, kyselina kávová, kyselina ferulová, piceatannol, trans-resveratrol, rutin, myricetin, kvercetin, kaemferol, isorhamnetin, p-dimethylaminocinnamaldehyd (DMACA) pocházely od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), malvidin-3,5-diglukosid pocházel od Indofine Chemical Company. Inc. (Hillsborough, NJ). Činidla: Folin-Ciocalteauovo činidlo, 2,2-difenyl-β-pikrylhydrazylový radikál (DPPH), 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ) a kyselina chloristá pocházely od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). 4.2 REÁLNÉ VZORKY VÍNA Metoda HPLC byla aplikována na šesti vybraných vzorcích vína: zvolena byla tři červená vína odrůd Rulandské modré, Laurot a Kofranka, a tři bílá vína odrůd Aurelius, Auxerrois a Ryzlink rýnský.. 39

40 Rulandské modré velmi stará odrůda pocházející z Francie, především z oblastí Burgundska a Champagne, vznikla pravděpodobně křížením odrůd Tramín červený a Mlynářka. Vína jsou světlejší cihlové barvy, jejich aroma je výrazně ovocné s tóny višní, švestek a lesního ovoce, v chuti jsou vysoce extraktivní, plná a kořenitá (PAVLOUŠEK, 2007). Obrázek 6 Rulandské modré (SOTOLÁŘ, 2006) Laurot česká interspecifická odrůda vyšlechtěná křížením odrůd Merlan a Fratava, vhodná pro biologické vinohradnictví. Víno má výraznou rubínovou barvu, ve vůni i chuti s tóny třešní, višní a vyzrálého lesního ovoce, celkově plné a harmonické, s výraznější tříslovinou (PAVLOUŠEK, 2007). Obrázek 7 Laurot (PAVLOUŠEK, 2007) Kofranka interspecifická odrůda českého původu, kříženec odrůd Merlan a Fratava, taktéž vhodná pro biologické vinohradnictví a produkci biovína. Charakterizuje ji víno s velmi intenzivní tmavočervenou barvou, s výraznou vůní po sušených švestkách, višních a po lesním ovoci, jeho chuť je plná, extraktivní (PAVLOUŠEK, 2007). Obrázek 8 Kofranka (PAVLOUŠEK, 2011b) 40

41 Aurelius - česká odrůda vzniklá křížením odrůd Neuburské a Ryzlink rýnský. Poskytuje vína typu Ryzlinku rýnského. Dává plná, aromatická vína se zastoupením květinových tónů a s podtónem domácího ovoce jako je jablko, hruška, meruňka, broskev (PAVLOUŠEK, 2007). Obrázek 9 Aurelius (SOTOLÁŘ, 2006) Auxerrois velmi stará odrůda pocházející z Francie, vznikla pravděpodobně volným křížením odrůd Rulandské modré s odrůdou Heunisch bílý. Víno je ovocné ve vůni a plné v chuti, velmi kvalitní, plné a harmonické, se svěží kyselinou (PAVLOUŠEK, 2007). Obrázek 10 Auxerrois (PAVLOUŠEK, 2007) Ryzlink rýnský velmi stará odrůda pocházející z německého Porýní, kde vznikla pravděpodobně jako kříženec mezi odrůdou Heunisch bílý a planou révou vinnou Vitis vinifera var. sylvestris. Víno má výrazné aroma s tóny zeleného jablka, kdoule, meruněk, broskví, doplněné vůní lipového květu. Chuť je plná a extraktivní, se svěží kyselinou (PAVLOUŠEK, 2007). Obrázek 11 Ryzlink rýnský (PAVLOUŠEK, 2011c) 41

42 4.3 HPLC STANOVENÍ Koncentrace jednotlivých fenolických látek byla stanovena metodou s přímým nástřikem vzorku. Vína byla odstředěna (relativní odstředivé zrychlení 3000 g; po dobu 6 min). Bílá vína byla 2 zředěna 50 mm kyseliny chloristé (HClO 4), červená vína byla 4 zředěna 30 mm kyseliny chloristé (HClO 4). Instrumentace: Binární vysokotlaký systém Shimadzu LC-10A Systém řízení: SCL-10A VP Shimadzu Čerpadla: LC-10AD VP Kolonový termostat s manuálním nástřikovým ventilem Rheodyne: CTO-10AC VP Diode array detector: Shimadzu SPD-M10A VP Software pro vyhodnocení: LC Solution Podmínky separace: Kolona: Alltech Alltima C18 (3 μm; mm + předkolona 3 7,5 mm) Teplota separace: 60 C Objem nástřiku vzorku: 20 µl Průtok mobilní fáze: 0,6 ml.min -1 Mobilní fáze A: 15 mm kyseliny chloristé (HClO 4) Mobilní fáze B: 15 mm kyseliny chloristé (HClO 4 ), 10 % methanolu (MeOH), 50 % acetonitrilu (ACN) Gradientový program: 0,00 min 2 % B 20,00 min 26 % B 30,00 min 45 % B 35,00 min 70 % B 37,00 min 100 % B 38,00 min 100 % B 38,01 min 0 % B 39,99 min 0 % B 40,00 min 2 % B 45,00 min 2 % B 42

43 Celková doba mezi dvěma vzorky byla 45 minut. Data v rozmezí vlnové délky nm byla zaznamenávána 41 minut. Stanovení jednotlivých složek na základě kalibračních křivek standardů: 200 nm: katechin; epikatechin 260 nm: kyselina vanilová; kyselina protokatechuová; kyselina 4-hydroxybenzoová 280 nm: kyselina gallová; kyselina syringová; cis-piceid; cis-resveratrol 310 nm: kyselina p-kumarová a její deriváty; trans-piceid; trans-resveratrol 325 nm: kyselina kávová a její deriváty; kyselina ferulová a její deriváty; piceatannol 360 nm: rutin; myricetin; kvercetin; kaemferol; isorhamnetin 520 nm: anthokyany Deriváty hydroxyskořicových kyseliny byly kalibrovány základními kyselinami, od kterých jsou odvozeny. Anthokyany byly kalibrovány na malvidin-3,5-diglukosid. 43

44 5. VÝSLEDKY Pro účely vyhodnocení obsahu flavonoidů ve víně byly ze všech identifikovaných fenolických látek v praktické části práce dále porovnávány pouze vybrané třídy flavonoidů, které jsou pro zastoupení ve vínech nejobvyklejší: - Flavanoly: katechin, epikatechin - Flavonoly: kvercetin, kaempferol, myricetin, rutin - Anthokyanidiny: cyanidin, malvidin, delphinidin, petunidin, peonidin a zástupce polyfenolických stilbenů: - Trans-Resveratrol Výsledky byly uspořádány do tabulek a začleněny do srovnávacích grafů tak, aby bylo možno porovnávat zastoupení sledovaných látek jak z pohledu jejich klasifikace, tak z pohledu vzorků vín. Jak je zřejmé z tabulky 6 a obrázku 12, nejvýznamnější zastoupení katechinu a epikatechinu, téměř 250 mg.l -1, bylo zjištěno ve vzorku Rulandské modré, výrazně méně již ve zbývajících dvou červených vínech Laurot a Kofranka. U bílých vín byly naměřeny hodnoty blížící se nule u vína Aurelius a Ryzlink rýnský, odrůda Auxerrois vykazovala obsah 10 mg.l -1. Tabulka 6 Obsah flavanolů a flavonolů (mg.l -1 ) ve vzorcích vín různých odrůd ČERVENÁ VÍNA Katechin Epikatechin Kvercetin Kaempferol Myricetin Rutin Rulandské modré 249,76 101,00 0,00 0,00 0,00 1,67 Laurot 46,35 37,40 1,36 0,05 0,76 10,81 Kofranka 25,65 25,36 0,10 0,05 1,05 1,18 BÍLÁ VÍNA Aurelius 0,74 1,50 0,00 0,00 0,00 0,00 Auxerrois 10,03 4,81 0,00 0,00 0,00 0,00 Ryzlink rýnský 2,47 0,73 0,00 0,00 0,00 0,02 44

45 Obrázek 12 Zastoupení flavanolů (mg.l -1 ) Výsledky analýzy flavonolů ukázaly pouze v případě rutinu významně detekovatelnou hodnotu (přes 10 mg.l -1 ) ve víně Laurot. U Rulandského modrého a Kofranky byl rutin zaznamenán v nízkém obsahu okolo 1 mg.l -1. Rulandské modré navíc nevykázalo žádnou hodnotu kvercetinu ani myricetinu. Všechny vzorky bílých vín byly v měření obsahu flavonolů na nule, což je čitelné z tabulky 6 a obrázku 13. Obrázek 13 Zastoupení flavonolů (mg.l -1 ) Hodnoty identifikovaných anthokyanidinů ukázaly jejich zásadní zastoupení v červených vínech, a naopak u bílých vín byly hodnoty nulové nebo blížící se nule. Tabulka 7 a obrázek 14 prokazují významné koncentrace malvidinu v odrůdě Laurot (243 mg.l -1 ) a Rulandské modré (111 mg.l -1 ), u Kofranky 65 mg.l -1. Flavonoidy delphinidin a petunidin byl zaznamenán ve vyšších hodnotách ve víně Laurot, peonidin 45

46 už s nižším obsahem v Rulandském modrém a Laurotu. Téměř nulové hodnoty cyanidinu byly naměřeny u Rulandského modrého a Kofranky, velmi nízké u Laurotu. Tabulka 7 Obsah anthokyanidinů (mg.l -1 ) ve vzorcích vín různých odrůd ČERVENÁ VÍNA Cyanidin Malvidin Delphinidin Petunidin Peonidin Rulandské modré 0,16 111,65 0,52 2,88 25,39 Laurot 8,34 243,05 62,15 81,11 18,33 Kofranka 0,94 65,95 6,62 9,66 3,02 BÍLÁ VÍNA Aurelius 0 0,69 0,02 0,04 0,14 Auxerrois 0 0,16 0 0,01 0,03 Ryzlink rýnský 0 0, ,01 Obrázek 14 Zastoupení anthokyanidinů (mg.l -1 ) Laboratorní analýza zaznamenala velmi nízký obsah trans-resveratrolu ve všech vzorcích vín, jak ukazuje tabulka 8. Tabulka 8 Obsah resveratrolu (mg.l -1 ) ve vzorcích vín různých odrůd ČERVENÁ VÍNA Trans-Resveratrol Rulandské modré 0,10 Laurot 0,45 Kofranka 1,10 BÍLÁ VÍNA Aurelius 0,03 Auxerrois 0,06 Ryzlink rýnský 0,02 46

47 Nejvyšší koncentrace resveratrolu byla stanovena u vína odrůdy Kofranka, poloviční množství u Laurotu. Rulandské modré a všechna tři bílá vína obsahovala zanedbatelné množství resveratrolu. Srovnání je vidět na obrázku 15. Obrázek 15 Zastoupení resveratrolu (mg.l -1 ) Následující srovnání v tabulce 9 názorně ukazuje poměrné zastoupení jednotlivých tříd flavonoidů a resveratrolu, zvlášť ve vínech červených a zvlášť v bílých vínech. Tabulka 9 Celkové srovnání obsahu flavonoidů a resveratrolu (mg.l -1 ) ČERVENÁ VÍNA FLAVANOLY FLAVONOLY ANTHOKYANIDINY RESVERATROL Rulandské modré 350,76 1,67 140,60 0,10 Laurot 83,75 12,98 412,98 0,45 Kofranka 51,02 2,38 86,18 1,10 BÍLÁ VÍNA Aurelius 2,24 0,00 0,89 0,03 Auxerrois 14,84 0,00 0,19 0,06 Ryzlink rýnský 3,2 0,02 0,09 0,02 Analyzované vzorky červených vín se odlišovaly zastoupením jednotlivých polyfenolických látek, což pro srovnání ukazují obrázky 16 a 17. Podobně je vidět rozdílné hodnoty polyfenolů při srovnání v bílých vínech na obrázcích 18 a

48 Obrázek 16 Obsah flavonoidů a resveratrolu (mg.l -1 ) v červených vínech Obrázek 17 Poměr flavonoidů a resveratrolu v červených vínech 48

49 Obrázek 18 Obsah flavonoidů a resveratrolu (mg.l -1 ) v bílých vínech Obrázek 19 Poměr flavonoidů a resveratrolu v bílých vínech 49