Masarykova univerzita. Lékařská fakulta BAKTERIÁLNÍ PŮVODCI PRŮJMŮ - OBLIGÁTNÍ STŘEVNÍ PATOGENY. Bakalářská práce. v oboru zdravotní laborant

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta BAKTERIÁLNÍ PŮVODCI PRŮJMŮ - OBLIGÁTNÍ STŘEVNÍ PATOGENY Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jana Juránková, Ph.D. Autor: Jana Pospíchalová Brno, duben 2013

2 Jméno a příjmení autora: Jana Pospíchalová Název bakalářské práce: Bakteriální původci průjmů - obligátní střevní patogeny Pracoviště: Oddělení klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno Bohunice Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jana Juránková, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2013 Souhrn: Obligátní střevní patogeny salmonely, shigely, kampylobaktery a yersinie jsou častými původci průjmů. Z velké části případů je příčinou nákazy nevhodně zpracovaná potrava nebo nesprávné hygienické návyky vnímavého jedince. Laboratorní diagnostika se skládá z několika kroků. V první řadě je to mikroskopie, dále kultivace, biochemické určení a sérotypizace kmenů. V práci se zabývám četností výskytu těchto patogenů ve FN Brno za posledních 5 let a srovnáním výsledků s celou ČR a ostatními zeměmi. Klíčová slova: Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, obligátní střevní patogen, průjem, laboratorní diagnostika, četnost výskytu Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Jany Juránkové, Ph.D. a uvedla v seznamu literatury všechny pouţité literární a odborné zdroje. V Brně dne.

4 Cíl práce: Cílem mé bakalářské práce je popsat bakteriální původce průjmů, jejich morfologii, průběh onemocnění, která způsobují a laboratorní metody jejich stanovení z biologického materiálu pacientů. Dále je mým cílem sledovat výskyt těchto patogenů u pacientů hospitalizovaných ve FN Brno od roku 2008 do roku 2012 a srovnání četnosti výskytu s výskytem v celé České republice a ve světě. Hypotéza: Podle mě je nejčastěji se vyskytujícím obligátním střevním patogenem Salmonella enteritidis, u které dochází k nákaze prostřednictvím potravy, ve které se předem namnoţí do potřebné koncentrace. Myslím si, ţe výskyt obligátních střevních patogenů by se mohl v průběhu let postupně sniţovat, jelikoţ v dnešní době je stále více kladen důraz na hygienu..

5 Poděkování: Děkuji MuDr. Janě Juránkové, Ph.D. za odborné vedení mé bakalářské práce, za poskytnuté informace důleţité pro zpracování daného tématu, za trpělivost a ochotu poradit mi s jakýmkoliv problémem a za čas, který mi věnovala během tvoření mé práce.

6 Obsah 1. Úvod TEORETICKÁ ČÁST 2. Rod Salmonella Morfologie Antigenní struktura Značení antigenní struktury Rozdělení Primárně antropopatogenní salmonely Primárně zoo-antropopatogenní salmonely Patogenita Faktory patogenity Patogeneze Infekční dávka Klinické syndromy Tyfus a paratyfus Gastroenteritida Dlouhodobý nosičský stav Laboratorní diagnostika Rod Shigella Morfologie Antigenní struktura Rozdělení Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Patogenita Patogeneze Bacilární dysenterie Laboratorní diagnostika Rod Yersinia Yersinia pestis

7 4.1.1 Morfologie Antigenní struktura Patogenita Patogeneze Formy moru Dýmějový (bubonický) mor Plicní mor Septická forma moru Yersinia pseudotuberculosis Morfologie Antigenní struktura Patogenita Yersinia enterocolitica Morfologie Antigenní struktura Patogenita Patogeneze Laboratorní diagnostika Rod Campylobacter Morfologie Antigenní struktura Patogenita Patogeneze Laboratorní diagnostika EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 6. Materiál Metodika Kultivační vyšetření stolice na obligátní střevní patogeny Odběr primárního vzorku a transport Pouţívaná média Amiesovo transportní médium Krevní agar Endova půda SS agar

8 XLD agar Půda CIN Selektivní půdy k izolaci kampylobakterů Selenitová půda Hajnova půda Půda MIU Biochemický klín Přístroje a pomůcky Pracovní postup Sérologické reakce Sérotypizace kmenů Widalova reakce Výsledky Výskyt obligátních střevních patogenů ve FN Brno Výskyt bakterií rodu Salmonella Výskyt bakterií rodu Shigella Výskyt bakterií rodu Yersinia Výskyt bakterií rodu Campylobacter Sezónní výskyt Diskuze Výskyt obligátních střevních patogenů v ČR Výskyt obligátních střevních patogenů ve světě Závěr Seznam pouţité literatury

9 1. Úvod Akutní infekční průjmová onemocnění jsou celosvětovým problémem. Podle údajů Světové zdravotnické organizace je ročně ve světě evidováno přibliţně 3-5 miliard případů akutního průjmu. V České republice bylo v posledních letech zaznamenáno 50 aţ 60 tisíc případů průjmových onemocnění infekčního původu. Infekční průjem byl definován Světovou zdravotnickou organizací jako stav provázený dvěma nebo více řídkými stolicemi denně, nebo i jedinou řídkou stolicí, která obsahuje hlen, krev nebo hnis. Další moţná definice označuje průjem jako změnu frekvence, konzistence, barvy či objemu stolice oproti běţnému stavu u téhoţ jedince. Kaţdá definice musí splňovat podmínky náhlého rozvoje a maximálně čtrnáctidenního trvání. ( Mezi časté bakteriální původce průjmů řadíme bakterie z rodu Salmonella, Yersinia, Shigella a Campylobacter. Jedná se o gramnegativní tyčinky nenáročné na kultivaci. Tyto obligátní střevní patogeny zpravidla způsobují pouze střevní infekce, ale u oslabených osob, např. osob s imunodeficiencí, novorozenců, popřípadě u starších lidí mohou některé z těchto bakterií, např. Yersinia pestis, vyvolat závaţné celkové infekce (sepse). Hlavní komplikací průjmu je dehydratace. Při velkých ztrátách tekutin a elektrolytů můţe dehydratace vést aţ k metabolickému rozvratu a déletrvající deficit vody při nedostatečném příjmu a výrazných ztrátách stolicí a zvracením vede aţ k selhání ledvinných funkcí. ( Diagnostiku střevních patogenů lze provádět jak přímým průkazem, tak nepřímo. Přímý průkaz spočívá v mikroskopickém vyšetření a dále v kultivaci, nepřímý průkaz se provádí průkazem protilátek pomocí aglutinace nebo tzv. Widalovou reakcí. (Votava aj. 2000) - 9 -

10 TEORETICKÁ ČÁST 2. Rod Salmonella Salmonela byla objevena v roce 1885 doktorem Theobaldem Smithem v ústavu veterinární mikrobiologie D. E. Salmona, odtud pochází její název. (Votava aj. 2003) Salmonely jsou ve světě hlavní příčinou alimentárních infekcí a výskyt salmonelóz v posledních letech stoupá. (Greenwood aj. 1999) 2.1 Morfologie Salmonely jsou typické bakterie čeledi Enterobacteriaceae a jedná se o gramnegativní fakultativně anaerobní nesporulující tyčinky schopné pohybu. Jsou 2-3 µm dlouhé a přibliţně 0,5 0,8 µm široké (Obr. 1). Enterobakterie jsou si navzájem velmi podobné a od jiných gramnegativních tyčinek se o mnoho neliší, proto je význam morfologie v diagnostice zanedbatelný. (Greenwood aj. 1999) Obr. 1 Salmonella (Zdroj: Antigenní struktura Antigenní struktura je pro charakteristiku salmonel velmi důleţitá. K zařazení mikroba mezi salmonely postačí několik biochemických testů a průkaz několika antigenů. Přesné určení vyţaduje hlubší antigenní analýzu. Typická salmonela má dva soubory antigenů, jeţ lze sérologicky snadno prokázat. Jedná se o O antigeny a H antigeny. O antigeny jsou somatické termostabilní polysacharidy lipopolysacharidu buněčné stěny, H antigeny jsou strukturní bílkoviny bičíků. Bičíky většiny salmonel mají dvojfázovou variaci, jeţ spočívá v existenci dvou alternativních forem

11 definovaných dvěma různými soubory genů. Při expresi jednoho z těchto souborů genů bičík obsahuje jeden nebo více antigenů fáze 1, naopak pokud je exprimován druhý soubor, syntetizuje buňka jeden nebo více antigenů fáze 2. Některé salmonely syntetizují také povrchový polysacharid, z nichţ největší význam má Vi antigen, který znesnadňuje detekci O antigenu. (Greenwood aj. 1999) Značení antigenní struktury O antigeny se číslují arabskými číslicemi, bičíkové antigeny fáze 1 se označují malými písmeny a bičíkové antigeny fáze 2 malými písmeny i číslicemi. Označení antigenní struktury má tři části, popisující po řadě O antigeny, H antigeny fáze 1 a H antigeny fáze 2. Části se oddělují dvojtečkou a sloţky v kaţdé části čárkami. Do této doby bylo popsáno 2000 sérotypů a všechny byly pojmenovány. Nejvíce se vyskytující sérotypy jsou uvedeny v tab. 1. (Greenwood aj. 1999) S. typhi 9, 12, [Vi] : d : - S. paratyphi B 1, 4, 5, 12 : b : 1,2 S.typhimurium 1, 4, 5, 12 : i : 1,2 S. enteritidis 1, 9, 12 : g, m : 1,7 S. virchow 6, 7 : r : 1,2 S. kedougou 1, 13, 23 : i : l, w S. hadar 6, 8 : Z 10 : e, n, x S. heidelberg 1, 4, 5, 12 : r : 1,2 S. infantis 6, 7, 14 : r : 1,5 Tab. 1. Označení antigenní struktury nejčastěji se vyskytujících sérotypů (Zdroj: Greenwood aj. 1999) 2.3 Rozdělení Během desetiletí bylo objeveno a popsáno mnoho sérovarů salmonel, které byly povaţovány za jednotlivé druhy. Dnes uţ je jich více neţ dva tisíce a tak vznikl nový pohled na taxonomii salmonel, který je rozděluje na dva druhy s několika poddruhy. (Votava aj. 2003) Primárně antropopatogenní salmonely Do této skupiny patří Salmonella typhi a Salmonella paratyphi A, B a C. Tyto salmonely jsou pro člověka primárně patogenní a na člověka jsou adaptovány. Ze zvířat se velmi zřídka dají izolovat. Jedná se o velmi závaţné původce břišního tyfu a paratyfu. (Votava aj. 2003)

12 2.3.2 Primárně zoo - antropopatogenní salmonely Tyto salmonely mají široké hostitelské spektrum a lze je izolovat z mnoha ţivočišných druhů. U nás patří mezi nejběţnější původce bakteriálních střevních nákaz. Mezi zoo - antropopatogenní salmonely řadíme Salmonella typhymurium, Salmonella enteritidis, nebo také Salmonella infantis. (Greenwood aj. 1999, Votava aj. 2003) 2.4 Patogenita Patogenita salmonel je trojího typu. První skupina salmonel vyvolává septická onemocnění. Do této skupina patří např. Salmonella typhi a paratyphi, které způsobují tyfus a paratyfus, jak jiţ bylo zmíněno. Druhá skupina salmonel vyvolává hnisavá onemocnění např. v kloubech, na meningách, nebo v kostech a patří sem Salmonella choleraesuis, Salmonella dublin, Salmonella panama a Salmonella wirchow. Jedná se o tzv. salmonelózy s lokální manifestací. Do třetí skupiny řadíme sérotypy vyskytující se u více ţivočišných druhů, které způsobují enterokolitidy charakteru otravy z potravin, většinou nazývané salmonelózy. (Bednář aj. 1996) 2.5 Faktory patogenity Jasně prokázaným faktorem patogenity je postranní řetězec O-antigenu, který se uplatňuje jako blokátor fagocytózy a brání téţ aktivaci komplementu alternativní cestou. Mechanismus tohoto účinku je moţno si částečně představit jako jakési distanční zařízení; imunitní reakce s tímto bohatě rozvinutým O-antigenem probíhá v bezpečné vzdálenosti od důleţitých struktur bakterie. Povrchové proteiny umoţňují průnik bakterie do eukaryotických buněk. K faktorům virulence patří téţ produkce cytotoxinů, které poškozují epiteliální buňky. Některé salmonely tvoří enterotoxiny. (Bednář, M. a kolektiv, Lékařská mikrobiologie) 2.6 Patogeneze Infekce začíná tím, ţe se do trávicího ústrojí dostanou salmonely v dostatečném počtu, aby překonaly obranné mechanismy organismu, jako je odpověď imunitního systému nebo např. kyselá reakce ţaludku, a usídlí se v tenkém střevě. Mnohé pokusy potvrdily, ţe k infekci dojde pouze poté, co se salmonely dostanou aţ do jícnu. (Greenwood aj. 1999) Jakmile se bakterie dostanou do střevního lumina, začnou se mnoţit. Pomocí adheziv přilnou k mikroklkům sliznice tenkého střeva. Epitelie mají na povrchu specifické receptory obsahující manózu, na něţ se adheziny váţou. V membránách buněk mikroklků se pak vytváří drobné trhliny, jimiţ salmonely pronikají do buňky, kde se mnoţí. Pomnoţují se také v makrofágách Peyerových plaků. Pronikají také do submukózy a odtud do regionálních

13 lymfatických uzlin. Všechny klinické projevy salmonelové infekce, včetně průjmů, začínají aţ po průniku tenkým střevem. (Greenwood, D.;Slack, R. C. B; Peutherer, J. F. a kol. Lékařská mikrobiologie) 2.7 Infekční dávka Na skutečnost, kolik salmonel se musí dostat do organismu, aby propukla infekce, není jednotný názor. Rozvoj infekce po expozici patogenním mikrobům je dán určitou pravděpodobností. Při kontaktu jednoho mikroba s potenciálním hostitelem je jen malá pravděpodobnost, ţe vznikne infekce. Patogen je většinou eliminován bez jakýchkoli následků. Čím více mikrobů pronikne do hostitelského organismu, tím se pravděpodobnost bakteriální infekce zvětšuje. Infekční dávku ovlivňuje mnoho faktorů, např. jeden sérotyp zahrnuje kmeny s různou virulencí. Čím více je daný kmen virulentní, tím menší dávka bude zapotřebí k propuknutí infekce. Záleţí také na způsobu, jakým se bakterie dostanou do ţaludku, např. bakterie ve vodě a v nápojích projdou ţaludkem rychle a ţaludeční šťáva je nestačí inaktivovat. Infekční dávka také závisí na věku a odolnosti hostitele a na jeho obranných mechanismech schopných eliminovat patogenní částice. (Greenwood aj. 1999) 2.8 Klinické syndromy Salmonely mohou způsobovat velmi široké spektrum klinických projevů onemocnění. Mezi tři hlavní onemocnění způsobené salmonelami patří břišní tyfus a paratyfus, gastroenteritida a asymptomatický nosičský stav. (Greenwood aj. 1999) Tyfus a paratyfus Břišní tyfus je způsoben bakterií Salmonella typhi, paratyfus je způsoben bakterií Salmonella paratyphi typu A, B, nebo C. Onemocnění se stejnými příznaky však můţe způsobit za určitých okolností kterýkoli jiný sérotyp. Po průniku bakterií sliznicí ilea se bakterie lymfatickou cestou dostanou do mezenterických uzlin, kde se pomnoţí a odtud se dostávají do krevního oběhu. Při těchto onemocněních způsobují salmonely nejprve primární a poté sekundární bakteriémii. Při primární bakteriémii, v prvních dvou týdnech inkubační doby, salmonely infikují játra, ţlučník, slezinu, ledviny a kostní dřeň. V těchto orgánech se salmonely pomnoţí a poté přecházejí zpět do krve a tak vzniká sekundární bakteriémie. Současně se sekundární bakteriémií nastupují horečky a ostatní klinické projevy. Ze ţlučníku se poté salmonely dostanou zpět do tenkého střeva a

14 v Peyerových placích a v ostatní lymfatické tkáni se rozvine zánětlivá reakce. Po infiltraci makrofágy se objeví nekróza a vznikají charakteristické tyfové vředy. Interval mezi infekcí a prvními příznaky onemocnění je různě dlouhý, můţe trvat 3 aţ 50 dní, většinou je to asi dva týdny. Příznaky jsou zpočátku neurčitého charakteru. Nejčastěji se jedná o suchý kašel a krvácení z nosu, nechutenství, úporná bolest hlavy, bolest v břiše. Pacienti si často stěţují na zácpu. U neléčených pacientů v prvním týdnu postupně stoupá teplota, která trvá asi 7-10 dní a v týdnu prudce klesá. Zdrojem nákazy je pouze člověk, buď nemocný, nebo se jedná o bacilonosiče, u kterého se salmonely nacházejí ve ţlučníku. Přenos nákazy probíhá přes fekálně kontaminovanou vodu. Léčba tohoto onemocnění se provádí pomocí chloramfenikolu, který je podáván perorálně, ale i intravenózně u těţce nemocných pacientů trpících anorexií, nadýmáním, popřípadě zvracením. Léčba musí trvat 14 dní, při kratší době léčby můţe docházet k relapsu. Alternativní léčba můţe být prováděna také pomocí ampicilinu a kotrimoxazolu. V případě rezistence bakterií k výše uvedeným látkám je moţné pouţít ciprofloxacin. (Greenwood aj. 1999) Gastroenteritida K původcům gastroenteritidy patří nejčastěji Salmonella typhimurium a Salmonella enteritidis. Tato onemocnění jsou poměrně častá. Zdrojem nákazy bývají potraviny a bakterie v nich obsaţené se musejí před poţitím pomnoţit do infekční koncentrace. Rezervoárem infekce jsou různí obratlovci. Charakteristickými znaky akutní gastroenteritidy je nauzea, zvracení, bolest v břiše, bolest hlavy, malátnost, průjem a horečka. Inkubační doba je 8 48 hodin. Nástup je rychlý, klinický průběh krátký, akutní stádium trvá většinou 2 3 dny a poté dochází ke spontánnímu uzdravení. V tomto případě mají antibiotika omezený význam. Především se musí nahradit ztráta tekutin a elektrolytů, aby nedošlo k dehydrataci z nadměrné ztráty tekutin zvracením a průjmem, dále se symptomaticky léčí nauzea, zvracení a bolest. (Greenwood aj. 1999) Dlouhodobý nosičský stav Salmonely se po uzdravení vylučují stolicí ještě několik dní aţ měsíců. Dlouhodobý nosičský stav se nachází u osob, které salmonely vylučují stolicí rok a déle. Chronické nosičství můţe nastat po infekci kterýmkoli sérotypem, nejčastěji to však bývá Salmonella typhi. Bakterie

15 jsou přítomny ve ţlučovém měchýři nebo v močovém ústrojí a vylučují se stolicí, popřípadě močí. Léčba u dlouhodobého nosičského stavu je velmi obtíţná. (Greenwood aj. 1999) 2.9 Laboratorní diagnostika Diagnostiku salmonel lze provádět jak přímým průkazem, tak nepřímo. Provádí se z kmenů izolovaných z krve, ze stolice nebo z moče. (Greenwood aj. 1999, Votava aj. 2000) Přímý průkaz spočívá v kultivaci. Na Endově agaru tvoří salmonela laktózanegativní kolonie. Jako speciální půdy, určené především k identifikaci salmonel se pouţívají půdy deoxycholátcitrátová (DC), XLD a MAL. Na půdách XLD a MAL tvoří salmonely bledé kolonie s černým středem, kde černá barva souvisí s tvorbou sulfidů. Současně s naočkováním těchto půd se materiál očkuje i do pomnoţovací tekuté půdy obsahující seleničitan sodný. Řadu kmenů je moţné zachytit aţ s následným vyočkováním této půdy. Velmi důleţitá pro identifikaci salmonel je jejich biochemická aktivita. Pozitivní je test na produkci sirovodíku, štěpí glukózu a mannitol, nikoli však laktózu a sacharózu, tvoří plyn z glukózy a dekarboxylují lysin. Po kultivaci a určení biochemické aktivity následuje určení sérotypu izolované salmonely pomocí sklíčkové aglutinace s hyperimunními séry proti tělovým i bičíkovým antigenům. (Votava aj. 2000) Významnější, zejména u nosičů, je průkaz nepřímý. Nepřímý průkaz je prováděn tzv. Widalovou reakcí. Tato reakce spočívá v průkazu protilátek v séru pacienta proti tělovým i bičíkovým antigenům. Jako významné a pozitivní se u Widalovy reakce hodnotí titry 100 a více. (Votava aj. 2010) 3. Rod Shigella V roce 1897 japonský bakteriolog Kioshi Shiga objevil bakterii zodpovědnou za bacilární úplavici a tato bakterie byla pojmenována podle svého objevitele Shigella. (Votava aj. 2003) 3.1 Morfologie Shigely jsou typické bakterie z čeledi Enterobacteriaceae. Jedná se o gramnegativní 1-4 µm dlouhé a 0,3-1 µm široké tyčinky a na rozdíl od většiny střevních patogenů jsou nepohyblivé (Obr. 2). Ze všech enterobakterií jsou shigely nejméně odolné vůči zevním vlivům. (Greenwood aj. 1999, Votava aj. 2003)

16 Obr. 2 Shigella (Zdroj: Antigenní struktura Shigely lze typizovat pomocí O antigenu. O antigeny pomáhají při druhovém určení shigel, neboť biochemicky se tyto druhy rozlišují poměrně špatně. (Votava aj. 2003) 3.3 Rozdělení Rod Schigella se podle biochemických a sérologických znaků dělí do čtyř druhů: Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii a Shigella sonnei. (Greenwood aj. 1999) Shigella dysenteriae Shigella dysenteriae je podskupinou rodu Shigella s 12 sérotypy, z nichţ kaţdý má jeden hlavní antigen. Jedná se o bakterii s nízkou rezistencí na zevní vlivy, avšak infekční dávka je velmi nízká. Zdrojem infekce je pouze člověk. Shigella dysenteriae sérotyp 1 produkuje výrazný toxin. Tento toxin účinkuje jako enterotoxin na kličce králičího tenkého střeva, jako neurotoxin pro myš a jako cytotoxin na buněčné kultury Hela a VERO. Je sloţen ze dvou subjednotek. Subjednotka A učinkuje jako N - glykosydáza, která odštěpuje adenin na ribozomové subjednotce. Důsledkem je inhibice proteosyntézy. Shigella dysenteriae je primárním patogenem pro člověka a pro primáty a vyvolává bacilární dysenterii. Nejtěţší průběh má infekce způsobená sérotypem 1. Hlavním mechanismem patogenního působení je průnik do sliznice tlustého střeva, intracelulární mnoţení v těchto buňkách a jejich poškození za vzniku nekrózy a vředu. Ve stolici je moţno prokázat hlen, hnis a krev. (

17 3.3.2 Shigella flexneri Shigella flexneri je nepohybující se tyčinkovitá bakterie, která se vyskytuje v 6 sérotypech a je fyziologicky velmi podobná jako Shigella dysenteriae. Jedná se o nejčastějšího původce akutních krvavých průjmů neboli bacilární úplavice. Shigela flexneri je hlavním problémem veřejného zdraví v rozvojových zemích. ( Shigella boydii Shigella boydii se vyskytuje v 15 sérotypech a téţ se jedná o tyčinkovitou bakterii způsobující bacilární úplavici. Infekce je způsobena fekálně - orálním přenosem. Jde o vysoce infekčního patogena schopného infikovat hostitele s méně neţ 20 buňkami s nástupem asi za hodin. ( Shigella sonnei Kmeny Shigella sonnei jsou antigenně homogenní. Jedná se o nejméně patogenní bakterie z rodu Shigella. ( 3.4 Patogenita Shigela je na rozdíl od salmonely čistě lidským patogenem. Je původcem bacilární úplavice neboli shigelózy. Nejtěţší průběh má infekce Shigella dysenteriae sérotyp 1. Úplavice je doprovázena tenesmy, coţ jsou velmi častá a neovladatelná nucení na stolici. Stolice často obsahuje hlen a hnis. Dochází také k časté ulceraci střev a tak můţe stolice obsahovat krev. Přítomna je i horečka a slabost. (Votava aj. 2003) 3.5 Patogeneze Shigely se vyznačují schopností pronikat do buněk tlustého střeva, intracelulárně se mnoţit a způsobovat poškození buněk za vzniku nekrózy a vředu. Při invazi vyuţívají invaziny zvané Ipa neboli invasion plasmid antigen, které se váţou na integriny na povrchu M - buněk Peyerových plaků a poté i střevních epitelií. (Votava aj. 2003) Shigely většinou nepronikají do submukózy, nevzniká bakteriémie ani systémové onemocnění. Záchyt těchto bakterií v krvi je spíše ojedinělý. (Bednář aj. 1996) V buněčné odpovědi se uplatňují především polymorfonukleární leukocyty, které jsou spolu s erytrocyty a odloučenými epiteliemi patrné v mikroskopickém preparátu stolice. Infekční dávka je malá, k propuknutí infekce postačí mikrobů. Příčinou nízké infekční dávky můţe být odolnost shigely k účinku kyselého prostředí v ţaludku a ve ţluči. (Greenwood aj. 1999)

18 3.6 Bacilární dysenterie Jedná se o nemocnění způsobené bakterií Shigella. Inkubační doba je 2-3 dny, ale příznaky mohou nastoupit i po 12 hodinách. Nástup je náhlý a prvním příznakem je obvykle břišní kolika. Poté následuje vodnatý průjem, horečka a pacient je neklidný. V této fázi můţe onemocnění skončit, nebo můţe dále pokračovat křečemi v břiše, tenesmy a častými, málo objemnými stolicemi s krví a hlenem. Typická délka trvání je asi čtyři dny, ale někdy můţe onemocnění trvat deset dní a více. Závaţnost onemocnění závisí na druhu shigely. Nejtěţší průběh má infekce způsobená bakterií Shigella dysenteriae. Zvláště vysoká virulence se připisuje jejímu účinnému exotoxinu. Tento toxin ovlivňuje transport tekutin ve sliznici střeva a produkuje ho i řada ostatních kmenů shigel, ale jeho úloha v patogenezi dyzenterie není jasná. Shigella dysenteriae typu 1 je také zodpovědná za hemolyticko uremický syndrom, který dysenterii v některých zemích doprovází. Hemolyticko uremický syndrom zahrnuje hemolytickou anémii, trombocytopenii a akutní selhání ledvin. Dochází k aktivaci komplementu, diseminované intravaskulární koagulaci a u dětí se jedná o nejčastější formu akutního selhání ledvin. Onemocnění způsobené Shigella flexneri a Shigella boydii můţe mít stejně těţký průběh jako onemocnění vyvolané Shigella dysenteriae. Onemocnění způsobené Shigella sonnei u zdravých osob probíhá jen s několika řídkými stolicemi a s nezřetelnými trávicími potíţemi. Nejedná se o smrtelné onemocnění. K úmrtí můţe dojít u pacientů s přidruţenou chorobou, nebo u velmi starých osob. Bacilární dysenterie se šíří fekálně - orálním cyklem pomocí rukou. Jde o typickou nemoc špinavých rukou. Pacient, nebo nosič kontaminuje např. na toaletě splachovadlo, kohoutek umyvadla, ručník nebo ostatní předměty, a kdyţ se jich dotkne další osoba, přenesou se shigely na její ruce a dále pak do úst a můţe dojít k nákaze. Nosič můţe také kontaminovat potravu. Shigely se mohou dostat do vzduchu v podobě aerosolu při splachování průjmové stolice, poté se usadí na sedátku toalety a zde ve vlhké atmosféře mohou přetrvat i několik dní. (Greenwood aj. 1999) Základem terapie je jako u všech průjmových onemocnění doplnění tekutin. K léčbě antibiotiky se přistupuje jen u velmi mladých, velmi starých a zesláblých osob. Pouţívá se ampicilin, kotrimoxazol, tetracyklin nebo ciprofloxacin. Na ampicilin a tetracyklin však

19 postupně vzniká rezistence. U asymptomatických osob by se neměla antibiotika uţívat ani profylakticky, ani pro rychlejší eliminaci v rekonvalescenci. Infekce Shigella sonnei probíhá mírně a nevyţaduje léčbu antibiotiky. Na místě je jen hydratační terapie nápoji s elektrolyty. (Greenwood aj. 1999, Votava aj. 2003) 3.7 Laboratorní diagnostika Při laboratorní diagnostice shigel se kombinuje kultivace, biochemický průkaz a antigenní analýza pomocí sklíčkové aglutinace se specifickými antiséry. Biochemická aktivita je však velmi malá. Výtěr se stolicí se musí zásadně dopravovat v transportní půdě, pro sníţenou odolnost shigel. Kultivačně jsou středně náročné, na Endově půdě rostou v bezbarvých koloniích a na XLD agaru jsou kolonie červené. Shigella sonnei se mnoţí v selenitovém bujónu. Inkubace se provádí při 37 C hodin. ( Greenwood aj. 1999, Votava aj. 2010) 4. Rod Yersinia Rod Yersinia byl navrţen pro druhy z rodu Pasteurella, které se lišily od typového druhu Pasteurella multocida. Nejvýraznějším patogenem z tohoto rodu je Yersinia pestis, původce moru. Tento patogen byl objeven v roce 1894 nezávisle na sobě Alexandrem Yersinem a Shibasaburem Kitasato. Mikrob nesl původně jméno Pasteurella pestis. (Votava aj. 2003) Mezi další významné zástupce řadíme bakterie Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica a další nově odlišené druhy Yersinia intermedia, Yersinia frederiksenii a Yersinia aldovae. (Bednář aj. 1996) 4.1 Yersinia pestis Yersinia pestis je nejzávaţnějším patogenem z enterobakterií. Způsobuje mor, který je znám více neţ 3000 let. (Votava aj. 2003) Morfologie Yersinia pestis je gramnegativní, nesporulující a nepohyblivá krátká kokobacilární tyčinka. Je 1,5 µm dlouhá a 0,7 µm široká (Obr. 3). Vyskytuje se ojediněle, nebo ve dvojicích a v tekuté půdě v řetízcích. Typické je výrazně polární barvení tyčinek. (Greenwood aj. 1999)

20 Obr. 3 Yersinia pestis (Zdroj: Antigenní struktura Netvoří O specifické postranní řetězce. Na povrchu je lokalizován proteinový komplex F 1, je klíčovým projektivním antigenem. Virulentní kmeny tvoří proteiny V a W, tvorba je vázána na plazminech. (Bednář, M. a kolektiv, Lékařská mikrobiologie) Patogenita Patogenita je určena komplexem faktorů, jejichţ tvorba je vázána na chromosomu a na plazminech. Exprese těchto genů je určována kultivačními podmínkami, coţ způsobuje velkou variaci ve virulenci. Za nejdůleţitější faktory se povaţují ty, které blokují fagocytózu. Virulentní kmeny jsou fakultativně intracelulární parazité a mnoţí se uvnitř makrofágů. (Bednář aj. 1996) Patogeneze Yersinia pestis proniká do epiteliálních buněk a do makrofágů. Je výrazně invazivní. V místě poranění vzniká hemoragická pustula a odtud se infekce šíří do svodných lymfatických uzlin. Jejich následným zvětšením vzniká dýměj neboli bubo. Při dalším průniku yersinií dochází k bakteriémii a sepsi. Při rozvoji sekundární pneumonie se yersinie šíří do okolí vykašláváním, mohou se nakazit další lidé a mohou onemocnět primární pneumonií. Po prodělaném onemocnění vzniká dobrá imunita. (Bednář aj. 1996) Formy moru Podle cesty přenosu můţe dojít ke třem formám infekce bubonová, plicní a septická Dýmějový (bubonický) mor Bubonický mor přenáší blecha morová. Jedná se o zoonózu. Bakterie se přenášejí ze zvířete na zvíře a ze zvířete na člověka blechami, hlavně blechou Xenopsylla chceopis, coţ je

21 ektoparazit krys. Za chladného a vlhkého počasí se mor šíří v populaci krys. Horké a suché počasí není pro šíření moru ideální, protoţe blechy za těchto podmínek hynou. Pří sání na nemocném zvířeti se yersinie dostanou do střeva blechy, kde se pomnoţí a ucpou její zaţívací trakt. Kdyţ zvíře uhyne, blecha hledá jiného hostitele, zvíře nebo člověka. Nakaţená blecha jiţ nemůţe sát, nestrávená potrava se vrátí zpátky a je vstříknuta do nového hostitele. Přenos Yersinie pestis blechou z krysy na člověka má za následek místní afekci, označovanou jako pestis minor, s mírnými příznaky. Častěji jsou postiţeny regionální uzliny a objevuje se bolestivé zduření v místě, kde bylo původní bleší kousnutí. Mikrob se z těchto bubonů můţe rozšířit do celého těla. Pokud se nezahájí přiměřená antibiotická léčba jiţ na počátku onemocnění, dosahuje úmrtnost aţ 50 %. Smrtelné případy končí úmrtím asi za 4 dny. (Greenwood aj. 1999) Plicní mor Plicní forma se rozvíjí buď jako komplikace bubonické formy, nebo se přenáší mezi lidmi vdechnutím kapének obsahujících Yersinia pestis. Sputum pacienta obsahuje velké mnoţství yersinií a za vhodných podmínek se onemocnění rychle šíří kapénkovou infekcí, nezávisle na hlodavcích a blechách. Epidemie šířením kapénkami snáze vznikají v přelidněných a nehygienicky udrţovaných obydlích. (Greenwood aj. 1999) Po nakaţení Yersinia pestis se vyvine těţká bronchopneumonie. Projevuje se řídkým krvavým sputem. Tato forma moru je vysoce nakaţlivá, a pokud není léčena, smrt přichází asi za 2 aţ 3 dny po prvních příznacích. (Votava aj. 2003) Septická forma moru Vzniká buď primárně, nebo sekundárně jako komplikace bubonové nebo plicní formy. (Greenwood aj. 1999) Šíření probíhá hematogenní cestou. Začíná náhlým nástupem vysoké horečky. Kůţe se zbarvuje do purpurové barvy následkem respiračního selhání. U septické formy můţe smrt nastat ten stejný den, kdy začaly příznaky. (Votava aj. 2003) Při podezření na jakoukoli formu moru je nutné okamţitě zahájit léčbu bez čekání na laboratorní vyšetření. (Greenwood aj. 1999)

22 4.2 Yersinia pseudotuberculosis Yersinia pseudotuberculosis je běţným parazitem a patogenem hlodavců, ptáků a sudokopytníků. Člověk se nakazí jen zřídka. U člověka způsobuje akutní zánět mezenterických mízních uzlin. Infekce nastává kontaktem kůţe s vodou kontaminovanou nemocnými zvířaty nebo poţitím kontaminované zeleniny. (Bednář aj. 1996) Morfologie Yersinia pseudotuberculosis je malá ovoidní gramnegativní tyčinka o rozměrech 0,5 x 0,8 5,0 µm (Obr. 4). V zorném poli se nachází jednotlivě, ve shlucích, nebo krátkých řetízcích. Mohou se vyskytovat i kokoidní, nebo dlouhé vláknité formy. Při teplotách okolo C se tvoří peritrichózní bičíky a Yersinia pseudotuberculosis se stává pohyblivou. (Greenwood aj. 1999) Obr. 4 Yersinia pseudotuberculosis (Zdroj: Antigenní struktura Yersinia pseudotuberculosis se vyskytuje nejméně v 6 sérotypech. Kaţdý sérotyp má specifické termostabilní somatické antigeny. Některé antigeny jsou společné s Yersinia pestis a se salmonelami. Při teplotě v rozmezí C tvoří bičíkový antigen. Kolem 90 % všech lidských onemocnění je způsobeno sérotypem 1. Antigenní příbuznost existuje mezi sérotypy 2 a 4 a salmonelami skupin B a D. (Greenwood aj. 1999)

23 4.2.3 Patogenita Vysoce virulentní kmeny u lidí mohou vyvolat buď subklinické, nebo smrtelné septické onemocnění. Smrtelná infekce probíhá u člověka s příznaky tyfu, s horečkou, purpurou a zvětšením sleziny a jater. Častěji však způsobuje adenitidu mezenterických uzlin, která můţe simulovat akutní nebo subakutní apendicitidu. Postihuje hlavně děti a mladistvé okolo roku. (Bednář aj. 1996) Adenitida mezenterických uzlin se spontánně vyhojí. Sepse se musí léčit parenterálně podávanými antibiotiky. (Greenwood aj. 1999) 4.3 Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica je značně rozšířena v přírodě jako parazit zvířat, především hlodavců. Jedná se o obligátně patogenní bakterii. Nákazy způsobené Yersinia enterocolitica postihují zejména střevo. Vyskytuje se v primárně infikovaném mase a můţe kontaminovat i vodu. (Bednář aj. 1996) Morfologie Yersinia enterocolitica je morfologicky velmi podobná Yersinii pseudotuberculosis. Jedná se o gramnegativní tyčinku o rozměrech 1,0 3,0 x 0,4-0,8 µm (Obr. 5) pohybující se jen při niţších teplotách (kolem 25 C). (Greenwood aj. 1999) Obr. 5 Yersinia enterocolitica (Zdroj: Antigenní struktura Sérotypizace se provádí podle somatických O antigenů. U nás se nejčastěji vyskytuje sérotyp O3, ojediněle O9. V USA je nejčastější sérotyp O8. (Bednář aj. 1996)

24 4.3.3 Patogenita Virulence je vázána na genetickou informaci v chromosomu a v plazminech. Virulence značně kolísá a je dána invazivitou a průnikem bakterie do buněk. V patogenitě se významně uplatňuje membránový protein. (Bednář aj. 1996) Patogeneze Yersinia enterocolitica způsobuje lehkou i těţkou gastroenteritidu, lymfadenitidu mezenterických uzlin a u oslabených a starých osob můţe způsobit i sepsi. (Greenwood aj. 1999) Alimentární infekcí se Yersinia enterocolitica dostává do terminálního ilea a do apendixu, proniká do buněk a do lymfatické tkáně. Poté se mnoţí v makrofázích a vyvolávají tvorbu granulomů. Výjimečně vzniká nekróza a vředy. U lidí se sníţenou imunitou můţe vzniknout bakteriémie. Nevirulentní kmeny jsou rychle vyloučeny, bez průniku do buněk. Klinický obraz se mění podle věku. U dětí se objevují bolesti břicha a horečka, u dospělých převaţují příznaky infekce zaţívacího traktu a průjmy. (Bednář aj. 1996) Léčba se indikuje jen u těţkých případů. Při postiţení uzlin a při bakteriémii je nutno podat antibiotika. (Gereenwood aj. 1999) 4.4 Laboratorní diagnostika Laboratorní diagnostika yersinií se provádí pomocí mikroskopie, kultivací a pomocí nepřímého průkazu protilátek pasivní hemaglutinací. Mikroskopicky lze yersinie rozpoznat podle polárního barvení tyčinek a pomocí tvaru, který se odlišuje od ostatních enterobakterií. (Votava aj. 2010) Ke kultivaci se pouţívá krevní agar, MacConkeyho půda, Endova půda a selektivní kultivační půda CIN. Inkubace probíhá při 37 C po dobu 48 hodin. Na Endově a MacConkeyho půdě se vytvářejí malé laktózanegativní kolnie. Dále je vhodné kultivovat naočkované půdy při pokojové teplotě, při 25 C a při 4 C. (Votava aj. 2000) Z biochemických vlastností je pro yersinie charakteristické štěpení močoviny. (Votava 2010)

25 5. Rod Campylobacter První příznaky kampylobakterové infekce byly popsány Theodorem Escherichem jiţ v roce 1886 u kojenců. Rod Campylobacter byl však objeven aţ v roce Jedná se o skupinu bakterií, která byla dříve známá pod pojmem mikroaerofilní vibria. Původně byly známi jako původci potratů u hovězího a vepřového dobytka. Jejich patogenita nebyla dlouho prokázána. Poté, co se podařila jejich kultivace, byly prokazovány také u lidí a byly přeřazeny do samostatného rodu. (Bednář aj. 1996) Rod Campylobacter má 13 druhů. Nejvýznamnější pro člověka jsou Campylobacter jejuni a Campylobacter coli. Ostatní druhy jsou spíše vzácné, např. Campylobacter lari, Campylobacter concisus, Campylobycter hyointestinalis a Campylobacter upsaliensis. (Greenwood aj. 1999) Kampylobakter obecně vyvolává střevní infekce u lidí, aborty u domácích zvířat a uplatňuje se jako podmíněný patogen u lidí se sníţenou imunitou. (Bednář aj. 1996) 5.1 Morfologie Kampylobaktery jsou štíhlé, spirálovité gramnegativní tyčinky s jedním bičíkem na kaţdém pólu. Jsou 0,2 0,8 µm široké a 0,5 6,0 µm dlouhé (Obr. 6). Patří k nejrychleji se pohybujícím bakteriím. Za nevýhodných podmínek přecházejí v kokovité útvary. (Bednář aj. 1996, Greenwood aj. 1999) Obr. 6 Campylobacter (Zdroj: Antigenní struktura Kampylobaktery mají dva typy antigenů, odpovídající somatickým O antigenům a bičíkovým H antigenům bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Pennerovo schéma zařazuje kampylobaktery podle lipopolysacharidového antigenu do 65 sérotypů. Termolabilní

26 povrchové a bílkovinné bičíkové antigeny tvoří základ Liorova schématu, tvořeného asi 100 skupinami. Pro jemnější rozlišení kmenů lze pouţít k určení sérotypu obě schémata nebo jedno z nich kombinovat s biotypizací či fagotypizací. (Greenwood, D.;Slack, R. C. B; Peutherer, J. F. a kol. Lékařská mikrobiologie) 5.3 Patogenita Patogenní kampylobaktery schopné vyvolat akutní průjmová onemocnění mohou produkovat cytotoxiny, nebo enterotoxiny, které jsou podobné cholerovému toxinu. Tento enterotoxin produkuje především Campylobacter jejuni, Campylobater coli a Campylobacter lari. (Bednář aj. 1996) 5.4 Patogeneze Vstupní branou infekce je trávicí ústrojí. Infekce nastává poţitím infikované potravy nebo vody, ale i kontaktem s nakaţenými zvířaty. Kampylobakter se mnoţí v tenkém střevě a poté proniká do slizničního epitelu střeva. Zde vyvolá zánětlivou reakci, která způsobí přítomnost erytrocytů a leukocytů ve stolici. Infekční postiţení můţe zůstat lokalizované na tenkém střevě, nebo se můţe mikrob dostat do krevního oběhu a vzniká systémové horečnaté onemocnění. (Bednář aj. 1996, Greenwood aj. 1999) Průměrná inkubační doba u kampylobakterové enteritidy je 3 dny a onemocnění trvá 5-7 dní. Onemocnění začíná bolestí v břiše a průjmem. Dále mohou být přítomny chřipkové příznaky, jako je horečka a bolest svalů, někdy třesavka a pocení. Hlavní příznaky jsou bolest břicha a průjem. Symptomy pominou během několika dní, bakterie se však mohou vylučovat aţ 3 týdny. Kampylobakterovou enteritidu většinou nelze klinicky odlišit od salmonelové nebo shigelové infekce, bolesti břicha jsou však při kampylobakterové infekci větší. Průběh onemocnění je znázorněn na Obr. 7. Obr. 7 Průběh kampylobakterové infekce (Zdroj: Greenwood aj. 1999)

27 Kampylobakterová enteritida se spontánně vyhojí, ale někdy je zapotřebí podpůrná léčba hydratací a doplněním elektrolytů. Při systémovém onemocnění se uţívají antibiotika, především makrolidy. (Greenwood aj. 1999) 5.5 Laboratorní diagnostika Laboratorní diagnostika se provádí přímým průkazem a to jak mikroskopií, tak kultivací. Zatím málo vyuţívanou moţností přímého průkazu je detekce antigenů. Nepřímý průkaz protilátek metodou ELISA se pouţívá spíše jen výzkumně. (Votava aj. 2010) Vzorek stolice je většinou odebírán to Amiesovy transportní půdy. Kampylobakter je velmi citlivý na nepříznivé podmínky vnějšího prostředí a bez transportní půdy nepřeţije. Mikroskopicky je nutno v preparátu obarveném dle Grama prokázat zakřivené či spirálovité gramnegativní bakterie. Průkaz uvedených bakterií však nedovoluje stanovení diagnózy kampylobakterové infekce, ale pouze podezření. Základem laboratorní diagnostiky je přímý průkaz kultivací. (Votava aj. 2000) Kultivace vyţaduje selektivní podmínky k odstranění střevní doprovodné flóry. Jedním z nejpouţívanějších médií je selektivní půda s aktivním uhlím bez krve podle Karmaliho, neboli CMS agar. Důleţitou sloţkou CMS agaru je pyruvát sodný, který zvyšuje toleranci izolovaných bakterií k toxickému účinku kyslíku, a aktivní uhlí, které odstraňije toxické metabolity. Dále se pouţívá Butzlerovo selektivní médium a Skirrowův krevní agar. Nejvyšší selektivitu má CMS agar. Naočkované půdy se inkubují za mikroaerofilních podmínek, to znamená v atmosféře s 5 % O 2, 10 % CO 2 a 85 % N 2 při teplotě 42 C a dostatečné vlhkosti. Půdy se odečítají za 24, 48 a případně i 72 hodin inkubace. Na kultivační půdě za tu dobu vyrůstají nepravidelné, ploché, šedivé kolonie, které se plazivě táhnout podél očkovací čáry. Dalším důleţitým identifikačním znakem je rychle se vyvíjející oxidázová a katalázová reakce. (Votava aj. 2010) K odlišení Campylobactera jejuni od ostatních druhů se pouţívá jeho schopnost hydrolyzovat hippurát, rezistence k cefalotinu a citlivost k nalidoxové kyselině, ostatní druhy z rodu Campylobacter tuto schopnost nemají. (Votava aj. 2000)

28 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Experimentální část jsem prováděla na Oddělení klinické mikrobiologie FN Brno a zabývala jsem se vyšetřením stolice na obligátní střevní patogeny a výskytem těchto patogenů ve FN Brno za posledních 5 let. Byla jsem seznámena se zpracováváním vzorků, inkubací a následným odečítáním a zpracování jsem poté pod dohledem odborného pracovníka sama prováděla. 6. Materiál Ke zpracování výsledků byl pouţit biologický materiál od pacientů hospitalizovaných ve FN Brno od roku 2008 do roku Jedná se o výtěr z rekta pomocí sterilního tampónu, který byl uchováván v Amiesově transportním médiu (Obr. 8) a po přepravě do laboratoře bylo provedeno vyšetření na salmonely, shigely kampylobaktery a yersinie. 7. Metodika Obr. 8 Výtěr v Amiesově transportním médiu (Zdroj: vlastní) 7.1 Kultivační vyšetření stolice na obligátní střevní patogeny Kultivační vyšetření se provádí pomocí sestavy umělých kultivačních médií, které selektují nejdůleţitější střevní patogeny. Na základě rozdílných růstových nároků a různé biochemické aktivity bakterií se poté provádí jejich identifikace. (Vrba 2012) Odběr primárního vzorku a transport Správný výsledek mikrobiologického vyšetření začíná správným odběrem biologického materiálu a správným transportem do biologické laboratoře. Odběr vzorku pro vyšetření na

29 obligátní střevní patogeny se provádí výtěrem z konečníku pomocí sterilního tampónu, který se poté uchovává v transportní půdě, nejčastěji v Amiesově transportním médiu. Vzorek musí být co nejrychleji transportován do laboratoře, nejpozději do 2 hodin po odběru. Materiál je uchováván při pokojové teplotě. Vzorky jsou přijaty a označeny na příjmu dle směrnice: Příjem, manipulace a skladování vzorků biologického materiálu v laboratoři oddělení klinické mikrobiologie (Vrba 2012) Používaná média Amiesovo transportní médium První půda, se kterou se vzorek dostane do styku je Amiesovo transportní médium. Jeho úkolem je udrţet mikroby během přepravy do laboratoře v ţivotaschopném stavu a ve stejném poměru, v jakém se vyskytovaly v místě odběru. Obsahuje aktivní uhlí, které omezuje metabolismus mikrobů a absorbuje jejich toxické produkty. Dále se skládá z anorganických solí, thioglikolátu sodného a z 1 % agaru Krevní agar Krevní agar patří mezi základní kultivační půdy v klinické mikrobiologii. Mezi základní půdy je řazen, protoţe se na něj očkuje většina klinických vzorků a roste na něm naprostá většina lékařsky důleţitých mikrobů. Krevní agar umoţňuje sledování hemolytických vlastností vypěstovaných kmenů a podle toho je lze někdy přímo určit. Z tohoto důvodu lze krevní agar řadit i mezi půdy diagnostické. K přípravě krevního agaru se u nás pouţívá většinou ovčí, nebo také beraní krev. Některé laboratoře, například ve Velké Británii, pouţívají krevní agar připravený z krve koňské. Aby mohla být odebraná krev uchovávána v ledničce, je třeba ji nejdříve defibrinovat. Dále je také velmi důleţitá kontrola sterility krve. Kontrola sterility se provádí tak, ţe k 60 ml sterilního agarového základu přidáme 4 5 ml testované krve, promícháme a vylijeme do čtyř Petriho misek. Poté inkubujeme v termostatu při 37 C a druhý den hodnotíme, zda jsou půdy sterilní. Krevní agar se připravuje přidáním 7 % sterilní defibrinované beraní krve k agarovému základu, který musí být ochlazený na C. Přidávaná krev by měla mít pokojovou teplotu. Krev s agarem opatrně promícháme a rozléváme do Petriho misek

30 Endova půda Endova půda patří mezi poměrně často uţívané selektivně diagnostické médium. Původně byla určena k diagnostice břišního tyfu. V klinické mikrobiologii se jedná o diferenciální lehce selektivní půdu určenou k záchytu a předběţné diagnostice enterobakterií a některých odolných gramnegativních nefermentujících tyčinek jak ze stolice, tak i z ostatních klinických vzorků. Selektivita Endovy půdy je dána tím, ţe na ní rostou prakticky jen gramnegativní bakterie. Inhibitor růstu grampozitivních bakterií je bazický fuchsin. Jedná se také o půdu diagnostickou, protoţe se na ní dají diagnostikovat mikroby štěpící laktózu, která je v Endově půdě obsaţena. Indikátorem štěpení laktózy je opět bazický fuchsin, který je odbarvený siřičitanem sodným. Endova půda je lehce zakalená a nepatrně narůţovělá. Je třeba ji chránit před světlem, jinak dochází k výraznému růţovému zabarvení. Mikroby štěpící laktózu rostou na Endově půdě v tmavočervených koloniích se zlatoţlutým kovovým leskem. Půda kolem kolonií se rovněţ barví červeně. Při vyšetřování stolice jsou důleţité mikroby, které laktózu neštěpí. Rostou v bezbarvých průsvitných koloniích, které jsou dobře patrné na narůţovělém okolí půdy. Příprava: Sloţení základ (g/1000ml): Masový extrakt (sušina) 8,6 Pepton pro bakteriologii 10,0 Laktóza 10,0 NaCl 5,0 Na 2 NO 3, bezv. 1,4 Agar 12,0 ph 7,4 ± 0,2 Sloţení roztok fuchsinu (g/20 ml): Bazický fuchsin 1,0 93% etanol do 20 ml

31 47 g základu rozmícháme v 1000 ml vody, přidáme 4 ml roztoku bazického fuchsinu (0,2 g) a necháme půdu nabobtnat. Po rozvaření sterilizujeme 15 minut při 120 C. Po zchladnutí na 50 C rozléváme do Petriho misek SS agar SS agar (Salmonella - Shigella agar) je selektivní a zároveň diagnostická půda určená především k záchytu salmonel z klinických vzorků a z potravin. Obsahuje ţlučové soli a brilantní zeleň, které účinkují jako inhibitory grampozitivních mikrobů. Obsahuje také laktózu a thiosulfát, které zastávají funkci substrátů. Indikátorem štěpení laktózy je neutrální červeň a indikátorem tvorby sirovodíku je citrát ţelezitý. SS agar má červenohnědou barvu. Kolonie salmonel na něm rostou bezbarvé s černým středem, kolonie shigel pouze bezbarvé. Případné kolonie odolných kmenů štěpících laktózu budou červené, někdy obklopené precipitátem. Příprava: Sloţení (g/l): Peptony 10,0 Laktóza 10,0 Hovězí ţluč, sušená 8,5 Citrát sodný 10,0 Na 2 S 2 O 3 10,0 Citrát ţelezitoamonný 1,0 Brilantní zeleň 0,0003 Neutrální červeň 0,025 Agar 12,0 ph 7,0 ± 0,2 60 g přípravku rozmícháme v 1 litru destilované vody a za stálého míchání rozvaříme, poté plníme do Petriho misek. Přehřátí ničí selektivitu půdy, tudíţ se neautoklávuje

32 XLD agar XLD agar (xylosa lysin deoxycholát) je další selektivně diagnostická půda pouţívaná k izolaci salmonel a shigel. Neobsahuje pepton, pouze kvasničný extrakt. Růst grampozitivních mikrobů je potlačen pomocí deoxycholátu sodného, který do jisté míry potlačuje i plazivý růst protea. Půda obsahuje řadu substrátů: lysin, xylosa, laktosa sacharosa tiosulfát sodný a fenolová červeň. Jako indikátor tvorby sirovodíku je zde citrát ţelezitoamonný. Xylosu štěpí většina enterobakterií, shigely však ne. Salmonely nejdříve vyčerpají xylosu a pak dekarboxylují lysin. Zvýší se ph a salmonely rostou v červených koloniích stejně jako shigely. Salmonela se od shigely liší tvorbou sirovodíku, tudíţ její červené kolonie mají černý střed. Příprava: Sloţení (g/l): Kvasničný extrakt 3,0 L lysin 5,0 Laktóza 7,5 Sacharóza 7,5 Xylosa 3,5 NaCl 5,0 Deoxycholát sodný 2,5 Na 2 S 2 O 3 6,8 Citrát ţelezitoamonný 0,8 Fenolová červeň 0,08 Agar 15,0 ph 7,4 ± 0,2 V 1000 ml destilované vody rozmícháme 56,68 g přípravku. Za častého míchání vše rozvaříme. Nesmíme autoklávovat a nesmí dojít k přehřátí. Okamţitě po rozvaření dáme agar

33 do vodní lázně o teplotě 50 C a po ochlazení rozléváme do Petriho misek. Příprava se doporučuje v co nejmenších objemech, aby nedocházelo k příliš dlouhému zahřívání Půda CIN CIN je selektivně diagnostická půda, která slouţí k izolaci Yersinia enterocolitica z klinických vzorků, zejména ze stolice a z potravin. CIN je zkratka pro cefsulodin, Irgasan, coţ je halogenované bifenylové antiseptikum triclosan příbuzní hexachlorfenolu a neomycin. Tyto tři selektivní činidla se přidávají aţ do rozvařené půdy. Médium dále obsahuje deoxycholát sodný a krystalovou violeť, tudíţ na něm nerostou grampozitivní bakterie a z gramnegativních je kromě yersinií většina potlačena. Diagnostickou sloţkou půdy CIN je mannitol a indikátorem jeho štěpení je neutrální červeň. Typické kolonie Yersinia enterocolitica mají podobu býčího oka, coţ je červený střed s průsvitným okrajem. Podezřelé kolonie je nutno identifikovat biochemicky, protoţe podobně mohou vyrůst i jiné mannitolpozitivní mikroby, např. Citrobacter freundii. Příprava: Sloţení základu (g/l): Kaseinový pepton 10,0 Masový pepton 10,0 Kvasničný extrakt 2,0 D mannitol 20,0 Pyruvát sodný 2,0 NaCl 1,0 MgSO4 0,01 Směs ţlučových solí 1,0 Neutrální červeň 0,03 Krystalová violeť 0,001 Agar 12,5-33 -

34 ph 7,4 ± 0,2 Sloţení selektivního suplementu (1 lahvička/ 500 ml média): Cefsulodin 7,5 mg Irgasan (triclosan) 2,0 Novobiocin 1,25 mg 58,5 g základu rozmícháme v 1 litru destilované vody, rozvaříme a autoklávujeme 15 minut při 120 C. Po ochlazení na C asepticky přidáme obsah 1 lahvičky yersiniového selektivního suplementu CIN na 500 ml média. Selektivní suplement je předtím rehydratován přidáním 1 ml sterilní destilované vody a 1 ml etanolu. Vše dobře rozmícháme a rozplníme do Petriho misek Selektivní půdy k izolaci kampylobakterů K pěstování kampylobakterů se mohou pouţívat agarové základy pro krevní či čokoládový agar, většinou se však pouţívají kampylobakterová média bez krve. Důleţitou sloţkou těchto médií je pyruvát sodný a aktivní uhlí. Patří sem např. médium CCDA (Charcoal Cefaporazone Deoxycholate agar) nebo médiu dle Karmaliho. Aktivní uhlí odstraňuje toxické metabolity narostlých bakterií, pyruvát zvyšuje toleranci kmenů vůči toxickému účinku kyslíku, stejnou vlastnost má také metabisulfit sodný, Na 2 S 2 O 5 nebo síran ţeleznatý. K odklonění střevní flóry se pouţívají selektivní antibiotické suplementy, dále také pomáhá kultivace při 42 C v mikroaerofilním prostředí. K selektivní izolaci Campylobacter jejuni a Campylobacter coli se také pouţívá selektivní agar dle Prestona. Campylobacter Agar Base ( Karmali) Příprava: Sloţení základu (g/l): Pepton, speciální 23,0 Škrob 1,0 NaCl 5,0-34 -

35 Aktivní uhlí 4,0 Agar 10,0 ph 7,4 ± 0,2 Sloţení Campylobacter Selective Supplement (Karmali) (g/l): Hemin 0,032 Pyruvát sodný 0,1 Cefaloperazon 0,032 Vankomycin 0,02 Cyklohexamid 0,1 21,5 g základu přidáme do 500 ml destilované vody, rozvaříme a sterilizujeme autoklávováním 15 minut při 121 C. Po zchlazení na 50 C asepticky přidáme obsah jedné lahvičky selektivního suplementu rekonstituovaného 2 ml sterilní destilované vody. Dobře rozmícháme a rozlíváme do Petriho misek Selenitová půda Selenitová půda se pouţívá k selektivnímu pomnoţení bakterií ze stolice, moče, potravin a jiného materiálu. Ţivným základem selenitové půdy je pepton, obvykle enzymatický kaseinový hydrolyzát. Selenit inhibuje koliformní mikroby, ale jen během prvních 6 12 hodin inkubace. Poté dojde ke zvýšení ph půdy vlivem redukce selenitu a koliformní mikroby se mohou začít mnoţit. Salmonely selenit neovlivňuje, takţe se mohou začít mnoţit hned po naočkování. Kvůli udrţení optimálního ph obsahuje půda laktosu nebo mannitol, jejichţ štěpení brání alkalizaci média. Selenitová půda existuje v několika variantách, např. s mannitolem místo laktosy, s přídavkem brilantní zeleně nebo s cystinem. Po optimální době kultivace, nejpozději za 18 hodin, je třeba vyočkovat selenitovou půdu na pevná selektivně diagnostická média určená k záchytu salmonel

36 Příprava: Sloţení (g/l): Pepton pro bakteriologii 6,0 Laktóza 5,5 Seleničitan sodný 2,0 NaH 2 PO 4 4,0 Na 2 HPO 4 5,5 ph 7,1 ± 0,2 23 g půdy rozpustíme v 1 l purifikované vody a povaříme 10 minut ve vodní lázni. Po zchlazení sterilně rozplníme do zkumavek po 10 ml. Půda ve zkumavkách se jiţ nesmí sterilizovat Hajnova půda Jedná se o kombinovanou diagnostickou půdu určenou ke screeningu střevních patogenů, především k rozlišení salmonely a shigely od ostatních enterobakterií na základě jejich schopnosti štěpit sacharidy a tvořit sirovodík. Půda se nalévá do zkumavek tak, aby část zatuhla šikmo. Očkuje se čistou kulturou vpichem do plného dolního sloupce a hádkem na povrchu šikmé části. Odečítá se po hod. inkubace. Půda obsahuje nepatrné mnoţství glukózy, laktózy a sacharózy. Indikátorem jejich štěpení je fenolová červeň. V alkalickém prostředí je fenolová červeň červená a kyselém prostředí se zbarví do ţluta. Bakterie, které štěpí pouze glukózu, produkují určité mnoţství kyseliny a mění původní načervenalé zbarvení půdy na ţluto. Více kyseliny se tvoří v dolním plném sloupci. Bakterie rostoucí na povrchu horní šikmé části oxidativně dekarboxylují pepton a vznikají tak alkalické produkty, které postupně neutralizují kyseliny v šikmé části, takţe šikmá část bude alkalická tudíţ červená a spodní část bude kyselá tudíţ ţlutá. Takovýto vzhled Hajnovy půdy znamená přítomnost laktózanegativního kmenu, coţ můţe být salmonela nebo shigela. Indikátorem tvorby plynu je přítomnost agarového gelu. Tvorba CO 2 se projeví přítomností bublin nebo potrháním agaru

37 Substrátem pro tvorbu sirovodíku je thiosulfát sodný a indikátorem je citrát ţelezitoamonný. H 2 S se vytváří redukcí thiosulfátu a jeho reakcí s ionty ţeleza vzniká černý sulfid ţelezitý. Redukce thiosulfátu probíhá v kyselém prostředí, proto zčerná jen dolní plný sloupec. Příprava: Sloţení (g/l): Enzymatický kaseinový hydrolyzát 5,0 Pepton pro bakteriologii 20,0 Laktóza 10,0 Sacharóza 10,0 Glukóza 1,0 NaCl 5,0 Fenolová červeň 0,05 Na 2 S 2 O 3 0,3 Cirát ţelezitoamonný 0,2 Agar 20,0 ph 7,4 ± 0,3 71,55 g půdy rozmícháme v 1 l studené purifikované vody a necháme nabobtnat. Poté směs rozvaříme v proudící páře a upravíme ph na 7,5. Naplníme do zkumavek a sterilizujeme 20 minut při 115 C a necháme zatuhnout v šikmé poloze Půda MIU Půda MIU (motility indole urea) je polotuhá půda pouţívaná k důkazu štěpení urey, štěpení indolu a k průkazu pohybu. Rozlévá se do zkumavek v podobě sloupce a očkuje se vpichem do středu. Pohyb zkoumaného kmene se projeví nárůstem v podobě zákalu mimo vpich. Štěpením urey se půda alkalizuje a barví se do růţova aţ červena. K průkazu tvorby indolu je zapotřebí

38 přidat Kovácsovo reagens, v případě pozitivity se na rozhraní půdy a činidla vytvoří červený prstenec. Příprava: Sloţení (g/l): Enzymatický kaseinový hydrolyzát 30,0 NaCl 5,0 NH 2 PO 4 2,0 Agar Oxoid No. 1 1,5 ph 6,9 Půdu rozpustíme v 1 l destilované vody a přidáme 2,4 ml roztoku fenolové červeně a 5 ml 1 % roztoku TTC (trifenyltetrazolium chlorid), rozvaříme, upravíme ph na 6,9, rozplníme po 250 ml do zásobních lahví a autoklávujeme 15 minut při 121 C. Před rozplněním rozvaříme v Arnoldově přístroji, ochladíme a na 250 ml média asepticky přidáme 40 ml sterilního 20 % roztoku urey. Poté asepticky rozplníme do zkumavek do výšky 2,5 cm, zazátkujeme vatou a necháme přes noc ve svislé poloze v termostatu Biochemický klín Biochemický klín, nebo také Švejcarova plotna, je kombinovaná diagnostická půda vylévaná na šikmo poloţenou Petriho misku kdy po zatuhnutí vzniká klín, který sahá asi do 1/3 misky. Ke klínu se přilévá půda Endova. Pouţívá se k izolaci čisté kultury a k předběţné identifikaci střevních patogenů na základě štěpení urey, tvorby sirovodíku, fermentace glukózy s tvorbou plynů a rychlého štěpení laktózy, mannitolu a sacharózy. Biochemický klín obsahuje ţivný agarový základ z masového extraktu, peptonu a enzymatického kaseinového hydrolyzátu. Dále obsahuje glukózu, ureu a tiosulfát sodný a jako indikátory jsou přítomny bromthymolová modř a octan olovnatý. Během štěpení urey vytvářejí bakterie amoniak, který způsobí zvýšení ph a změnu barvy zeleného klínu do modra, mikroby fermentující glukózu mění barvu klínu do ţluta. Při tvorbě plynu vznikají bublinky pod sklíčkem, které je přiloţené na biochemickém klínu. Bakterie produkující sirovodík způsobují zčernání nárůstu v místě vpichů na biochemickém klínu. Dále

39 se pouţívají tablety mannitolu a sacharózy. V případě jejich štěpení zčervená nárůst kolem příslušných tablet. Příprava: Sloţení (g/l): Masový extrakt 4,0 Pepton pro bakteriologii 6,0 Enzymatický kaseinový hydrolyzát 6,0 NaCl 5,0 Urea 6,0 Glukóza 6,0 Brommethylová modř 0,06 Agar 13,0 ph 7,0 ± 0,2 46 g základu suspendujeme v 1 l čisté vody a necháme na chladném místě nabobtnat. Pak za občasného míchání povaříme v proudící páře. Upravíme ph na 7,0 a sterilizujeme 1 hodinu při 100 C. Po zchladnutí na 60 C asepticky přidáme 8 ml sterilního vodného roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 250 g/l a 8 ml sterilního vodného roztoku octanu olovnatého o koncentraci 100 g/l. Promícháme a vyléváme do mírně šikmo poloţených Petriho misek. Po zatuhnutí misky poloţíme na vodorovnou plochu a dolijeme Endovou půdou. (Votava aj. 1999) Přístroje a pomůcky Při zpracování materiálu jsou zapotřebí vatové tampóny se vzorkem, pomocí kterých se vzorek nanáší na kultivační médium, dále jsou potřeba bakteriologické kličky, kterými se vzorek naočkuje po celé ploše kultivačního média. Velmi důleţitý je plynový kahan, který slouţí k sterilizaci bakteriologické kličky a brání tak kontaminaci jednotlivých vzorků navzájem (Obr. 9)

40 Obr. 9 Sterilizace bakteriologických kliček (Zdroj: vlastní) Poté, co jsou vzorky naneseny na kultivační média, je zapotřebí dát je inkubovat na určitou dobu při určité teplotě. K tomu slouţí komorový termostat na C, termostat BT 120M na C a anaerostat, coţ je nádoba pro kultivaci bakterií v prostředí s nízkým obsahem kyslíku. Připravená média k pouţití a materiál k uschování je třeba uchovávat v lednici. (Vrba 2012) Pracovní postup Před zahájením zpracování je nutné vyjmout kultivační média z lednice a nechat je vytemperovat na pokojovou teplotu. Očkování materiálu: Vyjmeme tampón z transportní půdy a očkujeme následující kultivační půdy: Krevní agar, Endo agar, SS agar, XLD agar, CIN agar a CAMP agar. Po naočkování se tampóny zalamují do selenitového bujónu a transportní médium se likviduje. V selenitovém bujónu se do druhého dne bakterie pomnoţí a poté se znovu vyočkují na půdy XLD a Endo. Na krevní agar, Endo a SS agar se současně očkují dva vzorky pacientů, na CIN a CAMP agar čtyři. Proto je velmi důleţitá opatrnost a sterilizace bakteriologické kličky, aby se zabránilo kontaminaci a zkreslení výsledků. Stručný pracovní postup je znázorněn v tab

41 KA ENDO SS XLD CIN CAMP selenit 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 stolice Vyočkování ze selenitu za 24 hod. Tab. 2 Zpracování stolice na obligátní střevní patogeny (Vrba 2012) Kultivace: Po naočkování vzorků následuje kultivace při určité teplotě. CAMP agar se uzavře do anaerostatu s vyvíječem plynů (Obr. 10) a kultivuje se hodin termostatu při C. CIN agar se kultivuje hodin při pokojové teplotě a odečítá se po hodinách a hodinách. Krevní agar, Endo, SS a XLD agar se kultivuje hodin v termostatu při C. Endo a XLD naočkované ze selenitového bujónu se kultivují v termostatu při C hodin. Obr. 10 Anaerostat (Zdroj: vlastní)

42 Příprava mikroaerofilní atmosféry pro kampylobaktery (generátor plynu CapmpyGen): Chemikálie v generátoru plynu pohlcují kyslík za současného vzniku oxidu uhličitého, tím vzniká mikroaerofilní prostředí. Naočkované misky vloţíme do anaerostatu. Vyvíječ plynu má podobu papírového sáčku zabaleného do fólie. Fólii roztrhneme, vyjmeme papírový sáček a vloţíme ho do anaerostatu. Poté, co je papírový sáček vystaven vzduchu, začíná probíhat reakce, proto je nezbytné umístit vyvíječ do anaerostatu a uzavřít ho během 1 minuty, jinak nedojde ke vzniku potřebné atmosféry. Ke kaţdé kultivaci je nutno pouţít nový vyvíječ. Odečítání: Po uplynutí doby kultivace hodnotí vysokoškolský pracovník nárůst na kultivačních půdách a laborant provádí zápis výsledků do Laboratorního informačního systému. Objeví-li VŠ pracovník podezřelou kolonii, označí ji a laborantem je provedena izolace na MIU, HAJN a Švejcarovu plotnu pro bliţší určení pomocí biochemických vlastností. MIU očkujeme vpichem HAJN očkujeme vpichem a hádkem Švejcarova plotna: Označenou kolonii hustě naočkujeme na plochu biochemického klínu a na Endo agar naočkujeme širší pruh ve středu půdy. Do klínu provedeme 4 5 vpichů bakteriologickou kličkou. Na zbylou volnou plochu Endo agaru provedeme rozizolování. Na klín přiloţíme pinzetou sterilní sklíčko a na pruh ve středu agaru přiloţíme tablety mannitolu a sacharózy. Schéma jen znázorněno na Obr. 11. Obr. 11 Švejcarova plotna (Zdroj: vlastní)

43 Kultivace probíhá hodin v termostatu při C. Po uplynutí doby kultivace vyhodnotí VŠ pracovník nárůst a biochemickou aktivitu. Poté jsou případně provedeny další biochemické testy. Vše musí být opět zapsáno do Laboratorního informačního systému. (Vrba 2012) Příklad určení biochemických vlastností u salmonely je na Obr. 12 Obr Červená barva horní části Hajnovy půdy, světlá barva Endovy půdy bakterie neštěpí laktózu (dle ţluté barvy klínu ale štěpí glukózu) 2. Tmavočervená zóna kolem bílé tablety bakterie štěpí mannitol 3. Absence tmavočervené zóny kolem šedé tablety bakterie neštěpí sacharózu 4. Zčernání dolní části Hajnovy půdy a části biochemického klínu a vpichů bakterie tvoří sirovodík 5. Bubliny v Hajnově půdě i pod sklem na klínu, otevření vpichů bakterie tvoří plyn z glukózy 6. Zákal v MIU přítomen všude bakterie je pohyblivá 7. Vrstva Kovácsova činidla nezčervenala bakterie netvoří indol 8. Není růţová barva MIU ani modrá barva biochemického klínu bakterie neštěpí ureu (Zdroj: Votava aj. 2010)

44 7.2 Sérologické reakce Sérotypizace kmenů Sérotypizace kmenů, neboli antigenní analýza kmene je pouţívána k vnitrodruhovému určení mikrobů, tzv. antigenní typů, sérotypů či séroskupin. Metoda je zaloţena na reakci antigenu s protilátkou. Antigen je povrchová struktura mikroba a protilátka je imunoglobulin vytvořený proti danému mikroorganismu. Antigenní analýza se provádí pomocí aglutinace na skle. (Votava aj. 2000) Na skleněnou destičku kápneme kapku aglutinačního séra. Vedle naneseme bakteriologickou kličkou bakteriální kulturu a rozmícháme ji v kapce séra. Vzniká mléčně zkalená suspenze. Reakce musí probíhat při pokojové teplotě. Sklo nakláníme z jedné strany na druhou asi 1 minutu a poté zhodnotíme. Pozitivní reakce se projeví aglutinací neboli shlukováním do zřetelných vloček při současném projasnění suspenze. Při negativní reakci zůstane suspenze rovnoměrně zakalená. Vyšetření provádí VŠ pracovník a výsledek je poté zaznamenán do Laboratorního informačního systému. (Vrba 2012) Widalova reakce Widalova reakce slouţí k průkazu protilátek proti salmonele. Jedná se o aglutinaci na mikrotitračních destičkách, případně ve zkumavkách. Sérum pacienta se obvykle ředí od základu 1:12,5 v několika řadách důlků. Do kaţdé řady se přidá stejný objem antigenu typického pro salmonely. Přidáním antigenů vzniknou ředění 1:25, 1:50, 1:100 atd. Pouţívají se tělové antigeny 4, 5, 9, 12 a bičíkové antigeny b, d, g, m, i. Odečet bičíkových antigenů provádíme jiţ po dvouhodinové inkubaci při 37 C, odečet tělových antigenů provádíme druhý den po inkubaci při pokojové teplotě. Negativní reakce vypadá tak, ţe na dně mikrotitrační destičky je zřetelná tečka, coţ je sedimentovaný antigen. Pozitivní reakce se projeví vznikem chuchvalce, aglutinátu. Výsledkem odečtu reakce je titr, coţ je nejmenší ředění séra, při kterém ještě došlo k pozitivní reakci. Titry 1:50 se povaţují za podezřelé, titry 1:100 za jasně pozitivní. (Votava aj. 2010)

45 8. Výsledky Z laboratorního informačního systému FN Brno jsem získala informace o četnosti výskytu bakteriálních původců průjmů u pacientů hospitalizovaných ve FN Brno za období od roku 2008 do roku Výskyt jednotlivých rodů za toto období znázorňuje graf Výskyt obligátních střevních patogenů ve FN Brno rod Salmonella rod Campylobacter rod Yersinia rod Shigella četnost Graf 1 Četnost výskytu jednotlivých rodů v letech Výskyt bakterií rodu Salmonella Výskyt jednotlivých sérotypů salmonel: Salmonella agona bareilly derby enteritidis hadar heidelberg indiana infantis java livingstone montevideo

46 stanley thyphimurium paratyphi A Neurčeno Tab. 3 Četnost výskytu rodu Salmonella ve FN Brno (Zdroj: LIS FN Brno) četnost Graf 2 Četnost výskytu rodu Salmonella v jednotlivých letech Z grafu 2 vyplývá, ţe nejvíce salmonelových nákaz za sledované období bylo zaznamenáno v roce 2009, nejméně pak v roce Z dlouhodobějšího hlediska se počet případů sniţuje, v roce 2012 je však zaznamenáno o 7 případů více neţ v roce S. agona S. bareilly S. derby S. enteritidis S. hadar S. heidelberg S. indiana S. infantis S. java S. livingstone S. montevideo S. stanley S. thyphimurium S. paratyphi A Neurčeno Graf 3 Četnost výskytu jednotlivých sérotypů za celé sledované období Nejčastěji se vyskytující sérotyp ve FN Brno za posledních 5 let je Salmonella enteritidis, která představuje celých 75 % z celkového počtu případů. Salmonella thyphimurium zaujímá

47 11 %. U 10 % případů se nepodařilo sérotyp určit. Zbylá 4 % představují ostatní, méně časté sérotypy. S. agona S. bareilly S. derby S. enteritidis S. hadar S. heidelberg S. indiana S. infantis S. java S. livingstone S. montevideo S. stanley S. thyphimurium S. paratyphi A Neurčeno Graf 4 Četnost jednotlivých sérotypů v roce 2012 V roce 2012 bylo zaznamenáno 76 % případů způsobených bakterií Salmonella enteritidis, 4 % případů způsobila Salmonella thyphimurium Výskyt bakterií rodu Shigella Výskyt jednotlivých sérotypů shigel: Shigella sonnei flexneri boydii Tab. 4 Četnost výskytu rodu Shigella ve FN Brno (Zdroj: LIS FN Brno) četnost Graf 5 Četnost výskytu rodu Shigella v jednotlivých letech

48 Z grafu 5 můţeme vypozorovat postupný nárůst počtu případů. Od roku 2009, kdy byl zaznamenán pouze 1 případ, se četnost výskytu postupně zvyšuje, v roce 2012 bylo o 61 případů více neţ v roce předešlém. S. sonnei S. flexneri S. boydii Graf 6 Četnost výskytu jednotlivých sérotypů za celé sledované období Nejčastějším sérotypem z rodu Shigella je Shigella sonnei, která představuje 96 %. Shigella flexneri představuje 3 % a Shigella boydii pouhé 1 % Výskyt bakterií rodu Yersinia Yersinia enterocolitica Tab. 5 Četnost výskytu rodu Yersinia ve FN Brno (Zdroj: LIS FN Brno) četnost Graf 7 Četnost výskytu rodu Yersinia v jednotlivých letech Výskyt Yersinia enterocolitica ve FN Brno v letech je proměnlivý. Největší počet případů byl zaznamenán v roce V roce 2012 bylo zachyceno 13 případů, coţ je nejméně za posledních 5 let

49 8.1.4 Výskyt bakterií rodu Campylobacter Výskyt jednotlivých sérotypů kampylobakterů: Campylobacter coli jejuni sp Tab. 6 Četnost výskytu rodu Campylobacter ve FN Brno (Zdroj: LIS FN Brno) četnost Graf 8 Četnost výskytu rodu Campylobacter v jednotlivých letech Nejvíce případů kampylobakterové nákazy bylo zaznamenáno v roce 2010, nejméně v roce Počty případů se v jednotlivých letech příliš neliší. V roce 2012 bylo zachyceno 362 případů, coţ je o 30 případů více jak v roce 2011, došlo tedy k nárůstu. C. coli C. jejuni C. sp Graf 9 Četnost výskytu jednotlivých sérotypů za celé sledované období 83 % případů kampylobakterové nákazy bylo způsobeno sérotypem Campylobacter sp., 15 % způsobil Campylobacter jejuni a zbylá 2 % Campylobacter coli

50 C. coli C. jejuni C. sp. Graf 10 Četnost výskytu jednotlivých sérotypů v roce 2012 V roce 2012 způsobil kampylobakterovou nákazu z 54 % Campylobacter sp., z 39 % Campylobacter jejuni a ze 7 % Campylobacter coli. 8.2 Sezónní výskyt Počet nákaz způsobených obligátními střevními patogeny v průběhu roku v jednotlivých měsících kolísá. V letních měsících dochází ke zvýšení počtu hlášených případů díky vhodným podmínkám pro mnoţená bakterií v potravě. Chladné počasí v zimních měsících naopak způsobuje sníţení počtu hlášených případů. Salmonella Shigella Yersinia Campylobacter Leden Únor Březen Duben Květen Červen Červenec Srpen Září Říjen Listopad Prosinec Tab. 12 Záchyt střevních patogenů ve FN Brno v průběhu roku 2012 (Zdroj: LIS FN Brno) Sezónní výskyt u salmonelóz a kampylobakterových infekcí za rok 2012 je zřejmý z počtu hlášených případů v jednotlivých měsících. Patrná je míra zvýšení v průběhu letních měsíců,

51 počet případů salmonelóz vrcholí v srpnu a v září, největší počet kampylobycterových infekcí je v září a poté v říjnu. Yersiniózy a shigelózy hlášeny v průběhu celého roku 2012 jsou bez výrazné sezónnosti Salmonella Campylobacter Graf 17 Sezónní výskyt rodu Salmonella a Campylobacter ve FN Brno za rok Diskuze Z informací, které mi byly poskytnuty z LIS FN Brno jsem zjistila, ţe za posledních 5 let byla nejčastější původcem alimentárních nákaz salmonela. Kampylobakter byl druhý nejčastější původce. Yersinia a shigela měli téměř srovnatelnou četnost výskytu. Názorně je toto zastoupení ukázáno v grafu Výskyt obligátních střevních patogenů v ČR Nejčastějším původcem průjmových onemocnění v ČR v současné době jsou podle SZÚ bakterie z rodu Campylobacter, na druhém místě je rod Salmonella a na třetím místě rod Yersinia Salmonella Campylobacter Yersinia Shigella Tab. 7 Četnost výskytu nejčastějších střevních patogenů v ČR (Zdroj:

52 Salmonella Campylobacter Yersinia Shigella Graf 11 Četnost výskytu nejčastějších střevních patogenů v ČR v letech Od roku 2008 se počet případů kampylobakterových infekcí sníţil. V roce 2008 bylo zaznamenáno případů, kdeţto v roce 2012 bylo případů Salmonela způsobila v roce případů, v roce 2011 se počet případů sníţil na 8752, ale v roce 2012 se počet opět zvedl na případů za rok. Yersinia způsobila v roce infekcí a její výskyt se postupem času sniţuje, výskyt v roce se mi nepodařilo zjistit. Počet infekcí způsobených bakterií z rodu Shigella během posledních pěti let značně kolísá. Nejvíce případů bylo zaznamenáno v roce 2010 a nejméně v roce V roce 2012 bylo v ČR zaznamenáno 266 případů. ( 9.2 Výskyt obligátních střevních patogenů ve světě Salmonella Itálie Německo Polsko Rakousko Slovensko Španělsko Švédsko Velká Británie Celá Evropská Unie Tab. 8 Četnost výskytu rodu Salmonella v evropských zemích v letech (Zdroj: hppt://

53 četnost Graf 12 Četnost výskytu rodu Salmonella v EU v roce Salmonelóza je v EU druhou nejčastěji hlášenou gastrointestinální infekcí. Během let počet případů salmonelózy klesá a to především díky provádění úspěšných veterinárních kontrolních programů, zejména u drůbeţe. V roce 2010 bylo hlášeno potvrzených případů salmonelózy v 29 zemích EU. Nejvyšší počet byl zaznamenán v Německu a to případů, v ČR bylo v tomto roce zaznamenáno 8622 případů. Nejčastější sérotypy v roce 2010 byly Salmonella enteritidis, Salmonella thiphimurium a Salmonella infantis. (hppt:// Shigella Itálie Německo Polsko Rakousko Slovensko Španělsko Švédsko Velká Británie Celá Evropská Unie Tab. 9 Četnost výskytu rodu Shigella v evropských zemích v letech (Zdroj: hppt://

54 četnost Graf 13 Četnost výskytu rodu Shigella v EU v roce Infekce způsobené bakteriemi z rodu Shigella jsou v EU relativně neobvyklé. Často se jedná o případy související s cestováním do oblastí mimo EU. V roce 2010 bylo v EU hlášeno 7178 potvrzených případů. Nejvyšší počet případů byl hlášen ve Velké Británii, kde bylo v roce nákaz. V ČR bylo v tomto roce 450 případů. V Itálii nebyl v letech zaznamenán ani jeden případ. Nejčastějším sérotypem byla v roce 2010 Shigella sonnei, dále Shigella fleneri a poté Shigella boydii. (hppt:// Yersinia Itálie Německo Polsko Rakousko Slovensko Španělsko Švédsko Velká Británie Celá Evropské Unie Tab. 10 Četnost výskytu rodu Yersinia v evropských zemích v letech (hppt://