STANOVENÍ AUTOLÝZY Lactobacillus helveticus POMOCÍ GRAMOVA BARVENÍ A PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE

Transkript

1 STANOVENÍ AUTOLÝZY Lctocillus helveticus POMOCÍ GRAMOVA BARVENÍ A PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE IVA JEBAVÁ, JAROMÍR FIALA, ADÉLA PETŘÍKOVÁ, PAVEL ULBRICH c MILADA PLOCKOVÁ Ústv technologie mlék tuků, Ústv kvsné chemie ioinženýrství, c Ústv iochemie mikroiologie, Fkult potrvinářské iochemické technologie, Vysoká škol chemicko-technologická, Technická 5, Prh 6 Iv.Jev@vscht.cz, Jromir.Fil@vscht.cz, Adel.Petrikov@vscht.cz, Pvel.Ulrich@vscht.cz, Mild.Plockov@vscht.cz Došlo , přijto Klíčová slov: utolýz, průtoková cytometrie, Lctocillus helveticus, elektronová mikroskopie, Grmovo rvení Úvod Lctocillus helveticus je používán jko zákysová kultur při výroě sýrů s vysokodohřívnou sýřeninou (Grn Pdno, Prmigino Reggino, Emmentl) s nízkodohřívnou sýřeninou (Cheddr, Edm). Tento druh disponuje vysokým zstoupením intrcelulárních proteolytických enzymů, které po uvolnění z uňky do těst sýru pomocí utolýzy význmně přispívjí ke snížení hořkosti hydrolýzou hydrofoních peptidů, k zlepšování senzorických vlstností zvýšením produkce volných minokyselin k urychlování zrcího procesu 1-3. Mír utolýzy jednotlivých kmenů L. helveticus při výroě sýrů (in situ) je jedním z důležitých kritérií při výěru plikovtelných kmenů 4,5. Ke stnovení utolýzy in situ je možné použít uď smotnou výrou sýru, která je osvědčeným, le dlouhým ekonomicky náročným procesem, neo řdu in vitro metod, které vynikjí nízkými nákldy rychlostí 6. Z nejjednodušší screeningovou metodu in vitro je povžováno pozorování kteriální suspenze v nutričně chudém prostředí, jko je npříkld pufr, kde uňky mjí spontánní tendenci utolyzovt 7. V pufrech je mír utolýzy ovykle detekován úytkem uněk pomocí spektrofotometrického stnovení neo stnovením počtu životschopných uněk plotnovou metodou, stnovením přítomnosti ktivity intrcelulárních komponent (DNA, RNA, enzymy), mikroskopickým pozorováním neo pozorováním ktivity lytických enzymů (difuzní grová zkoušk, zymogrm) 6. Grmovo rvení sloužilo historicky k rozlišení kterií n dvě skupiny, které se vzájemně liší stvou uněčné stěny. Bylo zjištěno, že s použitím tohoto rvení lze u L. helveticus pozorovt změnu zrvení uněk při stnovení utolýzy v pufru 8. Původně grmpozitivní uňky L. helveticus (modro-filové zrvení) mění rvu jeví se jko grmnegtivní (růžovo-červené). Tto Grm-lilit je diskutován u některých mikroorgnismů (npř. Bcillus spp.) 9, le nikdy neyl spojován s utolýzou u L. helveticus. Průtoková cytometrie je znám jko velice přesná nlytická metod poskytující informce o stvu změnách kteriální populce 10. K rozlišení grmpozitivních grmnegtivních kterií lze využít metod průtokové cytometrie s vhodným fluorescenčním rvením. Specifická rviv pro grmpozitivní kterie jsou npříkld lipofilní rvivo rhodmine 123, rvivo HI (hexidium iodid) neo rvivo WGA (fluorescein-conjugted lecithin whet germ gglutinin), které se váže n N-cetylglukosmin v peptidoglyknu uněčné stěny. Těmto rvivům lipopolyschridy v uněčné stěně rání proniknutí do grmnegtivních uněk orvit je 11. Pro odlišení grmnegtivních kterií lze použít doplňkové rvivo, které rví všechny uňky ve vzorku. Jko vhodné se ukázlo rvivo HI, pokud je s uňkmi inkuováno v roztoku EDTA při 50 C po dou 15 min (cit. 11 ). Cílem této práce ylo zjistit, zd je možné průtokovou cytometrií odlišit v pufru utolyzovné uňky L. helveticus, jevící se při Grmově rvení jko grmnegtivní, od uněk grmpozitivních. Experimentální část Kmeny růstové podmínky V této práci yly použity tři kmeny L. helveticus (CNRZ 32J zákysová kultur Comté, Frncie, CNRZ 414 kumys, Rusko ICT BROI syrové krvské mléko, Česká repulik) získné z různých zdrojů, to jk vzhledem k iotopu, tk vzhledem k zeměpisnému původu. Všechny kmeny yly kultivovány v MRS ujónu (Oxoid, Anglie) eroně při teplotě 42 C po dou 16 h. Příprv uněk utolýz v pufru Kmeny yly očkovány inokulem 1 oj.% do 50 ml MRS ujónu kultivovány po dou 12 h. Poté yly odstředěny z podmínek: 9000 ot min -1 při teplotě 4 C po dou 15 min. Po odstředění yl superntnt dekntován uňky yly 2krát promyty ve 40 ml -glycerofosfátového pufru (Sigm-Aldrich) 12. Promyté uňky yly převedeny do fosfátového pufru (0,1 mol l -1, ph 7,0) jím zředěny n výslednou sornci 0,8-0,9 měřenou při vlnové délce 650 nm. Tkto připrvená uněčná suspenze ve fosfátovém pufru yl kultivován při teplotě 42 C po dou 6 h. 697

2 Stnovení utolýzy pomocí měření sornce Asornce uněčné suspenze ve fosfátovém pufru yl měřen spektrofotometrem Helios (Thermo Spectronic, Anglie) při vlnové délce 650 nm v čsech 0, 2, 4 6 h. Autolytická schopnost yl chrkterizován procentem utolýzy dle rovnice 7,12 : % utolýz = (A 0 A t ) * 100/ A 0 kde A 0 - sornce n počátku kultivce v čse 0 h, A t - sornce v průěhu kultivce v čse t, kde t = {2,4,6}. Stnovení utolýzy pomocí Grmov rvení světelného mikroskopu Fixní prepráty připrvené rozetřením 20 l uněčné suspenze ve fosfátovém pufru v čsech 0, 2, 4 6 h n plochu 1 cm 2 vyznčenou n podložním sklíčku yly fixovány plmenem, orveny podle Grm pozorovány optickým mikroskopem při tisícinásoném zvětšení pod imerzním olejem. Z kždého fixního preprátu ylo pořízeno pět snímků. U kždého snímku yl určen počet uněk jevících se jko grmnegtivní (růžovo-červené) počet uněk jevících se jko grmpozitivní (modro-filové). Autolytická schopnost yl chrkterizován procentem utolýzy dle rovnice: % utolýz = (% (G+) 0 % (G+) t ) * 100 / % (G+) 0 kde je % (G+) 0 - procentuální zstoupení grmpozitivních uněk n počátku kultivce v čse 0 h, % (G+) t - procentuální zstoupení grmpozitivních uněk v průěhu kultivce v čse t, kde t = {2,4,6}. Stnovení utolýzy elektronovým mikroskopem Vzorky pro elektronovou mikroskopii yly připrveny metodou negtivního rvení z uněčné suspenze ve fosfátovém pufru v čsech 0 4 h. Suspenze yl nnesen n tři minuty n elektronmikroskopickou měděnou síťku potženou uhlíkem. Následovlo odsátí uněk opláchnutí síťky vodou. Poté yl síťk položen n 10 s n kpku roztoku wolfrmáto-křemičitnu sodného (4 hm.%, ph 7,4). Buňky yly pozorovány trnsmisním elektronovým mikroskopem JEOL JEM-1010 s urychlovcím npětím 80 kv. Snímky yly pořízeny CCD kmerou Meg- View III spojenou se softwrem AnlySIS (Olympus Soft Imging Solutions, Německo) C. Poté ylo přidáno 10 l zásoního roztoku WGA vzorek yl inkuován při pokojové teplotě po dou 4 min. Před cytometrickou nlýzou yl vzorek zředěn 3 mol l -1 KCl n výsledný ojem 1 ml. Vzorky yly měřeny n průtokovém cytometru (PAS III, Prtec GmH, Německo). Pomocí měření reltivní distriuce velikost uněk (FSC), červené fluorescence (FL3) emitovné HI, zelené fluorescence (FL1) emitovné WGA yl zjišťován podíl utolyzovných uněk. Sttistická nlýz nměřených dt Všechn stnovení utolýzy yl opkován 6krát n nezávislých vzorcích. Pro vyloučení odlehlých hodnot yl plikován Den- Dixonův test s hldinou význmnosti 0,05. Výsledky yly prezentovány jko ritmetický průměr z šesti měření doplněné směrodtnými odchylkmi. Výsledky diskuse Klsickou metodou stnovení utolytické ktivity měřením sornce yl potvrzen rozdílný utolytický potenciál testovných kmenů. Nejvíce lytický kmen L. helveticus yl po 4 h kultivce kmen CNRZ 32J po 6 h kultivce kmen BROI (or. 1). N or. 2 vidíme, že grmpozitivní uňky L. helveticus se po 4 h kultivce ve fosfátovém pufru rví dle Grm jko grmnegtivní tj. růžovo-červené. Tto změn nstává prvděpodoně v důsledku modifikce externích uněčných struktur. Předpokládáme, že grmnegtivně jevící se uňky L. helveticus mjí poškozenou uněčnou stěnu resp. zeslenou vrstvu peptidoglyknu, což potvrzuje i elektronová mikroskopie. N or. 3 je zznmenán morfologický rozdíl uněk před po 4 h kultivci ve fosfátovém pufru. Stnovení utolýzy průtokovou cytometrií Byly připrveny zásoní roztoky fluorescenčních rviv HI (Invitrogen, Moleculr Proes, USA) o koncentrci 200 g ml -1 fluorescenčního rviv Oregon Green conjugted WGA (Invitrogen, Moleculr Proes, USA) o koncentrci 1 mg ml -1, které yly uchovávány při -18 C před použitím filtrovány (velikost pórů 0,22 m) 10. Buněčná suspenze yl zředěn v čsech 0, 2, 4 6 h v poměru 1:100 roztokem KCl (3 mol l -1 KCl, 0,035 mol l -1 EDTA, ph 7,0). K 100 l vzorku ylo přidáno 20 l zásoního roztoku HI vzorek yl inkuován 15 min při Or. 1. Stnovení utolýzy ve fosfátovém pufru pomocí měření sornce při 650 nm u tří kmenů L. helveticus 32J, 414 BROI; A utolýz 698

3 Výsledky utolytické ktivity stnovené pomocí sledování úytku grmpozitivních uněk korelovly s výsledky klsické metody. Některé uňky všk yly zrveny jk červeně, tk modře docházelo tk k sujektivním chyám při stnovení rvy uňky, což způsoilo vysoké směrodtné odchylky (or. 4). Průtokovou cytometrií ylo zjištěno (or. 5), že ěhem kultivce dochází k tvorě dvou různých skupin uněk, lišících se ve schopnosti vázt rvivo HI. Toto rvivo vyzřující červenou fluorescenci FL3 doshuje u vzorku po 4h kultivci ve fosfátovém pufru dvou mxim, což svědčí o tom, že ve vzorku jsou přítomny dv typy uněk stejně tk jko při Grmově rvení. Ve vznosti rviv WGA, sledovné pomocí emise zelené fluorescence FL1, neyl zznmenán žádná souvislost s uněčnou utolýzou. Sledováním reltivní distriuce velikosti uněk (FSC) v průěhu kultivce ve fosfátovém pufru průtokovou cyto Or. 2. Sledování uněk L. helveticus BROI ve fosfátovém pufru orvených dle Grm n počátku kultivce ) v čse 0 h, ) v čse 4 h, světelným mikroskopem při tisícinásoném zvětšení Or. 3. Sledování utolýzy uněk L. helveticus BROI ve fosfátovém pufru n počátku kultivce ) v čse 0 h, ) v čse 4 h, elektronovým mikroskopem Or. 4. Stnovení utolýzy ve fosfátovém pufru pomocí Grmov rvení světelného mikroskopu u tří kmenů L. helveticus 32J, 414 BROI; A utolýz 699

4 Or. 5. Příkld sledování utolýzy u L. helveticus BROI ve fosfátovém pufru průtokovou cytometrií se stnovením reltivní velikosti uněk (FSC) červené fluorescence (FL3) získné orvením hexidium iodidu (HI) ) n počátku kultivce v čse 0 h, ) v průěhu kultivce v čse 4 h metrií ylo prokázáno, že velikost uněk ěhem kultivce klesá (or. 6). Největší změny v reltivní velikosti yly ptrny u v počátku největších uněk kmene BROI. Zde docházelo k zmenšení reltivní distriuce velikosti uněk z 11,8 n 8,7. U osttních kmenů yl tendence stejná le s pozvolnější změnou. Závěr Or. 6. Sledování reltivní velikosti uněk L. helveticus 32J, 414 BROI průtokovou cytometrií v průěhu kultivce ve fosfátovém pufru. RDV reltivní distriuce velikosti Různými metodmi ylo prostudováno utolytické chování tří kmenů L. helveticus. Byl použit klsická metod sledování utolýzy v pufru pomocí měření sornce, která yl doplněn o stnovení pomocí grmov rvení světelného mikroskopu, elektronové mikroskopie průtokové cytometrie s fluorescenčním rvením. Bylo zjištěno, že Grmovo rvení průtokovou cytometrii lze použít jko doplňkové metody k detekci utolýzy u L. helveticus. 700

5 Tto práce yl finncován z účelové podpory n specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT č. 21/2010) grntem MŠMT LITERATURA 1. Bockelmnn W.: Int. Diry J. 5, 977 (1995). 2. Hnnon J. A., Wilkinson M. G., Delhunty C. M., Wllce J. M., Morrissey P. A., Beresford T. P.: Int. Diry J. 13, 313 (2003). 3. Hnnon J. A., Kilcwley K. N., Wilkinson M. G., Delhunty C. M., Beresford T. P.: Int. Diry J. 17, 316 (2007). 4. Kenny O., FitzGerld R. J., O Cuinn G., Beresford T. P., Jordn K.: Int. J. Diry Tech. 58, 207 (2005). 5. Kenny O., FitzGerld R. J., O Cuinn G., Beresford T. P., Jordn K.: Int. Diry J. 58, 797 (2006). 6. Lortl S., Chpot-Chrtier M. P.: Int. Diry J. 15, 857 (2005). 7. Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J. C., Monnet V.: J. Diry Sci. 81, 2321 (1998). 8. Ondráčková I., Solichová K., Fil J., Plocková M.: Sorník: Celostátní přehlídky sýrů 2010, Výsledky přehlídek sorník přednášek konference Mléko sýr. VŠCHT Prh, 264 (2010). 9. Beveridge T. J.: J. Bcteriol. 172, 1609 (1990). 10. Novák J., Bsřová G., Fil J., Dostálek P.: Chem. Listy 102, 183 (2008). 11. Holm C., Jespersen L.: Appl. Environ. Microiol. 69, 2857 (2003). 12. Kozkov D., Solichová K., Ondrckov I., Svirkov E., Plockov M.: J. Food Nutr. Res. 49, 1 (2010). 13. Horsáková I., Voldřich M., Čeřovský M., Sedláčková P., Šicnerová P., Ulrich P.: Czech J. Food Sci. 27, 362 (2009). I. Jevá, J. Fil, A. Petříková, P. Ulrich c, nd M. Plocková ( Deprtment of Diry nd Ft Technology, Deprtment of Fermenttion Chemistry nd Bioenginee-ring, c Deprtment of Biochemistry nd Microiology, Fculty of Food nd Biochemicl Technology, Institute of Chemicl Technology, Prgue): Detection of Lctocillus helveticus Autolysis Using Grm Stining nd Flow Cytometry In this study we comined common method for utolysis detection - spectrophotometry of cteril suspension in uffer with Grm stining - nd flow cytometry. After 4-h incution in phosphte uffer the Grmpositive cells re colored like Grm-negtive cells. A correltion etween spectrophotometric oservtion nd Grm stining ws found. Using flow cytometry, the formtion of two peks of red fluorescence emitted y hexidium iodide (HI) ws oserved fter 4-h incution of the cell suspension in phosphte uffer. This indictes the presence of two cell groups with different cpcity of inding HI to peptidoglycn s well s explins the oservtion y electron nd light microscopy on Grm stining. A decrese in cell size during their cultivtion in phosphte uffer ws lso oserved. 701