Masarykova univerzita. Lékařská fakulta CYTOLOGICKÁ DIAGNOSTIKA CHOROB ŠTÍTNÉ ŽLÁZY A MOŽNOSTI JEJÍHO ZPŘESNĚNÍ. Bakalářská práce

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta CYTOLOGICKÁ DIAGNOSTIKA CHOROB ŠTÍTNÉ ŽLÁZY A MOŽNOSTI JEJÍHO ZPŘESNĚNÍ Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí práce: MUDr. Jitka Kyclová Autor: Lucie Svatošová Brno, duben 2014

2 Jméno a příjmení autora: Název bakalářské práce: Lucie Svatošová Cytologická diagnostika chorob štítné žlázy a možnosti jejího zpřesnění Pracoviště: Vedoucí bakalářské práce: FN Brno Ústav patologie MUDr. Jitka Kyclová Rok obhajoby bakalářské práce: 2014 Souhrn: Cytodiagnostika lézí štítné žlázy byla na Ústavu patologie FN Brno zavedena teprve před poměrně krátkou dobou (cca 2 roky). Cílem práce je zhodnotit dosavadní výsledky a jejich korelaci s bioptickými nálezy a zaměřit se na možnost zavedení metodik zvyšujících diagnostickou výtěžnost vyšetření, zejména techniku cytobloku, popřípadně imunocytochemické vyšetření. Klíčová slova: štítná žláza, cytologie, klasifikace Bethesda, FNAC Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Jitky Kyclové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne Podpis autora

4 Poděkování Ráda bych poděkovala své vedoucí bakalářské práce paní MUDr. Jitce Kyclové za odborné vedení, věcné připomínky a spolupráci při získávání a zpracování dat pro statistickou část práce. Dále také laborantkám cytologické laboratoře za cenné rady ohledně zpracování vzorků.

5 Obsah: 1 Úvod Obecná část Štítná žláza (glandula thyroidea) Fyziologie štítné žlázy Poruchy štítné žlázy Vrozené poruchy Struma Poruchy funkce Zvýšená funkce tyreotoxikóza Graves-Basedowova choroba Snížená funkce hypotyreóza Subklinické poruchy funkce (skryté) Záněty Akutní hnisavá tyreoiditida Subakutní tyreoiditida de Quervainova Chronická tyreoiditida Hashimotova tyreoiditida Nádory Nádory benigní Folikulární adenom (FA) Nádory maligní Papilární karcinom (PTC) Folikulární karcinom (FTC) Medulární karcinom (MTC) Málo diferencovaný karcinom Anaplastický karcinom (ATC)

6 Neepitelové nádory Speciální část Bethesda klasifikace Bethesda I Bethesda II Bethesda III Bethesda IV Bethesda V Bethesda VI Cytologické vyšetření Indikace k odběru Uzlová struma Hashimotova tyreoiditida Hyperfunkční struma Opakování FNAC Zvětšené lymfatické uzliny Experimentální část Odběr materiálu Zařízení Příprava pacienta Odběr vzorků Zpracování vzorku Přímý nátěr Další techniky Barvení preparátu Barvení dle Papanicolaoua Barvení dle Giemsy Hodnocení preparátu

7 4.3 Imuocytochemie Interpretace výsledků Zpracování získaných dat Správná cytologická diagnóza Nesprávná cytologická diagnóza Závěr Literatura Seznam tabulek: Tabulka 1. Rozdělení nádorů Tabulka 2. Bethesda klasifikace Tabulka 3. Indikace k vyšetření FNAC Tabulka 4. Barvení dle Papanicolaouva Tabulka 5. Barvení dle Giemsy Tabulka 6. Celkový přehled a srovnání vzorků Tabulka 7. Nesprávná cytologická diagnóza Tabulka 8. Počty SP, SN, FP a FN výsledků Seznam grafů: Graf 1. Histogram absolutních četností vyšetřených pacientů Graf 2. Procentuální zastoupení jednotlivých Bethesda kategorií Graf 3. Histogram absolutních četností správně diagnostikovaných pacientů

8 Seznam obrázků: Obrázek 1. a. Schéma štítné žlázy [1], b. Struktura folikulu [2] Obrázek 2. Struma [3] Obrázek 3. Endokrinní orbitopatie [7] Obrázek 4. Akutní zánět štítné žlázy. [4] Obrázek 5. Granulomatózní zánět štítné žlázy de Quervainova tyreoiditida. [4] Obrázek 6. Hashimotova lymfocytární tyreoiditida. [4] Obrázek 7. Mikrofolikulární adenom [4] Obrázek 8. Papilární karcinom s přítomností typických papil. [5] Obrázek 9. Medulární karcinom [5] Obrázek 10. Málo diferencovaný karcinom. [4] Obrázek 11. Anaplastický karcinom. [4] Obrázek 12. MALT lymfom [4] Obrázek 13. Nedaignostické nálezy [4] Obrázek 14. BFN: Graves-Basedowova choroba [4] Obrázek 15. Atypie nejasného významu [4] Obrázek 16. Aspirace tenkou jehlou (FNAC) [5] Obrázek 17. Zhotovení přímého nátěru [5] Obrázek 18. Barvící analyzátor [6]

9 Seznam použitých zkratek: AUS ATC BFN CRP ČR EO FA FLUS FN FN Brno FN nebo SFN FN HCT nebo SFN HCT FNAC FP FTC MALT MEN MGG MTC PAP PTC atypie nejistého významu anaplastický karcinom benigní folikulární uzlík C-reaktivní protein Česká republika endokrinní orbitopatie folikulární adenom folikulární léze nejistého významu falešně negativní Fakultní nemocnice Brno folikulární neoplazie nebo podezření z folikulární neoplazie folikulární neoplázie, Hürtleho buněčný typ nebo podezření z folikulární neoplazie, Hürtleho buněčný typ aspirační biopsie tenkou jehlou falešně pozitivní folikulární karcinom slizniční lymfatická tkáň mnohočetná endokrinní neoplázie May-Grünwald-Giemsa medulární karcinom Papanicolaou papilární karcinom

10 SFM SP SN TRH TSH TX tzv. ÚPA UZ podezření z malignity správně pozitivní správně negativní tyreotropin stimulující hormon tyreotropní hormon toxický takzvaný Ústav patologie ultrazvuk

11 1 Úvod V této práci jsou přehledně zpracované choroby štítné žlázy se zaměřením na jejich cytologický obraz, čemuž je věnována obecná část. Speciální část je zaměřena na Bethesda klasifikaci, obecnou rovinu cytologického vyšetření a jednotlivé stavy, které považujeme za indikaci k provedení FNAC. V experimentální části je popsán postup odebrání a následného zpracování vzorku a to několika technikami. Důraz je kladen především na zhotovení přímého nátěru, který je pro diagnostiku nemocí štítné žlázy rutinně používán na Ústavu patologie FN Brno, kde mi byly předány veškeré informace ohledně laboratorního zpracování přijatých vzorků a poskytnuta data použitá pro zpracování statistické části. Cílem statistické práce je zhodnocení dosavadních výsledků cytologických vyšetření štítné žlázy na ÚPA FN Brno a jejich korelace s bioptickými nálezy u dohledaných pacientů

12 2 Obecná část 2.1 Štítná žláza (glandula thyroidea) Jedná se o velkou endokrinní žlázu, která je umístěna v přední a dolní části krku. Má tvar podkovy a je tvořena pravým a levým lalokem, které jsou spojeny úzkým spojovacím můstkem, uloženým před průdušnicí (obr. 1.a). Žláza je bohatě prokrvována, což zajišťuje její červenohnědou barvu. Do žlázy vnikají četné přepážky, které ji rozdělují na menší lalůčky až mikroskopické folikuly. (PĚGŘÍM, a další, 1972) Přepážky postupně přecházejí v jemné vazivo, složené z retikulárních vláken, které odděluje folikuly, obklopované sítí krevních a mízních kapilár fenestrovaného typu. Folikuly jsou kruhovité útvary, jejichž stěna je tvořena z vrstvy epitelových buněk (obr. 1.b). Výška těchto buněk je ovlivňována funkcí žlázy. Při hypofunkci jsou buňky ploché, za normálních okolností kubické a v hyperfunkci dosahují cylindrického tvaru. Střed folikulů je vyplňován viskózní tekutinou neboli koloidem, produkovaným folikulárními buňkami. Součástí koloidu je glykoprotein thyroglobulin, který obsahuje základní hormony štítné žlázy a to především tetrajodtyronin (tyroxin), trijodtyronin a dijodtyronin. Na jejich produkci a uvolnění má vliv tyreotropní hormon hypofýzy (TSH). Vedle folikulárních buněk se zde nacházejí i takzvané parafolikulární C buňky. Ty jsou zodpovědné za sekreci hormonu kalcitoninu. Velikost a váha štítné žlázy závisí na několika faktorech, jako je věk, pohlaví či geografické podmínky. (ČIHÁK, 1988) Obrázek 1. a. Schéma štítné žlázy [1], b. Struktura folikulu [2]

13 2.2 Fyziologie štítné žlázy Tyreoidální činnost, tedy produkce hormonů, je ovlivňována několika způsoby: a) osa hypotalamus-hypofýza Hormon hypotalamu TRH stimuluje syntézu a uvolnění TSH v hypofýze. TSH je následně odpovědný za vyplavení hormonů štítné žlázy do krve. V případě jejich zvýšené koncentrace v krvi dojde k pozastavení výdeje TSH díky tzv. zpětné vazbě s pomocí vyšších nervových center v mozku. (DVOŘÁK, 2002) b) příjem jódu v potravě Dostatečný příjem jódu je pro správnou činnost žlázy nezbytný. Doporučené množství je µg jódu denně. Vyšší hladiny jsou potřebné především v těhotenství a pubertě. (DVOŘÁK, 2002) V případě, že denní příjem jódu klesne pod 50 µg, tyreoidea není schopna udržet přiměřenou sekreci hormonů. Onemocnění z nedostatku jódu se projevují jak u dětí, tak i u dospělých pacientů. Patří mezi ně především: struma, hypotyreóza, poruchy mentálních funkcí či somatického vývoje, jódová tyreotoxikóza. Denně je využito asi 75 µg jodidu k syntéze hormonů a vytváření zásobního množství, které je potřebné jako ochrana před obdobím eventuálního deficitu. Zbylá část přijatého jódu se vrací zpět do extracelulární tekutiny. (LÍMANOVÁ, a další, 1995) c) imunitní systém Imunitní systém je významným regulátorem funkce štítné žlázy. Účastní se pomocí protilátek, které stimulují nebo inhibují jeji činnost za patologických stavů. Některá onemocnění štítnice mají autoimunitní charakter. (LÍMANOVÁ, a další, 1995) d) funkce enzymů Přeměna hormonu tyroxinu na účinný trijodtyronin pomocí specifických enzymů. (DVOŘÁK, 2002)

14 2.3 Poruchy štítné žlázy Hormony tyroxin a trijodtyronin zvyšují metabolismus a tím se podílí na růstu a vývoji celého organismu. Nepostradatelným prvkem k produkci těchto hormonů je jód. Jejich hladinu v krvi ovlivňuje tzv. zpětná vazba mezi tyroxinem a TSH. V okamžiku, kdy koncentrace tyroxinu v krvi klesne, dojde k uvolňování TSH vlivem daného liberinu (tyreoliberin). V opačném případě liberinu ubývá. (STŘÍTESKÝ, 2001) Vrozené poruchy Mezi vrozená onemocnění štítné žlázy řadíme několik stavů, především kongenitální hypotyreózu (vrozené snížení funkce). K tomuto onemocnění dochází z 2 různých příčin: - porucha morfogeneze štítné žlázy (dysgeneze) - porucha funkce štítné žlázy (dyshormonogeneze) Pro včasnou diagnostiku poruch funkce štítné žlázy je zaveden novorozenecký skríning. Jde o vyhledávání kongenitální hypotyreózy pomocí laboratorního vyšetření hladiny TSH v krvi novorozence. (MARKALOUS, a další, 2007) Při nedostatečné činnosti dochází k těžkým poruchám, které jsou způsobeny nedostačujícím množstvím hormonu tyroxinu v krvi. Při nevčasné novorozenecké diagnostice těchto poruch dochází k opožděnému duševnímu i tělesnému vývoji dítěte. To má za následek zpomalený růst, ochablé svalstvo, špatné chápání i hluchoněmotu. Po stránce duševní dochází až ke kretenismu. (PĚGŘÍM, a další, 1972) Struma Jedná se o zvětšení štítnice, které může způsobit viditelné rozšíření krku (Obr. 3). Díky tomu dochází k utlačování jeho orgánů, což může mít za následek potíže při dýchání a polykání. (STŘÍTESKÝ, 2001) Jako prostá struma se označuje takové zvětšení štítné žlázy, při kterém nedochází k poruše funkce nebo jinému onemocnění jako je zánět, nádor a další

15 Deficit jódu je jedním z hlavních příčin vzniku prosté strumy. Vliv mají také genetické predispozice, strumigeny či škodliviny zevního prostředí. V České republice se četnost strumy výrazně snížila po zajištění normalizace přísunu jódu v potravě. (MARKALOUS, a další, 2007) Podstatou je hyperplazie folikulárních buněk. V případě rovnoměrného zvětšení, bez přítomnosti uzlovitých ložisek, mluvíme o difuzní strumě. Postupem času dochází k vzniku hyperplastických uzlů a to v různých částech žlázy. Po takovémto vývoji vzniká struma nodózní. (ČÁP, a další, 2003) Z histologického hlediska má difuzní struma podobný obraz jako normální štítná žláza malé folikuly s nepatrným množstvím koloidu, ohraničené vysokými tyreocyty. Jde o tzv. difuzní parenchymatózní strumu. Častější jsou však velké folikuly bohaté na koloid s kubickými nebo plochými folikulárními buňkami. Pak hovoříme o difuzní koloidní strumě. U strumy nodózní vnímáme mikrofolikulární uspořádání uzlů s nepatrným koloidem a cylindrickými folikulárními buňkami či makrofolikulární, kde jsou objemné folikuly vyplněné koloidem s atrofickými tyreocyty. Často dochází ke kombinaci obou systémů nejen v rámci jedné žlázy, ale i jednoho uzlu. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 2. Struma [3] Poruchy funkce Normální funkce štítné žlázy je velmi důležitý faktor nejen pro vývoj jedince, ale i pro správný průběh většiny životních pochodů. V okamžiku, kdy dojde ke snížení nebo zvýšení této funkce, dochází k postupným změnám. Ty mohou vygradovat až k životně nebezpečným stavům

16 dělení poruch funkce: - Zvýšená funkce - Snížená funkce - Skryté poruchy funkce (MARKALOUS, a další, 2007) Zvýšená funkce tyreotoxikóza U hyperfunkce dochází k zvýšenému uvolňování tyreoidálních hormonů tyroxinu a trijodtyroninu do krve. To neodpovídá potřebám organizmu a tak vniká hypertyreóza. Tuto chorobu doprovází řada vedlejších příznaků. Patří sem hubnutí, horkokrevnost, poruchy spánku, bušení srdce až poruchy srdečního rytmu, průjmy či postupná svalová slabost. (MARKALOUS, a další, 2007) Tyreotoxikáza může vzniknout z různých příčin. Mezi nejčastější patří: - Graves-Basedowova choroba - toxická mnohouzlová struma - toxický (independentní) adenom - další méně časté příčiny (DVOŘÁK, 2002) Graves-Basedowova choroba Jde o autoimunitní onemocnění štítné žlázy, které je nejčastější příčinou zvýšené funkce a to především v oblastech, kde není problém s nedostatkem jódu v potravě. Autoprotilátky působí na receptor pro TSH, což má za následek jeho stimulaci. Výsledkem tohoto procesu je růst žlázy a vyšší produkce hormonů. (ČÁP, a další, 2003) Kromě příznaků tyreotoxikózy se u Graves-Basedowovy choroby objevují i příznaky z postižení tkání mimo štítnou žlázu. Typickým příkladem je imunitní poškození tkání v očnici, tzv. endokrinní orbitopatie (EO). Ta se projevuje různými příznaky, mezi které patří: zkrácení horního i dolního víčka,

17 začervenání či otok víček, bolestivý tlak za oční koulí, nadměrné slzení nebo vytlačování oka z očnice, tzv. exoftalmus (obr. 3.). Dále může docházet k různým poruchám vidění až ke slepotě. (DVOŘÁK, 2002) Obrázek 3. Endokrinní orbitopatie [7] Snížená funkce hypotyreóza Nedostatečná produkce hormonů štítné žlázy je nejčastější příčinou vzniku hypotyreózy. Za těchto okolností hovoříme o primární hypofunkci. Vzácně narážíme na sekundární hypofunkci, způsobenou defektem řízení štítnice z hypofýzy. Nemocní se potýkají se zvýšenou únavou, zimomřivostí, bolestí svalů a kloubů, suchou kůží nebo zpomalením tepu. U dlouhodobě nedostatečné činnosti sledujeme poruchy výměny tuků. Je tedy i zvýšené riziko vzniku aterosklerózy. (MARKALOUS, a další, 2007) Subklinické poruchy funkce (skryté) Jde o poškození, při kterém pacienti nepociťují žádné obtíže ani příznaky, ale jsou zde viditelné laboratorní odchylky. Můžeme sledovat buď zvýšenou hladinu TSH v krvi, což poukazuje na hypofunkci, anebo sníženou hladinu, která doprovází hyperfunkci. Hodnoty tyroxinu a trijodtyroninu oproti hladině TSH zůstávají v normě. (MARKALOUS, a další, 2007)

18 2.3.4 Záněty Zánět je složitý komplex dějů a morfologických změn, zpravidla vyvolaný působením škodlivého činitele. Má funkci obrannou a opravnou. Příčiny vzniku zánětu můžou být různé. Ze zevního prostředí působí vlivy fyzikální i chemické. Ty můžou způsobit různé rány, popáleniny a jiné, jejichž hojení probíhá právě zánětem. Infekční záněty jsou původu biologického. Vnitřní příčiny nemocí se na vzniku zánětu uplatňují patogenní imunitou. (STŘÍTESKÝ, 2001) Mezi záněty štítnice neboli tyreoiditidy se řadí choroby, které mají různý původ i průběh. Můžeme je rozdělit do tří základních skupin. záněty akutní (náhlé) záněty subakutní (několik týdnů) záněty chronické (dlouhodobé) (MARKALOUS, a další, 2007) Akutní hnisavá tyreoiditida Jde o vcelku vzácný zánět štítné žlázy. Hlavní příčinou je infekce bakteriemi. Mezi ně se řadí především streptokoky, stafylokoky, pneumokoky, ale také salmonela či mykobakteria. Nejčastějšími pacienty jsou děti do 10 let věku a u dospělých jsou k akutní hnisavé tyreoiditidě o něco více náchylnější ženy než muži. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 4. Akutní zánět štítné žlázy [4] Četné neutrofily, makrofágy a zánětlivé nečistoty

19 Z pohledu cytologie je zde několik typických znaků, které napomáhají k určení správné diagnózy. V cytologických nátěrech nacházíme především neutrofilní granulocyty, dále také histiocyty a makrofágy. U folikulárních buněk, kterých bývá v nátěru jen malé množství, můžeme sledovat degenerativní změny. V případě, že preparát obarvíme dle Grama, můžeme prokázat i přítomnost bakterií. (ČÁP, a další, 2003) Subakutní tyreoiditida de Quervainova Příčina subakutního zánětu štítné žlázy není zcela jistá. Nejčastěji se však hovoří o původu virovém. Této hypotéze nahrává i fakt, že k subakutní tyreoiditidě dochází častěji v období, kdy se ve vyšší míře projevují virová onemocnění. Antibiotika jsou v tomto případě neúčinná. Z klinického pohledu můžeme pozorovat zduření štítné žlázy, která je na pohmat a při polykání bolestivá. Dále vnímáme obecné projevy zánětu jako je vysoká sedimentace erytrocytů, vyšší hladina CRP a zvýšená teplota. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 5. Granulomatózní zánět štítné žlázy de Quervainova tyreoiditida [4] Přítomny jsou epiteloidní granulomy, smíšené zánětlivé buňky a benigní folikulární buňky. Cytologický nátěr de Quervainovy tyreoiditidy bývá krevnatý se střední buněčností. Především v počáteční fázi nacházíme lymfocyty, leukocyty a makrofágy. Dále jsou přítomny epiteloidní buňky, obrovské mnohojaderné buňky, které mohou mít i více než 100 jader, či folikulární buňky. Cytologický obraz se v průběhu nemoci mění, proto má v časných stádiích odlišnou podobu než v pozdních fázích, kde se vyskytuje jizevnaté pojivo, které poukazuje na reparativní změny. (ČÁP, a další, 2003)

20 Chronická tyreoiditida Nejčastější zánětlivé onemocnění štítnice, které postihuje až 3% populace v ČR. Nejrizikovější skupinou jsou ženy středního a vyššího věku, u kterých je riziko vzniku nemoci 5-15%. Vzniká následkem autoimunitního onemocnění a vliv mají i genetické predispozice. Chronických zánětů štítné žlázy je několik typů. (MARKALOUS, a další, 2007) Varianty chronické tyreoiditidy podle Volpého klinická klasifikace: - Hashimotova tyreoiditida - lymfocytární tyreoiditida dětí a adolescentů - chronická fibrózní varianta - atrofická tyreoiditida - idiopatická asymptomatická hypotyreóza - poporodní a tzv. tichá tyreoiditida (LÍMANOVÁ, a další, 1995) Hashimotova tyreoiditida Lymfomatózní struma byla popsána roku Má velmi variabilní charakter a hlavně velikost. Tento typ tyreoiditidy není sice bolestivý, ale pacienti popisují nepříjemné pocity na krku. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 6. Hashimotova lymfocytární tyreoiditida [4] Viditelné onkocyty a polymorfní lymfocyty

21 V cytologickém obrazu jsou především lymfocyty ve všech stupních vyzrávání. Celkově si všímáme vysoké buněčnosti v nátěru. Kromě lymfoidních elementů se zde nacházejí makrofágy s jadernou drtí, tzv. lymfo-histiocytární uzlíky nebo plazmatické buňky. Zhruba u třetiny nemocných nalézáme v nátěru izolované histiocyty a mnohojaderné obrovské buňky. Typickým znakem jsou onkocyty s jadernou polymorfií. V pozdních fázích jsou nátěry méně buněčné s přítomností fragmentů pojiva. (ČÁP, a další, 2003) Nádory Nádor je geneticky podmíněný abnormální přírůstek buněčné tkáňové hmoty klonálního charakteru. Jeho růst není v koordinaci s růstem okolních tkání a rovnovážným stavem organismu. Nádorová proliferace přetrvává i po odstranění základního etiologického momentu. (REJTHAR, a další, 2002) Můžeme je třídit do dvou hlavních skupin a to na nádory benigní a maligní. Toto dělení vychází ze vztahu k okolní tkáni a ze způsobu jejich šíření. (REJTHAR, a další, 2002) Nádory benigní Základním charakteristickým rysem benigních neboli nezhoubných nádorů je pomalý růst bez závažného porušení okolní tkáně. Zůstávají ohraničené, často i vazivově opouzdřené a na okolí působí většinou jen tlakem. Pouzdro vzniká z vlastního nádorového stromatu a částečně i z okolní, tlakovou atrofií pozměněné tkáně, která je v bezprostřední blízkosti s nádorem. Díky tlakové atrofii mohou vznikat sekundární opouzdření i u nádorů, které samy o sobě žádné pouzdro nemají, a dokonce u některých mírně prorůstajících nádorů. Chirurgicky bývají snadno odstranitelné. Škodlivé jsou nejčastěji díky svému nepříznivému umístění. Mezi nezhoubné nádory štítné žlázy patří folikulární adenomy. Jsou opouzdřené a je u nich patrná folikulární buněčná diferenciace. (REJTHAR, a další, 2002)

22 Folikulární adenom (FA) Nezhoubný, vazivově opouzdřený tumor, který vzniká z folikulárních buněk. Jeho velikost je většinou 1-3 cm a tvar je kulovitý či vejčitý. Okolní tkáň bývá nádorem utlačována. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 7. Mikrofolikulární adenom [4] Mikrofolikly s koloidem v centru. Folikulární adenomy podléhají velké variabilitě histologického uspořádání, nejčastěji jde o mikro- nebo normofolikulární typ. To se odráží i ve vzhledu cytologických nátěrů. V případě již zmiňovaných normofolikulárních adenomů dominuje v nátěrech na pozadí difuzně rozprostřený koloid s folikulárními buňkami, které jsou jednotlivě rozprostřené nebo ve skupinkách různé velikosti. Převážně jde o středně buněčné nátěry s přítomností tkáňových fragmentů. Mikrofolikulární adenomy bývají podstatně buněčnější. Folikulární buňky jsou jednotlivě rozptýlené nebo se nacházejí v malých shlucích. V těchto shlucích jsou často zbytky aspirovaných mikrofoliklů, které mohou obsahovat malé množství koloidu. (ČÁP, a další, 2003) Nádory maligní Maligní neboli zhoubné nádory rostou vůči své okolní tkáni agresivně a jsou schopny vytvářet metastázy neboli druhotná ložiska nádorových buněk ve vzdálených místech od primárního nádoru

23 Projevem agresivního růstu je: a) infiltrativní růst - šíření tkáňovými štěrbinami b) invazivní růst - často provázen těžkými poruchami funkce postižené tkáně či krvácením narušených cév Chirurgické odstranění je poměrně komplikované. Oproti benigním tumorům jsou od okolní tkáně jen nepřesně ohraničené. (REJTHAR, a další, 2002) Nádor vycházející z Benigní typ Maligní typ Folikulárních buněk - Folikulární adenom - Folikulární karcinom - Papilární karcinom - Málo diferencovaný karcinom - Anaplastický karcinom Parafolikulárních C buněk - Medulární karcinom Tabulka 1. Rozdělení nádorů Papilární karcinom (PTC) Zhoubný epitelový nádor, který vychází z folikulárních buněk. PTC je nejčastějším maligním typem a představuje % nádorů štítné žlázy. (VLČEK, a další, 2002) Vyšší riziko vzniku je po ozáření krku či hlavy. Často jde o radiační poškození v dětství a následný vznik nádoru ve věku okolo 20 let. U PTC je relativně větší výskyt metastáz do krčních lymfatických uzlin. (ČÁP, a další, 2003) Kromě klasické formy papilárního karcinomu, která je nejčastější, jsou i další morfologické varianty PTC. Patří mezi ně: - Folikulární varianta PTC - Cystický PTC - Difuzní sklerozující PTC - PTC z cylindrických buněk - PTC z vysokých buněk

24 - Onkocytární varianta PTC - Onkocytární PTC s lymfoidním stromatem (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 8. Papilární karcinom s přítomností typických papil [5] Z cytologického hlediska vnímáme několik základních znaků, které jsou typické pro klasický PTC. Nátěry jsou vysoce buněčné, s malým množstvím zahuštěného koloidu. U nádorových buněk dochází ke zvětšení a anizomorfii jader, vznikají mnohočetné intranukleární pseudoinkluze a zářezy. Vyskytují se i obrovské mnohojaderné buňky, papilární fragmenty či psamomatózní tělíska. Pro spolehlivé určení diagnózy PTC je potřeba, aby v nátěru bylo více znaků současně. (ČÁP, a další, 2003) Folikulární karcinom (FTC) Maligní epitelový nádor štítné žlázy se známkami folikulární diferenciace. Neobsahuje jaderné změny a papily, které jsou typické pro papilární karcinom. Celkově představuje druhý nejčastější zhoubný nádor štítné žlázy. Jeho výskyt je výrazně vyšší v oblastech s nedostatkem jódu. U FTC je typický sklon k hematogenním metastázám především v plicích a kostech. (VLČEK, a další, 2002) U FTC jsou nátěry obdobně jako u FA hypercelulární s nepatrným množstvím až absencí koloidu. Folikulární buňky jsou nízce kohezivní, převážně jednotlivě či v drobných shlucích rozptýlené. V některých případech tvoří mikrofolikulární formace s koloidovým centrem. (ČÁP, a další, 2003)

25 V současné době neexistují spolehlivá cytologická kritéria, která by dokázala s jistotou rozlišit benigní a maligní folikulární tumor. Pro konečnou diagnózu je třeba znát histologický obraz. Folikulární karcinom se svou histologickou stavbou podobá folikulárnímu adenomu. Oba mají vazivové pouzdro a stejnou mikroskopickou strukturu. Jediný rozdíl je v přítomnosti či absenci invaze (šíření). Folikulární tumor považujeme za maligní v takovém případě, kdy dojde k invazi pouzdra v celé jeho tloušťce anebo k invazi do cév. (ČÁP, a další, 2003) Medulární karcinom (MTC) Tento typ vychází z parafolikulárních C-buněk. Medulární karcinom není tak častý a představuje 3-12 % nádorů štítné žlázy. Výskyt MTC je především sporadický (2/3 případů), ale objevuje se i ve familiární formě (1/3 případů) s autozomálně dominantním typem dědičnosti. (VLČEK, a další, 2002) Familiární MTC je většinou součástí syndromu mnohočetné endokrinní neoplázie (MEN), která se dělí na 2 typy: MEN 2a a MEN 2b. U typu MEN 2a vzniká u 50% nemocných také feochromocytom a u 20-30% se zároveň vyvíjí primární hyperparatyreóza. MEN 2b varianta je méně častá, projevuje se agresivním MTC a feochromocytomem, marfanoidním habitem či ganglioneuromy sliznice dutiny ústní a střeva. Příčinou vzniku familiární formy nádoru je mutace RET protoonkogenu v zárodečné buňce, proto postihuje všechny buňky organizmu. U sporadických forem není příčina jasná. Jako nádorový marker se využívá stanovení hladiny kalcitoninu, který je produkován medulárním karcinomem, ze séra pacienta. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 9. Medulární karcinom [5] Buňky MTC mají často plazmacytoidní vzhled. Občasné větší atypické buňky jsou také přítomny

26 Cytologické nátěry jsou středně až bohatě buňěčné, s buňkami jednotlivě rozptýlenými nebo v drobných skupinkách. Koloid zcela chybí, ale mohou být přítomny hrudky amyloidu. Nádorové buňky jsou často dvoj- či vícejaderné a mívají různé tvary (plazmacytoidní, vřetenaté, trojúhelníkovité). Cytoplasma bývá bohatá, s azurofilními nebo eozinofilními granuly. (ČÁP, a další, 2003) Málo diferencovaný karcinom Do této kategorie se řadí karcinomy, které jsou na hranici mezi dobře diferencovaným a anaplastickým karcinomem štítné žlázy. Vznik může být způsoben dediferenciací z folikulárního či papilárního karcinomu. Imunohistochemická, elektronmikroskopická a morfometrická data nás upozorňují, že ve většině případů má tento tumor blíže k folikulárnímu karcinomu než k papilárnímu. Jeho prognóza je horší než u nádorů diferencovaných. Pět let přežije zhruba 50% pacientů. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 10. Málo diferencovaný karcinom [4] Uniformní buňky rozptýlené v malých skupinkách Buněčnost nátěru je střední až vysoká. Folikulární buňky se vyskytují jednotlivě nebo uspořádané solidně či trabekulárně ve skupinách. Nádorové buňky jsou poměrně uniformní s pravidelnými jádry, nenápadnými jadérky a chudou cytoplazmou. (ČÁP, a další, 2003)

27 Anaplastický karcinom (ATC) Velmi agresivní, a tak i nejzhoubnější nádor štítné žlázy. V celkovém měřítku patří ATC mezi nejhorší typ lidských nádorů. Vyskytuje se především u pacientů s dlouhodobou anamnézou strumy, která se začala náhle zvětšovat. Často metastazuje do vzdálených orgánů, jako jsou kosti, plíce, játra či mozek. (VLČEK, a další, 2002) Klinicky se projevuje jako rychle narůstající masa v okolí štítné žlázy, která způsobuje stlačování orgánů v okolí s následnou dysfagií, dušností či chrapotem. Stejně jako u málo diferencovaného karcinomu předpokládáme, že ATC vzniká dediferenciací dobře diferencovaných tumorů. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 11. Anaplastický karcinom [4] Záchyt mitotického dělení Nátěry jsou převážně hypercelulární s nálezem nekrotické drti a neutrofilních granulocytů na pozadí. Folikulární buňky jsou jednotlivě rozptýlené nebo v drobných skupinkách a koloid zcela chybí. Typická je polymorfie buněk s více jádry, často jsou zastižené mitózy. Jádra jsou převážně excentricky uložena s prominujícími, často vícečetnými jadérky. Cytoplazma buněk může být bohatá, ale častěji je redukovaná. (ČÁP, a další, 2003) Neepitelové nádory Mezi neepitelové maligní nádory patří sarkomy a lymfomy. Jejich výskyt je vcelku vzácný. Řadí se mezi rychle rostoucí tumory. (VLČEK, a další, 2002)

28 Lymfomy štítné žlázy jsou obvykle úzce spjaty s chronickou Hashimotovou tyreoiditidou. (LÍMANOVÁ, a další, 1995) Obrázek 12. MALT lymfom [4] (mucossa asociated lymphotid tissue = slizniční lymfatická tkáň) Cytologický obraz je závislý na druhu lymfomu. U maligních lymfomů jsou typické extrémně hypercelulární nátěry s jednotlivě rozptýlenými buňkami. Také si u nich můžeme povšimnout vysokého stupně mitotické aktivity. Při zhotovování nátěrů často dochází k mechanickému zhmoždění jader, která jsou velmi křehká, na pozadí pak můžeme vidět vláknité chromatinové formace. Folikulární buňky jsou zde výjimečně, v případě jejich přítomnosti jde většinou o onkocyty. Koloid zcela chybí a zárodečná centra nebývají zastoupena. Charakteristickým znakem je přítomnost lymfoglandulárních tělísek. (ČÁP, a další, 2003)

29 3 Speciální část 3.1 Bethesda klasifikace Pro správné hodnocení cytologických nátěrů byla zavedena tzv. Bethesda klasifikace Jde o mezinárodní standardizovaný systém, který stanovuje nejen diagnostické kategorie a riziko jejich malignity, ale také doporučuje algoritmy dalšího postupu při péči o pacienta s diagnostikovanou nemocí štítné žlázy. Cílem klasifikace je snížit počet nejistých nálezů a počet operací štítné žlázy z důvodů benigních lézí. (LUDVÍKOVÁ, 2013) Diagnostický nález I. Nediagnostický nebo nedostatečný vzorek Riziko malignity (%) Klinické doporučení Reaspirace II. Benigní 0-3 Klinické sledování III. Atypie nejistého významu nebo folikulární léze nejistého významu 5-15 Reaspirace/klinické sledování IV. Folikulární neoplazie nebo podezření z folikulární neoplazie Lobektomie V. Podezření z malignity Lobektomie/tyreoidekto mie VI. Maligní Tyreoidektomie, radiace (ALI, a další, 2010) Tabulka 2. Bethesda klasifikace Bethesda klasifikace cytologických nálezů aspirační cytologie štítné žlázy

30 3.1.1 Bethesda I Do kategorie Bethesda I spadají cytologie, které jsou nedostatečné či nediagnostické. K tomu může dojít z několika důvodů: - Vzorek je pouze cystická tekutina - Bezbuněčný vzorek - Jiné (překryto krví, sraženinami, artefakty, atd.) (JISKRA, 2011) Obrázek 13. Nedaignostické nálezy [4] a. Rozsáhlý překryv krví brání v hodnocení folikulárních buněk. b. Nátěr je bohatý na červené krvinky, lymfocyty, monocyty a postrádá prvky štítné žlázy. Některé uzlíky štítné žlázy jsou velmi cévnaté. Odebraný materiál považujeme za nediagnostický nebo nedostatečný, pokud nesplňuje následující kritéria. Cytologický vzorek štítné žlázy musí obsahovat minimálně šest skupin dobře vizualizovaných folikulárních buněk. V každé skupině by jich mělo být alespoň deset. Výjimky z tohoto požadavku platí pro následující zvláštní okolnosti: - Solidní uzlíky s cytologickou atypií. Vzorek, který obsahuje významné cytologické atypie, se nikdy nezařazuje do kategorie Bethesda I. Je nutné oznámit jakoukoliv významnou atypii i v případě, když není přítomen minimální počet folikulárních buněk. - Solidní uzlíky se zánětem. Uzlíky u pacienta s Hashimotovou tyreoiditidou, abscesem nebo granulomatózní štítnou žlázou můžou obsahovat pouze četné zánětlivé buňky

31 Takové případy jsou interpretovány jako benigní. Není nutný minimální počet folikulárních buněk. - Koloidní uzlíky. Uzlíky, které se skládají z bohatého, hustého koloidu, jsou považovány za benigní a vyhovující pro hodnocení. Minimální počet buněk se nevyžaduje, pokud převažuje snadno rozeznatelný koloid. (ALI, a další, 2010) Bethesda II Bethesda II zahrnuje s vysokou pravděpodobností benigní vzorky, jako jsou například: - Benigní folikulární uzly (adenomatoidní uzel, koloidní uzel atd.) - Lymfocytární (Hashimotova) tyreoiditida v příslušném klinickém kontextu - Granulomatózní (subakutní) tyreoiditida - Jiné (JISKRA, 2011) Označení benigní folikulární uzlík (BFN) se vztahuje k cytologickému vzorku, který je vhodný pro hodnocení a skládá se převážně z koloidu a benigně vypadajících folikulárních buněk v různých poměrech. (ALI, a další, 2010) Obrázek 14. BFN: Graves-Basedowova choroba [4]

32 3.1.3 Bethesda III Obecná diagnostická kategorie Atypie nejistého významu (AUS) nebo Folikulární léze nejistého významu (FLUS) je vyhrazena pro vzorky, které obsahují buňky s architektonickou nebo jadernou atypií a nelze je zařadit do žádné jiné Bethesda třídy. V případě počáteční diagnózy AUS/FLUS je obecně uplatňován přístup opakovaného odběru po určité době. U některých případů mohou být vhodnější jiná řešení. (ALI, a další, 2010) příklady použití dg. AUS: - málo buněčný vzorek s převahou architektonických atypií (mikrofoliklů) - zcela ojedinělé cytologické atypie, které by mohly odpovídat PTC, ale jejich počet nestačí pro dg. Bethesda V - převaha onkocytů u pacienta s Hashimotovou tyreoiditidou - výrazné atypie u pacienta léčeného radiojodem - atypie v kvalitativně či kvantitativně limitovaném nátěru - monomorfní populace lymfoidních buněk (nelze vyloučit lymfoproliferaci) apod. Obrázek 15. Atypie nejasného významu [4] Řídce buněčný vzorek s převahou mikrofoliklů

33 3.1.4 Bethesda IV Diagnostická kategorie Folikulární neoplazie (FN) nebo Podezření z folikulární neoplazie (SFN) se týká buněčných aspirací složených z folikulárních buněk, z nichž většina je uspořádána do struktur, vyznačujících se buněčným shlukováním a tvorbou mikrofoliklů. Případy, které ukazují rysy papilárního karcinomu, jsou z této kategorie vyloučeny. Folikulární neoplázie, Hürtleho buněčný typ (FN HCT) nebo Podezření z folikulární neoplazie, Hürtleho buněčný typ (SFN HCT) se vztahuje na buněčné aspirace, které se skládají téměř výhradně z Hürtleho buněk. Onkotické buňky s jadernými rysy papilárního karcinomu jsou z této kategorie také vyloučeny. (ALI, a další, 2010) Bethesda V Podezření z malignity (SFM). Do této kategorie řadíme takové vzorky, jejichž rysy vyvolají podezření z malignity, ale výsledky nejsou dostatečné pro přesvědčivou diagnózu. Morfologické změny jsou takového stupně, že zhoubný nádor je považován za více než pravděpodobný. (ALI, a další, 2010) Můžeme mít podezření z: - Papilárního karcinomu - Medulárního karcinomu - Metastatického karcinomu - Lymfomu - Jiné (JISKRA, 2011)

34 3.1.6 Bethesda VI Do kategorie maligní řadíme tato onemocnění: - Papilární karcinom - Málo diferencovaný karcinom - Medulární karcinom - Nediferencovaný anaplastický karcinom - Spinocelulární karcinom - Smíšený karcinom - Metastatický karcinom - Non-Hodgkinův lymfom (JISKRA, 2011)

35 3.2 Cytologické vyšetření Klinická cytologie je diagnostická disciplína, která patří mezi morfologické mikroskopické vyšetřovací metody. Z praktického hlediska na buňce hodnotíme zejména jádro, cytoplazmu, buňku jako celek, vztahy mezi buňkami a pozadí. (KUBÁLEK, 2001) K získání materiálu pro vyšetření štítné žlázy využíváme především metodu aspirační biopsie tenkou jehlou (FNAC), která je vysoce senzitivní i specifická. (VLČEK, a další, 2002) Cytodiagnostiku můžeme rozdělit do tří po sobě jdoucích částí: vlastní metodika, skríning a formulace závěrečné diagnózy. Metodickou a skrínigovou část provádí kvalifikovaní histologičtí laboranti s cytodiagnostikou atestací. Tito laboranti prohlíží preparáty, ve kterých hledají diagnostická místa a provádí jejich popis. Předběžnou diagnózu následně předají kvalifikovanému patologovi, který formuluje diagnózu závěrečnou. (DVOŘÁK, a další, 2008) Indikace k odběru Vyšetření FNAC je indikováno U uzlové strumy U Hashimotovy tyreoiditidy U hyperfunkční strumy U opakované FNAC U zvětšených lymfatických uzlin Z jiných důvodů Tabulka 3. Indikace k vyšetření FNAC Uzlová struma Vyšetření FNAC se provádí především k rozpoznání velkého množství benigních uzlů od maligních lézí štítné žlázy. Hlavní indikací je uzel a to zejména hmatný solitární uzel štítnice. Klinicky významné jsou především uzly větší než 1cm. U takto velkých uzlů se vždy

36 využívá FNAC a následné cytologické vyšetření. V některých případech se vyšetřují i uzly menší než 1 cm, které se také mohou řadit mezi klinicky významné karcinomy. (ČÁP, a další, 2003) Hashimotova tyreoiditida Hashimotova tyreoiditida jde stanovit již na základě klinického, laboratorního a ultrazvukového vyšetření. Musí být však přítomny dvě z těchto známek: - primární hypotyreóza se zvýšenou hladinou TSH - přítomnost protilátek proti tyreoidální peroxidáze - hypoechogenní ultrazvukový obraz V takovém případě není třeba cytologického ověření. FNAC je využívána především u netypické poporodní, tiché či juvenilní tyreoiditidy. Aspirační cytologii Hashimotovy tyreoiditidy využíváme u pacientů, jejichž diagnózu nelze stanovit na základě laboratorního a UZ vyšetření. Dále při progresi přes supresi tyroxinem a u jasného uzlu při ultrazvukovém vyšetření. (ČÁP, a další, 2003) Hyperfunkční struma U hyperfunkční strumy je FNCA využívána především u pacientů, u kterých je plánovaná terapie radioaktivním jódem. V případě, že je cytologie znepokojivá, přichází na řadu operační zákrok. Graves Basedowova struma bývá indikací k FNCA jen v případě, že je při ultrazvukovém vyšetření nalezen uzel. (ČÁP, a další, 2003)

37 Opakování FNAC K zopakování odběru přistupujeme z různých důvodů. Jedním z nich je nediagnostický odběr, u kterého je indikace vcelku jasná. Komplikovanější postup je u benigních výsledků při první cytologii. Četnost falešně negativních výsledků u aspiračních cytologií kolísá mezi 1-11%. Jako možnost se nabízí opakování odběru za 6-12 měsíců, ale i tento postup má své příznivce i odpůrce. (ČÁP, a další, 2003) Opakování FNAC se kromě nediagnostických aspirací doporučuje u jiných výsledků, než je koloidní uzel, při pochybnostech ohledně správnosti odběru z uzlu, při klinické změně uzlu a u dalších klinických symptomů. (ČÁP, a další, 2003) Zvětšené lymfatické uzliny Jako ideální metoda pro vyšetření zvětšených krčních lymfatických uzlin se zavedla tenkojehlová aspirační cytologie. Výsledky tohoto vyšetření nám mimo jiné mohou pomoci potvrdit diagnózu karcinomu nebo lymfomu štítné žlázy. (ČÁP, a další, 2003)

38 4 Experimentální část 4.1 Odběr materiálu Zařízení Pro odebrání vzorku používáme injekční stříkačku a sterilní jehlu, jejíž velikost může být různá. Všeobecně se však pohybuje do 1.5 palce. Velikost použité jehly je také závislá na velikosti či hloubce léze. Aby došlo k odběru vzorku, je třeba vyvolat podtlak v injekční stříkačce. K usnadnění tohoto kroku můžeme využít tzv. aspirační pistole. Technika odběru by měla být přizpůsobena velikosti ruky a úrovni manuální zručnosti lékaře, který odběr provádí. (CLARK, a další, 2005) Příprava pacienta V úvodu si musíme s pacientem promluvit a vysvětlit mu, o jaké vyšetření se jedná. Především ho uklidnit a ujistit, že jde o rychlý a málo bolestivý zákrok. Samozřejmě ho seznámíme i s riziky a možnými komplikacemi, které mohou nastat. Dobré je sepsat informovaný souhlas pacienta. (ČÁP, a další, 2003) Odběr se provádí vleže na zádech bez podložky hlavy. Polštář může být umístěn pod lopatkami pacienta pro umožnění mírné hyperextenze krku. Tento manévr je vcelku nepohodlný a pro pacienty s problémy krční páteře někdy i nemožný. Pacient by v této poloze neměl setrvávat dlouhou dobu. (CLARK, a další, 2005) Odběr vzorků Je třeba zdůraznit, že aspirace je vlastně nesprávné pojmenování. V případě, že se jedná o cystický uzel, získáváme materiál opakovaným pohybem jehlou v solidní části uzlu, čímž se

39 buňky a koloid dostanou do jehly. Malé množství podtlaku v injekční stříkačce zajišťuje udržení materiálu ve středu jehly. (CLARK, a další, 2005) Lékař fixuje uzel mezi druhým a třetím prstem levé ruky. Přitom pacienta připraví na odběr tím, že mu řekne, aby polknul a dále už nepolykal. V průběhu odběru na něj mluví. Zatímco drží uzel na svém místě mezi dvěma prsty levé ruky, pravou rukou vpichuje jehlu (obr. 12). Vpich by měl být stabilní a plynulý. Jakmile je špička jehly v uzlu, lékař by měl vyvinout slabý podtlak na stříkačku, aby došlo k nasátí vzorku. Následně zopakovat krát pohyb jehlou dopředu a dozadu v rámci uzlu a to po dobu 5-10 sekund, aniž by podstatně změnil směr jehly. Objem materiálu získaného z uzlu by měl zcela zůstat v jehle. U větších objemů je pravděpodobné, že došlo ke zředění vzorku krví, což může způsobit diagnostické problémy. Před vyjmutím jehly by měl být uvolněn podtlak. Na místo vpichu je nutno s mírným tlakem přiložit gázový polštářek, aby se zabránilo vytvoření hematomu. (CLARK, a další, 2005) Při punkci štítné žlázy se často využívá ultrazvuková kontrola, díky které se zvýšila přesnost tohoto vyšetření. Z jasně hmatného uzlu lze bezpečně odebrat vzorek pouze na základě palpace. Zavedení ultrazvukové kontroly má své výhody: - Upřesnění indikace - Navedení jehly do solidní porce v případě cystických uzlů - Zisk materiálu z malých či komplikovaně uložených ložisek (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 16. Aspirace tenkou jehlou (FNAC) [5]

40 4.2 Zpracování vzorku Máme k dispozici několik technik, které můžeme využít pro zpracování aspirátu štítné žlázy. Volba konkrétní metody je závislá především na možnostech přípravné laboratoře a diagnostických zkušenostech cytologa. Mezi nejoblíbenější dostupné metody patří: přímé nátěry, cytospiny, cytobloky a tenkovrstvé preparáty. (CLARK, a další, 2005) Přímý nátěr Nátěr je nutno zhotovit ihned po odebrání vzorku. Využíváme běžná podložní sklíčka, která musí být důkladně zbavena veškerých nečistot, především mastnoty. Počet nátěrů je závislý na množství odebraného aspirátu. (ČÁP, a další, 2003) Na sklíčko naneseme takové množství vzorku, aby bylo možné provést tenký nátěr, který se na něj vejde. Nesmí končit až při samém okraji skla a je třeba ho provést tzv. do ztracena. Někdy pro jasné určení diagnózy stačí pouze jeden nátěr, ale běžně se zhotovuje 8-10 preparátů. Více jich není potřeba. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 17. Zhotovení přímého nátěru [5]

41 4.2.2 Další techniky V případě cystických lézí, které přináší větší objemy, aplikujeme malé množství vzorku na sklíčka pro přímé nátěry, jak bylo popsáno výše. Zbytek obsahu je vyhrazen pro cytospin, cytoblok či filtrace přes membránu (ThinPrep). (CLARK, a další, 2005) (ČÁP, a další, 2003) Mezi metody, při kterých dochází ke koncentrování buněk, patří cytospin, tj. speciální cytologická centrifuga, a filtrace přes membránu, která je součástí komerčního systému ThinPrep. V rámci druhé uvedené metody je vzorek po odběru vypláchnut do fixační tekutiny, ve které je také omyta použitá jehla a stříkačka. Základem tohoto roztoku je alkohol. Vzorek je poté automatizovaně promyt, filtrován přes membránu a následně přemístěn na sklíčko k barvení. Tento způsob zpracování cytologických odběrů u štítné žlázy je užíván zejména v USA. Tato technika má však své nevýhody. Dochází u ní k odplavení řídkého koloidu, ztrátě architektoniky buněčných shluků a také ke svráštění buněk, což má za následek menší záchyt jaderných zářezů a pseudoinkluzí, typických pro papilární karcinom. Jestliže získaná tekutina není čirá, je potřeba přidat protisrážlivé činidlo citrát. (ČÁP, a další, 2003) Další možnou cytologickou metodou jsou cytobloky. Jejich příprava nepatří mezi rutinně zavedené metody. (CLARK, a další, 2005) Principem takového zpracování je tvorba parafínem zalitých bloků z jemných jehlových aspirací. Postup zhotovení cytoblokového preparátu: - Buňky v suspenzi se odstředí za vzniku buněčného koncentrátu - Fixace buněk pro následující kroky - Buňky jsou hromadně přemístěny z centrifugační zkumavky - Dále je postup stejný jako při histologickém zpracování tkáně (GILL, 2013) Následující histologický postup: - Odvodnění a zalití do parafínu - Krájení parafínových bločků na tenké řezy - Napínání řezů na podložní sklíčko - Odparafínování a barvení řezů - Montování řezů

42 - Pozorování preparátu ve světelném mikroskopu (JIRKOVSKÁ, 2006) V současné době jsou na trhu systémy, které usnadňují zpracování cytologických vzorků pro zhotovení cytobloku Barvení preparátu Pro barvení cytologií štítné žlázy neexistuje jednoznačný doporučovaný způsob. Je několik možností, jak cytologické nátěry barvit. Můžeme využít barvení dle Papanicolaoua (PAP). Zde se krásně zvýrazní jádra, struktury chromatinu, jadérka apod. Nevýhodou je špatné ozřejmení charakteru a změn cytoplazmy folikulárních buněk a horší vizualizace koloidu. Další možností je barvení dle Maye-Grünwalda-Giemsy (MGG). U MGG je sice horší znázornění textury jader, ale oproti polychromu je ideální pro barvení cytoplazmy, koloidu a dalších struktur. Někteří patologové upřednostňují barvení hematoxylinem-eosinem, na které jsou zvyklí z klasických histologických preparátů. (ČÁP, a další, 2003) Barvení dle Papanicolaoua Nátěry určené pro tento způsob barvení je nutno po jejich zhotovení fixovat v alkohol-éteru a v průběhu zpracování nesmí dojít k jejich vyschnutí. (ČÁP, a další, 2003) Obrázek 18. Barvící analyzátor [6] Varistain

43 Postup cytologického barvení dle Papanicolaoua pomocí barvícího analyzátoru Varistein 24-4 (obr. 18.): Použitý roztok Čas Použitý roztok Čas 1. 96% alkohol 10 min 10. Oplach v 96% alkoholu 30 s 2. Oplach destilovanou vodou 1 min 11. Polychrom EA50 5 min 3. Harrisův hematoxylin 5 min 12. Oplach v 96% alkoholu 40 s 4. Praní ve vodě 1 min 13. Oplach v 96% alkoholu 40 s 5. Praní ve vodě 1 min 14. Oplach v 96% alkoholu 40 s 6. Modrání ve vodě z vodovodu 10 min 15. Absolutní alkohol 1 min 7. 96% alkohol 40 s 16. Xylen 5 min 8. Oranž G6 5 min 17. Xylen 5 min 9. Oplach v 96% alkoholu 1 min Tabulka 4. Barvení dle Papanicolaouva Po ukončení barvení preparáty zamontujeme. Poté jsou připraveny k hodnocení zkušeným cytologem. Výsledek barvení: jádra buněk tmavě modrá až fialová, cytoplasma eozinofilních buněk růžová až fialová, cytoplasma cyanofilních buněk zelená, erytrocyty oranžovočervená, hlen zelená až světle fialová, bakterie tmavě fialová, spory a mycelia růžová, kreatinizující buňky - oranžová Barvení dle Giemsy Před obarvením necháme cytologické nátěry zaschnout minimálně 30 minut. Následně si připravíme kyvety s barvicí řadou a preparáty postupně posouváme skrze jednotlivé roztoky po určitých intervalech dle tabulky

44 Použitý roztok Ředění Čas 1. May-Grünwald Neředěný 5 minut 2. May-Grünwald Ředěný 1:1 destilovanou vodou 5 minut 3. Giemsa-Romanowski Ředěný 1:10 destilovanou vodou 20 minut 4. Voda z vodovodu Oplach Tabulka 5. Barvení dle Giemsy Výsledek barvení: jádra modrá až fialová, jadérka tmavě modrá, cytoplazma šedivě-modrá, erytrocyty světle červená, hlen modrý až fialový Hodnocení preparátu U cytologické diagnostiky je třeba prohlédnout všechny nátěry daného pacienta v celé ploše a nesmí dojít k přehlédnutí některých partií. Hodnotitelné buňky se zpravidla nacházejí na okrajích nátěrů. Posuzují se jednotlivé morfologické znaky, jako je velikost jader a jejich variabilita, struktura chromatinu, množství a charakter cytoplazmy, přítomnost koloidu a dalších buněčných elementů. Je třeba eliminovat riziko přecenění či podcenění jednotlivých morfologických znaků a tím i zamezit stanovení nesprávné diagnózy. (ČÁP, a další, 2003) 4.3 Imuocytochemie Pro zpřesnění cytologické diagnózy můžeme využít metody imunocytochemie. K imunocytochemické detekci se využívá vazba antigenu a specifické protilátky. (DVOŘÁK, a další, 2008) Volba použité protilátky je závislá na předchozím mikroskopickém vyšetření. Tuto metodu limituje potřeba dostatečného počtu nátěrů s diagnostickým množstvím materiálu. Lze však využít zbytkový materiál, který je zpracován do cytobloku (viz kapitola 4.2.2) anebo je nutné aspiraci opakovat

45 Indikace k imunocytochemickému vyšetření: - Diferenciální diagnóza medulárního karcinomu - Diferenciální diagnóza nízce diferencovaných nádorů - Odlišení primárních lézí od metastáz - Odlišení uzlu štítné žlázy od léze příštítného tělíska - Odlišení floridní fáze Hashimotovy tyreoiditidy od nízce maligního MALT lymfomu I přes přínos této metody by konečná cytologická diagnóza neměla být založena jen na výsledku imunocytochemie, který je v rozporu s morfologickým a klinickým nálezem. Je zde riziko falešné pozitivity či falešné negativity. (ČÁP, a další, 2003) 4.4 Interpretace výsledků Pro stanovení validní diagnózy je nezbytná úzká klinicko-patologická spolupráce. Čím více informací poskytne endokrinolog, tím přesnější může být závěr od cytologa. Hlavní úlohou FNAC je výpomoc s rozhodnutím o následném postupu v léčbě pacienta. Zda v daném případě bude nejlepším řešením operativní zákrok anebo konzervativní léčba. U diagnostických pochybností se nátěr poskytuje k tzv. druhému čtení, kdy případ zhodnotí i jiný erudovaný cytolog. Výsledky jsou důležité především z hlediska potvrzení či vyvrácení malignity. Prioritou je zajištění včasné diagnózy u maligních nálezů. (ČÁP, a další, 2003) V říjnu roku 2007 byla v Bethesdě (Maryland, USA) uspořádána konference, zaměřená na tenkojehlovou aspirační cytologii štítné žlázy. Náplní této konference byla rozprava o problémech tyreoidální cytodiagnostiky, především zavedení shodných terminologických a cytologických kritérií FNAC a usnadnění interpretace diagnostických závěrů. Cílem klasifikace těchto nálezů bylo také snížit množství operací u pacientů s benigní lézí. (LUDVÍKOVÁ, 2013) Všechny uvedené aktivity byly završeny v roce 2010 publikací Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology (BSRTC), která detailně představila unifikovaný mezinárodní standardizovaný systém pro hodnocení a popisování tyreoidální cytopatologie, který je mezi cytology známý jako Bethesda (LUDVÍKOVÁ, 2013) Přesné rozdělení do jednotlivých kategorií a jejich charakterizace je uvedena v tabulce 2. a kapitole 2.1. Až praxe postupně ukáže, jaký má nová mezinárodní klasifikace vliv na zlepšení cytologické diagnostiky chorob štítné žlázy. (LUDVÍKOVÁ, 2013)

46 4.5 Zpracování získaných dat Predikce ( ) Správná cytologická diagnóza Nesprávná cytologická diagnóza Celkem vzorků Bethesda I 93 Bethesda II Bethesda III Bethesda IV Bethesda V Bethesda VI 5 Tabulka 6. Celkový přehled a srovnání vzorků Srovnání cytologických diagnóz (Bethesda klasifikace) Do statistického zpracování byly použity výsledky cytologických vyšetření 453 pacientů, které byly hodnoceny na Ústavu patologie (ÚPA) FN Brno v období od do U 51 případů byla dohledána i histologická diagnóza a následně zpracována korelace mezi cytologickým a histologickým nálezem. Tabulka 6. znázorňuje celkové rozdělení pacientů do Bethesda kategorií a jejich následující srovnání s ohledem na správnost diagnózy u zmíněných 51 vzorků. Zařazení výsledků do jednotlivých Bethesda kategorií usnadnilo vyhodnocení statistických dat. V grafu 1. je vypracován histogram absolutních četností vyšetřených pacientů. Můžeme si zde povšimnout, že výrazně nejobsáhlejší skupinou je kategorie Bethesda II. Ta je považována za benigní a riziko malignity je zde 0-3%. Výsledky spadající do kategorie Bethesda V a VI jsou zahrnuty do jedné skupiny, jelikož riziko malignity je v obou případech vysoké a rozlišit tyto kategorie v počítačové databázi není možné. I z tohoto důvodu je snaha takovéto případy včas podchytit a především správně diagnostikovat, aby mohla být poskytnuta adekvátní léčba, která v co největší míře napomůže k úplnému uzdravení nemocného

47 Počet pacientů Bethesda I Bethesda II Bethesda III Bethesda IV Bethesda V+VI Klasifikace Graf 1. Histogram absolutních četností vyšetřených pacientů Zařazení jednotlivých vzorků do Bethesda klasifikací. 5,08% 6,40% 20,53% 14,79% Bethesda I Bethesda II Bethesda III Bethesda IV Bethesda V + VI 53,20% Graf 2. Procentuální zastoupení jednotlivých Bethesda kategorií