PROTEINY ( = BÍLKOVINY) DNA RNA protein modifikovaný protein

Transkript

1 PROTEINY ( = BÍLKOVINY) DNA RNA protein modifikovaný protein

2 - více než 50 % buněčné sušiny organismů -chemicky se jedná o biopolymery složené z jednoho nebo více lineárních polypeptidových řetězců, obsahujících obvykle 100 až aminokyselinových zbytků (kódovaných AK) - není obecná klasifikace; lze je rozdělovat např. podle: -specifické funkce -chemického složení -tvaru a rozpustnosti molekul -lokalizace v organismu

3 Funkce (rozmanité) -strukturní -obranná (protilátky) -transportní -zásobní -katalytickou -regulační -pohybová (myosin a aktin ve svalových vláknech)

4 Chemické složení Jednoduché Složené - polypeptidová + neproteinová část Složené: metaloproteiny fosfoproteiny glykoproteiny lipoproteiny nukleoproteiny

5 DĚLENÍ PODLE TVARU MOLEKULY -globulární - albuminy (rozp. ve vodě) -fibrilární - globuliny (rozp. v roztocích solí) -membránové DĚLENÍ PODLE LOKLAIZACE V ORGANISMU -intracelulární (vnitrobuněčné) a extracelulární (mimobuněčné) -bílkoviny krevní plasmy (též plasmové, plasmatické nebo sérové proteiny)

6 Vznik peptidové vazby Zjednodušené schema níže uvedená reakce takto neprobíhá Proč? + H 3 N CH R1 COO + + H 3 N CH COO + H 3 N CH C NH CH COO - R2 R1 O R2 Polypeptidový řetězec (peptidy, proteiny) DNA RNA protein modifikovaný protein Syntéza proteinů animace:

7 Úrovně struktur -primární struktura - pořadí zbytků aminokyselinových zbytků v lineárním polypeptidovém řetězci -sekundární struktura popisuje prostorové vztahy sousedních nebo blízkých aminokyselinových zbytků -terciární struktura - prostorové vztahy vzdálených částí řetězce a tím i celkový tvar molekuly -kvarterní struktura popisuje vzájemné uspořádání více polypeptidových řetězců; řada bílkovin není tvořena jediným řetězcem, složeným do definované terciární struktury; často jde o oligomery tvořené jedním nebo několika typy tzv. podjednotek

8 Struktury bílkovin

9

10 Primární struktura bílkovin ( + kovalentní) pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci (kódováno v DNA)

11 Kovalentní struktura bílkovin (primární struktura + posttranslační modifikace) 1. Propojení řetězců kovalentními vazbami 2. Odštěpení částí řetězců 3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin 4. Připojení mastných kyselin 5. Glykosylace 6. Fosforylace (dočasné či trvalé) 7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) 8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly) 1-3: jednoduché bílkoviny 4-8: složené bílkoviny

12

13 Lze pohlížet jako na text >gi ref ZP_ putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQIVKTP NIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPFRTGIRSWIPTGKDVALGRNELT IANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLVNTAGFVTDATLDN AKERPRFGMVYPTGWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVVNWLDNKKDSKPFFLYVA FTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYGDWADKPWRGTGEYYANISYL DAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVTREARKVYELNLAGETDGLRGRKDN LWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTPVYGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESL VPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQDDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKT DRFETINQIGKNPDIEKQMYGKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG

14 URČOVÁNÍ CELKOVÉHO AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ AK 1 -AK 2 -AK 3...AK n kyselá nebo bazická hydrolysa AK 1 + AK 2 + AK AK n (určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny - chromatografické dělení)

15 Určení N-koncové a C-koncové aminokyseliny N-koncové: Sangerova metoda; reakce s DNF (viz reakce AK) C-koncové: -specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy) -redukce -COOH LiBH 4 na -OH, identifikace aminoalkoholu

16 Určování sekvence Edmanovo odbourávání - zbylý polypeptidový řetězec zůstane neporušen (rozdíl proti využití totální hydrolýzy při Sangerově metodě jen N-koncová AK); lze tedy opakovat a přímo číst pořadí AK; princip automatických sekvenátorů až několik desítek AK

17 Určování primární struktury Určení počtu polypeptidových řetězců v proteinu; Rozštěpení disulfidových vazeb mezi řetězci a uvnitř polypeptidových řetězců; Izolace jednotlivých řetězců; Vícenásobné specifické štěpení polypeptidových řetězců na kratší fragmenty; Určení pořadí aminokyselin v těchto fragmentech; Sestavení primární struktury polypeptidů; Určení původního propojení polypeptidových řetězců. Pozn. Možnost sekvenování peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie

18 Určování primární stuktury

19 Prostorové uspořádání biopolymerů (obecné znaky) 1. Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí. 2. Nativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře. 3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. 4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické. 5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační dynamické systémy). 6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

20 Stabilizace struktury bílkovin nekovalentní interakce * Vazebná energie Typ interakce Příklad (kj/mol) vodíkové vazby: voda (led) -O-H...O= 17 peptidové vazby (můstky H O) =N-H...O=C 15 neutrální a nabitá skupina -COO -...HO-CH 2-15 elektrostatické interakce ion-ion -COO H 3 N permanentní dipól - permanentní dipól C d+ =O d-...c d+ =O d- Londonovy dispersní interakce patrové interakce mezi dvěma alifatickými atomy C mezi dvěma aromatickými kruhy Phe 2 0,11 6 hydrofobní interakce mezi dvěma methylovými skupinami 1,2 mezi dvěma postranními 6

21 Hydrofobní interakce

22 Sekundární struktura - popisuje prostorové uspořádání sousedních nebo blízkých částí polypeptidového řetězce

23 konformace polypeptidového řetězce je definována torzními úhly vazby Cα-N (φ) a vazby Cα- C (ψ) - hodnota těchto úhlů je definována jako 180 v případě, že je řetězec v rovinné, plně rozvinuté konformaci a klesá až k hodnotě 180 (přetočení na druhou stranu ). Volná rotace je omezena sterickými zábranami mezi atomy vlastní kostry polypeptidového řetězce a sterickou náročností postranních řetězců aminokyselin; rotační úhly mohou tedy nabývat jen určitých hodnot

24

25 stereotypní opakování struktury NH-CHR-CO- => tendence k tvorbě periodických prostorových struktur Základní typy: α-šroubovice β-struktury α-šroubovice charakterizovány parametry: výškou závitu, směrem otáčení (levotočivé a pravotočivé) a počtem aminokyselinových zbytků nebo počtem atomů na jednu otáčku šroubovice.

26 Sekundární struktury bílkovin V proteinech časo - pravotočivá šroubovice označovaná jako α- helix, která je charakterizována výškou závitu 0,54 nm a 3,6 aminokyselinového zbytku (resp. 11 atomy) na jeden závit - stabilizován vnitrořetězcovými vodíkovými můstky, které se vytvářejí podél osy šroubovice mezi nad sebou ležícími CO a NH skupinami.

27 β-struktura - další časté periodické uspořádání polypeptidového řetězce -bývá stabilizována propojením s antiparalelně (častěji) či paralelně probíhajícím polypeptidovým řetězcem stejné konformace, s nímž je spojen maximálním možným počtem meziřetězcových vodíkových můstků. Tak vznikají struktury zvané β-skládaný list (angl. β-pleated sheet). Jejich plocha bývá různým způsobem zakřivena (tzv. twisted sheet) nebo může tvořit válec (tzv. β-barrel) Antiparalelní β-struktura polypeptidového řetězce

28 Periodické sekundární struktury zastoupeny v proteinech různou měrou, od několika procent až po desítky procent z celkové struktury. Mezi těmito útvary se řetězec otáčí zpět, někdy až o 180º. Tyto ostré změny směru, umožněné určitými sekvencemi aminokyselin, bývají označovány jako β-ohyby, (angl. β-bend nebo β-turn), protože často propojují β-struktury. Jsou tvořeny čtyřmi aminokyselinovými zbytky, často se v nich vyskytuje prolin a glycin. Jsou charakteristické pro globulární bílkoviny, zajišťují jejich sférický tvar. Supersekundární struktury např.: Zn-prst, Leu Zip

29 Alfa helixy v hemoglobinu

30 Terciární struktura proteinů -popisuje uspořádání celého polypeptidového řetězce a tedy i celkový tvar molekuly. Terciární struktura myoglobinu

31 Kvarterní struktura

32 Příklady bílkovin s kvarterní strukturou Bílkovina Rel.mol.hm. oligomeru Počet podjednotek Charakter, funkce hemoglobin (lidský) podjednotky dvou typů (a 2 b 2 tetramer), přenos kyslíku α-amylasa (lidská) identické podjednotky, enzym (hydrolytické štěpení škrobu) alkoholdehydrogenasa (kvasinky) identické podj., enzym (katalysuje redukci acetaldehydu na ethanol) ferritin (lidský) skladování železitých iontů (až 4300 Fe 3+ ) glutaminsynthetasa (E.coli) pyruvátdekarboxylasa (E.coli) enzym (synthesa Gln z Glu), kulovité identické podj. tvoří 2 šestiúhelníky umístěné nad sebou enzymový komplex, podjednotky 3 typů, každá katalysuje jednu dílčí reakci (odd. 9.2) hemocyanin (plži) metalloprotein obsahující Cu 2+ ; přenos O 2 ; dutý válec 40x40 nm virus tabákové mozaiky helikálně uspořádané identické podj. (M r ) tvořící komplex s RNA

33 Svinování proteinů (folding) - neprobíhá náhodným způsobem - probíhá postupně - při skládání některých proteinů, zejména bílkovin s kvarterní strukturou, asistují v buňkách bílkoviny označované jako chaperony a) malé dočasné periodické struktury b) supersekundární struktury c) strukturní domény a "roztavená" glubule d) závěrečné úpravy za účasti enzymů

34 Vlastnosti proteinů Nábojové vlastnosti Rozpustnost - v závislosti na ph, iontové síle Denaturace - ztráta nativní konformace Kooperativita (denaturační přechod) Optické

35 Rozpustnost proteinů - v závislosti iontové síle

36 Kooperativita -důsledky pro vlastnosti biopolymerů Molekula reaguje na podněty z vnějšího prostředí jako celek; to znamená, že konformační impuls, vyvolaný v jedné části molekuly, může vyvolat celý řetězec následků, jež končí konformační změnou v jiné, prostorově vzdálené části molekuly Sigmoidní charakter - náhlý přechod mezi nativním a denaturovaným stavem je důsledkem kooperativity nativní struktury -př. fosforylace enzymů

37 OPTICKÉ VLASTNOSTI Absorpce UV záření: -peptidová vazba ( nm) -aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm ( pro srov. DNA cca 260 nm) Abs. spektra lidského sérového albuminu (1), lidského imunoglobulinu G (2) a DNA (3) v ultrafialové oblasti. Koncentrace obou bílkovin je 1 mg/ml, koncentrace DNA 0,1 mg/ml

38 Vztah struktury a funkce vybraných proteinů Keratiny (ř. keras roh) - významná skupina fibrilárních bílkovin; podílejí se na výstavbě intermediárních filament cytoskeletu vlasů, chlupů, nehtů, rohů a peří; nerozpustné ve vodě a odolné vůči fyzikálním i chemickým vlivům. Hlavní skupina - α-keratiny - struktura je tvořena α -helixem; dvě tyto šroubovice se pak stáčejí do levotočivého kabelu (tzv. coiled-coil), jejichž dvojice vytváří protofilamentum a osmice intermediární filamentum cytoskeletu

39 Imunoglobuliny (Ig) - globulární glykoproteiny krevního séra. Molekula připomíná tvarem písmeno Y; na jeho horních ramenech jsou lokalizovány oblasti, které nekovalentně váží antigeny; pro svojí velkou strukturní různorodost se označují jako variabilní.

40 Svalové kontrakce - aktin, myosin a tropomyosin

41 Membránové proteiny

42 Hemoglobin

43

44 Kovalentní modifikace proteinů aneb translací to nekončí

45 translací to nekončí DNA RNA protein modifikovaný protein Mají modifikace podstatný význam pro funkci proteinů? Ano. Nejedná se jen o kosmetické změny Známo více než 200 typů kovalentních modifikací (in vivo)

46 Čím jsou determinovány možné kovalentní modifikace? typem, pořadím a prostorovou lokalizací aminokyselinových zbytků aparátem enzymů realizujících modifikace

47 KOVALENTNÍ MODIFIKACE (enzymové i neenzymové) IN VIVO IN VITRO VRATNÉ NEVRATNÉ PŘIROZENÉ UMĚLÉ

48 1. Posttranslační modifikace role v řadě různých buněčných procesů svinování proteinů stabilizace prostorové struktury proteinů lokalizace proteinů v buňce přenos signálu exprese genů regulace aktivity enzymů mezibuněčné interakce

49 Příklady posttranslačních modifikací Fosforylace vratná modifikace (kinasy / fosfatasy) obvykle na OH skupinách zbytků serinu, threoninu, tyrosinu významný regulační prvek: aktivita řady enzymů aktivita glykogen fosforylasy je regulována fosforylací na zbytku serinu v pozici 14 regulace transkripce role při přenosu signálu

50

51 Regulace transkripce fosforylací CREB (camp - responsive element binding protein) transkripční faktor fosforylace na serin 133 asociace s CBP; (CREB binding protein) CREB CBP komplex aktivuje CREB dependentní transkripci mj. i remodelací chromatinu acetylací histonů

52 Glykosylace připojení sacharidů na proteiny - typické pro extracelulární a membránové proteiny role glykosylace: často nutná pro správné svinutí proteinu stabilizace proteinu regulace rozpoznávání molekulové mezibuněčné obrovská variabilita řada míst glykosylace a každé z nich může být glykosylováno mnoha způsoby

53 Místa připojení sacharidů na protein (N) přes asparagin; endoplasmatické retikulum (kotranslační); proteiny krevní plasmy, imunoglobuliny, řada enzymů (O) přes serin /threonin; Golgi aparát; muciny, kolageny (C) (přes tryptofan) (P) (fosfothreonin, fosfoserin)

54 Mechanismus glykosylace na asparagin dolichol

55 Regulace transkripce glykosylací glykosylace CREBu brzda transkripce - působí opačně než fosforylace modifikován serin a threonin N- acetylglukosaminem

56 Lipidace - usnadňuje připojení proteinů na membrány, vzájemné interakce proteinů Prenylace - připojení farnesyl, dolichol nebo geranylgeranyl zbytků; farnesylace u některých G proteinů farnesylace Acylace připojení mastných kyselin (myristová, palmitová) přes ester, thioester nebo amid; rhodopsin palmitoylovaný na zbytku cysteinu

57 Modifikace proteinu jiným proteinem - proteiny mohou být navázány (např. přes svůj C-konec) ke zbytkům lysinu jiného proteinu Ubiquitinylace - nejznámější modifikací tohoto typu signál pro degradaci proteinu (např. chybně svinutý protein) SUMOylace (SUMO: Small Ubiquitin-like Modifier) - role v řadě buněčných procesů: transport mezi jádrem a cytosolem, regulace transkripce, apoptosa, stabilizace proteinu, odpověď na stres

58 Acetylace - obvyklá na N koncích některých proteinů nebo zbytcích lysinu; N-terminální serin histonu H4 acetylován Hydroxylace - konverze prolinu na hydroxyprolin v kolagenu katalyzovaná prolyl-4-hydroxylasou acetylace Jodace - thyroglobulin jodován (na Tyr) při syntéze thyroxinu Karboxylace - karboxylace prothrombinu (srážení krve) na zbytek Glu (účast vitaminu K) Methylace - methylací mohou být modifikovány například histony; lysine 20 histonu H4 může být mono- nebo dimethylován methylace

59 Nukleotidylace - připojení mononukleotidu reguluje aktivitu některých enzymů; utilizace dusíku v E. coli: glutamin synthetasa specificky adenylována (kovalentní připojení AMP) na zbytku tyrosinu; adenylovaná forma je inaktivní; stupeň adenylace je řízen regulačním proteinem PII schopnost proteinu PII regulovat adenylaci glutamin synthetasy je řízena jeho uridinylací (kovalentní připojení UMP) na zbytku Sulfatace různé typy (O-, S-, N-); na Tyr (protein protein interakce) Připojení prostetických skupin - hem (globin a cytochrom), FAD, biotin Vytvoření disulfidových vazeb - typické pro extracelulární proteiny; formace disulfidových můstků - po svinutí proteinu do (téměř) finální podoby Aktivace zymogenů - odštěpením sekvence, která kryje jejich aktivní centrum - proteasy (chymotrypsin, trypsin, trombin)

60 2. Enzymová modifikace (in vitro) Defosforylace kaseinů ve zrajících sýrech (fosfatasa) vliv na štěpení a následně chuťové vlastnosti sýrů; vstřebávání vápníku možnost ovlivnění procesu (přídavek fosfatasy)

61 3. Neenzymové modifikace (in vivo i in Oxidativní poškození vitro) působením volných radikálů ROS (reactive oxygen species) vodíku (H 2 O 2 ), peroxid vodíku, hydroxyl etc.; mohou vznikat produkty buněčného metabolismu např. superoxid z mitochondrie 2 O 2. oxid dusnatý (NO), peroxonitrát (NO 3 ; vznik: H 2 O 2 + NO 2 ONOO + H 2 O), oxidace methioninu (in vivo i in vitro) možnost enzymové opravy neenzymové modifikace enzymem methioninsulfoxidreductasou - konverze oxidovaných zbytků zpět na methionin chlorotyrosin, nitrotyrosin a bityrosin v lipoproteinech artherosklerotického plaku oxidace methioninu

62 Glykace navázání molekuly cukru (např. glukosy nebo fruktosy) na molekulu proteinu (in vitro i in vivo) na rozdíl od glykosylace není katalyzována enzymově Příklady: in vitro - při tepelné úpravě pokrmů (při vyšších teplotách) obsahujících jak proteiny, tak sacharidy in vivo - glykace hemoglobinu - valin na N-konci; diagnostická aplikace

63 4. Umělé modifikace proteinů Kvantifikace proteinů s využitím kovalentních značek ICAT (Isotope Coded Afinity Tags), kvantifikace/studium Cys itraq (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification) Kovalentní imobilizace enzymů možnost opakovaného použití stabilizace enzymu vyloučení kontaminace enzymem příp. jeho autokatalytickými produkty (proteasy)

64 Eupergit C kopolymer vážící proteiny přes oxiranové skupiny reakcí s -NH 2 s volnými skupinami zbytků lysinu více bodové kovalentní připojení stabilizace vysoká stabilita při ph 1 až 12 penicilin amidasa na Eupergitu C - 60% původní aktivity po 800 cyklech

65 Význam kovalentních modifikací proteinů pro funkci živých organismů (setkání s medvědem) v potravinářství (výroba sýrů) biotechnologie (kovalentní imobilizace enzymů) diagnostické metody v medicíně (glykace) proteomika (kvantifikace proteinů)