Bílkoviny (=proteiny) (vztah struktury a funkce) DNA RNA protein modifikovaný protein

Transkript

1 Bílkoviny (=proteiny) (vztah struktury a funkce) DNA RNA protein modifikovaný protein

2 Chemické složení Jednoduché Složené - polypeptidová + neproteinová část Složené: metaloproteiny fosfoproteiny glykoproteiny lipoproteiny nukleoproteiny

3 BÍLKOVINY = PROTEINY, Kde je hranice mezi bílkovinami a (poly)peptidy? DĚLENÍ PODLE TVARU MOLEKULY globulární - albuminy (rozp. ve vodě) - globuliny (rozp. v roztocích solí) fibrilární membránové

4 Vznik peptidové vazby Zjednodušené schema níže uvedená reakce takto neprobíhá Proč? + H 3 N CH R1 COO - N CH COO H N CH OO - 3 C NH CH C H 3 + R2 R1 O R2 Peptidy 2 několik desítek AK

5

6

7

8 Úrovně struktur

9 Struktury bílkovin

11 Primární struktura bílkovin ( + kovalentní) pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci (kódováno v DNA)

12 Lze pohlížet jako na text >gi ref ZP_ putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQI VKTPNIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPFRTGIRSWIPTGKD VALGRNELTIANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLV NTAGFVTDATLDNAKERPRFGMVYPTGWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVV NWLDNKKDSKPFFLYVAFTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYG DWADKPWRGTGEYYANISYLDAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVT REARKVYELNLAGETDGLRGRKDNLWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTPV YGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESLVPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQ DDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKTDRFETINQIGKNPDIEKQMY GKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG

13 Určování primární struktury (aminokyselinové složení) 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce 2. Určit N-konec a C-konec 3. Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním (kam až to jde) 4. Dvě nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy 5. Opakovat bod 3 6. Sestavit primární strukturu řetězce 7. Určit způsob propojení původních řetězců 8. Možnost sekvenování peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie

14 Určení N-koncové aminokyseliny

15 Určení C-koncové aminokyseliny Specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy) Redukce -COOH LiBH 4 na -OH, identifikace aminoalkoholu

16 Princip petidového mapování

17 Určování primární stuktury

18 I. Štěpení proteinu(ů) (malá variabilita; volba enzymu, reakčních podmínek) 1. Chromatografické a elektroforetické metody II. Analýza vzniklých peptidových fragmentů (značná variabilita) 2. Hmotnostní spektrometrie na principu MALDI-TOF 3. Hmotnostní spektrometrie na principu LC-MS/MS

19 Kovalentní struktura bílkovin (primární struktura + posttranslační modifikace) 1. Propojení řetězců kovalentními vazbami 2. Odštěpení částí řetězců 3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin 4. Připojení mastných kyselin 5. Glykosylace 6. Fosforylace (dočasné či trvalé) 7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) 8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly) 1-3: jednoduché bílkoviny 4-8: složené bílkoviny

20 Konformace peptidového řetězce

21 Typy nekovalentních interakcí uplatňujících se v živých systémech * Střední hodnota energie vazby C - H v molekule methanu je 416 kj.mol -1. ** Pro prostředí s hodnotou relativní permitivity 4, přibližně odpovídající nepolárnímu prostředí uvnitř bílkovinné globule.

22 Hydrofobní interakce

23

24

25 Sekundární struktury bílkovin

31 Sekundární struktury bílkovin Alfa helixy v hemoglobinu

32 Terciární struktura

33 Terciární struktura

34 Obecné znaky prostorového uspořádání organisovaných" biopolymerů 1. Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí. 2. Nativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře. 3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. 4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické. 5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační dynamické systémy). 6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

35 Vlastnosti proteinů Nábojové vlastnosti Rozpustnost - v závislosti na ph Denaturace - ztráta nativní konformace Kooperativita (denaturační přechod) Optické

36

37 Kvarterní struktura

38 Příklady bílkovin s kvarterní strukturou

40 Svinování (folding) - neprobíhá náhodným způsobem - probíhá postupně a) malé dočasné periodické struktury b) supersekundární struktury c) strukturní domény a "roztavená" glubule d) závěrečné úpravy za účasti enzymů (peptidylprolin-cis-trans-isomerasa, proteindisulfid-isomerasa) - Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky?

41 Svinování (folding)

42 Dělení bílkovin podle jejich funkce stavební a podpůrné kolageny, elastin, keratiny (fibrilární) bílkoviny cytoskeletu (tubulin, vimentin, též pohyb) nukleoproteiny (histony, ribosomální bílkoviny) transportní a skladovací hemoglobin a myoglobin (O 2 ) transferrin a ferritin (Fe) sérový albumin (mast. kyseliny, bilirubin, hem...) apolipoproteiny (lipidy, cholesterol) cytochrom c (elektrony) bílkoviny zajišťující membránový transport pohyb aktin a myosin (+další) ochranné a obranné imunoglobuliny fibrinogen regulační hormony receptory (membránové a intracelulární) regulační bílkoviny proteosynthesy katalytická enzymy

43

44 Kovalentní modifikace proteinů aneb translací to nekončí

45 translací to nekončí DNA RNA protein modifikovaný protein Mají modifikace podstatný význam pro funkci proteinů? Ano. Nejedná se jen o kosmetické změny Známo více než 200 typů kovalentních modifikací (in vivo)

46 Čím jsou determinovány možné kovalentní modifikace? typem, pořadím a prostorovou lokalizací aminokyselinových zbytků aparátem enzymů realizujících modifikace

47 KOVALENTNÍ MODIFIKACE (enzymové i neenzymové) IN VIVO IN VITRO VRATNÉ NEVRATNÉ PŘIROZENÉ UMĚLÉ

48 1. Posttranslační modifikace role v řadě různých buněčných procesů svinování proteinů stabilizace prostorové struktury proteinů lokalizace proteinů v buňce přenos signálu exprese genů regulace aktivity enzymů mezibuněčné interakce

49 Příklady posttranslačních modifikací Fosforylace vratná modifikace (kinasy / fosfatasy) obvykle na OH skupinách zbytků serinu, threoninu, tyrosinu významný regulační prvek: aktivita řady enzymů aktivita glykogen fosforylasy je regulována fosforylací na zbytku serinu v pozici 14 regulace transkripce role při přenosu signálu

50

51 Regulace transkripce fosforylací CREB (camp - responsive element binding protein) transkripční faktor fosforylace na serin 133 asociace s CBP; (CREB binding protein) CREB CBP komplex aktivuje CREB dependentní transkripci mj. i remodelací chromatinu acetylací histonů

52 Glykosylace připojení sacharidů na proteiny - typické pro extracelulární a membránové proteiny role glykosylace: často nutná pro správné svinutí proteinu stabilizace proteinu regulace rozpoznávání molekulové mezibuněčné obrovská variabilita řada míst glykosylace a každé z nich může být glykosylováno mnoha způsoby

53 Místa připojení sacharidů na protein (N) přes asparagin; endoplasmatické retikulum (kotranslační); proteiny krevní plasmy, imunoglobuliny, řada enzymů (O) přes serin /threonin; Golgi aparát; muciny, kolageny (C) (přes tryptofan) (P) (fosfothreonin, fosfoserin)

54 Mechanismus glykosylace na asparagin dolichol

55 Regulace transkripce glykosylací glykosylace CREBu brzda transkripce - působí opačně než fosforylace modifikován serin a threonin N- acetylglukosaminem

56 Lipidace - usnadňuje připojení proteinů na membrány, vzájemné interakce proteinů Prenylace - připojení farnesyl, dolichol nebo geranylgeranyl zbytků; farnesylace u některých G proteinů farnesylace Acylace připojení mastných kyselin (myristová, palmitová) přes ester, thioester nebo amid; rhodopsin palmitoylovaný na zbytku cysteinu

57 Modifikace proteinu jiným proteinem - proteiny mohou být navázány (např. přes svůj C-konec) ke zbytkům lysinu jiného proteinu Ubiquitinylace - nejznámější modifikací tohoto typu signál pro degradaci proteinu (např. chybně svinutý protein) SUMOylace (SUMO: Small Ubiquitin-like Modifier) - role v řadě buněčných procesů: transport mezi jádrem a cytosolem, regulace transkripce, apoptosa, stabilizace proteinu, odpověď na stres

58 Acetylace - obvyklá na N koncích některých proteinů nebo zbytcích lysinu; N-terminální serin histonu H4 acetylován Hydroxylace - konverze prolinu na hydroxyprolin v kolagenu katalyzovaná prolyl-4-hydroxylasou acetylace Jodace - thyroglobulin jodován (na Tyr) při syntéze thyroxinu Karboxylace - karboxylace prothrombinu (srážení krve) na zbytek Glu (účast vitaminu K) Methylace - methylací mohou být modifikovány například histony; lysine 20 histonu H4 může být mononebo di- methylován methylace

59 Nukleotidylace - připojení mononukleotidu reguluje aktivitu některých enzymů; utilizace dusíku v E. coli: glutamin synthetasa specificky adenylována (kovalentní připojení AMP) na zbytku tyrosinu; adenylovaná forma je inaktivní; stupeň adenylace je řízen regulačním proteinem PII schopnost proteinu PII regulovat adenylaci glutamin synthetasy je řízena jeho uridinylací (kovalentní připojení UMP) na zbytku Sulfatace různé typy (O-, S-, N-); na Tyr (protein protein interakce) Připojení prostetických skupin - hem (globin a cytochrom), FAD, biotin Vytvoření disulfidových vazeb - typické pro extracelulární proteiny; formace disulfidových můstků - po svinutí proteinu do (téměř) finální podoby Aktivace zymogenů

60 2. Enzymová modifikace (in vitro) Defosforylace kaseinů ve zrajících sýrech (fosfatasa) vliv na štěpení a následně chuťové vlastnosti sýrů; vstřebávání vápníku možnost ovlivnění procesu (přídavek fosfatasy)

61 3. Neenzymové modifikace (in vivo i in Oxidativní poškození vitro) působením volných radikálů ROS (reactive oxygen species) vodíku (H 2 O 2 ), peroxid vodíku, hydroxyl etc.; mohou vznikat produkty buněčného metabolismu např. superoxid z mitochondrie 2 O 2. oxid dusnatý (NO), peroxonitrát (NO 3 ; vznik: H 2 O 2 + NO 2 ONOO + H 2 O), oxidace methioninu (in vivo i in vitro) možnost enzymové opravy neenzymové modifikace enzymem methioninsulfoxidreductasou - konverze oxidovaných zbytků zpět na methionin oxidace methioninu chlorotyrosin, nitrotyrosin a bityrosin v lipoproteinech artherosklerotického plaku

62 Glykace navázání molekuly cukru (např. glukosy nebo fruktosy) na molekulu proteinu (in vitro i in vivo) na rozdíl od glykosylace není katalyzována enzymově Příklady: in vitro - při tepelné úpravě pokrmů (při vyšších teplotách) obsahujících jak proteiny, tak sacharidy in vivo - glykace hemoglobinu - valin na N-konci; diagnostická aplikace

63 4. Umělé modifikace proteinů Kvantifikace proteinů s využitím kovalentních značek ICAT (Isotope Coded Afinity Tags), kvantifikace/studium Cys itraq (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification) Kovalentní imobilizace enzymů možnost opakovaného použití stabilizace enzymu vyloučení kontaminace enzymem příp. jeho autokatalytickými produkty (proteasy)

64 Eupergit C kopolymer vážící proteiny přes oxiranové skupiny reakcí s -NH 2 s volnými skupinami zbytků lysinu více bodové kovalentní připojení stabilizace vysoká stabilita při ph 1 až 12 penicilin amidasa na Eupergitu C - 60% původní aktivity po 800 cyklech

65 Význam kovalentních modifikací proteinů pro funkci živých organismů (setkání s medvědem) v potravinářství (výroba sýrů) biotechnologie (kovalentní imobilizace enzymů) diagnostické metody v medicíně (glykace) proteomika (kvantifikace proteinů)

66 Chromatografické metody pro separaci proteinů Gelová chromatografie Ionexová chromatografie Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie

67 Gelová chromatografie Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru Rozdělovací chromatografie v systému kapalina kapalina Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu nemísitelnost s mobilní fází Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později Isokratická eluce Objem vzorku < 2 % objemu kolony Chromatografické materiály zesítěný dextran (Sephadex), agarosa, polyakrylamid Možnost stanovení molekulových hmotností Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

68 Gelová permeační chromatografie Pořadí eluce : největší>střední>nejmenší molekula

69 Gelová permeační chromatografie

70 Gelová chromatografie

75 Příklad Pokuste se vysvětlit pořadí, ve kterém se budou vymývat z kolony Sephadexu G-200 následující bílkoviny: cytochrom c (RMH = ), ATPsulfurylasa (RMH = ) a xantinoxidasa (RMH = ).