MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA Ústav technologie potravin

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA Ústav technologie potravin Vliv přídavku probiotik na výskyt biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích Disertační práce Vedoucí práce: Vypracovala: Prof. MVDr. Ing. T. Komprda, CSc. Mgr. Petra Hoferková Brno 2012

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Vliv přídavku probiotik na výskyt biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis doktoranda.

3 PODĚKOVÁNÍ Mé poděkování patří především vedoucímu mé disertační práce panu prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc. za odborné rady a vedení při zpracování této disertační práce a Mgr. Radce Hulánkové, Ph.D. za poskytnutí cenných rad a připomínek. Poděkování za spolupráci při řešení experimentální části práce patří také Doc. RNDr. Vlastimilu Dohanlovi, Ph.D. a Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně za poskytnuté technické zázemí.

4 OBSAH 1 Úvod Cíl práce Literární přehled Trvanlivé fermentované salámy Produkce ve světě Suroviny a výroba Mikroorganismy v trvanlivých fermentovaných salámech Bakterie mléčného kvašení Micrococcaceae Kvasinky Plísně Startovací kultury Probiotika Historie probiotik Definice a vlastnosti Tradiční probiotika laktobacily a bifidobakterie Enterokoky Probiotika ve fermentovaných salámech Molekulární metody Polymerázová řetězová reakce Biogenní aminy Charakteristika a zdravotní aspekty Mikroorganismy produkující biogenní aminy Výskyt BA ve fermentovaných salámech Faktory ovlivňující výskyt BA ve fermentovaných salámech Legislativa Detekční metody Materiál a metodika Materiál Výroba salámů Přístroje a pomůcky Roztoky a kultivační půdy Roztoky Kultivační půdy Komponenty a chemikálie pro PCR Metodika Skladování a odběr vzorků Mikrobiologická analýza Metoda stanovení biogenních aminů a polyaminů Stanovení ph a vodní aktivity Testování tyrosindekarboxylázové a histidindekarboxylázové aktivity u startovacích kultur a kmenů L. casei v dekarboxylačním médiu (DCM) Konfirmace schopnosti izolátů startovacích kultur a probiotických kmenů L. casei produkovat tyramin a histamin v DCM metodou HPLC Screening izolátů startovacích a probiotických kultur na přítomnost DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu a histidindekarboxylázu Konfirmace L. casei metodou PCR Statistické zpracování výsledků...48

5 5 Výsledky Vliv vybraných faktorů na koncentraci biogenních aminů v průběhu zrání a skladování fermentovaných salámů Screening izolátů startovacích a probiotických kultur na přítomnost DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu a histidindekarboxylázu Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei ve fermentovaných salámech na koncentraci BA v celém průběhu zrání a skladování Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty ph a aktivity vody Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na sledované skupiny mikroorganismů Diskuse Vliv vybraných faktorů na koncentraci biogenních aminů v průběhu zrání fermentovaných salámů Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty ph a aktivity vody v průběhu zrání Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na sledované skupiny mikroorganismů Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci BA v celém průběhu zrání a skladování Závěr Seznam použité literatury...86

6 SUMMARY Biogenic amines (BA) content in fermented meat products can be influenced by many factors. The aim of this study was to evaluate the influence of different producers, spice mixtures, starter cultures and especially probiotic cultures on BA content and additional physical-chemical and microbiological parameters during rippening (up to 28 th day after stuffing) and storage at 15 C (up to 49th day after stuffing). Sausages were made in two processing facilities with use of two different spice mixtures (H: Herkules, P: Paprikáš). Each type of product was made in four batches, each with different combination of starter (C: Pediococcus pentosaceus, F: Lactobacillus curvatus Staphylococcus carnosus) and probiotic culture (Lactobacillus casei BGP 93 and Lactobacillus casei 431). Sausages were sampled 0, 14, 28 and 49 days after stuffing. With exception of spermine and spermidine the content of BA determined with HPLC-UV method increased during rippening and storage. At the end of storage tyramine, putrescine and cadaverine reached the highest values. Concentrations of the three biogenic amines were significantly (P < 0.05) lower in sausages with L.casei BGP 93 (139, 119 and 26 mg kg-1) and L. casei 431 (173, 123 and 27 mg kg-1) in comparison with control (240, 155 and 42 mg kg-1). There were no statistically significant differences in the sum of BA between the sausages of different producers. However the sausages with spice mixture P exhibited at the end of storage lower concentrations of BA than the sausages with spice mixture H (P < 0.05) and the sausages with starter culture C exhibited lower concentrations of BA than the sausages with starter culture F (P < 0.05). In all sausages there was a typical drop of ph during first weeks of fermentation from approx. 6.0 to average value 4.5. Values of a w decreased faster in probiotic sausages than in control (P < 0.05). Addition of probiotics projected partially in counts of lactic acid bacteria, but the total viable count and counts of enterococci were not significantly affected. L. casei strain BGP 93 lowered the concentrations of BA in sausages more than L. casei 431, reflecting probably the higher initial content of BGP 93 (5.62 log CFU g-1) than that of the strain 431 (4.62 log CFU g-1). Both strains of L. casei were capable to survive well in the analysed sausages and their counts incresed during rippening and storage to 6.83 (strain BGP 93) and 5.83 (strain 431) log CFU g-1.

7 In light of positive effects on human organism it would be advisable to increase the content of probiotics at least by 1 log. We proved that the incorporation of probiotic cultures into dry fermented sausages led to lower concentrations of biogenic amines. This effect was notable especially at the end of rippening and during storage. Higher addition of probiotics in combination with more appropriate starter culture (not producing BA) or application of probiotic culture as a starter culture could further decrease the BA content in sausages.

8 1 ÚVOD V dnešní době nabývají v Evropě stále více na popularitě potraviny působící příznivě na lidské zdraví, tzv. funkční potraviny. S těmito potravinami přicházejí na trh výrobci ve snaze se odlišit a prosadit své výrobky na trhu. Funkční potraviny jsou potraviny obohacené o větší množství biologicky aktivních látek, než se nachází v jejich standardní podobě. Prospěšné složky, jako jsou vitamíny, antioxidanty, vláknina a probiotické bakterie mléčného kvašení se začaly do potravin přidávat v 90. letech 20. století. Mezi snad nejznámější funkční potraviny patří výrobky obohacené o probiotické mikroorganismy. Jako nosiče probiotických kultur se většinou používají fermentované mléčné výrobky. Nedávno se však pozornost obrátila také k trvanlivým fermentovaným masným výrobkům, do kterých jsou cíleně přidávána probiotika. Představiteli probiotik jsou hlavně střevní kmeny rodu Lactobacillus a Bifidobacterium. Produkce kvalitních a zdravotně nezávadných trvanlivých fermentovaných masných výrobků patří dnes bezesporu mezi základní předpoklad úspěchu výrobců jak na tuzemském, tak také na zahraničním trhu. Z tohoto důvodu je ze strany výrobních společností vyvíjena snaha o inovaci procesů výroby k eliminaci výskytu zdraví škodlivých mikroorganismů nebo toxických látek. Vzhledem k technologii výroby fermentovaných masných výrobků dochází ke zvýšené tvorbě biologicky aktivních látek, které mohou mít nepříznivý vliv na zdravotní nezávadnost finálního produktu. Mezi tyto látky se řadí nízkomolekulární látky bazické povahy odvozené od aminokyselin biogenní aminy. Vyskytují se v buňkách rostlinných a živočišných materiálů, kde zajišťují řadu důležitých funkcí. V nadměrném množství mohou způsobovat nežádoucí až toxické účinky a jejich přítomnost je tedy nežádoucí. Za tvorbu biogenních aminů jsou zodpovědné enzymy dekarboxyláz, zejména tyrosindekarboxyláza a histidindekarboxyláza. Některé startovací kultury jsou schopny redukovat koncentrace biogenních aminů v závislosti na fyzikálně-chemických parametrech, zejména ph a vodní aktivita, kdy ph je klíčový faktor ovlivňující činnost dekarboxyláz aminokyselin. Byl zaznamenán vzájemný vztah mezi produkcí biogenních 8

9 aminů a poklesem ph v salámech způsobeným mléčnou fermentací. Teplota má také jednoznačně vliv na tvorbu biogenních aminů hlavně v rybím mase a v sýrech, kde obsah biogenních aminů vzrůstá se zvyšující se teplotou a dobou skladování. Teplota ovlivňující činnost mikroorganismů přítomných v salámech může mít na hromadění aminů opačný efekt. Zvolením vhodného typu probiotických bakterií a zvolením vhodných podmínek zrání a skladování fermentovaných výrobků je možné ovlivnit tvorbu biogenních aminů. Mezi metody umožňující detekci mikroorganismů produkujících biogenní aminy se jako nejvíce vhodné jeví molekulárně genetické metody, konkrétně metoda polymerázové řetězové reakce (PCR). 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem této disertační práce bylo: Stanovení koncentrací biogenních aminů v trvanlivých fermentovaných salámech s přídavkem probiotické kultury L. casei a jejich srovnání s výrobky téhož typu bez přídavku probiotické kultury. Posouzení vlivu vybraných faktorů (výrobce, kořenící směs s startovací kultury) na koncentraci biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích. Určení fyzikálně-chemických parametrů (ph a aktivity vody) a posouzení tvorby biogenních aminů v souvislosti s těmito parametry. Ověření dekarboxylázové aktivity použité směsné startovací kultury (Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus a Pediococcus pentosaceus) a probiotické kultury kmenů Lactobacillus casei. 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Trvanlivé fermentované salámy Podle vyhlášky č. 326/2001 Sb., ve znění pozdějších předpisů, je trvanlivý fermentovaný masný výrobek definován jako výrobek tepelně neopracovaný určený k přímé spotřebě, u kterého v průběhu fermentace, zrání, sušení a uzení za definovaných podmínek došlo ke snížení aktivity vody na hodnotu aw (max.) = 0,93 s minimální dobou trvanlivosti 21 dní při teplotě plus 20 C. Údržnost tohoto typu výrobku je výsledkem působení celé řady překážek pro rozvoj nežádoucí a patogenní mikroflóry: přídavek dusitanu, soli a/nebo cukru, snížení redoxního potenciálu, přídavek startovací kultury obsahující bakterie mléčného kvašení (produkce kyseliny mléčné, bakteriocinů, kompetice o živiny), snížení ph, snížení vodní aktivity, uzení (Toldrá et al., 2007) Produkce ve světě Fermentované masné výrobky se vyrábí po celém světě a jejich škála je značně široká. Fermentované salámy vynalezli údajně již Sumerové a ve starověku je znali i Číňané, Řekové a Římané (Cocolin et al., 2008). Za kolébku výroby v Evropě je považována Itálie, odkud se tato technologie rozšířila i do dalších zemí. V průběhu staletí se vyvinuly určité tradiční postupy a zásady v produkci trvanlivých fermentovaných masných výrobků napříč Evropou. V některých zemích se velice často používají tradiční postupy bez aplikace startovacích kultur. Zkušenosti řeznických mistrů i podmínky, které převládaly v produkčních oblastech, vtiskly salámům charakteristické rysy a umožnily rozlišit např. italské či francouzské výrobky od německých nebo švédských 11

12 produktů. Mezi nejvýznamnější producenty trvanlivých fermentovaných salámů dnes patří Německo, Itálie, Španělsko, Francie či Maďarsko (Kameník, 2011). Obecně se fermentované masné výrobky dělí dle konzistence (trvanlivé-sušené, polosušené, roztíratelné) a dle finálního ph na výrobky s vysokým finálním ph a s nízkým finálním ph, s čímž obvykle souvisí i délka zrání (Marianski and Marianski, 2009). Výrobky s vysokou finální hodnotou ph zrají dlouho a jsou typické právě pro Itálii nebo Maďarsko. V Itálii je tradiční doba zrání až 6 měsíců, v Maďarsku dní. Výrobky s nízkou finální hodnotou ph jsou typické např. pro Skandinávii a Střední Evropu (Kameník a Budig, 2010) Suroviny a výroba Trvanlivé fermentované salámy se připravují z mraženého vepřového a hovězího masa a vepřového tuku (Vignolo et al., 2010). Nejrozšířenějším druhem masa pro výrobu trvanlivých salámů (zejména v Evropě) je vepřové maso. V našich podmínkách se zpracovává v různých poměrech s hovězím masem. V zahraničí se používá např. i maso koňské, skopové nebo krůtí. Vepřové sádlo má být jadrné, využívá se pouze hřbetní sádlo. Měkký tuk je nežádoucí z hlediska konzistence výrobku a kvůli větší náchylnosti k oxidaci (Kameník, 2011). Obsah tuku v trvanlivých fermentovaných salámech je vysoký a dosahuje až 50 % (Marianski and Marianski, 2009). Dalšími zásadními přísadami jsou dusitanová solící směs v množství 2 4 %, sacharidy, koření a startovací kultura (Vignolo et al., 2010). Sůl představuje jednu z prvních překážek pro růst nežádoucích mikroorganismů. Navíc se podílí na rozpuštění svalových bílkovin a tvorbě gelu mezi masem a tukovými částicemi v díle. Samozřejmě má také význam pro chuť finálního výrobku (Leroy and De Vuyst, 2008). Dusitany představují další překážku pro růst patogenů, která funguje už v díle. Také se podílí na tvorbě barvy. Vznik a stabilitu barvy typické pro uzené maso zaručuje i případný přídavek askorbátů (Marianski and Marianski, 2009). Z koření se používá např. pepř, kardamon, česnek či paprika. V Maďarsku se produkuje řada trvanlivých salámů se značným obsahem papriky (1 2 %) (Kameník, 2011). Kromě vlivu na chuť a vůni může mít koření i antioxidační a antimikrobiální účinky. Na inhibici různých bakterií na povrchu salámů se navíc 12

13 podílejí i složky kouře během uzení, např. fenoly, karbonylové sloučeniny a různé organické kyseliny (Feiner, 2006). Sacharidy se přidávají jako zdroj živin pro startovací kulturu (Toldrá, 2004). Přídavek sacharidů do díla ovlivňuje rychlost a intenzitu fermentace. Používají se monosacharidy (glukóza, fruktóza), disacharidy (sacharóza, laktóza), případně i oligosacharidy (např. škrobový sirup). Glukóza i sacharóza jsou vzájemně zastupitelné. Pro fermentované salámy s dobou zrání 4 týdny a více je optimální přídavek 0,3 % dextrózy nebo sacharózy. Pro salámy s rychlejším a kratším zráním (méně než 3 týdny) lze přidávat 0,5 0,7 %. Laktóza způsobuje pomalejší pokles hodnot ph a je třeba počítat s její vyšší zbytkovou koncentrací v díle. Proto se doporučuje přídavek 0,5 % laktózy do salámů pomalu zrajících a 1 % pro salámy s rychlejší fermentací (Ruiz, 2007). Ne všechny bakterie mléčného kvašení však laktózu snadno fermentují a zvláště některá probiotika (např. Lactobacillus rhamnosus GG) ji nejsou schopna využívat vůbec (Työppönen et al., 2003). V některých recepturách se přidává do díla místo sacharidů glukono-deltalakton (GdL). Jeho hydrolýzou vzniká D-glukonová kyselina, která snižuje ph díla již za několik hodin (Leroy and De Vuyst, 2008). GdL se obvykle aplikuje v množství 0,3 0,5 %. Negativní stránkou GdL je nežádoucí vliv na tuk ve fermentovaných salámech. Proto lze GdL použít pouze do salámů s kratší dobou zrání a kratší trvanlivostí (Lücke, 2003). Pro trvanlivé fermentované salámy s nízkou konečnou hodnotou ph je charakteristický přídavek sacharidů do díla v množství 0,3 0,7 % a vyšší počáteční teploty zrání (22 25 C), které umožní rozvoj bakterií mléčného kvašení (startovacích kultur). Tyto mikroorganismy fermentují sacharidy na kyselinu mléčnou, a tím dojde k poklesu ph na 5,3 i méně (4,5 5,0) (Leroy and De Vuyst, 2008). Typickými českými výrobky ve skupině s vyšším finálním ph byly Poličan a Lovecký salám, s nízkým ph salám Herkules. V současnosti však výrobci přidávají z důvodů větší standardizace procesu zrání sacharidy a startovací kultury i do tradičních produktů, jejichž hodnoty ph mohou tímto klesat < 5,0 (Kameník, 2011). Po mělnění a promíchání se solí, kořením a dalšími přísadami se vzniklé dílo plní do obalového střeva (Marianski and Marianski, 2009). Mělnění, míchání a narážení díla do obalových střev musí zajistit, aby zůstala zachovaná struktura tukové tkáně, která 13

14 potom tvoří v nákroji výrobků charakteristickou mozaiku. Je proto třeba použít mraženou surovinu, ostré řezací nástroje a vhodnou narážečku. Pro výrobu trvanlivých masných produktů se používají střeva propustná pro vodní páru, plyny a složky kouře. V dnešní době se u nás používají především tenká vepřová střeva, a to pro produkci trvanlivých klobás. Z umělých střev jsou to především tzv. fibrousová střeva (zpevněná celulóza) a klihovkové obaly (Kameník, 2011). Za definovaných podmínek (teplota, relativní vlhkost a proudění vzduchu) probíhá v klimatizovaných komorách zrání (Toldrá, 2004). Teplota je rozhodující pro fermentační děje v díle. Musí být nastavena na požadavky bakterií, které jsou jako startovací kultury přidány do díla. Začíná se na C, poté se teplota postupně snižuje na cca 16 C. Relativní vlhkost vzduchu musí zajistit v kombinaci s prouděním vzduchu sušení tj. odvod vody z díla a povrchu výrobku. Pokud je vlhkost v komoře příliš nízká a proudění vzduchu příliš vysoké, sesychá povrchová vrstva těsně pod obalovým střevem a vzniká tzv. kroužek, kdy v nevysušeném středu salámu může docházet ke kažení. Délka zrání závisí na typu výrobku. Salámy se zpravidla udí po dobu prvních sedmi dnů, kdy visí v tzv. zakuřovacích komorách. V této fázi probíhá také fermentační proces, teploty jsou nastavené na C s postupným snižováním až na C ke konci tohoto období. Poté se výrobky přesunují do zracích komor, kde při již nižších teplotách kolem 15 C a relativní vlhkosti vzduchu kolem % pokračuje zrání a sušení produktů. Délka pobytu v klimatizovaných komorách záleží na druhu výrobku. Tenké výrobky ve skopových střívkách (příp. kolagenních jedlých obalech) jsou hotové za několik dní, salámy o průměru mm za 3 týdny. Sladění externích parametrů (teplota, vlhkost, proudění) harmonizuje proces fermentace se sušením díla, navozuje rovnoměrné zrání a výsledkem je produkce kvalitních výrobků (Kameník, 2011). 3.2 Mikroorganismy v trvanlivých fermentovaných salámech V trvanlivých fermentovaných masných výrobcích můžeme nalézt širokou škálu mikroorganismů. Mezi nejvýznamnější skupiny patří bakterie mléčného kvašení, gram pozitivní, kataláza pozitivní koky a dále 14 kvasinky a plísně. Tyto skupiny

15 mikroorganismů se ve fermentovaných masných výrobcích vyskytují jednak v množství daném kontaminací použitého masa, případně jsou záměrně přidávány do díla jako startovací kultury (Toldrá, 2008). Další skupiny mikroorganismů vyskytující se ve fermentovaných trvanlivých salámech jsou pseudomonády nebo čeleď Enterobacteriaceae, jejichž rozvoj je však omezen nepříznivými podmínkami prostředí (Lücke, 2003). Také patogenní bakterie (Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Clostridium spp., Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157 aj.) jsou inhibovány obsahem soli a dusitanů, později produkty fermentace bakterií mléčného kvašení včetně bakteriocinů (Marianski and Marianski, 2009) Bakterie mléčného kvašení Obecně se jedná o acidotolerantní, gram pozitivní tyčky nebo koky, s výjimkou rodu Sporolactobacillus nesporulující a náležející převážně do řádu Lactobacillales, což je geneticky velmi různorodá skupina. V současné době jsou do skupiny bakterií mléčného kvašení (BMK) řazeny rody Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Sporolactobacillus, Streptococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella. Rod Bifidobacterium je někdy řazen mezi bakterie mléčného kvašení díky fenotypické podobnosti (Fontana et al., 2011). Fermentací sacharidů vytváří BMK kyselinu mléčnou a ovlivňují tak zásadně údržnost a chuť výrobku. Kromě kyseliny mléčné produkují heterofermentativní druhy (např. L. reuteri) i méně žádoucí produkty jako je kyselina octová, etanol, acetoin, peroxid vodíku apod. (Toldrá, 2008). Řada významným druhů jako je Lactobacillus sakei, L. curvatus nebo L. plantarum jsou fakultativně heterofermentativní a v případě změněných podmínek prostředí (např. při přítomnosti kyslíku) mohou přejít na heterofermentativní metabolismus (Kameník, 2011). Některé rody bakterií mléčného kvašení jsou producenty bakteriocinů. Jedná se o sloučeniny bílkovinné povahy, které vykazují baktericidní aktivitu proti omezenému spektru mikroorganismů, většinou úzce příbuzných s daným producentem. Bakteriocinogenní startovací kultury jsou používány ke zlepšení konkurenceschopnosti 15

16 startovacích kultur a k prevenci růstu alimentárních patogenů (Cocconcelli and Fontana, 2010). BMK se kromě údržnosti a chuti podílí v menší míře i na tvorbě aroma fermentovaných salámů, a to nejen nežádoucími produkty heterofermentativního metabolismu. Např. Lactobacillus sakei disponuje peptidázami, čímž zvyšuje obsah volných aminokyselin. Ovlivněny mohou být i senzorické vlastnosti tuku, a to díky produkci lipáz a následnému zvyšování koncentrace volných mastných kyselin (např. Lactobacillus plantarum). Na druhou stranu u Lactobacillus sakei byla detekována kataláza, která omezuje žluknutí tuků (Flores and Toldrá, 2011). Jednotlivé druhy BMK se liší různou optimální teplotou růstu i citlivostí vůči obsahu soli. Minimální růstové podmínky pro BMK jsou ph 3,0 a aw 0,95, teplota a obsah soli se liší (viz tabulka 1). Z původního množství 3 4 log KTJ g-1 se během fermentace jejich počty zvýší až na 6 8 log KTJ g-1 (Talon and Leroy, 2011). Některé BMK mohou být však i nežádoucí. L. viridescens způsobuje zelenání masa v důsledku tvorby peroxidu vodíku, L. brevis a L. mesenteroides jsou nežádoucí tvorbou plynu a nepřijatelným okyselením. Rod Brochotrix může způsobovat odchylky chuti a vůně (Marianski and Marianski, 2009). Tabulka 1: Růstové vlastnosti různých mikroorganismů podílejících se na fermentaci masa (Marianski and Marianski, 2009). Mikroorganismus Optimální teplota ( C) Maximální obsah NaCl (%) Lactobacillus sakei 30 9 Lactobacillus farciminis Lactobacillus plantarum Lactobacillus curvatus Lactobacillus pentosus 25 9 Pediococcus acidilactici Pediococcus pentosaceus 35 7 Staphylococcus carnosus Staphylococcus xylosus Micrococcaceae

17 Mezi dominantní druhy u tradičních fermentovaných salámů vyráběných bez přídavku startovacích kultur patří laktobacily, a to zejména Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus a Lactobacillus plantarum (Talon and Leroy, 2011) Micrococcaceae Do této čeledi náleží stafylokoky a rod Kocuria. Podílí se na vzniku barvy, neboť redukují dusičnany na dusitany (Cocolin et al., 2008). Množí se poměrně pomalu a při ph vyšším než 5,4. Mají proteolytickou a částečně i lipolytickou aktivitu. Stafylokoky jsou anaerobní a více tolerantní vůči NaCl, zatímco mikrokoky jsou aerobní a jsou aktivní spíše na povrchu výrobku (Toldrá, 2008). Nejčetnějšími druhy této skupiny bakterií izolovaných z trvanlivých fermentovaných salámů na konci zrání jsou S. xylosus, S. equorum a S. saprophyticus (Talon and Leroy, 2011) Kvasinky Kvasinky jsou součástí tradičních fermentovaných salámů. Vyznačují se také proteolytickou a lipolytickou aktivitou a podílejí se tak na chuti a aroma výrobku. Částečně odbourávají kyselinu mléčnou, čímž zvyšují ph výrobku (Toldrá, 2004). Predominantním druhem ve fermentovaných masných výrobcích je Debaryomyces hansenii (Toldrá, 2008) Plísně Plísně na povrchu jsou typické pro některé druhy fermentovaných salámů. Používají se kulturní plísně, např. Penicillium nagliovense, Penicillium chrysogenum, které se očkují na salámy před umístěním do zracích komor (Toldrá, 2008). Porost kulturní plísně chrání obsah před světlem a tedy oxidací tuků. Kulturní plísně se podílejí na chuti výrobku, zajišťují rovnoměrné sušení a omezují růst divokých plísní, které mohou produkovat mykotoxiny (Marianski and Marianski, 2009). 3.3 Startovací kultury Zatímco po staletí se používala tradičně fermentace masa pomocí mikroorganismů přítomných v mase a v prostředí, v dnešní době jsou tyto techniky nahrazovány aplikací 17

18 komerčně vyprodukovaných startovacích kultur (Marianski and Marianski, 2009). Startovací kultury jsou definované jako přípravky, které obsahují živé mikroorganismy nebo mikroorganismy v klidovém stavu, které vyvíjejí v mase žádoucí metabolickou aktivitu (Cocconcelli, 2008). Zatímco zpočátku se používaly zejména kmeny izolované z rostlinného materiálu, dnes se klade důraz na získávání kmenů z fermentovaných masných výrobků, adaptovaných již na toto prostředí (Cocconcelli and Fontana, 2010). Bakterie mléčného kvašení se v mase přirozeně vyskytují, ale v těžko odhadnutelné kvalitě a množství. Většinou se jedná o heterofermentativní typ, který se kromě tvorby kyseliny mléčné podílí i na dalších reakcích, vedoucích ke vzniku nepříjemných pachů. Startovací kultury jsou homofermentativní a produkují pouze kyselinu mléčnou. Jejich přídavek ve velkém množství zaručuje jejich dominanci, vedoucí k potlačení rozvoje nežádoucích mikroorganismů (Marianski and Marianski, 2009). Startovací kultury se používají ve výrobě salámů ke snížení doby fermentace a k zajištění nízkých koncentrací zbytkových dusitanů a dusičnanů ve finálním výrobku, čímž se zlepšuje bezpečnost a stabilita výrobku a prodlužuje jeho údržnost. Jedná se o směsi bakterií mléčného kvašení a kataláza pozitivních, koaguláza negativních koků, namíchaných dle požadovaných finálních vlastností výrobku (Burdychová a Šulcerová, 2009). Aplikují se do díla současně s přídavkem sacharidů (Kameník, 2011). Nejčastěji se jako masné startovací kultury používají směsi Lactobacillus sakei, L. casei, L. curvatus, L. pentosus, L. plantarum, Pediococcus acidilactici a P. pentosaceus, Staphylococcus carnosus a S. xylosus, Kocuria varians, Debaryomyces hansenii, Penicillium nalgiovense a Penicillium chrysogenum (Coconcelli and Fontana, 2010; Fontana et al., 2011). Mezi základní požadavky na startovací kultury patří kromě dobrého růstu v daném prostředí i aspekty bezpečnosti pro lidské zdraví. Týkají se zejména patogenity, toxických či alergenních účinků (včetně produkce biogenních aminů) a rezistence vůči antimikrobiálním látkám (Burdichon et al., 2012). Zástupci rodů Lactobacillus, Leuconostoc a Pediococcus jsou navrženy Evropským úřadem pro bezpečnost potravin na status QPS (Qualified Presumption of Safety), tedy jako bezpečné pro použití v potravinách (EFSA, 2011). Bezpečnostní rizika jsou spojována zejména s koaguláza negativními stafylokoky. U některých kmenů včetně např. druhu S. xylosus byla zjištěna 18

19 rezistence vůči antibiotikům nebo geny rezistence (Resch et al., 2008), produkce stafylokokových enterotoxinů (Zell et al., 2008) a v menší míře i tvorba biogenních aminů (Even et al., 2010; Talon and Leroy, 2011). Na druhou stranou přidání startovacích kultur snižuje hromadění biogenních aminů v salámech (Ruiz-Capillas et al., 2011). Aby dokázaly startovací kultury potlačit růst mikroorganismů schopných tvořit aminy, musí být schopné konkurence (Suzzi and Gardini, 2003). Vhodné druhy startovacích kultur jsou využívány rovněž jako protektivní kultury nebo dokonce jako probiotika. 3.4 Probiotika Historie probiotik První poznatky o výrobcích s obsahem bakterií mléčného kvašení s příznivými účinky na lidské zdraví jsou přisuzovány ruskému bakteriologovi a imunologovi Mečnikovovi. Mechanismus účinku si vysvětloval tak, že bakterie mléčného kvašení v trávicím traktu brzdí nadměrné množení proteolytické mikroflóry, které tvoří pro organismus škodlivé štěpné produkty proteinů (Görner a Valík, 2004). Bakterie mléčného kvašení byly prvně objeveny Pasteurem v roce V roce 1878 je Lister izoloval ze zkysaného mléka a později byly objeveny i v trávicím traktu. V roce 1889 Tissier objevil Bifidobacterium spp., a v roce 1900 Moro izoloval Lactobacillus acidophilus (Lee and Salminen, 2009). Probiotika byla prvně použita pro terapeutické účely při střevních potížích Tissierem v roce 1906 (Muller et al., 2009). Pojem probiotika poprvé použil Lilley a Stillwell v roce 1965 jako pojem opačný k antibiotikům. V roce 1974 podal Parker první oficiální definici probiotik, která je potom v roce 1991 revidována R. Fullerem do podoby, ve které se uvádí dodnes (Borchers et al., 2004). Prvními probiotickými výrobky v Evropě byly kysané mléčné výrobky, nyní jsou však v této skupině zahrnuty i další druhy potravin, např. další mléčné produkty, masné výrobky, nápoje a kvašené výrobky obecně (Gueimonde and Salminen, 2005). 19

20 3.4.2 Definice a vlastnosti Probiotikum je definováno jako živý organismus přidávaný do potravin, který příznivě ovlivňuje zdraví konzumenta zlepšením rovnováhy jeho střevní mikroflóry (FAO/WHO, 2001). Příznivý účinek probiotik (viz tabulka 2) je podmíněn požitím dostatečného množství živých bakterií. Za tzv. terapeutické minimum je považována podle různých autorů dávka 6 12 logaritmických řádů buněk (Huckle and Zhang, 2011). Tabulka 2: Pozitivní účinky probiotik na zdraví (De Vuyst et al., 2008). lepší trávení potravin (např. proteinů, dietárních polysacharidů) snížená intolerance laktózy dodání živin a růstových faktorů (vitamínů, minerálů) v biologicky využitelné formě udržování mikroflóry tlustého střeva v rovnováze snížení rizika střevních potíží (gastrointestinální infekce, zácpa) snížení rizika vzniku a délky průjmu (způsobeného rotaviry, antibiotiky, Clostridium difficile, cestovatelský průjem) inhibice nežádoucích a patogenních bakterií (gastrointestinální infekce vyvolané Streptococcus mutans, Helicobacter pylori, Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium difficile; infekce močového systému, infekce dýchacího systému) modulace/stimulace imunitního systému (buněčná imunita, tvorba protilátek) snížení rizika vzniku atopického ekzému a alergií (astma, senná rýma, potravinová alergie, ekzémy, dermatitidy) příznivé účinky na žaludeční potíže (syndrom podrážděného žaludku) příznivé účinky na zánětlivá onemocnění žaludku a střev (ulcerativní kolitida, Crohnova choroba) protirakovinné účinky snižování hladiny cholesterolu v krvi Mezi kritéria, která by měly splňovat kmeny s probiotickými vlastnostmi, patří: musí být zdravotně nezávadné, nesmí být patogenní, musí být natolik rezistentní, aby přežily bez poškození v průběhu technologického zpracování a zůstaly životaschopné po celou dobu trvanlivosti potraviny, neměly by ovlivňovat organoleptické vlastnosti potraviny, 20

21 přežívají v kyselém prostředí a v přítomnosti žluči (nesmí být během průchodu zažívacím traktem zničeny nebo oslabeny), přichycují se na epiteliální buňky ve střevech a jsou schopny dalšího růstu, je prokázán jejich pozitivní vliv na zdravotní stav (Makras et al., 2004) Tabulka 3: Příklady kmenů, které jsou komerčně využívány jako probiotika (De Vuyst et al., 2008). Kmen Název výrobku Zaměření Laktobacily Lactobacillus casei Imunitass Actimel obranyschopnost Yakult zažívací systém, obranyschopnost LC1 zažívací systém, obranyschopnost Lactobacillus plantarum 299v ProViva zažívací systém Lactobacillus rhamnosus GG Gefilus, Vifit,... zažívací systém, obranyschopnost (DN ) Lactobacillus casei Shirota (YIT 9029) Lactobacillus johnsonii La1 (NCC 533) (ATCC 53103) Bifidobakterie Bifidobacterium animalis subsp. lactis různé názvy střevní mikroflóra, imunitní systém Bb12 Bifidobacterium animalis subsp. lactis Activia průběh zažívání Bifidus Actiregularis (DN ) Bifidobacterium breve Yakult Bifiene zažívací systém, střevní mikroflóra Bifidobacterium longum BB 536 různé názvy (jogurt, střevní mikroflóra, imunitní systém prášek) Směsi bakterií mléčného kvašení VSL#3 (směs osmi kmenů) VSL#3 (prášek) léčba (střevní onemocnění, syndrom podrážděného žaludku) Další bakterie Escherichia coli Nissle 1917 Mutaflor (suspenze) léčba (střevní mikroflóra, střevní onemocnění) Kvasinky Saccharomyces boulardii Enterol (tablety) léčba (průjem, Clostridium difficile) Jako probiotické kultury jsou nejčastěji používány kmeny z rodu Lactobacillus a Bifidobacterium a v menší míře rody Pediococcus, Propionibacterium, Enterococcus, 21

22 Bacillus, Streptococcus a Saccharomyces (Champagne and Møllgaard, 2008; Khan et al., 2011). Příklady kmenů a výrobků jsou uvedeny v tabulce Tradiční probiotika laktobacily a bifidobakterie Rody Lactobacillus a Bifidobacterium jsou nejčastěji využívány jako probiotika (Lee and Salminen 2009). Jejich pozitivní účinky na zdraví jsou dobře známé a doložené. Tabulka 4: Druhy rodu Lactobacillus využívané jako probiotika (Hammes and Hertel, 2009). Lactobacillus Metabolismus Habitat acidophilus homofermentativní A, B * casei fakultativní heterofermentativní A crispatus homofermentativní A, B delbrueckii homofermentativní A johnsonii homofermentativní A, B paracasei fakultativní heterofermentativní A, B, C plantarum fakultativní heterofermentativní B, C reuteri heterofermentativní A, B rhamnosus fakultativní heterofermentativní A salivarius homofermentativní B * A: fermentované potraviny a krmiva; B: zvířata/člověk; C: potraviny (kažení) Do rodu Lactobacillus se v současnosti řadí přes 100 druhů. L. alimentarius, amylovorus, aviarius, brevis, buchneri, curvatus, farciminis, fermentum, gallinarum, gasseri, helveticus, hilgardii, kefiranofaciens kefiri, mucosae, panis, paraplantarum, pentosus, pontis, sakei, a sanfranciscensis mají statut QPS (bezpečné pro použití v potravinách) a zástupci L. acidophilus, casei, crispatus, delbrueckii, johnsonii, paracasei, plantarum, reuteri, rhamnosus a salivarius jsou navíc využívány jako probiotika (Felis et al., 2009), pro které je typická produkce bakteriocinů ze skupiny lantibiotik (Reis et al., 2012). Jedná se o gram pozitivní, mikroaerofilní, kataláza negativní, nesporulující tyčky nebo kokobacily nacházené v potravinách, respiračním systému, ústní dutině, ve střevním traktu a ve vaginálním prostředí zvířat i lidí, v rostlinném materiálu a menší míře v odpadních vodách. Tato velmi různorodá skupina 22

23 je geneticky nejvíce spjata s rody Paralactobacillus a Pediococcus (Felis et al., 2009). Z hlediska zkvašování cukrů zahrnuje druhy homofermentativní, heterofermentativní i fakultativně heterofermentativní (viz tabulka 4). Rod Bifidobacterium v současnosti čítá 30 druhů. Jako probiotika se využívají rody B. adolescentis, bifidum, animalis, breve a longum (Nayak, 2011). I když se řadí mezi bakterie mléčného kvašení, fylogeneticky je tento rod od ostatních bakterií mléčného kvašení velmi vzdálen, neboť patří do zcela odlišného kmene. Druhy tohoto rodu specificky metabolizují hexózy s použitím enzymu fruktóza-6-fosfát-fosfoketoláza (konečný produkt kyselina octová a v o něco menší míře kyselina mléčná), čímž se velmi liší od laktobacilů a jim příbuzných rodů. Jedná se o gram pozitivní, nepohyblivé, nesporulující, někdy rozvětvené tyčky (odtud název Bifidobacterium), které jsou obligátně anaerobní (Felis et al., 2009). Vyskytují se převážně v trávicím traktu člověka (kde jsou považovány za predominantní mikroflóru) a zvířat, ale byly izolovány i z ústní dutiny a vaginálního prostředí člověka, obsahu bachoru, odpadních vod a zažívacího traktu včely medonosné (Nayak, 2011). Probiotické účinky jsou pravděpodobně dány i tvorbou bakteriocinů skupiny lantibiotik (bifidin I, bifidocin B) (Reis et al., 2012) Enterokoky Enterokoky jsou gram pozitivní, fakultativně anaerobní, kataláza negativní, oválné až lehce protáhle koky uspořádané ve dvojicích nebo řetízcích. V současnosti je jich popsáno přes 30 druhů (Franz et al., 2011). Vyskytují se v různém prostředí zejména proto, že jsou schopné přežívat a množit se i ve velmi nepříznivých podmínkách. Běžně se nachází v půdě, vodě, potravinách, rostlinách a ve střevním traktu široké škály zvířat, jakožto i člověka (Kayser, 2003). Enterokoky produkují bakteriociny (enterociny), které jsou schopné potlačovat růst jiných, často patogenních druhů bakterií (Cebrián et al., 2012). Nejvýznamnější druhy enterokoků jsou E. faecalis a E. faecium, které dominují mezi humánními izoláty (Kayser, 2003). Enterokoky tvoří normální součást střevní mikroflóry a patří mezi závažné podmíněné patogeny. Jsou původci infekcí močových cest, infekcí ran, nitrobřišních zánětů, enterokokových endokarditid, bakterémií a katét23

24 rových sepsí, meningitid, peritonitid, osteomyelitid, infekcí žlučových cest a gynekologických zánětů (Votava, 2003). Významné jsou zvláště nosokomiální infekce. Nosokomiální kmeny jsou často rezistentní na všechna konvenčně používaná antibiotika. Infekce způsobené enterokoky jsou velmi časté u dlouhodobě hospitalizovaných pacientů s katétry a u pacientů léčených širokospektrálními antibiotiky, aminoglykosidy a cefalosporiny (Kayser, 2003). Nejvýznamnější je rezistence na vankomycin. Rezistence je spojena s geny van (Votava, 2003). Gen vanc je gen přirozené rezistence některých enterokokových druhů na vankomycin a není přenosný. Geny vana, vanb, vand, vane či vang lze přenést plasmidy, takže enterokoky původně citlivé mohou přenosem těchto genů rezistenci získat. Kromě rezistence na antibiotika tyto kmeny také často vykazují faktory virulence jako je tvorba adhezinů, invazinů nebo hemolyzinu (Ogier and Serror, 2008). Studie zabývající se výskytem faktorů virulence u enterokoků ukázaly, že tyto faktory a antibiotická rezistence se mohou vyskytovat i u kmenů izolovaných z potravin a přírodních zdrojů (např. z rostlin). Obecně se zdá, že výskyt faktorů virulence je u kmenů izolovaných z potravin častější u E. faecalis než u E. faecium (Franz et al., 2011). Enterokoky patří mezi bakterie mléčného kvašení a mají význam jak ve fermentaci, tak při kažení potravin. Mohou způsobovat kažení tepelně opracovaných masných výrobků, ale mohou se podílet také na tvorbě aroma fermentovaných salámů, zvláště tradičních, spontánně fermentujících výrobků z oblasti Středomoří (Latorre-Moratalla et al., 2011). Role těchto mikroorganismů v onemocnění člověka vyvolává pochybnosti o jejich bezpečnosti při použití jako startovací kultury nebo probiotika (Ogier and Serror, 2008). Problémem samozřejmě může být i produkce biogenních aminů. Z těchto důvodů nejsou enterokoky na seznamu QPS mikroorganismů, jejich použití v potravinách se považuje za bezpečné (EFSA, 2011). Přesto však bylo provedeno několik studií se záměrným přídavkem enterokoků do fermentovaných salámů. Autoři Latorre-Moratalla et al. (2011) použili ve svém experimentu osm různých kmenů enterokoků, které záměrně očkovali do díla na výrobu fermentovaných masných výrobků. Na konci experimentu bylo zjištěno, že v průběhu skladování salámů docházelo podstatně méně k jejich oxidaci, než u salámů vyráběných 24

25 dle výrobní receptury. Autoři Sparo et al. (2008) použili úspěšně pro výrobu fermentovaných trvanlivých klobás kmen Enterococcus faecalis CECT7121 s inhibiční aktivitou proti nežádoucím mikroorganismům. Enterokoky byly studovány také z hlediska probiotických účinků. Jako probiotické kultury se v současnosti používají kmeny E. faecium NCIMB (SF68) a E. faecalis Symbioflor, a to jako doplňky stravy a doplňky výživy zvířat (Franz et al., 2011). Dalšími studovanými kmeny z hlediska bezpečnosti a probiotického potenciálu byl např. kmen E. faecium KH 24, E. faecalis CP58 nebo E. faecalis UGRA 10 (Bhardwaj et al., 2010; Nueno-Palop and Narbad, 2011; Cebrián et al., 2012) Probiotika ve fermentovaných salámech Fermentované salámy jako výrobky, které neprochází tepelným ošetřením, jsou vhodnými nosiči probiotických kultur. Při použití probiotik ve fermentovaných salámech je nutno zajistit, že kultura přežije v dostatečném množství, aby měla příznivé účinky na zdraví konzumenta. Proto by měla být probiotická kultura dobře přizpůsobena podmínkám ve fermentovaných salámech, aby se stala dominantní kulturou (Toldrá and Reig, 2011). Vhodné kultury lze získat screeningem kmenů izolovaných z tradičních typů fermentovaných salámů či komerčně používaných startovacích kultur (De Vuyst et al., 2008). Přežívání probiotik v dostatečném množství lze zaručit i jejich ochranou metodou mikroenkapsulace ve vhodném nosiči, jak dokázali např. Muthukumarasamy and Holley (2007). Neméně důležité je, aby probiotická kultura nezpůsobovala odchylky chuti a vůně výrobku například svojí lipolytickou aktivitou (Toldrá and Reig, 2011). Většina studií se zaměřuje na přežívání potenciálně probiotických kmenů v prostředí fermentovaných trvanlivých salámů, v menší míře na přežívání v trávicím traktu a adhezní schopnosti. Neméně důležité je však prokázání prospěšných účinků na lidské zdraví, v kterémžto směru existuje jen málo klinických studií. Tyto studie by přitom mohly zvýšit důvěru konzumentů v probiotické potraviny (Khan et al., 2011). Němečtí a japonští výrobci vyvinuli masné výrobky obsahující bakterie mléčného kvašení izolované z lidského střeva. Německý salám z roku 1998 obsahoval tři kmeny 25

26 L. acidophilus, L. casei a Bifidobacterium sp. a považuje se za první probiotický salám v tržní síti (Klingberg et al., 2005). Arihara et al. (1998) prokázali možnost použití kmene L. gasseri JCM 1131, Sameshina et al. (1998) použili k fermentaci kmeny L. rhamnosus FERM P a L. paracasei subsp. paracasei FERM P Tyto dva probiotické kmeny inhibovaly růst a tvorbu enterotoxinu u Staphylococcus aureus ve stejné míře jako komerční startovací kultura L. sakei. Andersen (1998) fermentoval trvanlivé salámy směsí tradiční startovací kultury Bactoferm T-SPX a potenciálně probiotickým kmenem L. casei LC-01 nebo směsí Bactofermu s Bifidobacterium lactis Bb-12. Také byly úspěšně vyzkoušeny kmeny L. rhamnosus GG a L. rhamnosus E (Erkkilä et al., 2001) a L. paracasei L26 a Bifidobacterium lactis B94 (Pidcock et al., 2002). Dále byla prokázána zvýšená inaktivace Eshcerichea coli O157:H7 během výroby salámu s probiotickými kmeny Lactobacillus reuteri ATCC a Bifidobacterium longum ATCC (Muthukumarasamy and Holley, 2007). Ruiz-Moyano et al. (2011) úspěšně vyrobili fermentovaný trvanlivý salám španělského typu (salchichón) s pomocí potenciálně probiotické kultury Pediococcus acidilactici SP Molekulární metody Molekulární metody nacházejí v mikrobiologii potravin stále větší uplatnění, a to nejen jako nástroj identifikace a studia patogenních mikroorganismů, ale také např. identifikace nových kmenů BMK izolovaných z fermentovaných masných výrobků. Pro možnost ověření, zda se přidaný probiotický kmen nachází ve výrobku v dostatečném množství, je nezbytné jeho odlišení od podobných bakterií. Kromě identifikace jsou molekulární metody užitečným nástrojem zejména pro studium vlastností potenciálních probiotických nebo startovacích kultur, jako je tvorba toxinů, biogenních aminů či bakteriocinů, rezistence vůči antibiotikům a další vlastnosti. Polymerázová řetězová reakce (PCR polymerase chain reaction) představuje dnes jednu z nejpoužívanějších, ne-li vůbec nejpoužívanější techniku molekulární biologie, z níž vychází i většina sofistikovanějších metod (Broll, 2010). 26

27 Historie této metody je ještě krátká, poprvé byla publikována v roce 1985 autory Saikim a Mullisem. V roce 1993 dostal Karl Mullis za objev PCR Nobelovu cenu v oblasti chemie (Patrinos and Ansorge, 2010) Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce je metoda založená na zmnožení (amplifikaci) definovaného úseku DNA v podmínkách in vitro. Pomocí PCR je možné vytvořit miliony kopií úseku DNA v průběhu několika hodin (Patrinos and Ansorge, 2010). Toto in vitro namnožení nukleové kyseliny má své podmínky a reagencie, bez nichž nelze amplifikaci uskutečnit (Broll, 2010). PCR vyžaduje přítomnost templátové DNA, DNA polymerázy, oligonukleotidových primerů, MgCl2 a nukleotidů (dntp) v roztoku s vhodným ph a iontovou silou. Aby byl průběh PCR efektivní, je potřeba optimalizovat koncentrace jednotlivých složek a teplotní režim (Dale et al., 2012). DNA polymeráza katalyzuje syntézu nového DNA řetězce ve směru 5 3 podle sekvence nukleotidů v komplementárním řetězci DNA od místa primeru navázaného na templát až do konce (Sambrook and Russell, 2001). Nejčastěji používaná termostabilní DNA polymeráza je izolovaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus a označuje se Taq DNA polymeráza. Optimální teplota pro její aktivitu je C po dobu přibližně 5 minut. Taq polymeráza vyžaduje pro svoji funkci přítomnost volných Mg2 iontů dodávaných ve formě MgCl2 (Patrinos and Ansorge, 2010). Na to, aby se mohla PCR uskutečnit, je nevyhnutelně potřebná templátová DNA. Jako vzorek se může použít DNA vyizolovaná z buněk, případně jen hrubý buněčný extrakt. V některých případech se jako vzorek používají celé buňky, respektive kolonie (Čikoš aj., 2001). Templátová DNA musí být neporušená v amplifikované oblasti, musí být přítomná v dostatečném množství a nesmí být kontaminovaná látkami, které by inhibovaly PCR (Patrinos and Ansorge, 2010). Z hlediska průběhu reakce je také nezbytná přítomnost primerů. Jsou to dva oligonukleotidy dlouhé zpravidla nukleotidů, jejichž sekvence odpovídá sekvencím úseku DNA určeného k amplifikaci (Čikoš aj., 2001). V případě použití PCR na průkaz patogenních bakterií se primery vybírají tak, aby se amplifikovaly úseky DNA, které jsou specifické pro daný 27

28 mikroorganizmus, nebo kódují charakteristický protein, související s jeho patogenitou (Patrinos and Ansorge, 2010). Amplifikace DNA v PCR (obrázek 1) probíhá ve třech opakujících se krocích: Obrázek 1: Schéma polymerázové řetězové reakce (Alberts et al., 1998) Denaturace, při které dochází při teplotě kolem 95 ºC k oddělení jednotlivých vláken DNA templátu na dvě samostatná vlákna (Čikoš aj., 2001) Annealing (hybridizace), čili nasednutí primerů ke komplementární sekvenci denaturovaného templátu DNA. Probíhá za teploty ºC, v závislosti na délce a sekvenci primerů. Extenze (elongace), při níž DNA polymeráza přikládá k 3'OH konci primeru nukleotidy podle komplementární sekvence templátu. Probíhá při teplotě 72 ºC, což je optimum pro Taq DNA polymerázu (Dale et al., 2012). Denaturace, annealing a extenze tvoří jeden cyklus PCR. Jeden primer nasedá na jedno vlákno denaturovaného DNA templátu, druhý primer nasedá na druhé vlákno templátu, přičemž úsek DNA ohraničený těmito dvěma primery se amplifikuje opakováním cyklů PCR vznikne produkt PCR. PCR produkty je možné vizualizovat pomocí různých barviv reagujících s DNA, přičemž nejčastěji se používá ethidium bromid, který se včleňuje do molekuly DNA a po vystavení UV záření červeně fluoreskuje. K detekci PCR produktu je možné také použít radioaktivní nebo neradioaktivní značku zabudovanou přímo do PCR produktu 28

29 nebo hybridizační sondy specifické určitému PCR produktu. Další možností je použití imunologické detekce DNA (Čikoš aj., 2001). 3.6 Biogenní aminy Charakteristika a zdravotní aspekty Biogenní aminy (BA) jsou zásadité, dusíkaté sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a alifatickou, heterocyklickou nebo aromatickou strukturou (obrázek 2). Mezi biogenní aminy nacházené v potravinách patří histamin, tyramin, tryptamin, putrescin kadaverin, fenylethylamin, spermin a spermidin (Ruiz-Capillas et al., 2011). Putrescin, spermidin, spermin a případně i agmatin se označují jako polyaminy, neboť obsahují více aminoskupin (Larqué et al., 2007). Obrázek 2: Chemická struktura biogenních aminů (A: histamin, B: tyramin, C: fenylethylamin, D: tryptamin, E: putrescin, F: kadaverin, G: spermidin, H: spermin, I: agmatin) (Koutsoumanis et al., 2010). 29

30 BA jsou syntetizovány u mikroorganismů, rostlin i zvířat (Vidal-Carou et al., 2011). Hlavní cestou vzniku BA je dekarboxylace (odstranění α-karboxylové skupiny) volných aminokyselin specifickými enzymy. Z aminokyseliny histidinu vzniká histamin, z tyrosinu tyramin, z tryptofanu tryptamin, z lysinu kadaverin. Putrescin vzniká z aminokyseliny argininu, a to buď přes agmatin, nebo přes ornitin. Z putrescinu poté může vznikat spermin a spermidin (Danquah et al., 2012). Biogenní aminy mají významné fyziologické vlastnosti. Mohou fungovat jako hormony a neurotransmitery (histamin), podílet se na syntéze hormonů, alkaloidů, nukleových kyselin a proteinů. Významná je regulace krevního tlaku. Polyaminy jsou velmi důležité pro regeneraci buněk a hojení tkání (Karovičová and Kohajdová, 2005; Spano et al., 2010). V nadměrném množství však mohou být BA zdraví škodlivé. Normální příjem BA ze stravy je metabolizován ve střevním traktu savců detoxifikačním systémem založeným na aktivitě enzymů monoaminooxidázy (MAO), diaminoooxidázy (DAO) a histidinmethyltransferázy (HMT). Účinnost tohoto detoxikačního systému je však velice individuální a při nadměrném příjmu BA potravou detoxikační kapacita nemusí stačit (Koutsoumanis et al., 2010). Toxicita histaminu a tyraminu je zvyšována současnou konzumací alkoholu a potravin obsahujících jiné BA, zejména diaminy a polyaminy. Jejich negativní působení spočívá v odčerpání detoxikační kapacity enzymů a v následném zesílení účinku toxičtějších BA (Standarová et al., 2008). Nejznámějším a nejvíce prostudovaným biogenním aminem je histamin, který je původcem tzv. scombroid poisoning (Hungerford, 2010). Tyto otravy se týkají určitých druhů ryb spojených s vysokým obsahem histidinu a mohou se projevovat svěděním a překrvením kůže, bolestí hlavy, zvracením, žaludečními křečemi, průjmem nebo poklesem krevního tlaku v důsledku vasodilatačních účinků histaminu (VidalCarou et al., 2011). Kromě otrav z ryb byly v mnohem menší míře hlášeny i otravy histaminem z různých druhů sýrů a dokonce i z piva (Shalaby, 1996). Otravy tyraminem jsou spojovány hlavně s konzumací sýrů, proto se také nazývají jako reakce na sýr (Standarová et al., 2008). Projevují se zejména hypertenzí a bolestmi hlavy až migrénami (Ruiz-Capillas et al., 2011). Podobně jako tyramin má vasokonstrikční účinky i fenylethylamin. Putrescin a kadaverin nejsou považovány samy o sobě 30

31 za toxické, ale mohou zvyšovat toxicitu histaminu a tyraminu (Vidal-Carou et al., 2007). Jako další zdravotní riziko u BA se uvádí jejich možná přeměna na karcinogenní nitrosaminy, což se týká hlavně polyaminů. Za tepla se spermidin, spermin, kadeverin, putrescin a tyramin mohou přeměňovat na sekundární aminy, které za přítomnosti dusitanů tvoří nitrosaminy (Ruiz-Capillas et al., 2011). Předpokládá se, že tato přeměna může probíhat nejen v potravinách (např. masné výrobky s přídavkem dusitanové solící směsi), ale i v našem trávicím traktu činností střevní mikroflóry (Koutsoumanis et al., 2010) Mikroorganismy produkující biogenní aminy Pro tvorbu BA je nutná přítomnost volných aminokyselin, bakterií tvořících dekarboxylázy a podmínek, při nichž bakterie mohou růst (Kalač, 2006). Dekarboxylázy aminokyselin se u bakterií příliš nevyskytují, ale schopnost tvořit BA byla popsána pro některé mikroorganismy, a to zejména z čeledi Enterobacteriaceae, dále Pseudomonas spp. a pro bakterie mléčného kvašení, přičemž tvorba biogenních aminů není záležitosti rodů či druhů, ale spíše kmenů v rámci druhu (Landete et al., 2007). Např. gen pro produkci tyraminu se u L. brevis pravděpodobně šíří horizontálním přenosem prostřednictvím mobilního elementu (genomic island) (Coton and Coton, 2009), zatímco u Enteroccus faecalis, E. faecium a E. durans se pravděpodobně jedná o druhovou charakteristiku (Ladero et al., 2012). Významné mikroorganismy tvořící BA jsou uvedeny v Tabulce 5. Bakteriální buňky vytváří svou činností BA pro snižování intracelulárního ph, jedná se tedy o obranný mechanismus proti kyselému prostředí (Bover-Cid et al., 2008), i když některé studie naznačují, že by mohly být dekarboxylázy využívány i v alternativních cestách získávání energie. Dekarboxylázy jsou substrátově specifické, nicméně bylo prokázáno, že např. tyrosin dekarboxyláza může za určitých podmínek dekarboxylovat alanin na fenylethylamin (Pessione et al., 2009). Existují dvě různé enzymatické skupiny dekarboxyláz. První jsou dekarboxylázy, jejichž aktivní centrum je tvořeno pyridoxal-5-fosfátem a které se vyskytují u gram negativních mikroorganismů (Landete et al., 2008). Tyto mikroorganismy jsou převážně 31

32 zodpovědné za tvorbu BA v rybách, neboť se ve fermentovaných salámech běžně nepomnožují. Nicméně vyšší počáteční kontaminace a nesprávné skladování surovin mohou stejně jako nekontrolovaná fermentace vést k pomnožení bakterií čeledi Enterobacteriaceae. Dekarboxylázy uvolněné z jejich buněk v počátečních fázích výroby mohou způsobovat akumulaci BA i v dalších fázích výroby, kdy už je růst těchto bakterií zastaven (Suzi and Gardini, 2003). Zástupci čeledi Enterobacteriaceae byli jako významní producenti BA identifikováni např. u tradičních španělských fermentovaných salámů (Lorenzo et al., 2010). Tabulka 5: Mikroorganismy produkující biogenní aminy (Vidal-Carou et al., 2007). Mikroorganismus tyramin fenylethylamin tryptamin histamin putrescin kadaverin Carnobasterium divergens carnobacterium piscicola Enterococus faecalis Enterococus faecium Lactobacillus bavaricus Lactobacillus brevis Lactobacillus buchneri Lactobacillus curvatus Lactobacillushilgardi Lactobacillus plantarum Pediococcus carnosus Staphylococcus carnosus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus xylosus Staphylococcus warneri Kocuria varians Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Escherichia coli Hafnia alvei Klebsiella oxytoca Morganella morganii Serratia liquefaciens Pseudomonas spp. 32

33 Druhou enzymatickou skupinou jsou dekarboxylázy s kovalentně vázaným pyruviolem, které se vyskytují u gram pozitivních mikroorganismů, a zvláště u bakterií mléčného kvašení (Koutsoumanis et al., 2010). Právě produkce BA bakteriemi mléčného kvašení, které se ve fermentovaných salámech vyskytují ve velkém množství, představuje největší riziko. Tvorba biogenních aminů byla prokázána u celé řady izolátů ze skupiny bakterií mléčného kvašení, izolovaných ze spontánně fermentovaných masných výrobků, včetně druhů, jejichž zástupci se používají jako startovací kultury (Ruiz-Capillas et al., 2011). Predominantními druhy BMK ve fermentovaných masných výrobcích jsou Lactobacillus sakei a Lactobacillus curvatus. Zatímco kmeny L. sakei nebývají schopny dekarboxylovat aminokyseliny, u kmenů L. curvatus je tato schopnost poměrně častá (BoverCid et al., 2008). Za velmi významné producenty tyraminu jsou mezi BMK považovány enterokoky (Bhardwaj et al., 2009). Naopak koky z čeledi Micrococcaceae se obvykle vyznačují slabou nebo vůbec žádnou dekarboxylázovou aktivitou (Vidal-Carou et al., 2007). Podíl koaguláza negativních stafylokoků schopných produkovat detekovatelné množství BA představoval v několika studiích fermentovaných salámů jen 6 14 % (Even et al., 2010; Latorre-Moratalla et al., 2010a; Martín et al., 2006). Seitter et al. (2011) zaznamenali vyšší výskyt aminogenních kmenů u S. carnosus než u S. xylosus Výskyt BA ve fermentovaných salámech BA se v potravinách vyskytují především jako produkty činnosti mikroorganismů. Proto jsou obsaženy hlavně ve fermentovaných potravinách, např. fermentovaných salámech, mléčných výrobcích, pivu, vínu či kysaném zelí (Danquah et al., 2012; Garcia-Marino et al., 2010; Ozdestan and Uren, 2010). Zvýšené koncentrace BA byly nalezeny vedle ryb např také v čokoládě, oříšcích, ovoci a zelenině (Shalaby, 1996; Suzzi and Gardini, 2003). U nefermentovaných potravin jsou BA (hlavně kadaverin a putrescin) především indikátorem nežádoucí mikrobiální činnosti (Karovičová and Kohajdová, 2005). V případě skladování potravin může být obsah BA ukazatelem jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny během výrobního procesu a skladování (Latorre-Moratalla et al., 2008). Fermentované salámy jsou často kontaminovány biogenními aminy, neboť během fermentace představuje mikrobiální růst, nízké ph a proteolýza vhodné podmínky 33

34 pro jejich tvorbu (Bover-Cid et al., 2001). Klíčový je již výběr hygienicky kvalitní suroviny (Latorre-Moratalla et al., 2008). Jediné aminy vyskytující se ve významném množství v čerstvém mase jsou spermin a spermidin a v menší míře putrescin. Vysoké koncentrace putrescinu a dalších biogenních aminů jsou spojovány s mikrobiálním růstem až kažením masa (Suzzi and Gardini, 2003). Ve fermentovaných salámech je jako hlavní amin vytvářen tyramin, a to již v prvních týdnech fermentace zároveň s poklesem ph. Naopak tvorba putrescinu nastupuje později a pozvolna a finální koncentrace bývají nižší než u tyraminu. Tvorba fenylethylaminu je mnohem méně výrazná a obvykle začíná až ve druhé polovině zracího procesu, kdy už jsou bakterie ve stacionární fázi růstu nebo odumírají (Bover-Cid et al., 2008). Kvantitativně se BA ve fermentovaných salámech vyskytují v množství od nuly až po několik set mg kg-1 (Vidal-Carou et al., 2007), a to v závislosti na mnoha faktorech Faktory ovlivňující výskyt BA ve fermentovaných salámech Tvorba biogenních aminů ve fermentovaných salámech je komplexní záležitost, která může být ovlivněna celou řadou faktorů, jako je úroveň mikrobiální kontaminace, použití startovacích kultur a faktory prostředí ovlivňující růst mikroorganismů (RuizCapillas et al., 2011). Prvním předpokladem je přítomnost prekurzorů, tedy volných aminokyselin. Ty jsou uvolňovány činností endogenních a mikrobiálních proteáz (Koutsoumanis et al., 2010). Aro Aro et al. (2010) zkoumali množství aminokyselin v průběhu zrání a zjistili, že ve srovnání s kontrolou obsahovaly salámy se startovací kulturou méně volných aminokyselin včetně argininu, histaminu a lysinu. Nejmenší obsah volných aminokyselin vykazovaly salámy se směsí Pediococcus pentosaceus a Staphylococcus xylosus, i když S. xylosus při samostatném přídavku množství aminokyselin neovlivňoval. Účinná byla i kombinace Lactobacillus sakei a S. carnosus. Použití vhodných startovacích kultur potlačujících rozvoj mikroorganismů s dekarboxylační aktivitou vedlo v mnoha studiích ke snížení tvorby BA. V závislosti na použité kultuře, druhu salámu a sledovaném BA bylo dosaženo poklesu až o 95 % (Bover-Cid et al., 2000; Talon et al., 2008; Latorre-Moratalla et al., 2010a; Lu et al., 34

35 2010). Kromě potlačení růstu dekarboxyláza pozitivních mikroorganismů byla u některých kmenů BMK také prokázána schopnost degradace BA in vitro (Chong et al., 2011). Během oxidativní deaminace BA vznikají aldehydy, peroxid vodíku a amoniak. Tyto enzymy mají optimum při 37 C a neutrálním až mírně zásaditém ph (Koutsoumanis et al., 2010). Z fyzikálně-chemických parametrů se diskutuje zejména vliv ph, aktivity vody, obsahu soli či dalších aditiv, teplota a relativní vlhkost při zrání. Tyto faktory ovlivňují tvorbu BA převážně prostřednictvím potlačení rozvoje dekarboxyláza pozitivních mikroorganismů (hlavně čeledi Enterobacteriaceae). Na druhou stranu ph a teplota ovlivňují přímo enzymatickou aktivitu dekarboxyláz. Dekarboxylázová aktivita je obvykle silnější při nižším ph, jako optimum se uvádí ph 4,0 5,5. Nižší ph také bude indukovat tvorbu dekarboxyláz jako obranný mechanismus. Zároveň však rychlé okyselení inhibuje růst Enterobacteriaceae a tím i přítomnost dekarboxyláz (Koutsoumanis et al., 2010). Podobně rozporuplný může být i vliv teploty. Pro spontánně fermentované salámy obvykle platí, že čím delší je doba zrání a čím vyšší teplota a relativní vlhkost, tím vyšší bude obsah BA (LatorreMoratalla et al., 2010b). Na druhou stranu vyšší teploty při zrání (kolem 24 C) umožní startovací kultuře rychleji přerůst ostatní, aminogenní mikroorganismy (Suzi and Gardini, 2003). Také byl potvrzen vliv kalibru salámu na tvorbu BA, kdy u výrobků s větším průměrem bývá detekován vyšší obsah biogenních aminů, zřejmě díky rozdílům v redox potenciálu, obsahu soli a aktivitě vody. Obdobně ve středu výrobku bývá vyšší koncentrace BA než v okrajových částech, které jsou více a rychleji vysušené a vykazují tak i vyšší koncentraci soli (Bover-Cid et al., 1999; Komprda et al., 2009; LatorreMoratalla et al., 2010b) Legislativa Toxické dávky BA je obtížné stanovit. Velmi záleží na individuálních rozdílech mezi lidmi, zastoupení jednotlivých BA v potravině, množství konzumované potraviny a přítomnosti jiných potencujících složek, jakými jsou například alkohol nebo léky 35

36 (Chong et al., 2011). Příjem histaminu v množství 5 10 mg už může vyvolat problém u některých citlivých jedinců, 10 mg je považováno za přijatelný limit, 100 mg vyvolává mírnou toxicitu a 1000 mg je již vysoce toxických (Karovičová and Kohajdová, 2005). V současnosti je v ČR platný pouze limit pro obsah histaminu v rybách a výrobcích z ryb spojovaných s vysokým množstvím histidinu, uváděný v Nařízení komise (ES) č. 2073/2005, v platném znění. Základní limit je 100 mg kg-1 (resp. 200 mg kg-1 u výrobků, které enzymaticky zrály v láku), přičemž 2 vzorky z 9 mohou obsahovat až dvojnásobné množství. Například v USA používají konzervativnější limit 50 mg kg-1 v reprezentativním vzorku (Hungerford, 2010). Rauscher-Gabernig et al. (2009) navrhli používat v EU limity pro histamin 500 mg kg-1 v salámech a 400 mg kg-1 v sýrech Detekční metody K identifikaci a kvantifikaci BA v potravinách se používají zejména chromatografické metody, a to zvláště HPLC (v reverzní fázi). Lze však použít i chromatografii na tenké vrstvě, plynovou chromatografii nebo ultra HPLC (Latorre-Moratalla et al., 2009). Existují i enzymatické, spektrofotometrické a imunologické metody stanovení, zvláště pro histamin (Vidal-Carou et al., 2011). Při výběru vhodné metody je třeba zohlednit především analyzovanou matrici. Chromatografické stanovení BA v potravinách zahrnuje jako hlavní kroky extrakci z matrice, derivatizaci, separaci a detekci (Komprda a Dohnal, 2010). Zvláště extrakce a derivatizace jsou při stanovení BA klíčové. Pro extrakci BA z potravin bylo navrženo použití kyseliny chloristé (0,4 0,6 M), kyseliny trichloroctové (5 10 %) a kyseliny chlorovodíkové (Karovičová and Kohajdová, 2005). Kyselina chlorovodíková však není vhodná k analýze ryb a masa (De Mey et al., 2012). Smělá a kol. (2004) porovnávali obě zbývající extrakční činidla a největší výtěžnost byla pro fermentované salámy dosažena po trojnásobné extrakci 5% kyselinou trichloroctovou. Dalším specifickým krokem je derivatizace. Většina BA není schopna dostatečné absorpce, ani nevykazuje významnou fluorescenci, a právě pomocí derivatizace se dosáhne citlivosti potřebné pro UV/VIS i fluorescenční detekci (De Mey et al., 2012). Nejčastěji se používají dansylchlorid, dabsylchlorid, benzoylchlorid a o-ftaldialdehyd, ale lze použít i řadu 36

37 dalších látek (Vidal-Carou et al., 2009). Ftalaldehyd nereaguje se sekundárními aminy a nelze ho tedy použít pro stanovení sperminu a spermidinu (Smělá a kol., 2004). Pro prevenci vzniku BA ve fermentovaných salámech je také klíčová včasná detekce mikroorganismů produkujících BA. Může zahrnovat průkaz tvorby BA ve speciálních kultivačních médiích, nebo ještě lépe průkaz přítomnost genů kódujících dekarboxylázy v genomu bakterie (Spano et al., 2010). Geny kódující histidin dekarboxylázu, lyzin dekarboxylázu, tyramin dekarboxylázu a ornithin dekarboxylázu se nazývají hdc, ldc, tdc a odc (v literatuře je možné najít i označení hisdc, tyrdc, hisdc, tyrdc apod.). Histidin dekarboxyláza, lysin dekarboxyláza a ornithin dekarboxyláza jsou různé u gram pozitivních a u gram negativních mikroorganismů, proto se u těchto skupin používají jiné sety primerů (Landete et al., 2007). Bylo také vyvinuto několik protokolů multiplex PCR pro současnou detekci hdc a tdc (Coton and Coton, 2005), hdc, tdc a odc (De las Rivas et al., 2005; Marcobal et al., 2005) nebo všech čtyř genů (De las Rivas et al., 2006). 37

38 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál Výroba salámů V rámci této práce byly použity trvanlivé tepelně neopracované (fermentované) salámy ze dvou výrobních závodů v České republice. V rámci běžné výrobní praxe za dodržení hygienických a skladovacích podmínek vyrobil každý výrobce od každého typu výrobku čtyři várky díla o hmotnosti 25 kg. Receptura obou výrobců byla následující: Na 100 kg hotového výrobku bylo použito 162 kg masa. Základní surovinou bylo vepřové maso a sádlo (80 %) a libové hovězí maso (20 %). Dále byla při výrobě použita dusitanová solící směs obsahující 0,9 % dusitanu sodného (2,5 %), směs koření (1,7 %), dextróza (1 %), antioxidant isoaskorban sodný (E 316) a mikrobiální kultury. Salámy byly vyrobeny s použitím dvou různých kořenících směsí (směs typická pro salám Herkules a směs typická pro salám Paprikáš). Od každého typu výrobku byly vyrobeny čtyři várky, každá s jinou kombinací startovací a probiotické kultury. Jako startovací kultura (0,5 g kg-1) byl přidáván Pediococcus pentosaceus (AS-3/100, Chr. Hansen, Dánsko) nebo směs Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus (FU-2, Alfred Willich, Německo). Probiotickou kulturu představoval kmen Lactobacillus casei BGP 93 (Sacco, Itálie) v množství 106 KTJ g-1 díla nebo kmen Lactobacillus casei 431 (Chr. Hansen, Dánsko) ve stejném množství. Směs mraženého sádla, masa a ostatních přísad byla po rozmělnění a smíchání na kutru naražena do kutisinových střev o průměru 45 mm. Fermentace a zrání probíhalo první den při 27 C a relativní vlhkosti vzduchu 92 %, dále po dobu jedenácti dnů při 20 C a relativní vlhkosti 85 % s přívodem studeného kouře a následovalo dosoušení po dobu šestnácti dnů (12 C, relativní vlhkost 70 %). Celková doba zrání tedy byla 28 dní Přístroje a pomůcky Anaeroboxy (Merck, Německo) 38

39 AnaeroGen (Merck, Německo) Autokláv Sanyo MLS-3750/3780 (Schoeller instruments, Česká republika) AW SPRINT TH-500 (Novasina, Švýcarsko) Běžné sterilní laboratorní sklo a pomůcky Centrifuga Hettich Universal 32R (Hettich, Německo) Chromatograf HP 1100 (Agilent Technologies, USA) Fotoaparát HP Photosmart R 707 (Hewlett-Packard, USA) Homogenizátor (Fabrilabo, Francie) Horizontální elektroforéza Midigel II (Apelex, Francie) Kapalinový chromatograf HP 1100 (Agilent technologies, Wilmington, USA) Kombinovaná chladnička s mrazákem (Scholler, Německo) Laboratorní váhy (Schoeller instruments, Česká republika) MS2 Minishaker (IKA Werke, Německo) Mikropipety (Biotech, Česká republika) Mikroskop Olympus BX50 (Olympus, Japonsko) Mixer (Moulinex, Francie) Nylonový membránový filtr (Chromatography Research Supplies, Addison, USA) ph-metr WTW ph 95 (Weilheim, Německo) Ponorný mixer (Heidolph Diax 900, Německo) Stomacher (Schoeller instruments, Česká republika) Termocyklátor PTC-150HB ( MJ Research, Waltham, USA) Termostat Sanyo (Schoeller instruments, Česká republika) Transluminátor (Vilber Laurmat, Francie) Vodní lázeň Julabo TW 20 (Schoeller instruments, Česká republika) Vortex (neolab Migge, Německo) 39

40 Zdroj stejnosměrného proudu (Omni-Bio, Česká republika) Roztoky a kultivační půdy Roztoky Roztok pro agarózovou gelovou elektroforézu TBE pufr připravíme naředěním ze zásobního roztoku 5 x TBE, ph 8,3 Tris(hydroxymethyl)aminomethane 54,0 g/l Kyselina boritá 27,5 g/l EDTA 3,72 g/l Destilovaná voda 1000 ml Ředící roztok Pepton 1,0 g/l Chlorid sodný 8,5 g/l Destilovaná voda 1000 ml Vše se dobře rozpustí za stálého míchání. Sterilizujeme v autoklávu 20 minut při teplotě 121 C. Dekarboxylační médium Trypton 5,0 g/l Kvasničný extrakt 5,0 g/l Masový extrakt 5,0 g/l NaCl 2,5 g/l Glukóza 2,0 g/l Twenn 80 1,0 g/l MgSO4 0,2 g/l MnSO4 0,05 g/l 40

41 FeSO4 0,04 g/l Citrát amonný 2,0 g/l Thiamin 0,01 g/l K2PO4 2,0 g/l CaCO3 0,1 g/l Pyridoxal-5-fosfát 0,05 g/l Bromcresol pyrole 0,06 g/l Agar 20,0 g/l Použité aminokyseliny v dekarboxylačním médiu L-tyrosin 1 % disodné soli (Sigma, Francie) 10 g/l Volná báze L-histidinu (Calbiochem, Kanada) 10 g/l Kultivační půdy Plate count agar (Noack, Francie) Trypton 5,0 g/l Kvasničný extrakt 2,5 g/l Glukóza 1,0 g/l Bakteriologický agar 12,0 g/l 20,5 g přípravku bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Sterilizace proběhla v autoklávu při 121 C po dobu 20 minut. MRS agar (Noack, Francie) Pepton 10,0 g/l Masový extrakt 10,0 g/l Kvasničný extrakt 5,0 g/l Glukóza 20,0 g/l 41

42 Tween 80 1,08 g/l Difosfát sodný 2,0 g/l Octan sodný 5,0 g/l Citrát sodný 2,0 g/l Sulfid hořčíku 0,2 g/l Sulfid manganu 0,05 g/l Bakteriologický agar 15,0 g/l 70,3 g dehydratované půdy bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Sterilizace v autoklávu proběhla při 121 C po dobu 20 minut. MRS agar s přídavkem moxalactamu (Noack, Francie) K 1000 ml sterilního MRS agaru připraveného dle výše uvedeného postupu a zchlazeného na teplotu 45 C bylo přidáno antibiotikum moxalactam (Sigma Aldrich, Německo) v množství 112 mg. Agar s kanamycinem a azidem sodným (Merck, Německo) Pepton z kaseinu 20,0 g/l Kvasničný extrakt 5,0 g/l Chlorid sodný 5,0 g/l Citrát sodný 1,0 g/l Azid sodný 0,15 g/l Kanamycin sulfát 0,002 g/l Eskulin 1,0 g/l Citrát železito-amonný 0,5 g/l Agar 15,0 g/l 47,5 g dehydratované půdy bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Sterilizace proběhla v autoklávu při teplotě 121 C po dobu 20 minut. 42

43 Komponenty a chemikálie pro PCR Bromfenolová modř MBI Fermentas, Kanada EDTA SERVA, Německo Ethidium bromid SERVA, Německo GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder MBI Fermentas, Kanada PCR agaróza SERVA, Německo Pufr 10 x loading pufr MBI Fermentas, Kanada Qiagen HotStar Master Mix Qiagen, Německo Taq DNA polymeráza Qiagen, Německo Voda pro injekce B. Braun Melsungen AG, Německo 4.2 Metodika Skladování a odběr vzorků Salámy byly po výrobě převezeny na Ústav technologie potravin Mendelovy univerzity, kde byly skladovány při teplotě 15 C po dobu 21 dní (až do 49. dne po naražení výrobku). Odběry vzorků probíhaly 0., 14., 28. a 49. den po naražení salámů. Vzorky byly od výrobců dopravovány do laboratoře v transportních chladicích boxech. Každá z provedených analýz byla provedena ve dvou opakováních. Odběr vzorků na mikrobiologické vyšetření proběhl v souladu s ČSN EN ISO Pro mikrobiologické vyšetření bylo za sterilních podmínek odebráno 10 g vzorku ze středu salámu a po dobu 90 sekund homogenizováno s 90 ml sterilního fyziologického roztoku ve Stomacheru. Po odběru vzorku na mikrobiologické vyšetření bylo odebráno 150 g vzorku na stanovení obsahu biogenních aminů. Do doby analýzy BA byly vzorky uchovávány v tmavých prachovnicích při -18 C. Zbývající část salámu byla použita pro stanovení ph a vodní aktivity. 43

44 V průběhu pokusu byl sledován vliv vybraných faktorů (výrobce, použitá kořenící směs, startovací kultury, probiotické kultury, doba zrání/skladování) na relevantní ukazatele (mikrobiologické, chemické, fyzikální) Mikrobiologická analýza U vzorků bylo prováděno stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM), počtu bakterií mléčného kvašení (BMK), Lactobacillus casei a enterokoků. Vyšetření se provádělo zalitím 1 ml inokula v Petriho misce příslušným živným médiem. Pro inokulaci byla použita dvě po sobě jdoucí desetinásobná ředění a z každého ředění byly připraveny dvě misky. Stanovení CPM se provádělo podle normy ČSN ISO 2293 Stanovení celkového počtu mikroorganismů, a to na půdě Plate Count Agar, inkubace aerobně 30 C/72 h. Stanovení BMK se provádělo podle ČSN ISO Stanovení počtu bakterií mléčného kvašení, a to na půdě MRS agar, inkubace anaerobně 30 C/72 h. Počty L. casei byly stanovovány podle Kröckela (2006) na půdě MRS s moxalactamem a konfirmovány pomocí PCR. Inkubace probíhala v anaerostatu při 37 C/72 h. Enterokoky byly stanovovány na půdě s kanamycinem, eskulinem a azidem sodným (KEAA), inkubace aerobně při 37 C/48 h Metoda stanovení biogenních aminů a polyaminů Do 85 ml zkumavek bylo naváženo vždy 10 g vzorku, ke kterému bylo přidáno 0,5 ml vnitřního standardu (1,7-diaminoheptan v koncentraci 1 mg ml-1). Vzorky byly homogenizovány s přídavkem 15 ml 5 % kyseliny trichloroctové (TCA) po dobu 2 minut. Vzniklá suspenze byla centrifugována po dobu 15 minut a následně filtrována přes papírový filtr. Supernatant byl filtrován přes papírový a vzniklý pevný podíl byl opět extrahován. Supernatant byl doplněn na objem 50 ml deionizovanou vodou a zfiltrován přes jednorázový nylonový membránový filtr (13 mm, 0,45 μl). Extrakt byl derivatizován dansylchloridem (5-dimethylaminonaphtalen-1-sulfonylchlorid, DCl). Derivatizační činidlo bylo připraveno rozpuštěním 5 mg dansylchloridu v 1 ml acetonu. Postup derivatizace: K 1 ml extraktu bylo přidáno 0,5 ml nasyceného Na2CO3 (ph 11,2). Derivatizační činidlo v množství 1 ml a směs byla promíchána 1 minutu. 44

45 Derivatizace probíhala 1 hodinu při 40 C bez přístupu světla. Deriváty aminů byly extrahovány diethyletherem (3 x 1 ml). Organická fáze byla odpařena do sucha dusíkem a odparek byl rozpuštěn v 0,5 ml acetonitrilu (ACN). Roztok byl zfiltrován přes nylonový membránový filtr 0,45 μm a nastříknut na chromatografickou kolonu. Biogenní aminy byly separovány pomocí kapalinové chromatografie HP Chromatograf byl složen z kvartérní pumpy (G1311A), vakuového degazeru (G1322A), autosampleru (G1313A) a UV/VIS detektoru s proměnnou vlnovou délkou (G1314A). Separace po derivatizaci DCl byla provedena pomocí gradientové eluce s H2O/ACN (čas 0 23 minut: H2O 35 0 %, ACN %) na koloně Zorbax Elipse XDB C18 (150 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) s předkolonou Meta Gard ODS-2 (30 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) při průtoku 0,8 ml min.-1 s použitím fotometrického UV/VIS detektoru při 254 nm. Separované biogenní aminy byly porovnáním retenčních časů se standardem BA po derivatizaci DCl (všechny standardy BA byly dodány jako hydrochloridy) a jejich koncentrace po DCl derivatizaci vyjádřeny v mg kg-1 původního (čistého) vzorku (nikoli na kg sušiny) pro lepší vyjádření podmínek konzumace (Latorre-Moratalla et. al., 2008). Koncentrace BA ve vzorku byla upravená metodou vnitřního standardu (Komprda a kol., 2004) Stanovení ph a vodní aktivity Měření ph bylo prováděno ph metrem WTW ph 95 vybaveným vpichovou elektrodou. Stanovení vodní aktivity bylo provedeno podle ČSN ISO Stanovení vodní aktivity, a to na přístroji AW SPRINT TH Testování tyrosindekarboxylázové a histidindekarboxylázové aktivity u startovacích kultur a kmenů L. casei v dekarboxylačním médiu (DCM) Přečištěné probiotické a startovací kultury (kultura Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus byla testována jako celek) byly inokulovány do tekutého dekarboxylačního média (DCM; podle autorů Bover-Cid and Holzapfel, 1999), které obsahovalo 1 % disodné soli tyrosinu a volnou bázi histidinu. Všechny izoláty byly inokulovány duplicitně v DCM s a bez (negativní kontrola) tyrosinu a histidinu 45

46 a inkubovány 4 dny při 37 C. Izoláty byly vyhodnoceny jako DCM pozitivní v případě barevné změny média ze žluté na fialovou. Do skleněné reagenční láhve o objemu 1 litr byly naváženy komponenty uvedené v rozpisu pro dekarboxylační médium (vyjma aminokyselin). Získaná směs byla rozpuštěna v litru destilované vody. Poté byla směs vložena do autoklávu, kde následně proběhla sterilace při teplotě 121 C po dobu 20 minut. Po ochlazení bylo ph směsi upraveno sterilními roztoky (0,1 M HCl a 0,1 M NaOH) na 7,4. Poté byly aminokyseliny předem rozpuštěné v 0,1 mol/l sterilní HCl přefiltrovány a opět bylo upraveno ph na 7,4 sterilními roztoky 0,1M NaOH nebo 0,1 M HCl Konfirmace schopnosti izolátů startovacích kultur a probiotických kmenů L. casei produkovat tyramin a histamin v DCM metodou HPLC Po inkubaci v DCM byly vzorky centrifugovány při ot./min po dobu 3 minuty při 4 C; 1 ml supernatantu byl smíchán s 1 ml 0,1 M HCl a 20 μl vnitřního standardu 1,7-diaminoheptan, roztok byl odstředěn na mini míchadle a znovu centrifugován. Supernatant byl filtrován přes nylonovou membránu (13 mm, 0,45 μl). Derivatizace probíhala 1 hodinu bez přístupu světla při 40 C a deriváty aminů byly extrahovány diethyletherem (3 x 1 ml). Organická fáze byla odpařena do sucha dusíkem a odparek byl rozpuštěn v 0,5 ml acetonitrilu. Roztok byl zfiltrován přes nylonový membránový filtr 0,45 μm a nastříknut na chromatografickou kolonu. Biogenní aminy byly separovány pomocí kapalinové chromatografie HP 1100 složeného z kvartérní pumpy (G1311A), vakuového degazeru (G1322A), autosampleru (G1313A) a UV/VIS detektoru s proměnnou vlnovou délkou (G1314A). Separace po derivatizaci DCl byla provedena pomocí gradientové eluce s H2O/ACN (čas 0 23 minut: H 2O 35 0 %, ACN %) na koloně Zorbax Elipse XDB C18 (150 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) s předkolonou Meta Gard ODS-2 (30 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) při průtoku 0,8 ml min.-1 s použitím fotometrického UV/VIS detektoru při 254 nm. Separované biogenní aminy byly porovnáním retenčních časů se standardem BA po derivatizaci DCl a jejich koncentrace po DCl derivatizaci byly vyjádřeny v mg kg-1 původního (čistého) vzorku (nikoli na kg sušiny) pro lepší vyjádření podmínek 46

47 konzumace, Latorre-Moratalla et al., 2008). Koncentrace BA ve vzorku byla upravená metodou vnitřního standardu (Komprda et al., 2004) Screening izolátů startovacích a probiotických kultur na přítomnost DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu a histidindekarboxylázu DNA byla izolována z kolonií startovacích a probiotických kultur podle autorů Sambrook and Russell (2001). PCR byla provedena s konečným objemem 25 μl obsahujícím přibližně 10 ng genomové DNA, 10 pmol primerů, 1U Taq DNA polymerázy a odpovídající množství Qiagen Hotstar Master Mix. Pro detekci tyrdc a hdc byly použity následující primery (Coton and Coton, 2005): TD2 (5`ACATAGTCAACCATRTTGAA-3`)/TD5 (5`-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG- 3`) a HDC3 (5`- GATGGTATTGTTTCKTATGA-3`)/HDC4 (5`-CAAACACCAGCAT CTTC -3`). DNA byla kompletně denaturovaná inkubací při 94 C po dobu 15 min. a následně amplifikována ve 30 cyklech (denaturace při 95 C po dobu 45 s., hybridizace primerů při 52 C po dobu 45 s., a syntéza komplementárního DNA řetězce při 72 C po dobu 75 s. pomocí termocyklátoru). V posledním amplifikačním kroku byly vzorky inkubovány při 72 C po dobu 10 min. pro kompletní prodloužení finálních produktů PCR. Po PCR byly amplifikované fragmenty DNA separovány pomocí agarosové gelové elektroforézy Konfirmace L. casei metodou PCR Suspektní kolonie L. casei izolované na MRS agaru s přídavkem moxalactamu byly konfirmovány metodou PCR podle metodiky Španová a kol. (2009). Primer Sekvence FcaselS 5 CTA TAA GTA AGC TTT GAT CCG GAG ATT T 3 RcaselS 5 CTT CCT GCG GGT ACT GAG ATG T 3 Všechny složky PCR směsi byly důkladně promíchány, krátce centrifugovány a umístěny do termocykleru. Podmínky amplifikace byly následující: denaturace DNA 95 C/30 s., hybridizace primerů 54 C/30 s. a syntéza komplementárního řetězce 72 C/60 s. 47

48 Před prvním cyklem byla směs zahřívána při 95 C/5 min.; v posledním cyklu byla syntéza řetězce při 72 C prodloužena na 7 min. Amplifikace proběhla v 30 cyklech. Poté byla reakční směs analyzována pomocí 1,5 % agarosové gelové elektroforézy. Při detekci PCR produktu (132 bp) byl použit velikostní standard DNA ( bp Ladder) Statistické zpracování výsledků Jednotlivé ukazatele byly měřeny ve dvou opakováních u každého vzorku salámu. Zprůměrované hodnoty byly použity následně ve statistickém vyhodnocení. Pro statistickou analýzu počtů mikroorgasnimů byly použity hodnoty vyjádřené v logaritmech KTJ g-1. Hodnoty u vzorků bez přídavku probiotických kultur, které byly v této práci použity pro srovnání, byly získány z paralelního pokusu, který probíhal za stejných podmínek (Sládková, 2010). Výsledky byly zpracovány počítačovým programem Statistica 8 (StatSoft Inc., USA). Pro statistické vyhodnocení vlivu sledovaných faktorů byla použita jednofaktorová ANOVA a následně provedena post-hoc analýza Duncanovým testem. Změny v koncentracích BA a v počtech sledovaných skupin mikroorganismů v průběhu zrání a skladování byly vyhodnoceny regresní analýzou. Testována byla průkaznost lineárního respektive kvadratického členu v celém průběhu zrání/skladování. 48

49 5 VÝSLEDKY 5.1 Vliv vybraných faktorů na koncentraci biogenních aminů v průběhu zrání a skladování fermentovaných salámů V rámci této práce byl hodnocen vliv výrobce, použité kořenící směsi, startovací kultury a probiotické kultury. Koncentrace biogenních aminů byly stanovovány metodou HPLC s UV detekcí u vzorků odebraných 0., 14., 28. a 49. den po naražení. U vzorků odebraných ihned po naražení a 14. den po naražení nebyly prokázány statisticky významné rozdíly (P > 0,05) mezi výrobci K a R, použitou kořenící směsí a přidanými startovacími kulturami z hlediska koncentrace histaminu. Počáteční hodnoty se pohybovaly pouze mezi 0 0,097 mg kg -1. Na konci doby zrání (obrázek 3) a skladování (obrázek 4) byly zaznamenány nižší koncentrace histaminu u salámů výrobce K ve srovnání s výrobcem R, nižší koncentrace u salámů se startovací kulturou Pediococcus pentosaceus a dále nižší koncentrace u salámů s přídavkem probiotik ve srovnání s kontrolou. Obrázek 3: Vliv vybraných faktorů na koncentraci histaminu na konci doby zrání (28. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) 49

50 Statisticky významné rozdíly byly zaznamenány především mezi jednotlivými startovacími kulturami 49. den (P < 0,01). Obrázek 4: Vliv vybraných faktorů na koncentraci histaminu na konci doby skladování (49. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) Koncentrace tyraminu se podobně jako u histaminu 0. den statisticky významně nelišila (P > 0,05) mezi salámy od dvou různých výrobců s odlišnou kořenící směsí a použitými startovacími kulturami, pouze počáteční koncentrace byly značně vyšší než u histaminu a pohybovaly se v rozmezí 2,18 8,13 mg kg-1. Zatímco u použité kořenící směsi byly naměřeny podobné hodnoty po celou dobu pokusu, již od 14. dne byly zaznamenány statisticky významné rozdíly mezi výrobci K a R (P < 0,05), jak je patrno na obrázcích 5 a 6. V průběhu skladování se také zvětšoval rozdíl mezi použitými startovacími kulturami, kdy salámy se startovací kulturou Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus vykazovaly obecně vyšší koncentrace tyraminu než salámy s kulturou Pediococcus pentosaceus. Statisticky významný rozdíl byl zaznamenán na konci doby skladování (P < 0,01). Koncentrace tyraminu na konci pokusu dosahovala nejvyšších hodnot ze všech sledovaných biogenních aminů a u všech kontrolních skupin přesáhla hodnotu 200 mg kg-1. 50

51 Obrázek 5: Vliv vybraných faktorů na koncentraci tyraminu na konci doby zrání (28. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C,D průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) U všech sledovaných parametrů byly zvláště na konci doby skladování zjištěny statisticky významné rozdíly mezi kontrolou a salámy s přídavkem probiotik (P < 0,05), jak je patrné z obrázku 6. 51

52 Obrázek 6: Vliv vybraných faktorů na koncentraci tyraminu na konci doby skladování (49. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C,D průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) Koncentrace 2-fenylethylaminu byla již od 0. dne statisticky vyšší u salámů od výrobce R než u salámů výrobce K (P < 0,01). Vliv použitého koření ani přidané startovací kultury na obsah 2-fenylethylaminu nebyl prokázán po celou dobu pokusu. Koncentrace 2-fenylethylaminu na konci zrání a na konci skladování jsou znázorněny v obrázcích 7 a 8. 52

53 Obrázek 7: Vliv vybraných faktorů na koncentraci 2-fenylethylaminu na konci doby zrání (28. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) Obrázek 8: Vliv vybraných faktorů na koncentraci 2-fenylethylaminu na konci doby skladování (49. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) 53

54 Koncentrace kadaverinu byla 0. den srovnatelná s koncentrací tyraminu, v průběhu pokusu však nedošlo k tak významnému nárůstu, jak je patrno z obrázků 9 a 10. Po celou dobu pokusu byl zaznamenáván statisticky významný rozdíl (P < 0,01) mezi použitými startovacími kulturami, kdy salámy se startovací kulturou Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus vykazovaly obecně vyšší koncentrace kadaverinu než salámy s kulturou Pediococcus pentosaceus. Již od 0. dne byl také patrný rozdíl mezi výrobci; na rozdíl od jiných biogenních aminů byl však vyšší obsah kadaverinu zjišťován u salámů výrobce K. Salámy s přídavkem probiotik vykazovaly nižší koncentrace kadaverinu než salámy bez přídavku probiotik (kontrola); tento rozdíl byl však statisticky významný (P < 0,05) až na konci doby skladování (obrázek 10). Obrázek 9: Vliv vybraných faktorů na koncentraci kadaverinu na konci doby zrání (28. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) 54

55 Obrázek 10: Vliv vybraných faktorů na koncentraci kadaverinu na konci doby skladování (49. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C,D průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) Koncentrace putrescinu dosahovaly po tyraminu druhých nejvyšších hodnot (viz obrázky 11 a 12). Vliv sledovaných faktorů byl v průběhu zrání a skladování značně proměnlivý. Rozdíl mezi výrobci K a R (vyšší koncentrace u salámů výrobce K) byl statisticky průkazný pouze u salámů testovaných ihned po naražení (P < 0,05), v dalších odběrech už dosahovaly salámy obou výrobců podobných hodnot. Naopak rozdíly mezi použitou startovací kulturou a rozdíly mezi kořením se projevily až od 14., respektive 28. dne po naražení. 55

56 Obrázek 11: Vliv vybraných faktorů na koncentraci putrescinu na konci doby zrání (28. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) Obrázek 12: Vliv vybraných faktorů na koncentraci putrescinu na konci doby skladování (49. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) 56

57 Koncentrace ostatních polyaminů sperminu a spermidinu se v průběhu zrání a skladování salámů snižovala. U sperminu byl opět patrný rozdíl mezi použitými startovacími kulturami, který však nebyl statisticky průkazný (P > 0,05). Významné byly rozdíly mezi výrobci K a R 49. den a rozdíly mezi použitým kořením 28. den (P < 0,05). Hodnoty sperminu ve 28. a 49. den po naražení jsou uvedeny v obrázcích 13 a 14. Obrázek 13: Vliv vybraných faktorů na koncentraci sperminu na konci doby zrání (28. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) 57

58 Obrázek 14: Vliv vybraných faktorů na koncentraci sperminu na konci doby skladování (49. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) U koncentrací spermidinu byl opět patrný vliv použité startovací kultury, který byl však statisticky průkazný pouze 14. den pokusu (P < 0,05). Vliv kořenící směsi na obsah spermidinu nebyl zaznamenán v celém průběhu pokusu. Salámy výrobce K vykazovaly stejně jako u sperminu vyšší koncentrace než salámy výrobce R, tento rozdíl byl však statisticky významný (P < 0,05) pouze na konci skladování (49. den). Hodnoty spermidinu ve 28. a 49. den po naražení jsou uvedeny v obrázcích 15 a

59 Obrázek 15: Vliv vybraných faktorů na koncentraci spermidinu na konci doby zrání (28. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A průměry označené stejnými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně neliší (P > 0,05) Obrázek 16: Vliv vybraných faktorů na koncentraci spermidinu na konci doby skladování (49. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) 59

60 V obrázcích 17 a 18. jsou zobrazeny hodnoty celkové sumy sledovaných aminů na konci doby zrání (28. den) a na konci doby skladování (49. den). Mezi dvěma odlišnými výrobci nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl v celkovém obsahu biogenních aminů (P > 0,05), jak je patrné z předchozích grafů, některé aminy se vyskytovaly ve větší míře v salámech výrobce K (kadaverin, spermin, spermidin), jiné zase v salámech výrobce R (histamin, tyramin, 2-fenylethylamin). Naopak významné rozdíly byly po celou dobu pokusu zaznamenávány mezi startovacími kulturami (P < 0,05), kdy salámy s kmenem Pediococcus pentosaceus vykazovaly zřetelně nižší koncentrace BA než salámy s přídavkem směsné kultury Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus. Dále byl prokázán statisticky významný rozdíl mezi salámy vyrobenými s přídavkem kořenící směsi Herkules, respektive Paprikáš (P < 0,05), kdy salámy s kořenící směsí pro Paprikáš vykazovaly nižší koncentrace BA než salámy s kořenící směsí typickou pro Herkules. Obrázek 17: Vliv vybraných faktorů na celkovou sumu sledovaných biogenních aminů na konci doby zrání (28. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) 60

61 Obrázek 18: Vliv vybraných faktorů na celkovou sumu sledovaných biogenních aminů na konci doby zrání (49. den) k kontrola (bez probiotika); K, R výrobci; H kořenící směs typu Herkules; P kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor výrobce všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C,D průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05) 5.2 Screening izolátů startovacích a probiotických kultur na přítomnost DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu a histidindekarboxylázu Dekarboxylační aktivita byla prokázána u obou startovacích kultur. U kmene Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus i Pediococcus pentosaceus byla prokázána schopnost tvořit tyramin, a to jak testováním v dekarboxylačním médiu, tak pomocí detekce metodou HPLC-UV a detekcí genu tyrosindekarboxylázy pomocí PCR. U probiotických kmenů L. casei nebyla tyrosindekarboxylázová a histidindekarboxylázová aktivita prokázána za použitích stejných metod jako v případě startovacích kultur. 61

62 5.3 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei ve fermentovaných salámech na koncentraci BA v celém průběhu zrání a skladování V této práci byl sledován vliv dvou různých kmenů L. casei na koncentrace BA ve fermentovaných salámech: L. casei BGP 93 a L. casei 431. Z hlediska stanovených cílů jsou podrobněji popsány a znázorněny časové závislosti koncentrace BA s ohledem na použitý kmen L. casei za pomoci regresní analýzy. Koncenrace BA v průběhu zrání a skladování, prezentované z pohledu použitého probiotického kmene a kontroly bez probiotik, jsou znázorněny v obrázcích 19 až 26. Koncentrace všech BA se po celou dobu zrání a skladování zvyšovala s výjimkou sperminu a spermidinu, jejichž obsah se naopak v celém průběhu sledování průkazně (P<0,001) snižoval. U většiny BA (vyjma sperminu a spermidinu) potlačil přídavek probiotické kultury jejich tvorbu, což se projevilo nejvíce 28. a 49. odběrový den. K větší inhibici tvorby BA došlo v případě salámu s použitým kmenem L. casei BGP 93, rozdíly mezi oběma kmeny L. casei však nebyly statisticky významné (P > 0,05). Statisticky významné snížení tvorby bylo prokázáno u tyraminu (oba kmeny L. casei), kadaverinu (oba kmeny L. casei), histaminu (pouze kmen BGP 93), putrescinu (oba kmeny L. casei) a také u celkové sumy aminů (oba kmeny L. casei). 62

63 Obrázek 19: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci histaminu v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 Obrázek 20: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci tyraminu v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 63

64 Obrázek 21: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci 2-fenylethylaminu v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 Obrázek 22: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci kadaverinu v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 64

65 Obrázek 23: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci putrescinu v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 Obrázek 24: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci sperminu v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 65

66 Obrázek 25: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci spermidinu v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 Obrázek 26: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na celkovou sumu všech sledovaných biogenních aminů v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 66

67 5.3.1 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty ph a aktivity vody Jedním z cílů této práce bylo také posouzení vlivu přídavku probiotik na fyzikálněchemické parametry salámů (ph, aw). Vývoj ph v průběhu zrání a skladování je znázorněn v obrázku 27. Během prvních týdnů fermentace došlo k poklesu ph z původní hodnoty přibližně 6,0 až na hodnotu přibližně 4,5. Během dalšího zrání a skladování zůstalo ph víceméně konstantní. Mezi salámy s probiotiky a kontrolou nebyly zjištěny žádné průkazné rozdíly. Hodnoty ph se mírně lišily pouze mezi salámy jednotlivých výrobců (R > K) a mezi použitými startovacími kulturami (směs Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus > Pediococcus pentosaceus). Obrázek 27: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty ph v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. V grafu jsou zobrazeny průměrné hodnoty bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 Hodnoty aw v průběhu zrání a skladování jsou znázorněny v obrázku 28. Aktivita vody se v průběhu celého pokusu snižovala až na úroveň 0,85 (kontrola), respektive 0,83 (probiotické salámy). Salámy s přídavkem probiotik vykazovaly ve srovnání s kontrolou prokazatelně nižší hodnoty aw (P < 0,05) již od 14. dne pokusu. 67

68 Obrázek 28: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty aktivity vody v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. V grafu jsou zobrazeny průměrné hodnoty bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na sledované skupiny mikroorganismů Koncentrace probiotických kultur v salámech byla sledována po celou dobu pokusu a výsledky těchto stanovení jsou uvedeny v obrázku 29. Suspektní kolonie L. casei byly konfirmovány metodou PCR (viz obrázek 30). Kmen L. casei 431 byl po celou dobu zastoupen v přibližně o 1 logaritmický řád nižším množství než kmen L. casei BGP 93. V průběhu zrání a skladování lze pozorovat pozvolný nárůst obou kmenů; počty L.casei BGP 93 se zvýšily z počátečního množství 5,62 log KTJ g-1 na 6,83 log KTJ g-1 a počty L.casei 431 dosáhly na konci skladování pouze hodnoty 5,83 log KTJ g -1 (počáteční množství 4,62 log KTJ g-1). 68

69 Obrázek 29: Počty probiotických kmenů L. casei v průběhu zrání. BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; kontrola průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96 Za účelem vyhodnocení možného vlivu mikrobiální kontaminace salámů na tvorbu BA je součástí této práce i doplňková mikrobiologická analýza, zahrnující stanovení celkového počtu mikroorganismů (obrázek 31), počtu bakterií mléčného kvašení (obrázek 32) a počtu enterokoků (obrázek 33). Obrázek 30: Agarosová gelová elektroforéza PCR produktu specifického pro L. casei (132 bp). Hodnoty CPM v prvních týdnech po vyrobení stouply z přibližně 6,6 log KTJ g-1 přibližně o 1 logaritmický řád. Vrchol křivky časové závislosti celkového počtu 69