Výtěžek ATP při glykolýze

Transkript

1 Výtěžek ATP při glykolýze 1. Výtěžek ATP při glykolýze a aerobní respiraci je různý u každého organizmu, ale teoretické maximum= 38 molekul ATP na molekulu katabolizové glukosy 2. Anaerobní organismy tvoří po glykolýze pouze 2 molekuly ATP na molekulu katabolizované glukosy

2 2 odlišné molekulární mechanismy vzniku ATP spřažené s oxidoredukcí: v cytoplasmě a na membráně Chemoorganotrofní způsob života bez kyslíku - 2 možnosti: buď zůstává základní schéma v platnosti a změna je v tom že kyslík je nahrazen jinou molekulou Nebo používají fylogeneticky nejstarší způsob fermentace - kvašení

3 Fermentace / mléčné a alkoholové kvašení v

4 Fermentace 1 Fermentace je takový způsob chemoorganotrofních oxidoredukcí, kdy organická redukovaná látka, zdroj energie, např.: glukosa, je v průběhu katabolismu rozštěpena na dvě látky, z nichž jedna je oxidována a druhá redukovaná. Transformace glukosy na pyruvát glykolysa čistý zisk z jedné molekuly glukosy : 2 ATP alkoholové kvašení Kvašení propionové rod Propionibacterium výtěžek 4 ATP na 1,5 molekuly glukosy

5 Fermentace 2 Mléčné kvašení : Homofermetativní Homofermetativní mléčné bakterie (rody Streptococcus, Lactococcus a Lactobacillus) mají laktátdehydrogenasu M. Heterofermentativní Heterofermetativní mléčné bakterie (rody Leuconostoc a Lactobacillus) nemají aldolasu a proto využívají pentosový cyklus, čímž mezi jejich produkty z hexos jsou vedle laktátu i oxid uhličitý a etanol. Kvašení enterobakterií různé produkty charakteristické pro rod Escherichia coli - produkuje hodně kyselin: octová a mléčná indol

6 Fermentace 3 Kvašení propionové charakteristické pro rod Propionibacterium, Veillonella, Bacteroides Laktát acetát + CO 2 + 2(2H) laktát + 2(2H) 2 propionát 3 laktát 2 propionát + acetát + CO2

7 Utilizace pyruvátu Schematický přehled Mléčné kvašení Octové kvašení Alkoholové kvašení Kvašení enterobakterií P yru vá t Butandiolové kvašení Propionové kvašení Kvašení klostridií

8 kvašení enterobakterií E.coli - C 2 - C 3 kondenzace - acetoin Aerobacter indologenes - acetoin + 2H = 2,3- butandiol acetoin - 2H = diacetyl Kvašení klostridií Clostridium - kys. máselná,kys. octová, H 2,CO 2, C.butylicum - butanol, isopropanol C.acetobutylicum - butanol, aceton

9 Kys. máselná a produkce dalších rozpouštědel Clostridium, Butyrvibrio, Bacillus C. acetobutylicum EMP dráha, tvorba C 3 a C 4 sloučenin - první fáze acidogenní, po poklesu ph stacionární fáze a vstup do solvetogenní fáze. Acetyl CoA kondenzuje na acetoacetát, který je buď redukován na butyrát a butanol nebo je štěpen dekarboxylací na aceton. Aceton může být dále redujkován na isopropanol. CH 3 CH 2 CO S.CoA + NADH + H + CH 3 CH 2 CH 2 CHO + HSCoA + NAD + CH 3 CH 2 CH 2 CHO + NADH + H + CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 OH + NAD+ Pyruvát (C 3 ) acetyl CoA + CO 2 + FdH + H + hydrogenasa pak konvertuje ferredoxin na H 2 FdH + H + H 2 + Fd

10 Respirace nitrátu 1 Nitrátová respirace u bakterií je dvojího druhu : 1) spojená s redukcí nitrátu na nitrit 2) spojená s redukcí nitrátu na plynný dusík Vedle této respirační redukce NO 3 - existuje zcela nezávisle asimilační redukce NO 3 - na NH 3, která probíhá u všech mikroorganismů schopných používat NO 3 - jako jediný zdroj dusíku.

11 Respirace nitrátu 2 Redukce nitrátu na nitrit - taxonomický znak těchto rodů : Escherichia, Shigella, Salmonella, Arizona, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus a další enterobakterie; dále rody : Staphyllococcus, Mycobacterium a jiné. Dále u některých druhů z rodů : Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Micrococcus a další.

12 Respirace nitrátu 3 NO H 2 Fysiologické donory protonů a elektronů : NO H 2 O NADH, sukcinát, laktát, formiát, glycerolfosfát, vodík, cytochrom b, chinon. Poslední dva fungují mezi příslušnou dehydrogenasou a terminální nitrátreduktasou. Systém je uložen na cytoplasmatické membráně bakterií. Fakultativně aerobní bakterie mají funkčně systém propojený s aerobním elektrotransportním systémem. Část komponent je společná, nitrátreduktázový systém má specifický cytochrom b-556

13 Respirace nitrátu 4 Asimilační redukce nitrátu Výskyt : a) bakterie : Bacillus, Clostridium, Cytophaga, Escherichia, Micrococcus b) plísně : Aspergillus, c) kvasinky : Penicillium Candida, Hansenula, Rhodotorul Asimilativní nitrátreduktasa redukuje nitráty na nitrily, je rozpustná v cytoplasmě, obsahuje molybden. Kontrola : nitrát - induktor, amoniak - represor Obvyklá tense O 2 nepůsobí represi synthesy.

14 Respirace fumarátu Výskyt: bakterie : Escherichia coli, Citrobacter, Shigella, Proteus Vnější nezávislý akceptor protonů a elektronů - fumarát Fumarátreduktasa - membránový enzym, spřažený s translokací protonů a se synthesou ATP. Výkon nižší : HOCOCH=CHCOOH + H 2 HOCOCH 2 CH 2 COOH G 0 = -86 kj/mol

15 Respirace tetrathionátu Výskyt : bakterie : Serratia, Salmonella, Providencia, Arizona, Proteus, Citrobacter a další Tetrathionátreduktasa je enzym spřažený se synthesou ATP a výkonem srovnatelný s fumarátreduktasou S 4 O H 2 2 S 2 O H + G 0 = -84,5kJ/mol

16 Respirace síranu Výskyt pouze u dvou rodů: Desulfotmaculum Desulfovibrio Striktně anaerobní mikroorganismy žijící v bahně (nemají Calvinúv cyklus pro autotrofní asimilaci CO 2 ) SO H 2 + H + HS H 2 O G 0 = -152kJ/mol Sulfát redukující bakterie důležité pro ekologickém prostředí (součást koloběhu síry), umožňují existenci fototropních bakterií v anaerobním prostředí a sirných bakterií v aerobních podmínkách, hojně přítomny ve vodách naftových a plynných ložiscích. Nutno odlišit od asimilativní redukce síranů

17

18 Růstovými substráty sulfát redukujících bakterií jsou laktát a acetát. Redukční síla redukující bakterie takto generovaná se stěhuje dolů do elektron transportního řetězce za současné redukce sulfátu na H 2 S, sulfan (hydrogen sulfide) a tvorby energie pomocí ATP synthasy

19 Respirace oxidu uhličitého CO H 2 CH H 2 O G 0 = -131 kj/mol Prováděna striktně anaerobně 3 rody a jen 9 druhy. Rozklad organické hmoty : bahno, sedimenty a v zažívacím traktu přežvýkavců (1 kráva dá cca 200 l CH 4 /den) : celulóza cukry mastné kyseliny alkoholy, CO 2, H 2 CH 4 Intenzivní při anaerobním čištění odpadních vod a biologických odpadů (kejda) - podstatná součást bioplynu - metan.

20 methanogeneze Methanogeny získávají energii využitím H 2 pro redukci CO 2. Také dekarboxylují acetát na CH 4 a CO 2. Methanogeny náleží mezi Archaea : Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanospirillum 4H 2 + CO 2 CH H 2 O 4HCOOH CH CO 2 + 2H 2 O 4CH 3 NH 2 Cl + 2H 2 O 3 CH 4 + CO NH 4 Cl 2(CH 3 ) 2 NHCl + 2H 2 O 3 CH 4 + CO NH 4 Cl 4(CH 3 ) 2 NHCl + 6H 2 O 9 CH CO NH 4 Cl CH 3 COOH CH 4 + CO 2

21 Struktura celulosy Celulosa je dlouhý řetězec glukosových molekul, vázaných primárně β(1-4) glykosidickými vazbami, což způsobuje, že pouze malý počet enzymů je schopen tento polymer degradovat. Je nejrozšířenější obnovitelný polymer na zemi. Hemicelulosa je větvený polymer xylosy, arabinosy, galaktosy, mannosy a glukosy. Hemicelulosa svazuje svazky celulusových vláken za tvorby mikrofibril, které posilují stabilitu buněčné stěny. Také se křížově váže s ligninem za tvorby komplexů, které zvyšují stabilitu, ale také umožňují mikrobiální degradaci.

22 Enzymová hydrolýza celulosy Krystalická celulosa, rozklad její struktury umožní kooperace nekatalyzujících reakcí a uvolní monomolekulární vlákna, která lze hydrolyzovat. Enzymová hydrolýza celulosy je pomalý a nekompletní proces. Konsorcium enzymů v bachoru přežvýkavců hydrolyzuje za 48 hodin asi 60-65% celulosy. Termití systém enzymů asimiluje celulosu ze dřeva z 90%. Celulosa - dlouhé polymery β-1,4- vázaných glukosových jednotek, které dále tvoří vláknité struktury vyššího řádu. Hemicelulosa - heteropolysacharid tvořený řetězci xylosy (xylany) nebo mannosy a glukosy (mannany a glukomannany) s postraními řetězci arabinosy, galaktosy, octové a glukuronové kyseliny. Oba polymery jsou v podstatě ve vodě nerozpustné. Lignin má vysoký protektivní účinek. Nacházejí se artefakty ze dřeva až 1500 let staré.

23 Synergismus mezi endoglukanasami, celobiohydrolasami a β-glukosidasami v celulasovém systému hub. Šestiúhelníky- glukosa Redukující konce černé

24 Trichoderma reesei Celulasový systém, který má synergii 3 typů enzymů : 1) endoglukanasa nebo 1,4- -D glukan-4-glukano hydrolasa E.C nahodile štěpí polymer celulosy a tím vytváří nové konce 2) exoglukanasa A nebo 1,4- -D glukan-glukano hydrolasa E.C uvolňuje D-glukosu z -glukanu exoglukanasa B nebo 1,4- -D glukan cellobiohydrolasa E.C tvoří D-cellobiosu z -glukanu 3) -glukosidasy nebo -D-glukosid gluko hydrolasy E.C uvolňují D-glukosu z rozpustných cellodextrinů a glukosidů Enzymy rodu Trichoderma - intensivní studium 3D struktura

25 3Dmodel celulasa

26 n Typy celulas

27 Zvýšení genové dose u Trichoderma nezměnilo významně množství produkovaných enzymů Studium cis- a trans- faktorů účastných na expresi těchto genů může překonat problémy zvyšování produkce celulas. Induktory produkce celulasy : sophorosa (2 β-1,2 vázaná glukosa). Tvorba tohoto cukru z cellobiosy je vyvolná tranglykosylační aktivitou β-glukosidasy (BGL I) T.resei má více kopií bgl I a má zvýšenou aktivitu β-glukosidasy. Produkční kmeny - minimálně 2 β-glukosidasy 2 hlavní xylanasy nejsou koregulovány (xyn 1, xyn 2)

28 K rozlišení podobných proteinů z různých organismů byl zaveden dvoupísmenový kód. Ct-Cel5a označuje první celulasu z GHF 5 Clostridium thermocellum. Thermobifida fusca poskytla šest β-glukanasových genů označených E1 - E6, které byly naklonovány. Ani jeden enzym sám o sobě nebyl schopen hydrolyzovat krystalickou celulosu. Zvýšení hydrolýzy - smísení několika komponent. Celulasy se liší nejen mechanismem účinku (endo / exo) ale také způsobem vazby na krystalický povrch substrátu. Enzym má obvykle 2 vazebná místa - aktivní místo na katalytické doméně a oddělené funkčně nezávislé místo na CBM

29 Rozpoznání nerozpustného substrátu: 3 představy 1) organismus produkuje konstitutivně nízkou hladinu celulasy za všech kultivačních podmínek, i na glukose. Tato hypotéza byla ověřena užitím protilátek, nikoli analýzou exprese. 2) signifikantní exprese celulasy je pozorovatelná po vyčerpání glukosy, výsledky potvrzené na úrovni mrna. 3) T. resei konidie obsahují kompletní soubor enzymů hydrolyzujících široké spektrum polysacharidů. Celulasy vázané na konidie mohou provádět počáteční degradaci molekul celulosy a tak tvořit induktory. Přítomnost cellobiohydrolasy CBHI a CBHII na povrchu konidií byla prokázaná imunochemicky. Normální poměr sekretované CBHI a CBHII do media je 4:1, však nebyl zachován.

30 Mechanismy bakteriální adheze k celulose Celkem čtyři známé mechanismy: 1) velké vícesložkové komplexy, označované jako cellulosomy 2) adheze pomocí fimbrií a bičíků (pili) 3) cukerné epitopy vrstev bakteriálního glykokalyxu 4) vazebné domény enzymů

31 Cellulosom Clostridium thermocellum C. thermocellum o C, substrát : celulosa a cellodextriny, transportuje cellobiosu Genom obsahuje 2 β-glukosidasy GHR 1 a 3 Cellulosomy tvoří polycellulosomy 100 MDa, stejný profil na ELFO 50 komponent Katalytická aktivita závisí na přítomnosti lipidů, Ca 2+, 6 13 % glykosylovaných, Ruminococcus, Butyrvibrio - R.albus cellulosom srovnatelný s C. thermocellum, cca 20 proteinů na ELFO, 8 endoglukanasová aktivita, 9 exogluglukanasová aktivita Celulasy z bakterií nejsou dosud komerčně produkovány

32 Nejprozkoumanějši cellulosom - Clostridium thermocellum minimálně 11 různých enzymů je propojeno do nekatalyzujícího lešeňovitého proteinu, který propojuje povrch buňky se substrátem. Vazba v podpůrném proteinu stimuluje aktivitu jednotlivých složek systému. Glykoprotein CipA (cellulosom integrating protein) zahajuje vazbu na substrát. CBM carbohydrate binding modul

33 Struktura hypotetického cellulosomu

34 Clostridium thermocellum - cellulosom

35 celulosom je tvořen 3 typy enzymů: endoglukanasa exoglukanasa β-glukanasa dosud popsáno více než 600 genů pro celulasy Komplexní molekulární architektura se skládá z katalytických a nekatalytických modulů. Nekatalytické moduly - vazebné domény celulosy: prolin/threonin/serin PTS box Obecně : carbohydrate-binding modules CBM. Další složky jsou fibronectin like modules a surfacelayer homologous modules SHL.

36 Modulární struktura lešení, c1 kohesinový modul 1, DocII kotvící modul typu II, GH9 skupina glykosyl hydrolas 9 (katalytický modul), x1 X-modul (hydrofilní modul 1) A.. Acetivibrio B. Butyrivibrio C. Clostridium

37

38

39 Skenovací el. mikroskopický snímek ferritinem ošetřených bakterií Ruminococcus albus, bakterie rostly na stěnách alfa-alfa

40 Skenovací el. mikroskopický snímek ferritinem ošetřených bakterií Ruminococcus flavefaciens, bakterie rostly na stěnách alfaalfa

41 Skenovací el. mikroskopický snímek ferritinem ošetřených bakterií Fibrinobacter succigenes, bakterie rostly na stěnách alfaalfa

42 Skenovací el. mikroskopický snímek ferritinem ošetřené kokultury F. succinogenes BL2 a Butyrivibrio fibrisolvens, bakterie rostly na stoncích bavlny

43 Skenovací el. mikroskopický snímek ferritinem ošetřené ko-kultury F. succinogenes S85 a B.fibrisolvens D1, bakterie rostly na stoncích bavlny

44 Skenovací el. mikroskopický snímek ferritinem ošetřené ko-kultury F.succinogenes BL2, bakterie rostly na pšeničné slámě upravené SO 2

45 Soubor adhezních mechanismů u mikroorganismů bachoru

46 Lignocelulosa Součást dřevin, degradace bakteriemi a houbami Termiti rozloží 74 99% celulosy a % hemicelulosy xylofagie Skupiny termitů: 1) nižší různorodé populace bičíkatých prvoků a prokaryot 2) vyšší bakterie jsou přítomny, kultivují a konzumují celulolytické houby

47 Lignin Lignin je druhá nejhojnější obnovitelná sloučenina na zemi. Je to heterogenní polymer sestávající z fenyl propanoidových substruktur spojených různými kovalentními vazbami. White-rot fungi houby bílé hniloby jsou jediné organismy schopné mineralizovat účinně lignin na CO 2 a vodu. Tvoří lignin-modifikující enzymy, jako lignin peroxidasy (LiPs), mangan peroxidases (MnPs), glyoxal oxidase (GLOX) a lakásu (laccase) k degradaci ligninu in ve dřevu buněčných stěn.

48 Lignin Lignin je komplexní polymer fenylpropanových jednotek,které jsou cross-linked jedna k druhé pomocí různých typů chemických vazeb. Tato komplexita má tudíž velký význam pro odolnost k mikrobiální degradaci. Některé organismy, zvláště pak houby, mají enzymy nezbytné ke štěpení ligninu. Počáteční reakce jsou zprostředkovány extracellulární ligninovou a manganovou peroxidasou, primárně produkovanou houbami bílé hniloby (white-rot fungi). Rovněž aktinomycety mohou rozkládat lignin, ale typicky degradují méně než 20% celkového ligninu. Degradace ligninu je primárně aerobní proces, neboť za anaerobních podmínek lignin může persistovat po velmi dlouhá období.

49 Lignolytická aktivita Lignolytické aktivity čtyř celulolytických organismů byly porovnány za použití slámy jako substrátu. Pouze Aspergillus japonicus a Polyporous versicolor degradovaly měřitelně lignin, a A. japonicus dával nejvíce proteinu. Při kultivaci na pevné fázi, nejvíce proteinu dával P. versicolor, následovaný A. japonicus. Předošetření slámy horkou vodou usnadnilo biodegradaci a tvorbu proteinu. Nutriční hodnota takto ošetřené slámy byla také zlepšena některými fungálními kulturami. Největší obsah degradovatelných polysacharidů ve slámě byl získán působením A. japonicus na tekutém mediu a Pleurotus ostreatus na pevném mediu.

50 Modely struktury ligninu Veratryl alkohol je nalézán jako metabolit ligninu u Phanerochaete.chrysosporium

51

52