In vitro testování scaffoldů pro tkáňové inženýrství. Jana Horáková

Transkript

1 In vitro testování scaffoldů pro tkáňové inženýrství Jana Horáková

2 Proces tkáňového inženýrství 1. Návrh nosiče Seznámení se s problematikou dané tkáně/orgánu Návrh nosiče pro danou aplikaci 2. Příprava a charakterizace nosiče 5. Klinické testy Klinické testy Klinická praxe 4. Testování in vivo 3. Testování in vitro Cytotoxicita nosiče Testy adheze a proliferace, migrace Testy buněčné de/diferenciace Testování in vivo

3 Přesnost metody Míra shody mezi výsledky získanými opakovanou analýzou téhož vzorku za předem stanovených podmínek (precision) Statistické vyhodnocení náhodných chyb Opakovatelnost (přesnost v sérii charakterizace metody a jejího provedení) Reprodukovatelnost (charakterizace stability metody) Mezilaboratorní reprodukovatenost

4 Přesnost metody Normální rozložení výsledků kolem průměrné hodnoty Míra rozptylu směrodatná odchylka (SD) Pracovní rozsah metody (maximálně akceptovatelná nepřesnost) Analytická citlivost metody určena směrnicí kalibrační závislosti (nejmenší rozdíl koncentrací, které lze s přípustnou nejistotou rozlišit)

5 Senzitivita metody Mez detekce průměrná hodnota slepého vzorku + 3 SD (nižší hodnoty nelze odlišit od náhodného šumu) Mez stanovitelnosti - průměrná hodnota slepého vzorku + 10 SD Linearita kalibrační závislost lze znázornit přímkou (ředění, snížení objemu vzorku)

6 Těsnost souhlasu mezi průměrnou hodnotou získanou z měření a dohodnutou referenční hodnotou Odchylka (bias) způsobena systematickými chybami Správnost kombinace přesnosti a pravdivosti Pravdivost metody

7 Typy in vitro testování Cytotoxicita materiálu Testy buněčné adheze (hodiny) Testy buněčné proliferace (dny, týdny) Testy buněčné migrace Testy buněčné de/diferenciace Hemokompatibilita Metody Mikroskopie Metabolické testy Specifické barvení (IF, IHC) Molekulárně biologické metody

8 Cytotoxicita ISO Biologické hodnocení zdravotnických prostředků Zkouška na cytotoxicitu in vitro 3 kategorie zkoušek: extrakt/přímý styk/nepřímý styk posouzení poškození buněk morfologickými prostředky měření poškození buněk měření růstu buněk měření specifických aspektů buněčného metabolismu

9 Cytotoxicita Positivní kontrola materiál vyvolávající reprodukovatelnou cytotoxickou odezvu (PUR, fenol, Triton X-100) Slepý vzorek extrakční činidlo bez vzorku (kultivační médium se sérem / bez séra, fyziologický roztok) Negativní kontrola materiál, který nevyvolává cytotoxickou odezvu (HMWPE) Podmínky extrakce dle povahy a účelu použití ZP (24 h, 37 C)

10 Cytotoxicita nosiče Kontaktní cytotoxicita vložení testovaného materiálu do kultivační jamky s buňkami sledování morfologie buněk v blízkosti zkoumaného materiálu = Zkouška přímým stykem Nontoxic Cytotoxic

11 Cytotoxicita nosiče Zkouška nepřímým stykem: Zkouška difúzí agarem

12 Cytotoxicita Zkouška na cytotoxicitu příjmem neutrální červeně Zkouška na cytotoxicitu MTT/XTT 1. den: nasazení buněk do 96-jamkových destiček (1x10 4 buněk/jamku) inkubace 24 hodin 2. den: mikroskopická kontrola buněk, odsátí kultivačního média přidání extraktů (alespoň 4 koncentrace, positivní, negativní kontroly, médium slepý vzorek) 3. den: mikroskopická kontrola buněk, odsátí média/extraktů přidání 50 μl MTT 2h inkubace odsátí, přidání 100 μl IPA měření při 570 a 650 nm Analýza dat: Viabilita (%)= 100 OD 570e /OD 570b OD 570e střední hodnota změřené absorbance extraktů OD 570b střední hodnota změřené absorbance slepých vzorků

13

14 % viability Cytotoxicita nosiče Koncentrační řada výluhů měření buněčné viability nejčastěji po 24hodinové inkubaci stanovení cytotoxické koncentrace PC NC E100 E90 E80 E70 E60 E50 E40 E30 E20 E10

15 Metabolické testy MTT, MTS, XTT, WST Nepřímá kvantifikace buněk měření jejich metabolické aktivity

16 Metabolické testy MTT MTS one step MTT XTT WST (Water soluble tetrazolium salts)

17 Cytotoxicita

18 Kultivace buněk na testovaném materiálu Viz praktická cvičení MTI Nasazení buněk na testovaný materiál sledování buněčné adheze a proliferace Doba kultivace, intervaly testování, počet buněk Statická vs dynamická kultivace Metody: Metabolické testy Fluorescenční mikroskopie Kvantifikace DNA Elektronová mikroskopie

19 Statická vs dynamická kultivace

20 Dynamická kultivace

21 Bioreaktory

22 Dynamická kultivace tubulárních vzorků

23 Fluorescenční mikroskopie Barvení buněčných struktur: Jádra PI, DAPI, Hoechst Cytoplasma fluorescein Specifické barvení fokální adheze (vinkulin, tallin), specifické buněčné receptory

24 Fluorescenční mikroskopie Kvantifikace počet buněk na ploše (zorné pole/počítací Gundersonovo okénko) po obarvení buněčných jader Spreading míra rozprostření buňky na materiálu vypovídá o buněčné adhezi

25 Fluorescenční mikroskopie Kvantifikace počtu buněk MATLAB Cells/1 mm KYNAR KYNAR+PEO SIGMA SIGMA+PEO d Cultivation time 8d SOLEF SOLEF+PEO

26 Detekce specifických proteinů Imunofluorescenční/imunohistochemické barvení Elektroforéza Western blot

27 Metody založené na detekci specifického antigenu 1. Imunofluorescence (IF) 2. Imunohistochemie (IHC) Princip: vazba specifické protilátky na antigen CD antigeny (membránové, intracelulární) Odlišný způsob značení 27

28 Struktura protilátky IgG IgD IgM IgE IgA 28

29 The B cells can make a unique antibody for each antigen presented. It is estimated that there is the potential to produce up to 1 x structurally different IgG antibodies. Antigen binding site Disulfide bonds Antigen binding site Fab region Fab region Fc region Antigen A Antigen B Antigen does not fit Antigen fits correctly 29

30 5. Antiglobulin is labeled with a signal molecule and indirect immunoassay is used to detect the target antigen + self Signal molecule Antiglobulin Primary antibody Target antigen (protozoan) Microscope slide 30

31 Imunofluorescence 31

32 Imunohistochemie Značení pomocí DAB (chromogen 3,3 -diaminobenzidin), avidinbiotin kompex substrát (DAB) II. protilátka SA-P I. protilátka buněčný antigen 32

33 3-amino-9-ethylkarbazol (AEC) karmínově červené barvy 33

34 A through G, Endothelialization, SMCs, and inflammatory cells in hirudin-peg-plla grafts. ECs were stained by using CD31 antibody (A D), SMCs were stained by using smooth muscle-major histocompatibility complex (SM-MHC) antibody (E and F), and monocytes and macrophages were stained by using CD68 antibody (G and H). A and C, Complete EC coverage and adventitial angiogenesis seen 1 month after implantation. B, En face staining shows complete endothelialization after 1 month. D, Complete endothelialization after 6-month implantation. E, Immunostaining for SM- MHC at 1 month. F, Immunostaining for SM- MHC at 6 months. G, CD68 staining at 1 month. H, CD68 staining after 6-month implantation. The bar indicates 200 μm (A), 50 μm (B), or 100 μm (C H). 34 Hashi et al.: Antithrombogenic Modification of Small-Diameter Microfibrous Vascular Grafts

35 Výběr protilátky Fixace Zhotovení řezů Antigen Retrieval Blokování Kontroly (pozitivní negativní) Přímé vs nepřímé metody Fluorescence Vícenásobné barvení 35

36 Negative control Negative control 36

37 Negative control CD 206 (M1) CCR 7 (M2) CD 45 37

38 LIVE/DEAD assay Rozlišení živých a mrtvých buněk: mrtvé buňky se barví červeně (PI/ethidium pronikne poškozenou membránou do jádra buňky), živé buňky se barví zeleně (neporušená membrána PI se nedostane do jádra; calcein)

39 Elektronová mikroskopie Kvalitativní (semikvantitativní) hodnocení Sledování buněčné adheze po nasazení buněk na materiál (v řádu několika hodin) Proliferace buněk po povrchu scaffoldu během kultivace vytvoření monolayeru buněk

40 Yarrow et al. BMC Biotechnology :21 Testy buněčné migrace

41 Kvantifikace DNA Nejpřesnější stanovení počtu buněk Izolace DNA (lýza buněk, odstranění proteinů, precipitace DNA ethanolem, rozpuštění DNA ve vodě nebo v pufru) 1. krok při práci s NK 2 typy izolace: 1. Fenol-chloroformová extrakce: standard, spolehlivé, levné x zdlouhavé, pracné 2. Adsorpční metoda vazba DNA na silikátovou kolonku

42 Izolace DNA pevné tkáně či rostlinné buňky nutno mechanicky rozrušit (homogenizátory) detergenty lýza buněk a denaturace proteinů (např. Triton X-100) EDTA, diethylpyrokarbonát (DEPC) aj. potlačení aktivity nukleáz přítomných ve vzorku odstranění druhé nežádoucí NK v závislosti na izolovaném typu (RNáza A, DNáza I)

43 lýza buněk Fenol-chloroformová extrakce přídavek směsi fenol:chloroform (1:1) denaturace proteinů a rozpouštění tuků centrifugace oddělení spodní organické fáze (fenol +chloroform), mezifáze (denaturované proteiny, zbytky buněk) a horní vodné fáze s rozpuštěnými NK pro dokonalé odstranění proteinů nutno extrakci opakovat, v závěrečném kroku přidat pouze chloroform (odstranění stopového množství fenolu z vodné fáze) vysrážení NK z vodné fáze přídavkem chlazeného 100% EtOH, zamražení na -80 C (30 60 min.) centrifugace odstranění supernatantu odsolení sedimentu (vysrážené NK) pomocí 70% EtOH vysušení sedimentu získaná NK se rozpustí v TE pufru (Tris-EDTA, ph 8) nebo deionizované vodě

44

45 Adsorpce NK na silikátový povrch rutinní izolace DNA a RNA

46 Kvantifikace DNA 1) Spektrofotometrie konjugované elektrony heterocyklických bází NK specificky absorbují UVzáření v rozmezí 230 až 320 nm s absorpčním maximem při 260 nm hodnota absorbance při 260 nm se využívá k výpočtu koncentrace NK Pro správné určení koncentrace NK na základě absorbance při 260 nm je nezbytná čistota vzorku! posouzení čistoty vzorku na základě poměru absorbancí A 260 /A 280 pro čistý vzorek NK se výsledné hodnoty poměru nacházejí v rozmezí 1,8-2,0

47 Kvantifikace DNA Spektrofotometrie absorpce DNA při 260 nm (čistota DNA- poměr 260/280 nm) - Malá senzitivita - Nulová specifita - Velké množství vzorku

48 Kvantifikace DNA 2. PicoGreen assay: izolace DNA spektrofluorimetrické stanovení množství DNA

49 Testování buněčné diferenciace Důležité sledování při kultivaci kmenových buněk ovlivnění jejich diferenciace růstovými faktory, mechanickými signály Některé buněčné linie dediferencují (chondrocyty) sledování jejich fenotypu Využití metod molekulární biologie detekce syntézy RNA pro dané proteiny (RT PCR), detekce proteinů (ELISA, IFL)

50 Polymerase chain reaction (Polymerázová řetězcová reakce) Namnožení specifického úseku DNA Analýza genu Genová exprese (RT PCR) Kvantifikace DNA (qpcr) 3 kroky (několikrát opakovány): 1. Denaturace rozpletení ds DNA ss DNA 2. Annealing Nasednutí primerů na specifická místa ss DNA 3. Polymerace syntéza DNA (termostabilní DNA polymeráza) PCR

51

52 PCR - obvykle x opakování, trvání 2 4 hodiny - amplifikace teoreticky geometrickou řadou po 30 opakováních 2 30 (107 mil.) kopií - účinnost ale pouze cca 80% - v 1.cyklu: vzniká řetězec nespecifické délky (syntéza ukončena při změně teploty) - v dalších cyklech: vznikají řetězce specifické délky, odpovídají vzdálenosti vymezené nasednutím primerů

53

54 Termocycler

55 RT PCR Sledování exprese genu na úrovni mrna přepis do DNA pomocí reverzní transkripce (RT) c DNA

56 Elektroforéza Princip: dělení nabitých částic na základě různých elektroforetických pohyblivostí (DNA, proteiny)

57 Princip separace - pentózofosfátová kostra všech nukleových kyselin nese při neutrálním ph stejně velký záporný náboj fragmenty ve stejnosměrném elektrickém poli migrují ke kladné elektrodě (+) - anodě a rychlost této migrace je závislá výhradně na jejich velikosti. kratší fragmenty putují rychleji a urazí větší vzdálenost než fragmenty delší - gel tvoří síťovitou strukturu s póry, brzdí pohyb NK

58 Horizontální elektroforéza Agarózový gel Nanášení vzorků

59 SDS elektroforéza ELFO na PAGE v přítomnosti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate, dodecylsíran sodný) SDS denaturuje proteiny, uděluje jim uniformní záporný náboj

60 Detekce - elektroforéza Barvení DNA - ethidium bromid

61 Western blot 1. Elektroforéza rozdělení proteinů, např. SDS- PAGE 2. blotting přenos na membránu, např. elektroforeticky 3. detekce (většinou imunodetekce)

62 Hemokompatibilita ISO Biologické hodnocení zdravotnických prostředků Výběr zkoušek na interakce s krví 5 kategorií zkoušek: 1. Trombóza (procento okluze, mi, SEM) 2. Koagulace (PTT, koagulační fa) 3. Destičky (počet, agregace, specifické markery) 4. Hematologie (hemolýza, dif) 5. Systém komplementu

63

64 ADHEZE KREVNÍCH ELEMENTŮ NA VLÁKENNÉ MATERIÁLY

65 Hemokompatibilita nosiče

66 VÝSLEDKY I TEST HEMOLÝZY INKUBACE VLÁKENNÝCH MATERIÁLŮ SE ZŘEDĚNOU PLNOU KRVÍ POSITIVNÍ KONTROLA: PLNÁ KREV ŘEDĚNÁ VODOU HEMOLÝZA NEGATIVNÍ KONTROLA: PLNÁ KREV ŘEDĚNÁ FOSFÁTOVÝM PUFREM STUPEŇ HEMOLÝZY - ZÁVISLOST NA PRŮMĚRU VLÁKEN

67 Hemokompatibilita nosiče

68 KOAGULAČNÍ ČASY PLAZMY PO INKUBACI S VLÁKENNÝMI MATERIÁLY BYLY MĚŘENY POMOCÍ PROTROMBINOVÉHO ČASU (PT) A AKTIVOVANÉHO PARCIÁLNÍHO TROMBOPLASTINOVÉHO ČASU (APTT) POSITIVNÍ KONTROLA: PLAZMA VNĚJŠÍ CESTA AKTIVACE KOAGULAČNÍ KASKÁDY MĚŘENÁ POMOCÍ PT NEBYLA OVLIVNĚNA PŘÍTOMNOSTÍ VLÁKENNÝCH MATERIÁLŮ, NEDOŠLO KE ZMĚNÁM KOAGULAČNÍCH ČASŮ. VNITŘNÍ CESTA AKTIVACE KOAGULACE MĚŘENÁ POMOCÍ APTT BYLA PRODLOUŽENA PO INKUBACI S VLÁKENNÝMI MATERIÁLY. VÝSLEDKY II TESTY KOAGULACE REFERENČNÍ HODNOTY: PT S APTT S

69 Trombogenicita

70 NEJVYŠŠÍ MÍRA AKTIVACE KREVNÍCH DESTIČEK BYLA NAMĚŘENA PO INKUBACI S KOLAGENOVÝM VLÁKENNÝM NOSIČEM. VYSOKÉ HODNOTY ABSORBANCE ODPOVÍDAJÍCÍ AKTIVITĚ TROMBOCYTŮ BYLY VŠAK NAMĚŘENY U VŠECH TESTOVANÝCH VLÁKENNÝCH MATERIÁLŮ Z BIODEGRADABILNÍCH POLYESTERŮ. VÝSLEDKY III TEST TROMBOGENICITY

71 VÝSLEDKY III TEST TROMBOGENICITY MĚŘENÍ VIABILITY TROMBOCYTŮ PO INKUBACI VLÁKENÝCH MATERIÁLŮ A FOLIÍ (F) S TROMBOCYTY PO DOBU 2 HODIN A 96 HODIN.

72 Užitečné odkazy QFI uhsi