CALPROTECTIN ELISA. EK-CAL 96 testů. Datum revize:

Transkript

1 CALPROTECTIN ELISA EK-CAL 96 testů Datum revize: BÜHLMANN LABORATORIES AG Baselstrasse 55 CH Schönenbuch, Switzerland Tel.: Fax: info@buhlmannlabs.ch

2 URČENÉ POUŽITÍ Souprava Calprotectin ELISA firmy BÜHLMANN je navržena pro extrakci a kvantitativní stanovení lidského Kalprotektinu (MRP8/14; S100A8/S100A9) ze vzorků lidské stolice (1-3). PRINCIP TESTU Po krátké extrakci za použití jednoho dílu stolice a 49 dílů extrakčního pufru, umožňuje test pro selektivní stanovení antigenu kalprotektinu sendvičovým testem ELISA. Získaná monoklonální protilátka (mab) vysoce charakteristická komplexy heterodimerického a polymerického Kalprotektinu (4-5), respektive je potažena na mikrotitrační destičku. Kalibrátory, kontroly a vzorky pacientů jsou inkubovány při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Po promývání zaznamenají zjištěné protilátky (Ab) konjugované na křenovou peroxidázu (HRP) molekuly kalprotektinu vázané na monoklonální protilátky potažené na destičce. Po inkubaci a dalším promývání, se přidá tetrametylbenzidin (TMB) (seskupení modré barvy), následuje zastavovací reakce (změní se na žlutou). Absorpce se měří při 450 nm. Reagencie Množství Kat. č. Příprava Extrakční pufr 3 lahve B-CAL-EX Připraven k použití 125 ml Mikrotitrační deska 12 x 8 jamek B-CAL-MP Připravena k použití potažena antikaprotektinem mab Krycí fólie na destičku 3 kusy Koncentrát promývacího pufru (10x) s konzervačními 1 láhev 100 ml B-CAL-WB Řeďte 900 ml deionizované vody látkami Inkubační pufr s konzervačními látkami 2 lahve 125 ml B-CAL-IB Připraveno k použití Kalibrátory A až E 1)2) Kalprotektin v pufr matrici s konzervačními látkami Kontrola nízká/vysoká 3) lidské sérum s konzervačními látkami Enzymový marker Anti-kalprotektin Ab konjugovaný k HRP TMB Substrát TMB v citrátovém pufru Zastavovací roztok 0,25 M kyseliny sírové 5 lahviček 1 ml 2 lahvičky 1 ml 1 lahvička 12 ml 1 lahvička 12 ml 1 lahvička 12 ml B-CAL- CASET B-CAL- CONSET B-CAL-EL B-TMB12 B-STS12 DODÁVANÉ REAGENCIE A PŘÍPRAVA Připraveno k použití Připraveno k použití Připraveno k použití Připraveno k použití Připraveno k použití Korozívní složka Tabulka 1 1) Současné koncentrace kalprotektinu standardů A až E jsou 4, 12, 40, 120 a 240 ng/ml. Pro stanovení ELISA nastává během extrakce roztoku vzorku 1:50 následně další ředění extraktu 1:50. Abyste mohli tyto kroky zahrnout do záznamu pro závěrečnou kalkulaci kalibrátorů A až E, musí být použity následující koncentrace pro dolní hranici ELISA postupu (viz strana 5): 10, 30, 100, 300 a 600 µg/g kalprotektinu. 2) Pokud si vyberete rozšířený ELISA postup (viz strana 6), musí být použity následující koncentrace kalibrátorů v příslušném protokolu: 30, 90, 300, 900 a 1800 µg/g kalprotektinu. 3) Kontroly obsahují šaržově specifická množství nativního lidského kalprotektinu. Nahlédněte do přílohy o kontrole kvality pro současné koncentrace. REAGENCIE DODÁVANÉ NA VYŽÁDÁNÍ Přístroje pro fekální extrakci Smart-Prep 50 zkumavek, špachtle a nádobky B-CAL-RD Schebo Quick-Prep TM 50 zkumavek skládajících se z nádobky, B-CAL-SO50 kuželovité & dávkovací špičky 1,3 ml, připraveno k použití Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

3 SKLADOVÁNÍ A STABILITA REAGENCIÍ Neotevřené reagencie Skladujte při 2 8 C. Nepoužívejte po vypršení doby expirace uvedené na štítcích. Otevřené / naředěné reagencie Extrakční pufr Skladujte při 2 8 C do data expirace. Mikrotitrační destička Nepoužité stripy ihned vraťte do fólie obsahující vysušující balení a uzavřete podél celé hrany zipu. Skladujte do data expirace při 2 8 C. Ředěný promývací pufr Skladujte až 6 měsíců při 2 8 C. Inkubační pufr Skladujte do data expirace při 2 8 C. Kalibrátory Kontroly Enzymový marker TMB-substrát Zastavovací roztok VAROVÁNÍ A OPATŘENÍ Mikrotitrační stripy, kalibrátory a kontroly této soupravy obsahují látky lidského původu. Každá zdrojová jednotka séra použitá na přípravu komponentů soupravy byla testována schválenou metodou FDA, byl zjištěn negativní povrchový antigen HBV, stejně tak protilátky HCV a HIV1/2. Přestože jsou tyto metody velmi přesné, neexistuje záruka, že tento materiál nepřenáší Hepatitidu nebo AIDS. Proto by se mělo zacházet se všemi vzorky pacientů a součástmi soupravy jako s možným přenašečem infekce. Se všemi výrobky obsahující zdroj lidského materiálu by se mělo zacházet v souladu s laboratorní praxí za použití příslušných opatření. Zastavovací roztok: Zastavovací roztok (B-STS) obsahuje kyselinu sírovou. Reagencie je dráždivá na oči, kůži a sliznice. Vyhněte se kontaktu s očima, kůží a oblečením. Noste příslušné ochranné oblečení, rukavice a ochranu očí. Po kontaktu s očima nebo kůží, opláchněte velkým množstvím vody. VYŽADOVANÉ MATERIÁLY NEDODÁVANÉ SE SOUPRAVOU Postup extrakce 10 µl jednorázové očkovací kličky (Sarstedt: ) 15 ml polypropylenové zkumavky se šroubovacími víčky (Sarstedt: ) vyžadované pro standardní extrakční postup; extrakční přístroje (viz výše). Laminární box Vortex mixér pro více zkumavek Přesné váhy ( mg) Mikrocentrifuga ( 3000 g) ELISA postup 10, 100 a 1000 µl přesné pipety s jednorázovými špičkami. Jednorázové polystyrénové nebo polypropylénové zkumavky pro přípravu roztoků vzorku ml odměrný válec k ředění promývacího pufru. Promývačka mikrrotitračních destiček (viz Poznámky k postupu) nebo mačkací lahve na promývací pufr Rotátor mikrotitrační destičky (viz Poznámky k postupu) Savý papír. Čtečka mikrotitračních destiček pro měření a absorpci při 450 nm. ODBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKU Pro extrakční postup je potřeba 50 až 100 mg čerstvé stolice. Odběr proveďte do obyčejných zkumavek a skladujte je v chladu při 2 8 C až 6 dnů. Zmrazení vzorků může trochu zvýšit koncentrace kalprotektinu kvůli přítomnosti neurotrofilů ve vzorku. Proto je pro lepší skladování lepší nechat extrakty při -20 C. Extrakty jsou stabilní až 4 měsíce. Důležité: Vzorek musí být odebrán bez jakékoliv chemického nebo biologického přídavku v prostředku pro odběr. Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

4 POZNÁMKY K POSTUPU Zbytky v jamkách mikrotitrační destičky jsou výsledkem výrobního procesu. Odstraní se v promývacím kroku (postup testu krok 3) a neovlivní výsledky. Extrakce: K získání kvantitativních výsledků je důležité homogenizovat celý vážený vzorek stolice v extrakčním pufru. Vyhněte se kontaminaci na vrchní části zkumavky nerozpustné (nestrávené) části mohou zůstat ve zkumavce po extrakci. Krátké 5-minutové odstředění během extrakce může způsobit kalnost roztoku. Kalnosti se vyhnete delším odstředěním, které neovlivní kvantitativní stanovení v ELISA. ELISA postup: v postupu ELISA jsou základní kroky promývací kroky, které garantují reprodukovatelnost výsledků. Musí být pokaždé zajištěn minimální inkubační čas promývacího pufru v jamkách, alespoň 20 vteřin. Při použití automatické promývačky doporučuje BÜHLMANN použít plate mode tj. každý krok postupu (ředění/aspirace) je proveden na všech stripech sekvenčně před zpracováním každého dalšího kroku. Tím je zaručen minimální inkubační čas. Uvedený počet promývacích cyklů je povinný kvůli reprodukovatelnosti výsledků. K zajištění úplné spolupráce antigenu/protilátky musí být inkubační čas v kroku 5 alespoň 30 minut. Trochu delší inkubační čas (až 5 minut) nemá žádný vliv na konečný výstup. Rotator destičky (shaker) musí mít rpm (<Hz). Vyšší rotační frekvence může způsobit slabou ředicí linearitu při hodnotách mezi 300/900 a 600/1800 µg/g. Měla by být použita orbitální rotace namísto třepání převrácením. Enzymová vazba je deaktivována kyslíkem a nepatrně senzitivní na azid sodný, thimerosal, kyselinu chlornou a aromatické chlorované uhlovodíky, které se často nachází v laboratorní vodě. Proto používejte pouze vysoce kvalitní neionizovanou vodu. Je doporučeno testovat každou kontrolu a vzorek v dupletu pokaždé, když je proveden test. Jelikož se podmínky mění s každým testem, musí být vždy vygenerována nová standardní křivka. Doporučeno je vertikální postavení. Pokud se počáteční koncentrace neznámého vzorku přečte vyšší než je nejvyšší kalibrátor (Kalibrátor E), vzorek musí být dále naředěn inkubačním pufrem a testován dál podle postupu testu. Výsledný ředicí faktor musí být zohledněn při kalkulaci výsledku. POSTUP TESTU Extrakce Standardní extrakční postup (viz strana 11) 1. Štítek a váha (tára) prázdné polypropylenové zkumavky dohromady s očkovací kličkou. 2. Odeberte 50 až 100 mg vzorku stolice prostřednictvím očkovací kličky a umístěte do předvážené zkumavky. 3. Odhadněte množství vzorku, odlomte očkovací kličku a spodní část kličky nechte ve zkumavce. 4. Přidejte extrakční pufr (49 krát vážený objem) do zkumavky, tu zavřete. Hmotnost [mg] vzorku Objem [ml] extrakčního pufru stolice 50 2,5 55 2,7 60 2,9 65 3,2 70 3,4 75 3,7 80 3,9 85 4,2 90 4,4 95 4, ,9 5. Homogenizujte vzorek po dobu 30 minut na vortexu pro více zkumavek silným třepáním (při nejvyšší rychlosti). 6. Přeneste homogenizovaný vzorek do 2 ml Eppendorf zkumavky a odstřeďujte v mikrocentrifuze po dobu 5 minut při 3000 x g. 7. Dejte supernatant do nové, označené zkumavky a pokračujte v ELISA postupu nebo skladujte extrakty při -20 C do 4 měsíců. Extrakční postupy za použití fekálních extrakčních zařízení: Extrakční postup je popsán a ilustrován v návodu k použití daného exaračního zařízení. 1. Fekální extrakční zařízení Roche (kat. č ) nebo BÜHLMANN Smart-Prep (kat. č. B-CAL-RD): Extrakční čas (třepání) může být redukován na 1 minutu. 2. ScheBoR Quick-PrepTM (kat. č. B-CAL-SO50): Extrakční zkumavky jsou předplněné extrakčním pufrem. Extrakční čas je kolem 10 minut (třepání). Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

5 Po extrakci, odstřeďujte zkumavky 5 minut při x g. Nebo přeneste homogenizovaný vzorek do 2 ml zkumavky Eppendorf a odstřeďujte v mikrocentrifuze 5 minut při x g. Sceďte supernatant do nové označené zkumavky a pokračujte v ELISA postupu nebo skladujte extrakt při -20 C po dobu 4 měsíců. Příslušné extrakční postupy jsou publikovány na webových stránkách: ELISA POSTUPY Test může být proveden podle následujících postupů spodní nebo rozšířená hranice ELISA postupu. Jaký postup bude zvolen, záleží na koncentraci kalprotektinu ve vzorcích. Pro vzorky nad 600 µg/g vyberte spodní hranici postupu za použití ředění vzorku 1:50 (pracovní rozmezí µg/g) (viz strana 5, 6) Pokud mají vzorky tendenci překročit 600 µg/g, vyberte rozšířenou hranici postupu při ředění vzorku 1:150 (pracovní rozmezí µg/g) (viz strana 5). NIŽŠÍ ROZMEZÍ ELISA POSTUPU PRACOVNÍ ROZMEZÍ µg/g Před použitím nechte reagencie ustálit na teplotu C 1. Řeďte extrakty stolice 1:50 s inkubačním pufrem (tj 20 µl extraktu a 980 µl inkubačního pufru) a dobře promíchejte. Nechte vzorek ustálit na teplotu C po dobu 5 minut než provedete krok 4c. 2. Připravte destičky s vhodnými stripy z držáku a bez odkladu je uzavřete do fólie spolu s vysoušedlem. Skladujte v chladu. 3. Promyjte potažené jamky dvakrát za použití nejméně 300 µl promývacího pufru na každou jamku. Vylijte jamky a důkladně vyklepte na savý papír. Důležité: Pro každé ze tří promývacích kroků musí být zajištěn minimální inkubační čas po dobu 20 vteřin promývacího pufru v jamkách (viz Poznámky k postupu Postup ELISA, strana 4). 4. a) Napipetujte 100 µl inkubačního pufru dvojmo do jamek A1+a2 (blank) Napipetujte 100 µl Kalibrátoru A dvojmo do jamek B1+B2 Napipetujte 100 µl Kalibrátoru B dvojmo do jamek C1+C2 atd. Napipetujte 100 µl nízké a vysoké kontroly dvojmo do jamek G1+G2 a H1+H2. Napipetujte 100 µl každého ředěného vzorku do příslušných jamek. 5. Zakryjte destičku fólií a inkubujte minut na rotátoru destičky při rpm při C (viz Poznámky k postupu Postup ELISA, strana 4). 6. Odeberte a vyhoďte fólii. Vylijte jamky a 3x promyjte za použití nejméně 300 µl promývacího pufru na jamku (viz Poznámky k postupu, strana 3). Vyklepejte na destičku na savý papír. 7. Napipetujte 100 µl enzymového markeru do všech jamek. 8. Přikryjte destičku fólií a inkubujte po 30 ± 5 minut na rotátoru destičky při rpm při C. 9. Odeberte a vyhoďte fólii. Vylijte jamky a 5x promyjte nejméně 300 µl promývacího pufru na každou jamku. Vylijte jamky a vyklepte destičku na savý papír. Důležité: Nechte TMB substrát vytemperovat na C. 10. Napipetujte 100 µl TMB substrátu do všech jamek. 11. Zakryjte destičku folií, chraňte destičku před přímým světlem, inkubujte 15 ± 2 minut na rotátoru destičky při rpm při C. 12. Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do všech jamek. Odstraňte vzduchové bubliny špičkou. Začněte krokem 13 do 30 minut. 13. Odečtěte absorpci při 450 nm ve čtečce mikrotitrační destičky. VÝSLEDKY PRACOVNÍ rozmezí µg/g Standardní křivka: zaznamenejte absorpci při 450 nm pro každý kalibrátor a blank jamky. Průměr duplicitních hodnot, odečtěte průměr blank jamek a zaznamenejte průměry (= opravená průměrná absorpce). Vykreslete absorpce (vertikální osa) versus koncentrace kalprotektinu kalibrátorů (horizontální osa) za použití semi logaritmického lin/log milimetrového papíru. Nakreslete nejlepší křivku nebo vypočítejte standardní křivku za použití čtyř logistických parametrů. Vzorky a kontroly: zaznamenejte absorpci při 450 nm pro každou jamku se vzorkem a kontrolou. Průměr duplicitních hodnot, odečtěte průměr blank jamek a nahrajte průměry (= opravená průměrná absorpce). Umístěte správnou absorpční hodnotu vzorku na vertikální osu, namalujte horizontální přímku protínající standardní křivku a čtěte koncentraci kalprotektinu z horizontální křivky. Pokud si vyberete spodní hranici ELISA postupu, následující koncentrace kalibrátoru, musí být použity v příslušném protokolu ELISA: 10, 30, 100, 300 a 600 µg/g kalprotektinu. Další ředicí faktory musí být znásobeny pro získání konečných výsledků. Viz Tabulka 16 a Obrázek 1 pro typická data (výsledky a standardní křivka). Tyto výsledky a standardní křivka jsou uvedeny pouze pro demonstraci. Standardní křivka musí být vygenerována pro každý set vzorků, které jsou testovány. Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

6 CHARAKTERISTIKY VÝKONU PRACOVNÍ ROZMEZÍ: µg/g Vnitřní přesnost testu: 4,7%. Vnitřní přesnost testu byla vypočítána z 20 párů hodnot ze 3 extrahovaných vzorků stolice testovaných v jednom stanovení podle postupu testu. Hodnoty zobrazuje Tabulka 17. Vnější přesnost testu: <15%. Vnější přesnost ELISA byla vypočítána z 5 extrahovaných vzorků stolice. Aliquoty byly testovány podle postupu testu v 10 různých stanoveních třemi laboranty za použití 2 šarží souprav ve dvou různých laboratořích. Hodnoty jsou zobrazeny v Tabulce 18. Analytická senzitivita: <10 µg/g. 20 duplikátů inkubačního pufru bylo testováno v jednom testu. Byla vypočítána průměrná a standardní odchylka pro absorpční hodnoty. Minimální zjistitelná dávka kalprotektinu byla vypočítána čistě podle Kalibrátoru A (10 µg/g) přidáním dvou standardních odchylek k průměrné absorpci a protínající tuto hodnotu standardní křivkou obsaženou v novém testu. Funkční senzitivita: <10 µg/g. Deset vzorků stolice s hodnotami mezi 5,2 a 1254 µg/g kalprotektinu bylo testováno 20krát duplicitně v jednom testu. %CV a průměrné hodnoty byly vypočítány pro každý vzorek. Funkční senzitivita byla pozorována na 15% CV. Výsledná preciznost profilu (Obrázek 2) umožňuje přesné měření v rámci celého standardního rozmezí od 10 do 600 µg/g. Linearita ředění: 103%. Sedm vzorků stolice se zvýšenými hodnotami kalprotektinu bylo extrahováno podle postupu testu. Extrakty byly ředěny inkubačním pufrem a sekvenčně testovány podle postupu testu. Očekávané hodnoty byly vypočítány z pozorované hodnoty z prvního ředění. Výsledky jsou zobrazeny v Tabulce 19. Přidaná výtěžnost: 100%. Dva extrahované vzorky stolice byly přidány k různým množstvím roztoku kalprotektinu obsahujícího lidské sérum. Vzorky byly měřeny před a po přidání příslušného postupu testu. Výsledky ukazuje Tabulka 20. Zkřížená reaktivita: <0,1%. Inkubační pufr přidaný k různým množstvím rekombinantu MRP8 a MRP14 byl měřen podle postupu testu. Hodnoty jsou v Tabulce 25. ROZŠÍŘENÉ ROZMEZÍ ELISA POSTUPU Pracovní rozmezí µg/g Před použitím nechte reagencie vytemperovat na C. Pracovní rozmezí může být rozšířeno faktorem 3, pokud ředíte vzorky 1:150 namísto 1:50. Tento postup je doporučován, pokud jsou očekávány vyšší koncentrace kalprotektinu. Preciznost a linearita testu umožňuje rozšíření hranic soupravy. 1. Nařeďte extrakty stolice 1:150 inkubačním pufrem (tj. 20 µl extraktu a 2980 µl inkubačního pufru) a dobře zamíchejte. NB: Jen ředěné extrakty stolice. Standardy a kontroly jsou připravené k použití. Nechte vzorky vytemperovat po dobu nejméně 5 minut při C před provedením kroku 4c. 2. Připravte destičky s vhodnými stripy z držáku a bez odkladu je uzavřete do fólie spolu se sušidlem. Skladujte v chladu. 3. Promyjte potažené jamky dvakrát za použití nejméně 300 µl promývacího pufru na každou jamku. Vylijte jamky a důkladně vyklepte na savý papír. Důležité: Pro každé ze tří promývacích kroků musí být zajištěn minimální inkubační čas po dobu 20 vteřin promývacího pufru v jamkách (viz Poznámky k postupu Postup ELISA, strana 4). 4. a) Napipetujte 100 µl inkubačního pufru dvojmo do jamek A1+a2 (blank) Napipetujte 100 µl Kalibrátoru A dvojmo do jamek B1+B2 Napipetujte 100 µl Kalibrátoru B dvojmo do jamek C1+C2 atd. b) Napipetujte 100 µl nízké a vysoké kontroly dvojmo do jamek G1+G2 a H1+H2. c) Napipetujte 100 µl každého ředěného vzorku do příslušných jamek. 5. Zakryjte destičku fólií a inkubujte minut na rotátoru destičky při rpm při C (viz Poznámky k postupu Postup ELISA, strana 4). 6. Odeberte a vyhoďte fólií. Vylijte jamky a 3x promyjte za použití nejméně 300 µl mycího pufru na jamku (viz Poznámky k postupu, strana 3). Vyklepejte na destičku na savý papír. 7. Napipetujte 100 µl enzymového markeru do všech jamek. 8. Přikryjte destičku fólií a inkubujte po 30 ± 5 minut na rotátoru destičky při rpm při C. 9. Odeberte a vyhoďte fólii. Vylijte jamky a 5x promyjte nejméně 300 µl promývacího pufru na každou jamku. Vylijte jamky a vyklepte destičku na savý papír. Důležíté: Nechte TMB substrát vytemperovat na C. 10. Napipetujte 100 µl TMB substrátu do všech jamek. 11. Zakryjte destičku fólií, chraňte destičku před přímým světlem, inkubujte 15 ± 2 minut na rotátoru destičky při rpm při C. 12. Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do všech jamek. Odstraňte vzduchové bubliny špičkou. Začněte krokem 13 do 30 minut. 13. Čtěte absorpci při 450 nm ve čtečce mikrotitrační destičky. Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

7 VÝSLEDKY PRACOVNÍ ROZSAH µg/g Standardní křivka: zaznamenejte absorpci při 450 nm pro každý kalibrátor a blank. Průměr duplicitních hodnot, odečtěte průměr blank jamek a nahrajte průměry (= opravená průměrná absorpce). Vykreslete absorpce (vertikální osa) versus koncentrace kalprotektinu kalibrátorů (horizontální osa) za použití semi logaritmického lin/log milimetrového papíru. Nakreslete nejlepší křivku nebo vypočítejte standardní křivku za použití čtyř logistických parametrů. Vzorky a kontroly: zaznamenejte absorpci při 450 nm pro každou jamku se vzorkem a kontrolou. Průměr duplicitních hodnot, odečtěte průměr prázdných jamek a zaznamenejte průměry (= opravená průměrná absorpce). Umístěte správnou absorpční hodnotu vzorku na vertikální osu, nakreslete horizontální přímku protínající standardní křivku a čtěte koncentraci kalprotektinu z horizontální křivky. Pokud si vyberete spodní hranici ELISA postupu, následující koncentrace kalibrátoru, musí být použity v příslušném protokolu ELISA: 30, 90, 300, 900 a 1800 µg/g kalprotektinu. Viz Tabulka 21 a Obrázek 3 pro typická data (výsledky a standardní křivka). Tyto výsledky a standardní křivka jsou uvedeny pouze pro demonstraci. Standardní křivka musí být vygenerována pro každý set vzorků, které jsou testovány. CHARAKTERISTIKY VÝKONU PRACOVNÍ ROZMEZÍ: µg/g Vnitřní přesnost testu: 4,0%. Vnitřní přesnost testu byla vypočítána z 20 párů hodnot ze 3 extrahovaných vzorků stolice testovaných v jednom stanovení podle postupu testu. Hodnoty zobrazuje Tabulka 22. Vnější přesnost testu: <15%. Vnější přesnost ELISA byla vypočítána z 5 extrahovaných vzorků stolice. Aliquoty byly testovány podle postupu testu v 10 různých stanoveních třemi laboranty za použití 2 šarží souprav ve dvou různých laboratořích. Hodnoty jsou zobrazeny v Tabulce 23. Funkční senzitivita: <30 µg/g. 18 vzorků stolice s hodnotami mezi 10,8 a 2080 µg/g kalprotektinu bylo testováno 20krát v jednom testu. %CV a průměrné hodnoty byly vypočítány pro každý vzorek. Funkční senzitivita byla pozorována na 15% CV. Výsledná preciznost profilu umožňuje přesné měření v rámci celého standardního rozmezí od 30 do 1800 µg/g. Výsledky jsou zobrazeny na Obrázku 4. Linearita ředění: 102%. Pět vzorků stolice se zvýšenými hodnotami kalprotektinu bylo extrahováno podle postupu testu. Extrakty byly ředěny inkubačním pufrem a sekvenčně testovány podle postupu testu. Očekávané hodnoty byly vypočítány z pozorované hodnoty z prvního ředění. Výsledky jsou zobrazeny v Tabulce 24. OČEKÁVANÉ HODNOTY Stanovení fekálního kalprotektinu je spolehlivá a snadná cesta k odlišení organické formy gastrointestinálních poruch. V klinické studii bylo 401 pacientů s příznaky vyšetřeno kolonoskopíí (publikace se připravuje). Endoskopická zkouška ukázala, že 273 pacientů s funkčním onemocněním, kde 128 pacientů mělo organickou poruchu (colitis, Crohnova nemoc, vředy, divertikulitida, polypy, adenomy, rakovina nebo infekční onemocnění). Analýza ROC křivky (AUC: 0,935) je výsledkem v optimálním klinickém cut-off při 50 µg/g. Aplikací tohoto cut-off může být zvýšena klinická senzitivita a specificita na 84,4% a 94,5%, respektive může být zvýšena diferenciací mezi organickými a funkčními poruchami (viz Tabulka 26). Fekální hladiny kalprotektinu dospělých a dětí jsou porovnatelné, ovšem hladiny novorozenců mohou být značně zvýšené (8). Tato data podporují následující doporučení pro interpretaci výsledků: Normální hodnoty pod 50 µg/g: Hodnoty kalprotektinu <50 µg/g nesvědčí o zánětu gastrointestinálního traktu. U pacientů s nízkými hladinami kalprotektinu není pravděpodobně potřeba invazivní zákrok ke stanovení příčiny zánětu (12). Zvýšené hodnoty mezi 50 a 200 µg/g: Hodnoty kalprotektinu mezi 50 a 200 µg/g mohou značit mírné organické onemocnění stejně jako zánět způsobený NSAID, mírná divertikulitida a IBD ve fázi remise. Lze doporučit opakování měření a provedení dalších vyšetření. Zvýšené hodnoty nad 200 µg/g: Hodnoty kalprotektinu > 200 µg/g ukazují aktivní organické onemocnění se zánětem v gastrointestinálním traktu. Jsou doporučena příslušná další vyšetření a léčba. Hladina cut-off doporučená pro dospělé (50 µg/g) může být použita také u dětí od 4 do 17 let bez ohledu na pohlaví (9). KONTROLA KVALITY Porozumění této instrukci je nutné pro úspěšné použití produktu. Spolehlivé výsledky budou dosaženy jen precizními laboratorními technikami (stávající GLP směrnice) a přesným sledováním tohoto návodu k použití. Momentálně není komerčně dostupné žádné kontrolní sérum pro kalprotektin, doporučujeme použití směsného vzorku pozitivních extraktů stolice pro vnitřní kontrolu kvality. Reprodukovatelnost parametrů standardní křivky a kontrolních hodnot by měla být ve stanovených limitech laboratorní přijatelnosti. Důvěryhodné limity pro kontroly jsou specifické podle šarží a vytištěné na dalším štítku kontroly kvality. Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

8 Pokud preciznost testu není ve stanovených limitech a opakování vyloučilo technické chyby, zkontrolujte (následující potíže: i) pipetování, kontrolní teploty a načasování přístroje ii) nastavení čtečky ELISA iii) data expirace reagencií iv) skladování a inkubační podmínky v) TMB substrát musí být bezbarvý vi) čistota vody. OMEZENÍ Reagencie dodávané v této soupravě jsou optimalizované pro měření lidského kalprotektinu v extrahovaných vzorcích stolice. Hodnoty fekálního kalprotektinu se používají jako podpůrný nástroj pro stanovení diagnózy. Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

9 Tabulka 16: Příklad výsledků PŘÍLOHA 1, TABULKY Obrázek 1: Příklad standardní křivky Tabulka 19: Ředicí linearita/podobnost Tabulka 17: Vnitřní přesnost testu Tabulka 18: Vnější přesnost testu: Obrázek 2: Profil přesnosti Tabulka 20: Zvýšená výtěžnost Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

10 Tabulka 21: Příklad výsledků PŘÍLOHA II, TABULKY Obrázek 3: Příklad standardní křivky Obrázek 4: Profil přesnosti Tabulka 22: Vnitřní přesnost testu Tabulka 23: Vnější přesnost testu Tabulka 24: Ředicí linearita/podobnost Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

11 Tabulka 25* Zkřížená reaktivita Data byla stanovena s nízkou hranicí postupu ELISA. Popis tabulky: cf. Výsledky (strana 5, 7) Charakteristiky výkonu (strana 5, 7) a Interpretace výsledků (strana 5, 7). Tabulka 26* Klinické studie PŘÍLOHA III, LITERATURA 1. Striz I and Trebichavsky I: Calprotectin a pleiotropic molecule in acute and chronic inflammation. Physiol Res. 53, (2004) 2. Tibble JA et al.: Use of surrogate markers of inflammation and Rome criteria to distinguish organic from nonorganic intestinal disease. Gastroenterol 123, (2002) 3. Fagerhol MK: Calprotectin, a faecal marker of organic gastrointestinal abnormality. Lancet 356, (2000) 4. Hessian PA and Fisher L: The heterodimeric complex of MRP-8 (S100A8) and MRP-14 (S100A9). Antibody recognition, epitope definition and the implications for structure. Eur J Biochem 268, (2001). 5. Goebeler M et al.: Expression and complex formation of S100-like proteins MRP8 and MRP14 by macrophages during renal allograft rejection. Transplantation 58, (1994). 6. Tibble JA et al.: A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn s disease. Gut 47, (2000). 7. Wassell J et al.: Faecal Calprotectin: a new marker for Crohn s disease? Ann Clin Biochem 41, (2004) 8. Konikoff MR and Denson LA: Role of fecal calprotec-tin as a biomarker of intestinal inflammation in inflam-matory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 12(6), (2006) 9. Fagerberg UL et al.: Colorectal inflammation is well predicted by fecal calprotectin in children with gastro-intestinal symptoms. J Pediatr Gastroenterol Nutr 40, (2005) 10. Johnson M W et al.: Faecal calprotectin: a noninvasivee diagnostic tool and marker of severity in pouchitis. Eur J Gastroenterol Hepatol 20 : , 2008) 11. Sipponen T et al. Faecal Calprotectin, Lactoferrin, and Endoscopic Disease Activity in Monitoring Anti-TNF-alpha Therapy for Crohn s Disease. Aliment Pharmacol Ther 28, , (2008) 12. Tschanguizi et al. Stool Calprotectin as a Marker of inflammation. Poster at UEGW, Jahnsen J, Røseth AG, Aadland E. Measurement of calprotectin in faeces.. Tidsskr Nor Legeforen 128, (2008) Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

12 Extrakce kalprotektinu Standardní extrakční postup PŘÍLOHA IV, KRÁTKÝ POSTUP Předvážená prázdná zkumavky + očkovací klička Váha 50 až 100 mg stolice Přidejte 49 dílů 1x B-CAL-EX Zavřete zkumavku a rychle třepejte 30 minut Přeneste ~1,0 ml do nové zkumavky Odstřeďujte 5 minut při x g Přeneste supernatant do nové zkumavky a pokračujte se spodní nebo rozšířenou hranicí ELISA postupu (1:50 nebo 1:150). Potažená mikrotitrační destička 2x promyjte 100 µl kalibrátorů, kontrol nebo ředěných vzorků inkubujte 30 +/- 5 minut při C na rotátoru destičky 3x promyjte přidejte 100 µl enzymového markeru inkubujte 30 +/- 5 minut při C na rotátoru destičky přidejte 100 µl TMB substrátu 5x promyjte inkubujte 15 +/- 5 minut při C na rotátoru destičky přidejte 100 µl Zastavovacího roztoku Čtěte absorpci při 450 nm (během 30 minut) ČAS DO VÝSLEDKU: 75 minut Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA

13 PŘÍLOHA V, SYMBOLY Popis Použijte do Popis Koncentrát promývacího pufru (10x) Katalogové číslo Inkubační pufr Šarže Kalibrátory A - E In vitro diagnostický prostředek Obsahuje příslušenství pro <n> testů Nízká kontrola Vysoká kontrola Nahlédněte do návodu k použití Enzymový marker Teplotní omezení TMB substrát Extrakční pufr Zastavovací roztok Mikrotitrační destička Datum revize: /12 BÜHLMANN Calprotectin ELISA