CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB

Transkript

1 CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB Vyučující: Zuzana Trojanová ( ) Michaela Sedlářová ( ) Barbora Mieslerová ( ) + Anna Zedková (laborantka) Podmínky k udělení zápočtu: Protokoly Zápočtový test termíny dle domluvy s vyučujícími

2 Mikrobiologické předměty a vybavení mikrobiologické laboratoře Katedry botaniky PřF UP v Olomouci jsou inovovány v rámci projektu OPVK Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/

3 Neděle Mikrobiologický rozbor pitné vody - hodnocení, oxidázový test, test na E. coli, shrnutí Mikroorganismy ve vzduchu - hodnocení, shrnutí Hodnocení - Srovnání účinnosti dezinfekčních prostředků - - hodnocení Mikroorganismy v půdě - hodnocení, shrnutí - Stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika - hodnocení, shrnutí Barvení mikroorganismů - Gramovo barvení - Mikromycety - shrnutí, kvasinky -

4 MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR PITNÉ VODY filtrace 100 ml vody přes membránový filtr přenos 1 ml vody na agarovou plotnu ENTEROKOKY KOLIFORMNÍ B. a E. COLI Slanetz-Bartley agar 37 C (44-48 hod) TTC agar s tergitolem C (24-48 hod) PSYCHROFILNÍ B. MasoPeptonový Agar 22 C (do 72 h) MEZOFILNÍ B. MasoPeptonový Agar C (24-48 h) přeočkování červenohnědých kolonií žluč-aeskulin-azidový agar (BEA), 44 C 48 h přeočkování žlutých kolonií Tryptofan-Sojový Agar (Bujón) 36 C, až 24 h oxidázový test průkaz E. coli indol

5 3. ÚKOL - mikrobiologický rozbor pitné vody - hodnocení Kultivujeme v bioinkubátoru - MEZOFILNÍ BAKTERIE (MPA 1) kultivace při teplotě 36 C až 48 hodin / - PSYCHROFILNÍ BAKTERIE (MPA 2) - při teplotě 26 C až 72 hodin - ENTEROKOKY presumptivní fekální streptokoky při teplotě 37 C h, (Slanetz-Bartleyův agar); narostlé kolonie na membránovém filtru přeočkujeme na žluč-aeskulin-azidový agar /inkubujeme při teplotě 44 C 48 h/ - KOLIFORMNÍ BAKTERIE a E. COLI -při teplotě C 24 hod (agar s tergitolem 7) narostlé kolonie na membránovém filtru přeočkujeme na neselektivní agar /inkubujeme při 36 C až 24 hodin/ a po této době provedeme konfirmační testy - oxidázový test, a test na produkci indolu

6 MPA 2 při teplotě 26 C až 72 hodin - stanovení PSYCHROFILNÍCH BAKTERIÍ Hodnotíme počet kolonií (KTJ/ml) a jejich tvar PSYCHROFILNÍ A MEZOFILNÍ BAKTERIE: pod těmito pojmy se rozumí všechny bakterie schopné růstu na organických látkách, a to při teplotě 22 C (psychrofilní) a 36 C (mezofilní) kultivace se provádí 2-3 dny na univerzálních živných půdách s bohatým obsahem organických živin, jako jsou TYE agar, kasein-sojový agar nebo masopeptonový agar

7 Další způsob stanovení psychrofilních bakterií / kultivovatelných mikroorganismů TYE (Tryptone - Yeast extract ) agar 1 ml vzorku nebo příslušného ředění (dle potřeby 1:10) se v Petriho misce dokonale promíchá s 15ml-20ml roztopeného specifického kultivačního media, zahřátého ve vodní lázni na max. 45 C. Sada misek se po ztuhnutí inkubuje při teplotě 22 C po dobu 68h. Z celkového počtu kolonií vyrostlých v kultivačním mediu se vypočte počet kolonií tvořících jednotek (KTJ) v 1 ml roztoku.

8 Hodnocení: počítají se kolonie v médiu při postranním osvětlení V nezředěném vzorku se uvádí počet kolonie tvořících jednotek v 1 ml roztoku -v případě, že je tam méně než 30 kolonií. Když je jich více než 300 označit jako nepočitatelné, nebo udělat další zředění. Automatické počítací zařízení Kolonie kultivovatelných mikroorganismů při 22 C

9 Pokud vyrostly kolonie na membránovém filtru, jsou přeneseny křížovým roztěrem na žluč-aeskulin- azidový agar (BEA) /inkubace při teplotě 44 C 48 h/. V případě, že původně béžová živná půda zhnědne v místě kultivace, je potvrzena přítomnost fekálních enterokoků. Konečný produkt 6,7- dihydroxykumarin v kombinaci s železitými ionty poskytuje tříslověhnědou až černou sloučeninu, která difunduje do média.

10 Biochemické testy na potvrzení / vyvrácení přítomnosti koliformních bakterií Oxidázový test umělohmotné proužky s detekčním papírkem nebo disky z filtračního papíru, se přiloží přímo na kolonii, hodnocení reakce již po 5-10s při laboratorní teplotě Činidlo pro oxidázový test: Tetramethyl-p-fenylendiamindihydrochlorid - KARCINOGEN Pozitivní reakce = sytě modropurpurové zbarvení papírku koliformní bakterie NEJSOU přítomny Negativní reakce = změna zbarvení po delší době než 60s nebo žádná změna zbarvení koliformní bakterie JSOU přítomny

11 Kolonie, které do 1 minuty zmodrají jsou cytochromoxidáza pozitivní a vyloučí se z počtu koliformních bakterií (jde o zástupce druhů z čeledi Vibrionaceae, např. Aeromonas) Příklady různých bakteriálních druhů rostoucích na selektivně diagnostických médiích ke stanovení koliformních bakterií (Tergitol, Endo apod). Charakteristika kolonií Lak + Oxi + Lak + Oxi - Lak - Oxi + Lak - Oxi - Příklady Druhy rodu Aeromonas Koliformní bakterie Nefermentující tyčinky, druhy rodu Aeromonas Enterobakterie, které nefermentují laktózu, např. Salmonella, Shigella, některé kmeny rodů Citrobacter, Proteus apod.

12 Průkaz Escherichia coli produkce indolu Kolonie z neselektivního agar (TSA) přeočkujeme do tekuté živné půdy s tryptofanem, kultivace při 36 C 24h. Potom do bujónu se zákalem přikápneme Kováczovo činidlo. Pokud se vytvoří růžovo-červené zbarvení = přítomnost indolu - je potvrzena přítomnost E. coli.

13 Limity mikrobiologického rozboru pitné vody podle vyhlášky 252/2004Sb. Test Limit Poznámka Clostridium perfringens Negativní / 100 ml Stanovení se provádí u pitných vod vyrobených z vod povrchových nebo z vod jimi ovlivněných Enterokoky Escherichia coli Koliformní bakterie Psychrofilní bakterie (22 C) Mezofilní bakterie (36 C) Negativní / 100 ml Negativní / 250 ml Negativní / 100 ml Negativní / 250 ml Negativní / 100 ml 200 CFU / ml Platí pouze pro balenou pitnou vodu Platí pouze pro balenou pitnou vodu 500 CFU / ml Platí pro balenou pitnou vodu 500 CFU / ml Platí pro vodu náhradního zásobování a vodu z malých zdrojů *** 100 CFU / ml 20 CFU / ml Platí pro balenou pitnou vodu 100 CFU / ml Platí pro vodu náhradního zásobování a vodu z malých zdrojů *** Pseudomonas aeruginosa Negativní / 250 ml Platí pouze pro balenou pitnou vodu CFU= KTJ

14 Mikrobiologický rozbor pitné vody (vyhláška 252/2004) Zfiltrovat 100 ml vzorku vody (250 ml balené vody) přes membránový filtr, přenést na: Slanetz-Bartleyův agar Kultivace při teplotě 37 C 44 hodin Enterokoky Nárůst červenohnědých kolonií ANO Křížový roztěr na žlučaeskulin-azidový agar (44 C/48h) Béžová živná půda zhnědne v místě kultivace potvrzení přítomnosti Voda není pitná NE Nepřítomnost bakterií Voda je pitná TTC půdu s tergitolem 7 (heptadecylsulfát sodný ) Kultivace při teplotě 37 C 24 hodin Koliformní bakterie a Escherichia coli Nárůst žlutých (okrových) kolonií Křížový roztěr na neselektivní tryptofansójový agar (36 C/24h) Oxidázový test Pozitivní reakce sytě modropurpurové zbarvení papírku koliformní bakterie nejsou přítomny Negativní reakce není změna zabarvení nebo je až po 60s koliformní bakterie jsou přítomny ANO Přeočkovat do tryptofansójového bujónu (36 C/24h) Kovaczovo činidlo Není změna zbarvení E.coli není přítomna Růžovo červené zbarvení = přítomnost indolu potvrzení přítomnosti E. coli

15 1 ml vzorku promíchat v Petriho misce s ml roztopeného specifického kultivačního média (TYE agar) zahřátého ve vodní lázni na max. 45 C Psychrofilní bakterie Inkubace 22 C/68h 1 ml vzorku vody napipetovat na MPA Psychrofilní bakterie Kultivace při teplotě 26 C až 72 hodin Mezofilní bakterie Kultivace při teplotě 36 C až 72 hodin Povrchové vody nebo vody jimi ovlivněné Clostridium perfringens Kultivace anaerobně na m-cp agaru při 44 C/21h Potvrzení kolonií pomocí par amoniaku (žluté kolonie C. perfringens se zbarví do růžova až červena) Počet KTJ vyšší než 200 Počet KTJ vyšší než 100 Přítomnost kolonií NE ANO NE ANO NE ANO Voda je pitná Voda není pitná

16 4. ÚKOL Mikroorganismy ve vzduchu SA Sabouraudův agar selektivní půda pro houby, obsahuje pepton, agar a cukry (glukozu nebo maltozu), ph 5,0. Kultivace při 26 C 72 h. MPA Masopeptonový agar obsahuje pouze výtažek z masa, pepton, sole a 2% agarovou řasu. Je základem pro další půdy. Neselektivní. Kultivace při C h. 1. Vytvoříme seznam míst, kde se nechávaly otevřené Petriho misky zvlášť uzavřené prostory! 2. Zhodnotíme počet narostlých kolonií výsledek se přepočítá na dobu expozice 1 hodina. Zvlášť na MPA a SA. 3. Rozlišíme bakteriální a houbové kolonie, popíšeme kolonie morfologie. 4. Seřadíme odběrná místa podle intenzity kontaminace Petriho misek 5. Slovní závěr

17 Hodnocení narostlých kolonií Rozlišení na BAKTERIÁLNÍ KOLONIE HOUBOVÉ KOLONIE

18 Morfologie kolonií bakterií Lactobacillus plantarum Staphylococcus aureus Okrouhlý tvar kolonií

19 Mycobacterium smegmatis Neznámý izolát Zvlněný tvar kolonií Laločnatý tvar kolonií

20 Neznámý izolát Sektorovitý tvar kolonií

21 TYPY PROFILU KOLONIÍ Pseudomonas aeruginosa Profil zvýšený Streptomyces albus Profil vypouklý

22 Streptococcus salivarius Tvar vypouklý Neznámý izolát Tvar knoflíkovitý

23 Bacillus licheniformis Tvar bradavčitý

24 TYPY OKRAJŮ KOLONIÍ Serratia marcescens Okraje hladké Bacillus anthracis Okraje vroubkované

25 Nocardia asteroides Okraje vláknité Thiomonas sp. Okraje prstovité (caput medusae)

26 Escherichia coli S koncentrickou stavbou Neznámý izolát Okraje svraštělé

27 Paenibacillus dendritiformis ve stresových podmínkách Rhizoidní okraje

28 Hladké (smooth) x drsné (rough) kolonie bakterií Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis

29 Typy pozorovaných bakteriálních kolonií Cf. Streptomyces

30 Typy pozorovaných houbových kolonií Penicillium sp. Penicillium sp. Nesporulující mycelium

31 Typy pozorovaných houbových kolonií Cf. Cladosporium Cf. Fusarium Cf. Chrysosporium

32 TYPY BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ

33 Kontaminace povrchů - Envirocheck Contact TVC

34 Envirocheck

35 Dezinfekce soubor opatření ke zneškodňování mikroorganismů pomoci fyzikálních (teplota nad 90 C), chemických (použití chemických látek) nebo kombinovaných postupů (teplota nad 60 C + použití chemických látek), které mají přerušit cestu nákazy od zdroje k vnímavému jedinci. X Sterilizace proces, který vede k usmrcování všech životaschopných mikroorganismů včetně spor, k nezvratné inaktivaci virů a usmrcení významných helmitů a jejich vajíček Desinfekce Preventivní profylaktická (zdravotnictví, potravinářství) postupy, které zabraňují vzniku infekce Represivní při vzniklé infekci, ohnisko nákazy

36 Fyzikální desinfekce a) Var za atmosférického tlaku po dobu nejméně 30 min b) Var v přetlakových nádobách po dobu nejméně 20 min c) Dezinfekce v přístrojích při teplotě 90 C a vyšší po dobu 10 min d) UV záření o vlnové délce 253,7-264 nm GERMICIDNÍ ZÁŘIVKY e) Filtrace, žíhání, spalování

37 Chemická desinfekce Skupiny dezinfekčních látek Oxidační činidla Halogeny Cyklické sloučeniny Alkálie a kyseliny Sloučeniny těžkých kovů Alkoholy Povrchově aktivní látky Kombinované látky

38 Požadavky na desinfekční prostředek Co nejširší spektrum účinku Stabilní Určitávhodnákoncentrace Snadno skladovatelný Snadno ředitelný vodou Nesmí působit škodlivě na člověka Nesmí poškozovat materiály Nesmí znečišťovat životní prostředí Musíme zachovat určitou délku působení

39

40 Jodofory (Betadine), jodofory + alkohol iodizol (antiseptikum)

41 Glutaraldehyd (Incidur) vyšší stupeň desinfekce

42 Chlorhexidin do spitadermu Kombinace lyzolu, krezolu účinně potlačuje původce tuberkulózy

43

44

45

46 7. ÚKOL - Srovnání účinnosti dezinfekčních prostředků Hodnotíme: 1. Přítomnost blanky na povrchu média u zkumavek se směsí desinfekčního prostředku a mikroorganismu Bacillus atrophaeus + Bacillus přítomen - Bacillus nepřítomen 2. Srovnání účinnosti jednotlivých desinfekčních prostředků mezi sebou Které desinfekční prostředky byly účinné i ve vyšším ředění, a které byly méně účinné?

47 A1 1% (9ml média a 1 ml 10% roztoku desinfekce) A2 0,1% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A1) A3 0,01% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A2) A4 0,001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A3) A5 0,0001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A4) K kontrola (10 ml média)

48 8. ÚKOL Mikroorganismy v půdě B. Průkaz bakterií v půdě/zemině Výsledek: 1. Stanovíme počet kolonií vyrostlých na plotnách a vypočteme množství mikroorganismů v 1 g zeminy. Přepočet počet KTJ x ředění (1% = x 10) x 10 (pipetovali jsme 0,1 ml) 2. Posoudíme morfologické vlastnosti jednotlivých kolonií a zapíšeme do protokolu

49 Typy nalezených bakteriálních kolonií Vláknité kolonie cf. Streptomyces Sporulující bakterie Hladké kolonie

50 ANTIBIOTIKA Antibiotika jsou látky, které inhibují růst (množení) mikroorganizmů (navozují bakteriostázu), nebo je usmrcují (působí baktericidně). Jsou produkovány bakteriemi nebo houbami. Účinné jsou i jejich (semi) syntetické deriváty. Ze širšího hlediska se k nim řadí i jiné antimikrobiální látky, tj. chemoterapeutika (syntetické substance) sulfonamidy a chinolony. Rozdělení na bakteriostatické a baktericidní není zcela přesné, protože mnoho bakteriostatických antibiotik působí ve vyšších koncentracích rovněž baktericidně (chloramfenikol u meningokokové infekce). Naopak některá baktericidní antibiotika neusmrcují určité bakterie ani ve vysokých koncentracích (penicilin G enterokoky). Jiným hlediskem je zařazení antibiotik do skupin podle farmakoterapeutického účinku: protistafylokoková, protipseudomonádová, antianaerobní, protituberkulozní aj. V současnosti je známo přes 6000 látek s antibiotickým účinkem, ale jen asi 70 z nich našlo uplatnění v humánní a veterinární medicíně, ostatní mají příliš výrazné nežádoucí účinky nebo jsou pro pacienta toxické. Antibiotika působí především proti bakteriím, některá jsou však účinná také proti houbám a parazitickým prvokům. Z chemického hlediska jsou antibiotika různorodou skupinou látek, většinou však mají molekulovou hmotnost menší než 2000 daltonů.

51 Historie Objev antibiotik spolu s aplikací hygienických praktik u lékařů (např. mytí rukou a použití sterilizovaných nástrojů) je jeden z nejdůležitějších objevů v současné medicíně. Dnes banální zranění, jako je škrábnutí, s sebou dříve nesla riziko infekce a smrti. Již 2500 let př. n. l. používali v Číně k léčbě infekcí obklady z plesnivého sojového mléka. První skutečně účinné objevené antibiotikum pocházelo z plísně. Francouzský doktor Ernest Duchesne zaznamenal už v roce 1896 fakt, že určité plísně rodu štětičkovec (Penicillium) ničí bakterie. Duchesne a jeho výzkum však zůstal zapomenut po celou generaci. Alexander Fleming během svého výzkumu antibakteriálního působení lysozymu kultivoval baktérie na agarových plotnách a jedna z nich byla napadena plísní druhu Penicillium notatum. Fleming zaznamenal čistou zónu kolem plísňového podhoubí a pochopil, že plíseň vylučuje něco, co růst bakterií zastavilo. I když nebyl schopen sloučeninu izolovat, svůj objev v roce 1929 popsal ve vědecké literatuře. Protože plíseň byla rodu Penicillium, nazval tuto sloučeninu penicilin. Zároveň ve 30. letech 20. století německý vědec Gerhard Domagk zkoumal antibakteriální vlastnosti některých barviv. Jedním z nich byl sulfonamid zvaný prontosil.

52

53 Použití Antibiotika se používají především k léčbě infekčních stavů, někdy však též preventivně (tzv. antibiotická profylaxe). V současnosti je však velkým problémem chybné použití antibiotik - zvláště pak použití nevhodného antibiotika (proti rezistetnímu původci) nebo předepsání antibiotik při léčbě virových onemocnění, jako je rýma nebo chřipka. Při nedodržení celé předepsané dávky antibiotik, obvykle pro pacientův subjektivní pocit zlepšení, nejsou patogenní mikroorganismy zcela zničeny. Kromě selhání léčby vede toto chování k rozvoji antibiotické rezistence u neúplně zahubených populací bakterií. Antibiotika se uplatňují i v jiných oblastech, než je medicína. Podávání malých množství antibiotik hospodářským zvířatům zvyšuje jejich přírůstky. Také při kultivacích mikroorganismů v biotechnologických laboratořích se používají antibiotika, a to v tkáňových kulturách či růstových mediích za účelem potlačení nežádoucí bakteriální kontaminace (v selektivních médiích). Často se používá kontaminace několika antibiotik a antimykotik, aby došlo k pokrytí celého spektra mikroorganismů.

54 Mechanismus účinku Nejdůležitější vlastností antibiotik je selektivita jejich účinku, tzn. že zasahují struktury, které jsou specifické pro mikroorganismy a pacienta víceméně nepoškozují. Rozdělení antibiotik podle mechanizmu účinku Inhibice syntézy buněčné stěny Porucha funkce cytoplazmatické membrány Inhibice syntézy bílkovin Inhibice syntézy nukleových kyselin Peniciliny, cefalosporiny, betalaktamy, karbapenemy, vankomycin, bacitracin Amfotericin B, azoly, polyeny, polymyxiny Aminoglykozidy, chloramfenikol, makrolidy, tetracykliny, linkomycin Sulfonamidy, trimetoprim, chinolony, rifampicin, pyrimetamin Významnou vlastností některých antibiotik (aminoglykozidů a betalaktamů) je postantibiotický efekt (PAE). Tím se rozumí doba, po kterou přetrvává zástava množení bakterií za podmínek, kdy bakterie už nejsou vystaveny účinkům antibiotika (není měřitelná koncentrace antibiotika v tělesných tekutinách či tkáních). Podstata tohoto jevu není dosud spolehlivě vysvětlena.

55

56 Citlivost bakterií k antimikrobiálním látkám Specifická, úzkospektrá antibiotika zasahují buď gramnegativní nebo grampozitivní, nebo dokonce jen některé bakteriální rody. Naproti tomu širokospektrá antibiotika ničí široké spektrum mikroorganismů, často včetně symbiotické mikroflóry na povrchu sliznic. Účinnost jednotlivých antibiotik však závisí také na umístění infekce a schopnosti pronikat danými tkáněmi až k ložisku infekce. Ke správné antibiotické terapii je vhodné zjistit citlivost konkrétní patogenní bakterie k antibiotikům. Všechny bakterie totiž nejsou stejně citlivé a některé jsou dokonce rezistentní a dané antibiotikum proti nim nepůsobí. Zjišťuje se proto tzv. minimální inhibiční koncentrace (MIC), což je koncentrace antibiotika, která zabrání růstu bakteriálních kolonií. Koncentrace, která bakterie usmrtí, se označuje jako minimální baktericidní koncentrace (MBC). Je zřejmé, že v případě primárně baktericidních antibiotik se MBC rovná MIC. V celém průběhu terapie by v místě infekce měla být taková koncentrace antibiotika, která odpovídá alespoň minimální inhibiční koncentraci.

57 Stanovení citlivosti diskovou difúzní metodou - v okolí disku s antibiotikem nerostou žádné kolonie bakterie Staphylococcus aureus

58 Citlivost bakteriálních kultur

59 Rizika antibiotické terapie jsou dána rezistencí mikroorganizmů, nežádoucími a toxickými účinky antibiotik. 1. Rezistence Rezistence znamená odolnost mikroorganizmů vůči působení antibiotika. Rezistence primární odpovídá geneticky podmíněné necitlivosti bakterií na dané antibiotikum bez ohledu na eventuelní předchozí kontakt s antibiotikem (například antibiotika, která narušují syntézu bakteriální buněčné stěny, jsou primárně neúčinná vůči mykoplasmám, které buněčnou stěnu nemají. ). Rezistence sekundární vzniká až v průběhu antibiotické terapie nebo následkem předchozího podávání antibiotika. V přítomnosti antibiotika se selektují rezistentní kmeny, které se nacházejí v každé velké bakteriální populaci. Rychlost rozvoje sekundární rezistence závisí na frekvenci mutací a na množství bakterií s určitým stupněm rezistence. Aby se nevyselektovaly rezistentní kmeny, muselo by být zničeno téměř 100 % infikujících organismů. Přežije-li malá část populace bakterií léčbu a může-li se reprodukovat, průměrná citlivost nové populace na dané antibiotikum bude mnohem menší než u původní populace, protože nová populace vyrostla z nemnohých organismů, které vydržely původní antibiotickou léčbu.

60 2. Nežádoucí a toxické účinky Nežádoucí účinky se objevují při obvyklých dávkách a doporučovaných farmakoterapeutických koncentracích v plazmě. Toxické účinky vznikají po vysokých dávkách, vlivem vysokých plazmatických koncentrací, eventuálně při vyšší citlivosti hostitele. Toxické účinky bývají klinicky charakteristické, závislé na dávce, s dočasnými nebo trvalými následky. Většinou se jim dá předejít nebo jejich klinické projevy zmírnit. Riziko je přijatelné u život ohrožujících onemocnění, není-li dostupné antibiotikum, které by poskytlo při srovnatelném účinku záruku vyšší bezpečnosti v léčbě.

61 Antibiotická rezistence se stala vážným problémem v rozvojových i vyspělých zemích. V některých nemocnicích je míra antibiotikové rezistence mezi mikroorganismy natolik vysoká, že běžná antibiotika jsou pro léčbu infekcí prakticky nepoužitelná. To vede k častějšímu použití nových a dražších sloučenin, což vzápětí vede k dalšímu vzniku rezistence na tyto nové léky a k nekončící snaze vyvinout nová a odlišná antibiotika pro udržení předstihu před infekcemi. Kupříkladu Staphylococcus aureus, který byl úspěšně ničen penicilinem ještě ve 40. a 50. létech 20. století, je dnes z 90 % rezistentní na penicilin. Pro účinnou léčbu tak zbyl jen úzký výběr léků, jako je např. vancomycin. Situaci zhoršuje fakt, že geny kódující antibiotickou rezistenci mohou být přenášeny mezi bakteriemi (např. konjugací). Konjugující bakterie, které vůbec nebyly vystaveny působení antibiotik, pak získávají rezistenci od těch, co ji mají. Problém antibiotické rezistence narůstá, pokud jsou antibiotika použita na léčbu viróz (na něž neúčinkují), a když jsou široce používána preventivně (např. v krmivech pro hospodářská zvířata). Těmito způsoby může rezistenci získat velké množství bakterií, z nichž následně vzniknou nové odolné generace.

62 9. ÚKOL - Stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika Vyhodnocení experimentu : 1. Měříme velikost inhibiční zóny u jednotlivých disků napuštěných antibiotiky vždy ve dvou na sebe kolmých rovinách zprůměrovat pro každé AB

63 Vyhodnocení experimentu : 2. Zhodnotíme, zda látky v česneku ovlivňují růst mikroorganismů

64 diallylthiosulfonát

65 Allicin fytoanticipin s baktericidními a fungicidními účinky Curtis et al. (2004) PMPP 65: 79-89

66 2. a 10. ÚKOL Anaerobní kultivace a Křížový roztěr Vyhodnocení

67 Gramovo barvení

68 DIFERENCIÁLNÍ GRAMOVO BARVENÍ

69 SCHÉMA STAVBY G+ A G- BAKTERIÁLNÍ STĚNY Peptidoglykan (mukopeptid, murein) + teichoová kyselina lipoteichoová kys., polysacharidy + lipopolysacharidy, lipoproteiny

70 Odlišnosti stavby buněčné stěny G + a G - bakterií

71 Micrococcus luteus Dále Staphylococcus aureus, Streptococcus, Bacillus subtilis Escherichia coli Dále Pseudomonas, Salmonella,

72 11. ÚKOL - Barvení mikroorganismů E. Gramovo barvení Cíl úkolu: Seznámit se s nejdůležitějším způsobem barvení, kterým rozdělujeme bakterie na grampozitivní a gramnegativní Pomůcky: Agarová plotna s koloniemi bakterií (E. coli, Staphylococcus aureus) očkovací klička, odmaštěná podložní skla, líhový kahan, sterilní destilovaná voda, roztok krystalové violeti, Lugolův roztok, roztok safraninu, imerzní olej Provedení: Na odmaštěné podložní sklo kápneme malou kapku vody. Vyžíhanou očkovací kličkou přeneseme do kapky vody malé množství bakterií a rozmícháme v jemně zakalenou suspenzi. Pak kličkou rozetřeme suspenzi do plochy tak, aby se vytvořil souvislý povlak. Necháme na vzduchu volně zaschnout a pak fixujeme tak, že sklíčko 3x protáhneme plamenem kahanu.

73 Vlastní barvení: - Barvíme v roztoku krystalové violeti 2-4 min. Opláchneme vodou. - Působíme 60s Lugolovým roztokem, slejeme. Opláchneme vodou. - Odbarvujeme 30s 96% etanolem a ihned opláchneme vodou - Dobarvujeme safraninem 60s, opláchneme vodou, osušíme a bez krycího skla pozorujeme olejovou imerzí pod mikroskopem. Výsledek: Všímáme si tvaru a zabarvení mikrobů. Modrofialově zbarvené bakterie jsou grampozitivní, růžové /červené/ gramnegativní

74 Příprava izolátů plísní, mikroskopické houby

75 Rod Penicillium Rod Penicillium patří mezi vláknité houby, vlákna jsou septovaná a mnohojaderná. Rozmnožuje se asexuálně (je řazen do pomocné skupiny Deuteromycota). Jeho zástupci mohou být isolováni ve formě spor nebo vegetativně rostoucího mycelia zejména z půdního prostředí, ze vzduchu a z nejrůznějších potravin. Většina druhů tohoto rodu patří mezi půdní saprofyty a podílí se na kolonizaci a mineralizaci rozmanitých organických materiálů. Tyto druhy mají velký význam při koloběhu prvků. Některé druhy patří mezi parazity, napadají především suché plody (obilí a další) a podílejí se na biodeterioraci těchto potravin. Za podmínek parazitického růstu produkují mykotoxiny. Některá penicilia napadají i měkké ovoce (citrusy, jablka, hrušky, meruňky a další) a svojí činností způsobují velké ekonomické ztráty

76 Většina mykotoxinů vykazuje kancerogenní účinky pro různé druhy živočichů. Mezi nejznámější patří citrinin (Penicillium sp.), patulin (P.expansum, P. patulinum), cyklopiazonová kyselina (P. griseofulvum, P. patulum), penicilová kyselina (Penicillium sp.), ochratoxiny (Penicillium sp.), rubratoxin (P. rubrum) a další. Využití zástupců tohoto rodu v technologiích: PRODUKCE ANTIBIOTIK penicilin (P. chrysogenum, P. notatum, β- laktamové antibiotikum) griseofulvin (P. griseofulvum heptaketid) PRODUKCE ENZYMŮ - β-1,3-glukanasa (P. italicum, P. emersonii) VÝROBA SÝRŮ P. roqueforti, P. camemberti

77 Botrytis cinerea Plíseň šedá (Botrytis cinerea) je nepohlavní stadium životního cyklu hub Botryotinia fuckeliana, které se rozmnožují výhradně nepohlavně. Choroba napadá zejména oslabené rostliny ve všech fázích vývoje a bez výběru druhů (je polyfágní). Mezi nejvýznamnější hostitele náleží i réva vinná. Na poškozených výhoncích starších rostlin se objevují měkké tmavé, vodnaté a rychle se rozšiřující skvrny, které za krátký čas hnědnou a pokrývají se šedivým povlakem konidií. Plíseň šedá se šíří především ve vlhkém prostředí, nebo za deštivého počasí. V oblastech, kde se pěstují bílé odrůdy vinné révy, se Botrytis cinerea neboli botrytida nazývá ušlechtilou plísní, jelikož snižuje obsah vody v hroznu, čímž vlastně zvyšuje obsah cukru, ale i aciditu, viskozitu a celkovou chuť, takže vznikne sladké, rozplývající se a šťavnatě aromatické víno. Plíseň se postupně rozleze po celém hroznu, až se nakonec bobule scvrknou.

78 Rhizopus Náleží do spájivých hub (Zygomycotina). Mají mohutné rhizoidy, rozmnožují se nepohlavně sporangiosporami a pohlavně spájením za vzniku zygospory Zástupci jsou saprofyté a fakultativní parazité většinou rostlin. Nejčastěji se vyskytuje v půdě, na rozkládajícím se ovoci a zelenině, rozkládajícím se trusu a starém pečivu. Do rodu Rhizopus patří několik obávaných původců systémových mykóz, Mohou růst ve stěnách velkých cév, což má za následek vznik živého trombu (ze změti hyf, trombocytů a leukocytů) a následnou embolii vedoucí k rychlé smrti postiženého. Mohou být i patogeny rostlin Dva druhy se využívají při kvašení. R. oligosporus při výrobě tempehu, fermentovaného sojového sýra a R. oryzae, při výrobě saké, rýžového vína.

79 URČOVÁNÍ MIKROSKOPICKÝCH VLÁKNITÝCH HUB 1. Typ mycelia - přehrádkované x nepřehrádkované 2. Typ spor vznikají exogenně (konidie) x endogenně (sporangiospory) Sporangiospory 3. Velikost a tvar spor (konidií) 4. Uspořádání konidioforů Rhizopus nigricans 5. Zbarvení kultivační půdy Zygomycotina Konidie Oidium neolycopersici Ascomycotina

80 7 skupin konidií na základě morfologie

81 Jednotlivé konidiofory Pyknida Koremium Acervulus Sporodochium

82 Zbarvení kultivačních půd r. Fusarium

83 Kvasinky Kvasinky jsou jednobuněčné houbové mikroorganismy. Většina kvasinek patří do třídy vřeckovýtrusných hub, některé však i do třídy hub stopkovýtrusných, a proto společně netvoří taxonomickou skupinu. Netvoří plodnice, množí se zejména nepohlavně a je pro ně charakteristický způsob dělení buněk, takzvané pučení. Mohou se množit i sexuálně tvorbou vřecek, které však nejsou uzavřená v žádných plodnicích (tedy askokarpech). Netvoří žádné pravé myceliální struktury, pouze pseudomycelium, které se podobá koloniím jednobuněčných organismů. Kvasinky jsou hojně využívány v potravinářství a biotechnologiích. Používají se například při výrobě vína, piva nebo chleba. Využívá se jejich schopnosti kvašení. Jsou ale mezi nimi i původci nemocí, jako je např. Candida albicans.

84 Důležitým fyziologickým znakem kvasinek a kvasinkových mikroorganismů je jejich enzymová aktivita. Při identifikaci si všímáme schopnosti zkvašovat jednotlivé druhy cukrů. Zkoušíme ji kvasnými zkouškami v plynovkách nebo speciálními přístroji.

85 Užitečné kvasinky v kvasném průmyslu Pivovarské kvasinky Ascomycetes, Saccharomycetaceae, r. Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae kvasinky svrchního kvašení Saccharomyces carlsbergensis kvasinky spodního kvašení (v současnosti převažují při výrobě piva) Drožďárenské kvasinky Stejné zařazení jako pivovarské - Saccharomyces cerevisiae. Jsou ale zvlášť vyšlechtěné se schopností se rychle rozmnožovat v aerobním prostředí, na úkor produkce ethanolu

86 Vinařské kvasinky Při ethanolovém kvašení ovocného moštu mají prvořadý význam vinařské (vinné) kvasinky. Do moštů se dostávají z nejrůznějších druhů ovoce Každý mošt obsahuje velmi pestrou paletu různých rodů a druhů kvasinek, z který je však nejdůležitější rod Saccharomyces. Největší uplatnění mají pravé vinařské kvasinky Saccharomyces cerevisiae var. elipsoideus (syn. Saccharomyces vini).

87 Patogenní kvasinky Mezi patogenní druhy kvasinek patří např. zástupci rodů Candida, Cryptococcus, kteří vyvolávají různá kožní, slizniční aj. onemocnění. Candida albicans, zástupce imperfektních kvasinek, je patogen urogenitálního traktu. Zde žije zcela běžně, ale je-li potlačena přirozená poševní mikroflóra (např. léčba antibiotiky) může se začít množit a působit značné obtíže. Cryptococcus neoformans je nebezpečný patogen napadající nervovou soustavu. Hlavními přenašeči jsou holubi. Candida albicans

88 6. ÚKOL - Příprava izolátů plísní - vyhodnocení Příprava monokultur plísní Vyhodnotíme intenzitu rozrůstání kolonií plísní na šikmém agaru Pozorujeme izoláty na agarových terčících pod mikroskopem, pokusíme se určit druh mikroskopické plísně. Konidie a konidiofory Botrytis cinerea Konidie a konidiofory r. Penicillium

89 Protokoly: shrnutí 1. Očkování biotrofních mikroorganismů 2. Anaerobní kultivace mikroorganismů 3. Mikrobiologický rozbor pitné vody 4. Průkaz mikroorganismů v ovzduší 5. Průkaz bakterií v ústní dutině a na povrchu kůže člověka A. Kultivační průkaz bakterií v ústní dutině člověka B. Kultivační průkaz bakterií na kůži 6. Příprava izolátů plísní 7. Srovnání účinnosti dezinfekčních prostředků 8. Mikroorganismy v půdě A. Celulolytické bakterie v půdě B. Průkaz bakterií v půdě/zemině

90 9. Stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika A. Stanovení účinnosti antibiotik difuzní disková metoda B. Stanovení účinnosti přírodních antibiotik česnek 10. Izolace mikroorganismů A. Křížový roztěr B. Očkování na šikmý agar C. Očkování do tekutého média D. Očkování z tekutého na pevné médium 11.Barvení mikroorganismů, mikroskopické sledování mikroorganismů A. Zhotovení nativního preparátu B. Kultivace mikroogranismů ve visící kapce C. Negativní barvení (Buriho metoda) D. Bakterie mléčného kvašení - barvení karbolfuchsinem E. Gramovo barvení

91 Protokoly MUSÍ obsahovat: Jméno a příjmení Název úkolu Cíl úkoku Pomůcky všechny, které jste skutečně používali Postup - VLASTNÍMI SLOVY, stručně, stačí v bodech, ale SROZUMITELNĚ (tak, aby bylo možné podle vašeho postupu pokus naprosto přesně zopakovat) Výsledky pouze surová data - (pozorování barevné změny, tvar kolonií atd.; výpočty, schémata, tabulky - řádně popsané; obrázky, nákresy - nesmí chybět zvětšení a řádný popis obrázku, slovní popis pozorovaného objektu atd.) Jinými slovy popíšete, co se dělo v průběhu pokusu, jak to vypadalo, kolik toho bylo, jaký byl rozdíl mezi negativní a pozitivní reakcí atd. ZÁVĚR - VŽDY celou větou, napíšete CO jste v daném úkolu zjistili a zdůvodníte proč jste zjistili to co jste zjistili. (Např. Vzorek vody z Nemilan nevyhovuje předpisům vyhlášky 252/2004Sb., protože byla prokázána přítomnost enterokoků (kolik KTJ/ ml), které se v pitné vodě vyskytovat nesmí Nebo: Naučili jsme se správný postup při Nebo: Nejůčinnější dezinfekční prostředek/antibiotikum byl protože )

92 Obecné poznámky k vypracování protokolů a nejčastější chyby latinské názvy organismů se píšou kurzívou popis tabulky se píše NAD tabulku, popis obrázku se píše POD obrázek nákresy se kreslí tužkou, čáry k nákresům se rýsují tužkou podle pravítka, popis nákresů se píše propiskou negativní výsledek je taky výsledek, je třeba jenom zdůvodnit, co pravděpodobně vedlo k chybě a proč pokus nevyšel podle očekávání pište vlastními slovy, stručně, jasně, výstižně a přesně přečtěte si po sobě pozorně to, co jste napsali (Nejsou tam chyby? Dává to smysl? Nechybí nic?) nekopírujte/neopisujte bezhlavě texty z prezentace můžete je použít jako osnovu, tu je ale NUTNÉ upravit podle toho co jste skutečně ve cvičení dělali a co jste používali dodržujte alespoň v rámci jednoho protokolu stejný tvar sloves (buď: použili jsme, připravili jsme, zapsali jsme nebo: použil/a jsem, připravil/a jsem, zapsal/a jsem, NEMIXOVAT)