CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2014

Transkript

1 CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2014 Výsledky přehlídek a sborník příspěvků konference Mléko a sýry Praha leden 2014

2 Sponzor: Publikace neprošla jazykovou ani odbornou úpravou. Za obsah příspěvků odpovídají autoři. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, 2014 ISBN

3 OBSAH Celostátní přehlídky sýrů Výsledky 15. ročníku Celostátních přehlídek sýrů. Čurda Ladislav, Štětina Jiří Ekonomické ukazatele výroby mléka v České republice. Kvapilík Jindřich Přednášky konference Mléko a sýry Faktory ovlivňující růst bakterií v savčích mlécích. Švejstil Roman, Rada Vojtěch, Musilová Šárka, Pechar Radko, Vlková Eva, Bunešová Věra, Geigerová Martina Stanovení obsahu imunoglobulinů v kravském a kozím mlezivu. Vašíčková Markéta, Skalka Volodimir, Čurda Ladislav Vliv emulzní enkapsulace buněk L. casei Lafti L-26 do mléčné bílkovinné matrice na jejich životaschopnost v různých podmínkách. Horáčková Šárka, Sedláčková Pavla, Plocková Milada Produkcia organických kyselín kultúrou Lactobacillus acidophilus NCFM Howaru Dophilus v závislosti od zloženia média a atmosféry. Mančušková Tatiana, Medveďová Alžbeta, Valík Ľubomír Kvantitativní stanovení Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus pomocí qpcr. Mühlhansová Andrea, Jebavá Iva, Plocková Milada Kvantifikácia rastu a metabolizmu druhu Geotrichum candidum v modelovom bujóne. Koňuchová Martina, Šípková Anna, Valík Ľubomír Mikrobiálne zloženie májovej bryndze: výsledky kultivačnej a nekultivačnej analýzy. Koreňová Janka, Kuchta Tomáš, Pangallo Domenico, Šaková Nikoleta Cesty prenosu Listeria monocytogenes vo výrobniach tradičných slovenských syrov. Minarovičová Jana, Koreňová Janka, Kaclíková Eva, Kuchta Tomáš Možnosti redukcie a degradácie biogennych amínov v modelových podmienkach. Greif Gabriel, Greifová Mária, Kováčová Monika Ternární směsi tavicích solí obsahující citronan sodný a jejich vliv na tvrdost modelových tavených sýrů. Salek Richardos Nikolaos, Buňka František, Černíková Michaela, Nagyová Gabriela, Kuchař Dalibor, Bačová Helena, Mynarčíková Lucie Studium vlivu ph na separaci laktosy a solí při membránové nanofiltraci syrovátky. Hinková Andrea, Židová Petra, Pour Vladimír, Henke Svatopluk, Bubník Zdeněk Demineralizace syrovátky pomocí elektrodialýzy. Ečer Jiří, Kinčl Jan, Čurda Ladislav Elektrodialýza kyselé syrovátky. Diblíková Lenka, Kubová Aneta, Štětina Jiří, Kinčl Jan, Čurda Ladislav

4 Plakátová sdělení: Vliv vybraných genotypů kappa-kaseinu na složení a technologické vlastnosti mléka od dojnic českého stakatého skotu. Velecká Milena, Javorová Jana, Falta Daniel, Andrýsek Jiří, Večeřa Milan, Chládek Gustav, Palík Jiří, Studený Stanislav Vliv doby mražení na vybrané parametry bazénových vzorků mléka dojnic holštýnského plemene. Javorová Jana, Velecká Milena, Falta Daniel, Andrýsek Jiří, Večera Milan, Chládek Gustav Účinnosť postdipingu na prírodnej báze v prevencii mastitíd. Kirchnerová Katarína, Vršková Martina, Foltys Vladimír, Říha Jan, Kadlec Robert, Sharaf Eldeen Idriss Testy určené na rýchlu detekciu mastitíd v porovnaní s klasickými metódami. Vršková Martina, Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír, Říha Jan, Sharaf Eldeen Idriss Predikcia zvodnenia ovčieho mlieka testovanie zvoleného modelu na mlieku kravskom. Tomáška Martin, Hanuš Oto, Hofericová Margita, Jedelská Radoslava, Chrachalová Katarína, Kološta Miroslav Významné skupiny mikroorganismů v kravském, kozím a ovčím mléce z různých faremních chovů. Kalhotka Libor, Dostálová Lenka, Přichystalová Jitka, Šustová Květoslava, Velecká Milena Sú syry zo surovéh mlieka bezpečné? Medveďová Alžbeta, Studeničová Adriana, Mančušková Tatiana, Valík Ľubomír, Veronika Ferenčíková Technologicky rizikové mikroorganismy v bílých sýrech a solných nálevech. Šviráková Eva, Chramostová Jana, Mühlhansová Andrea, Purkrtová Sabina, Jebavá Iva, Němečková Irena Antimikrobiální účinky levandulové silice na mikroorganismy obsažené v kozí syrovátce. Dostálová Lenka, Detvanová Lenka, Teplá Jana, Přichystalová Jitka, Kalhotka Libor, Rožnovská Doubravka, Lužová Táňa Stanovení Lactobacillus helveticus a Streptococcus thermophilus v tradičních kazašských sýrech vyrobených ze směsi kravského a kozího mléka pomocí qpcr. Zhexenbay Nurshash, Mühlhansová Andrea, Jebavá Iva, Alimardanova Mariam, Kulazhanov Talgat, Kozybaev Asilbek, Plocková Milada BSH aktivita laktobacilů izolovaných z různých zdrojů Sedláčková Pavla, Horáčková Šárka, Plocková Milada Dekarboxylázová aktivita vybraných zákysových bakterií mléčného kvašení v modelovém přírodním sýru. Flasarová Radka, Buňka František, Pachlová Vendula, Menšíková Anna, Georgová Nikola, Buňková Leona Hodnotenie technologických vlastností vybraných kmeňov Lactobacillus plantarum. Bezeková Jana, Čanigová Margita, Lavová Monika, Ducková Viera, Kročko Miroslav

5 Vybrané technologické vlastnosti laktobacilov izolovaných z kozieho mlieka. Klapáčová Lýdia, Slottová Anna, Bujňáková Dobroslava, Greif Gabriel, Kmeť Vladimír, Drončovský Maroš, Greifová Mária, Kološta Miroslav, Tomáška Martin, Dudriková Eva Hodnotenie senzorických vlastností čerstvých syrov s prídavkom probiotickej kultúry. Čanigová Margita, Flimelová Erika, Kňazovická Vladimíra, Ducková Viera Senzorické hodnocení pomazánkových másel. Ilko Vojtěch, Panovská Zdeňka, Míková Kamila Porovnání senzorických metod pro hodnocení tavených sýrů. Panovska Zdeňka, Ilko Vojtěch, Koštejnová Denisa Hodnocení senzorické kvality jogurtů z kozího mléka. Legarová Veronika, Vítová Kateřina, Kouřimská Lenka Vliv jakosti na konkurenceschopnost mléka a mlékárenských výrobků. Renata Hrubá, Jana Stávková Výskyt biogenních aminů v sýrech z farmářské produkce a vybraných fermentovaných mléčných výrobcích v ČR. Buňková Leona, Lorencová Eva, Velichová Helena, Buňka František Použití NIR spektroskopie k analýze vyrobených syrovátkových sýrů. Teplá Jana, Lužová Táňa, Dvořák Lukáš, Strnková Jana, Šustová Květoslava Kolorimetrické měření syrovátky během skladování. Jůzl Miroslav, Sýkora Vladimír, Pytel Roman, Teplá Jana, Lužová Táňa, Dvořák Lukáš, Strnková Jana, Šustová Květoslava Rejstřík autorů

6 6

7 CONTENS Results of 15 th National Cheese Competition Čurda Ladislav, Štětina Jiří Economic indicators of milk production in the Czech Republic Kvapilík Jindřich Conference Milk and Cheeses - Lectures Factors affecting the growth of bacteria in mammalian milks. Švejstil Roman, Rada Vojtěch, Musilová Šárka, Pechar Radko, Vlková Eva, Bunešová Věra, Geigerová Martina Determination of the immunoglobulins in bovine and goat colostrum. Vašíčková Markéta, Skalka Volodimir, Čurda Ladislav The influence of the emulsion encapsulation of L. casei Lafti L-26 cells into milk protein matrix on thein viability in different conditions. Horáčková Šárka, Sedláčková Pavla, Plocková Milada Production of Organic Acids by Lactobacillus acidophilus NCFM Howaru Dophilus Depending on the Media and the Atmospheric Composition. Mančušková Tatiana, Medveďová Alžbeta, Valík Ľubomír Determination of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus using qpcr. Mühlhansová Andrea, Jebavá Iva, Plocková Milada Quantification of Geotrichum candidum growth and metabolism in model broth. Koňuchová Martina, Šípková Anna, Valík Ľubomír Microbial Composition of May Bryndza Cheese Culture Based and Non-culture Based Analysis Results. Koreňová Janka, Kuchta Tomáš, Pangallo Domenico, Šaková Nikoleta Transmition Routs of Listeria monocytogenes in Slovak Traditional Cheese Producers. Minarovičová Jana, Koreňová Janka, Kaclíková Eva, Kuchta Tomáš Reduction ability and the degradation of biogenic amines in model conditions. Greif Gabriel, Greifová Mária, Kováčová Monika Ternary mixtures of emulsifying salts containing trisodium citrates and its influence on texture parameters of processed cheese. Salek Richardos Nikolaos, Buňka František, Černíková Michaela, Nagyová Gabriela, Kuchař Dalibor, Bačová Helena, Mynarčíková Lucie The effect of ph on separation of lactose and salts during membrane nanofiltration of cheese whey. Hinková Andrea, Židová Petra, Pour Vladimír, Henke Svatopluk, Bubník Zdeněk Demineralization of whey by electrodialysis. Ečer Jiří, Kinčl Jan, Čurda Ladislav Electrodialysis of acid whey. Diblíková Lenka, Kubová Aneta, Štětina Jiří, Kinčl Jan, Čurda Ladislav

8 Posters: Effect of selected genotypes of kappa-casein on composition and technological properties of milk from Czech Fleckvieh cows. Velecká Milena, Javorová Jana, Falta Daniel, Andrýsek Jiří, Večeřa Milan, Chládek Gustav, Palík Jiří, Studený Stanislav Effect of freezing time on selected parameters of bulk milk samples from Holstein breed. Javorová Jana, Velecká Milena, Falta Daniel, Andrýsek Jiří, Večera Milan, Chládek Gustav The efficiency of post-diping based on natural in prevention of mastitis. Kirchnerová Katarína, Vršková Martina, Foltys Vladimír, Říha Jan, Kadlec Robert, Sharaf Eldeen Idriss Tests designed for rapid detection of mastitis compared to traditional methods. Vršková Martina, Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír, Říha Jan, Sharaf Eldeen Idriss Prediction of adulteration of sheep s milk with water testing of the selected model on cow s milk. Tomáška Martin, Hanuš Oto, Hofericová Margita, Jedelská Radoslava, Chrachalová Katarína, Kološta Miroslav Important groups of microorganisms in cow's, goat's and sheep's milk from the various farm's breeding. Kalhotka Libor, Dostálová Lenka, Přichystalová Jitka, Šustová Květoslava, Velecká Milena Are cheeses from raw milk safe? Medveďová Alžbeta, Studeničová Adriana, Mančušková Tatiana, Valík Ľubomír, Veronika Ferenčíková Technologically risky microorganisms in white cheeses and salt brines. Šviráková Eva, Chramostová Jana, Mühlhansová Andrea, Purkrtová Sabina, Jebavá Iva, Němečková Irena Antimicrobial activity of Lavandin essential oil against microorganisms present in goat whey. Dostálová Lenka, Detvanová Lenka, Teplá Jana, Přichystalová Jitka, Kalhotka Libor, Rožnovská Doubravka, Lužová Táňa Determination of Lactobacillus helveticus and Streptococcus thermophilus in traditional Kazachstani cheese made from blend of cow and goat milk using qpcr. Zhexenbay Nurshash, Mühlhansová Andrea, Jebavá Iva, Alimardanova Mariam, Kulazhanov Talgat, Kozybaev Asilbek, Plocková Milada BSH activity of lactobacilli isolated from various sources. Sedláčková Pavla, Horáčková Šárka, Plocková Milada The decarboxylation activity of selected starter lactic acid bacteria in model Dutch type cheese. Flasarová Radka, Buňka František, Pachlová Vendula, Menšíková Anna, Georgová Nikola, Buňková Leona Evaluation of technological properties selected strains Lactobacillus plantarum. Bezeková Jana, Čanigová Margita, Lavová Monika, Ducková Viera, Kročko Miroslav

9 Certain processing properties of lactobacilli isolated from goat s milk. Klapáčová Lýdia, Slottová Anna, Bujňáková Dobroslava, Greif Gabriel, Kmeť Vladimír, Drončovský Maroš, Greifová Mária, Kološta Miroslav, Tomáška Martin, Dudriková Eva Evaluation of sensory properties in fresh cheeses with addition of probiotic culture. Čanigová Margita, Flimelová Erika, Kňazovická Vladimíra, Ducková Viera Sensory evaluation of cream spread. Ilko Vojtěch, Panovská Zdeňka, Míková Kamila The comparison of sensory methods for evaluation of spread cheeses. Panovska Zdeňka, Ilko Vojtěch, Koštejnová Denisa Evaluation of Sensory Quality of Goat Milk Yoghurts. Legarová Veronika, Vítová Kateřina, Kouřimská Lenka Influence of quality on competitivity of milk product. Renata Hrubá, Jana Stávková Monitoring of biogenic amines in cheeses manufactured at small-scale farms and in fermented dairy products in the Czech Republic. Buňková Leona, Lorencová Eva, Velichová Helena, Buňka František Use of NIR Spectroscopy for the analysis of made whey cheeses. Teplá Jana, Lužová Táňa, Dvořák Lukáš, Strnková Jana, Šustová Květoslava Colorimetric measurements of the whey during storage. Jůzl Miroslav, Sýkora Vladimír, Pytel Roman, Teplá Jana, Lužová Táňa, Dvořák Lukáš, Strnková Jana, Šustová Květoslava Author index

10 10

11 Celostátní přehlídky sýrů

12

13 VÝSLEDKY 15. ROČNÍKU CELOSTÁTNÍCH PŘEHLÍDEK SÝRŮ Čurda Ladislav, Štětina Jiří Ústav mléka, tuků a kosmetiky, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Results of 15 th National cheese competition Summary: The 15 th National Cheese Competition was organized traditionally by Department of Dairy, Fat and Cosmetics (ICT Prague), Czech-Moravian Dairy Association and Czech Chemical Society on the 16 and 22 of January 2014 in Prague. 59 hard, semi-hard, mould, white, fresh and processed cheeses of 17 producers competed in this year s show. Competitive samples of cheeses were divided into 12 categories and evaluated by a commission of experts and also by a public commission. Two commissions of experts formed from three or four members assessed each cheese. 190 evaluators worked in public commissions. The cheeses were evaluated according to their taste and aroma and their consistence and appearance. Cheeses from abroad (7 samples) were evaluated separately. The results are summarized in tables. Extraordinary cheeses were presented on an exhibition within the show. The National Cheese Show was accompanied by a conference called Milk and Cheeses with a scientific programme involving 16 lectures and 23 poster presentations. Ve dnech 16. a 22. ledna se v Praze uskutečnil 15. ročník Celostátních přehlídek sýrů, tradičně organizovaný Ústavem mléka, tuků a kosmetiky VŠCHT Praha. Spoluorganizátorem je Českomoravský svaz mlékárenský a Odborná skupina pro potravinářskou a agrikulturní chemii České společnosti chemické. Záštitu nad přehlídkami sýrů i navazující konferencí Mléko a sýry převzal již podruhé rektor VŠCHT prof. Ing. Karel Melzoch, CSc. 15. ročník Celostátních přehlídek sýrů zahájilo odborné hodnocení 16. ledna na VŠCHT v Praze. Do hodnocení bylo zařazeno 59 vzorků sýrů od 17 českých výrobců, což je počet srovnatelný s předchozím ročníkem. Označení kategorií a počty sýrů v jednotlivých kategoriích jsou uvedeny v tab. I. Tabulka I Rozdělení sýrů do kategorií. Kategorie Počet vzorků 1 Polotvrdé sýry 20-30% t.v s. 5 2 Polotvrdé sýry % t.v s. 5 3 Tvrdé a extratvrdé sýry a sýry s tvorbou ok 7 4 Uzené sýry 5 5 Sýry s plísní na povrchu 4 6 Sýry s plísní v těstě 4 7 Sýry s mazem na povrchu 7 8 Čerstvé a termizované sýry neochucené 6 9 Čerstvé a termizované sýry ochucené 3 10 Tavené sýry neochucené 4 11 Tavené sýry ochucené (uzené maso, šunka) 3 12 Speciality 6 Celkem 59 Nejvíce sýrů (18) na hodnocení poskytla MADETA a.s., která přihlásila sýry do 11 kategorií z 12 vyhlášených. Z dalších sýráren byly výrazně zastoupeny Mlékárna Klatovy a.s., Mlékárna Polná, spol. s.r.o. a ORRERO a.s., které přihlásily po 5 sýrech. Letošního ročníku již bohužel neúčastnila Miltra B, která v posledních ročnících získala řadu ocenění za sýry eidamského typu. Nejpočetnějšími kategoriemi byly tvrdé a extratvrdé sýry a sýry s tvorbou ok a kategorie sýrů zrajících pod mazem (v obou případech 7 sýrů); naopak minimální počet vzorků pro otevření kategorie (3 sýry alespoň od dvou výrobců) byl v kategorii tavených sýrů ochucených a v kategorii 13

14 sýrů čerstvých a termizovaných ochucených. Bylo hodnoceno rovněž 7 zahraničních sýrů, z toho 2 ze Slovenska. Všechny zúčastněné sýrárny a přihlašovatele sýrů uvádí tab. II. Tabulka II Přehled přihlašovatelů sýrů a jejich zastoupení v jednotlivých kategoriích. Přihlašovatel Počet Kategorie sýrů Česká republika Agricol 2 2 A.W. s.r.o., Loštice 1 1 BEL Sýry Česko a.s., Želetava Ing. Jan Dvorský 1 1 Kromilk s.r.o., Kroměříž Lacrum Velké Meziříčí s.r.o Laktos Madeta a.s., České Budějovice Lactalis Mlékárna Klatovy a.s Mlékárna Olešnice, RMD Mlékárna Otinoves s.r.o. 1 1 Mlékárna Polná s.r.o Moravia Lacto a.s., Jihlava Orrero a.s., Litovel Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany TANY, s.r.o., Nýrsko 1 1 TPK, s.r.o., provoz Pribina Přibyslav Vzorky z ČR celkem Dovozce zahraničních sýrů AGLO Trading s.r.o. 1 Kaas Handel, a.s. 2 Milex - Lipt. Mikuláš 2 Bongrain Czech Management Services 1 Lactalis CZ, s.r.o 1 Sýry z dovozu celkem 7 Způsob hodnocení zůstal zachován z předchozích ročníků. Při odborném hodnocení posuzují každý sýr 2 paralelní 3 až 4 členné komise, každá má nezávislého předsedu a je doplněna dalším nezávislým hodnotitelem nebo zástupci výrobců. Sýry se posuzují ve dvou znacích: vzhled a konzistence (ve výsledném hodnocení tvoří 40 %) a chuť a vůně (60 %). Tuzemským sýrům bylo na základě tohoto hodnocení uděleno celkem 17 diplomů. Ve většině kategorií byl s ohledem na malý počet vzorků udělen pouze jeden diplom, protože počet diplomů v jednotlivých kategoriích závisí na počtu přihlášených vzorků na jeden diplom musí být v kategorii alespoň 3 sýry. Diplomy získávají při dostatečném počtu vzorků (9 a více) první tři sýry v pořadí, v letošním ročníku bohužel žádná kategorie nebyla takto bohatě zastoupena. Celkové výsledky přehlídek jsou shrnuty v tab. III, hodnocení vzorků z dovozu je uvedeno v tab. IV. Tučně jsou vyznačené vzorky, které obdržely diplom. 14

15 Tabulka III Výsledky Celostátních přehlídek sýrů Kategorie Pořadí odborného hodnocení Pořadí veřejného hodnocení Sýr Výrobce (přihlašovatel) tvs suš [%] [%] Odb. hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Neparametrické hodnocení Veřejné hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Eidam 30% Agricol s.r.o ,0 6,0 16,6 77,1 3,3 2 4 Eidam 30% MADETA a.s ,7 6,1 15,2 76,9 2,9 3 3 Eidam 30%, plátky 100 g Agricol s.r.o ,3 8,1 15,5 77,3 3,4 4 5 Eidamská cihla 30% Lacrum Velké Meziříčí s.r.o ,7 4,1 12,5 74,7 3,1 5 2 Eidamský sýr 30% Mlékárna Polná, spol. s.r.o ,0 8,5 15,7 77,3 3, Président Gouda Mlékárna Klatovy a.s ,7 0,8 23,7 84,5 3,2 2 4 Verena ORRERO a.s ,7 7,5 11,1 66,1 4,0 3 5 Caciotta Stagionata ORRERO a.s ,0 7,0 7,6 59,6 4,3 4 2 Eidamský sýr 45% Mlékárna Polná, spol. s.r.o ,7 1,9 17,2 74,9 3,0 5 3 Eidamská cihla 45% Lacrum Velké Meziříčí s.r.o ,3 3,7 16,0 73,3 3, Madeland light MADETA a.s ,7 3,1 21,6 79,6 3,1 2 1 Gran Moravia ORRERO a.s ,7 6,8 25,0 83,1 3,4 3 2 Moravský Bochník Lacrum Velké Meziříčí s.r.o ,7 3,6 22,9 80,9 3,7 4 5 Moravský blok Moravan Moravia Lacto a.s ,7 6,0 17,9 75,8 3,7 5 7 Président Maasdamer Mlékárna Klatovy a.s ,3 7,6 13,3 70,4 3,0 6 4 Président Goldenburg Mlékárna Klatovy a.s ,7 3,3 18,0 75,2 4,2 7 6 Horácký sýr Moravia Lacto a.s ,0 4,4 14,9 71,6 4, Tylžský sýr uzený - plátky MADETA a.s ,0 2,0 13,4 76,3 4,4 2 5 Uhlíř - bílý uzený sýr Mlékárna Olešnice, RMD ,0 3,9 11,7 73,1 5,2 3 3 Madeland uzený MADETA a.s ,7 6,4 13,6 76,6 4,3 4 1 Eidam uzený Mlékárna Polná, spol. s.r.o ,7 8,7 19,3 84,3 3,5 5 2 Farmářský sýr Moravia Lacto a.s ,0 6,4 17,5 81,9 4, Kamadet MADETA a.s ,8 5,9 13,2 73,4 4,2 2 1 Král Sýrů Sametový TPK spol. s r.o ,3 6,5 21,9 84,1 2,9 3 2 Sedlčanský Hermelín smetanový Povltavské mlékárny a.s ,5 4,2 16,3 77,2 3,5 4 4 Sedlčanský Selský Povltavské mlékárny a.s ,3 3,5 11,1 69,7 4, Caesar Bleu MADETA a.s ,5 4,0 17,4 77,4 6,0 2 1 Jihočeská Zlatá Niva MADETA a.s ,8 8,9 18,2 80,3 4,3 3 3 Jihočeská Niva MADETA a.s ,3 5,4 15,4 77,0 3,8 4 4 Niva Extra Mlékárna Otinoves s.r.o ,7 2,8 11,5 71,6 3, Monastére MADETA a.s ,3 5,5 23,6 79,8 5,2 2 7 Sedlčanský Romadůžek Povltavské mlékárny a.s ,3 6,3 11,5 59,4 6,0 3 2 Král Sýrů Hermadur TPK spol. s r.o ,0 4,2 22,4 77,0 5,7 4 5 Jihočeský syreček MADETA a.s ,7 5,9 16,8 68,4 6,5 5 3 Klášterní sýr MADETA a.s ,5 2,7 21,9 76,7 5,2 6 4 Romadur MADETA a.s ,5 4,8 21,2 76,1 5,1 7 6 Pivní sýr - sýr zrající pod mazem Mlékárna Olešnice, RMD ,5 4,8 16,0 67,7 5, Cottage čistý MADETA a.s ,5 3,3 23,4 86,1 3,2 2 2 Galbani mozzarella Mlékárna Klatovy a.s ,3 2,2 17,8 78,3 3,9 3 6 Ricotta speciale ORRERO a.s ,3 3,3 8,4 64,3 4,2 4 3 Galbani mozzarella light Mlékárna Klatovy a.s ,8 3,2 17,6 78,1 3,6 5 4 Krajanka termizovaný smetanový sýr KROMILK a.s ,0 6,6 17,0 77,4 3,8 6 5 Giuncata ORRERO a.s ,8 3,1 9,2 66,0 4, Lučina - Česnek a bylinky Povltavské mlékárny a.s ,5 2,4 17,5 83,5 3,2 2 2 Cottage 150 g pažitka MADETA a.s ,5 2,6 17,5 82,8 3,5 3 3 Čerstvý sýr ananas KROMILK a.s ,3 2,6 11,9 75,2 4,6 15

16 Tabulka III Výsledky Celostátních přehlídek sýrů pokračování Kategorie Pořadí odborného hodnocení Pořadí veřejného hodnocení Sýr Výrobce (přihlašovatel) tvs suš [%] [%] Odb. hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Neparametrické hodnocení Veřejné hodnocení Průměrné hodnocení Interval spolehlivosti Jemný tavený sýr natur Laktos a.s ,8 5,8 13,6 66,9 4,4 2 2 Active, tavený sýr, 150 g BEL Sýry Česko a.s ,0 2,7 21,0 76,3 4,4 3 3 Šumavský tavený sýr smetanový TANY, spol. s.r.o., Nýrsko ,8 5,6 19,7 74,7 3,9 4 1 Lipno extra smetanové MADETA a.s ,8 4,5 22,2 78,2 4, Tavený sýr Lipno se šunkou MADETA a.s ,8 3,3 23,6 79,5 4,5 2 2 Smetanito se šunkou a cibulí BEL Sýry Česko a.s ,0 4,7 22,2 77,4 5,1 3 3 Tavený jemný sýr se šunkou Laktos a.s ,0 5,1 11,8 61,3 4,6 12 Tylžský sýr MADETA a.s ,3 3,1 76,7 4,7 Polotvrdý kozí sýr typu Gouda Ing. Jan Dvorský ,0 3,3 69,4 4,6 Archivní sýr MADETA a.s ,0 3,9 52,6 6,7 Zlatá Praha Mlékárna Polná, spol. s.r.o ,3 4,6 81,4 5,2 Balkánský sýr 1 kg plech Mlékárna Polná, spol. s.r.o ,3 3,4 78,3 3,3 Olomoucké tvarůžky Pusinky z Loštic A.W. spol. s r.o ,7 7,2 74,8 3,6 Tabulka IV Výsledky Celostátních přehlídek sýrů zahraniční vzorky Sýr Dovozce t. v s. [%] Président Le Bleu 140 g Lactalis CZ, s.r.o Džiugas AGLO Trading s.r.o Beemster Royaal Kaas Handel a.s Gruyére Kaas Handel a.s Vrchár MILEX NMNV, a.s Oštiepok MILEX NMNV, a.s Maroilles Fauquet Groupe Soparind Bongrain suš. [%] Kvalitativní kategorie Modus Medián Návrhy na diplomy Kvalitativní kategorie: 1. Vynikající 2. Výborný 3. Velmi dobrý 4. Průměrný 5. Podprůměrný Výrazný úspěch zaznamenaly sýry z Madety, které získaly celkem 8 diplomů. Dvěma diplomy byly oceněny sýry Mlékárny Klatovy, Mlékárny Polná a Povltavských mlékáren. Do kategorie výborných sýrů (t. j. v rozmezí 90 až 100 bodů) byly letos zařazeny tři sýry (v 2012 dva), výrazně narostl i podíl velmi dobrých sýrů a poklesl počet průměrných. Nejvyšší bodové ohodnocení (93,3) získala Zlatá Praha Mlékárny Polná, k výborným sýrům dále patří Cottage bez příchuti (Madeta a.s.) a Lučina s příchutí česnek a bylinky (Povltavské mlékárny a.s.). Žádný sýr nebyl hodnocen jako podprůměrný. Ve skupině zahraničních sýrů byly hodnoceny dva francouzské a dva slovenské sýry, po jednom sýru z Nizozemí, ze Švýcarska a z Litvy. O získání většiny vzorků sýrů z dovozu se zasloužil pan Ladislav Likler. Zahraniční sýry jsou posuzovány odděleně, hodnotí je všichni 16

17 členové odborných komisí i departážní komise. Každý hodnotitel sýr zařazuje do kvalitativních kategorií a navíc má právo 3 vzorky, které považuje za nejlepší, navrhnout na diplom. Nejvíce návrhů na diplom získal sýr Beemster Royaal (Kaas Handel a.s.), který získal 27 návrhů na diplom z 30 možných. Diplomy byly dále oceněny sýry Président Le Bleu (Lactalis CZ, s.r.o.) a Džiugas (AGLO Trading s.r.o.). Veřejné hodnocení se konalo 22. ledna v kongresovém sále Masarykovy koleje a zúčastnilo se ho 190 osob. Přehlídky osobně zahájil rektor VŠCHT prof. Ing. Karel Melzoch, CSc. Shoda mezi odborným a veřejným hodnocením je poměrně dobrá, ze 17 oceněných sýrů v odborném hodnocení by 11 obdrželo diplom i v hodnocení veřejném. Přehled rozdělení sýrů do kvalitativních kategorií v odborném i veřejném hodnocení je uveden v tab. V. Větší rozdíly se vyskytly např. v kategorii uzených sýrů a sýrů s mazem na povrchu. Porovnání četností hodnocení je uvedeno na obr. 1, v obou komisích se nejčastěji objevilo hodnocení mezi 80 a 90 body. Průměrné hodnocení lišilo pouze o 1,4 bodu (76,0 a 74,6 bodu). Medián je pro odborné hodnocení 80 bodů, pro veřejné 76 bodů. Tabulka V Rozdělení sýrů do kvalitativních kategorií Kvalitativní kategorie Bodové hodnocení Odborné hodnocení [% vzorků] Výborný (ideální typ) Veřejné hodnocení [% vzorků] Velmi dobrý Průměrný (standardní kvalita) Podprůměrný (min. 30 b. od každé komise) Nevyhovující < Relativní četnost [%] Hodnocení expertů Veřejné hodnocení Bodové hodnocení Obr. 1. Porovnání relativních četností hodnocení expertů a při veřejném hodnocení. 17

18 Odborný program přehlídek zahrnoval tři přednášky. Přednáška prof. Ing. K. Šustové, Ph.D., byla věnována kvalitě sýrů na českém trhu. Ing. J. Kvapilík, DrSc., analyzoval ve svém vystoupení ekonomické aspekty produkce mléka. Tradiční přednáška Současné sýrařství ve světě a v České republice Ing. J. Kopáčka, CSc., obsahovala i inspirativní příklady inovací v sýrařství. Odborné přednášky byly doplněny prezentací sponzora přehlídek a konference firmy Schoeller Allibert s.r.o., které tímto děkujeme za podporu Celostátních přehlídek sýrů. Na navazující konferenci Mléko a sýry 23. ledna bylo prezentováno 16 přednášek a 23 posterů. Obou akcí se kromě sponzora dále účastnilo 8 firem, jejichž činnost se dotýká především laboratorního vybavení pro analýzu mléka a mléčných výrobků. Tradiční součástí Celostátních přehlídek sýrů i konference je též výstava sýrů. Poděkování patří všem podnikům, které poskytly vzorky sýrů nejen na přehlídky ale i na výstavu. Jejich seznam uvádí tab. VI. Tabulka VI Seznam sýrů vystavených v průběhu Celostátních přehlídek sýrů a konference Mléko a sýry ( ) a) České sýrárny (výrobci) Sýrárna Sýr Sušina [%] Tvs [%] Agricol s.r.o. Polička Eidam 30% Olomoucké tvarůžky malé Olomoucké tvarůžky velké Olomoucké tvarůžky pusinky z Loštic ,8 1,8 1,8 A.W. s.r.o. Loštice Olomoucké tvarůžky věnečky 33 1,8 Olomoucké tvarůžky tyčinky 33 1,8 Olomoucké tvarůžky sváteční tyčinky Olomoucké tvarůžky kousky s kmínem Olomoucké tvarůžky kousky s česnekem ,8 1,8 1,8 BEL Sýry Česko a.s. Želetava Kromilk s.r.o., Kroměříž Syrokrém se šunkou (Karička) Syrokrém light (Karička) Matador smetanový Matador light Matador se šunkou Active Smetanito se šunkou Čerstvý sýr pažitka-česnek Čerstvý sýr steakove koření Čerstvý sýr balaton Čerstvý sýr pikant Čerstvý sýr ananas Blaník smetanový sýr lahodný Blaník smetanový sýr s pažitkou Blaník smetanový sýr zálesák pikantní Blaník smetanový sýr se šunkou a křenem Blaník smetanový sýr s houbami a cibulkou

19 Tabulka VI a - pokračování Sýrárna Madeta a.s., České Budějovice Mlékárna Klatovy a.s., Klatovy Sýr Tylžský sýr Monastére jemný zrající sýr Tylžský sýr plátky Tylžský sýr plátky uzený Caesar Bleu Jihočeská niva zlatá Blaťácké zlato Jihočeský cottage Jihočeský cottage s pažitkou Archivní sýr Madeland light Madeland jemný lahodný sýr plátky Madeland jemný lahodný sýr plátky uzený Klášterní sýr Romadur Syreček Tavený smetanový sýr Primátor Jihočeské lipno se šunkou Jihočeské lipno extra smetanové Lipánek extra smetanový Président camembert tavený sýr Président emmental tavený sýr Président smetanový tavený sýr Président šunkový tavený sýr Président bleu tavený sýr Président romadur tavený sýr Président uzený tavený sýr Tavený smetanový sýr Président light Galbani mozzarela Galbani mozzarela light Président cheddar Šumavský eidam uzený Šumavský eidam 20 % Šumavský eidam 30 % Šumavský eidam 45 % Président maasdamer Prézident emmental Président gouda Président eidam strouhaný Sušina [%] , Tvs [%] , , Mlékárna Otínoves s.r.o., Otínoves Niva extra sýr s ušlechtilou plísní

20 Tabulka VI a - pokračování Sýrárna Mlékárna Polná s.r.o., Polná Moravia Lacto a.s., Jihlava Orrero a.s., Litovel Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany TANY, s.r.o., Nýrsko Sýr Jadel pařený sýr s kořením Jadel pařený uzený sýr Jadel pařený sýr Eidamský sýr 45 % Eidamský sýr uzený Balkánský sýr Moravan Farmářský Uhlíř bílý uzený sýr Pivní sýr Gran moravia Caciotta stagionata Gran moravia přírodní extra tvrdý sýr Ricotta speciale Gran moravia Giuncata fresca Lučina česnek a bylinky Král sýrů hermelín Král sýrů hermadur Král sýrů sametový Sedlčanský smetanový hermelín Sedlčanský hermelín selský Sedlčanský romadůžek Sedlčanský modřenín Delicato smetanové Delicato s klobásou Delicato plísňové Šumavský sýr smetanový Sušina [%] ± 3 66 ± 3-43 ± 3 36, ,5 49, Tvs [%] ± 3 20 ± 3-9 ± 3 8,7 12,7 15,7 13,9 14,4 10, , Tabulka VI b) Zahraniční společnosti (dovozci/výrobci) Sýrárna AGLO Trading s.r.o. Praha, ČR (dovozce) MILEX NMNV, a.s. Liptovský Mikuláš, SR (výrobce, dovozce) MILK AGRO s.r.o. Prešov, SR (výrobce) Lactalis CZ, s.r.o. Praha, ČR (dovozce) Sýr Džiugas tvrdý sýr 40%, zrání 36 měsíců Džiugas tvrdý sýr 40%, zrání 18 měsíců Sýr uzený SNACK Pik-Nik klasik, čerstvé sýrové tyčinky Pik-Nik se šunkou, čerstvé sýrové tyčinky Vrchár Oštiepok Sušina [%] Tvs [%] Volovec Président Le Bleu

21 EKONOMICKÉ UKAZATELE VÝROBY MLÉKA V ČESKÉ REPUBLICE Kvapilík Jindřich Výzkumný ústav živočišné výroby, v. v. i., Praha Uhříněves Economic indicators of milk production in the Czech Republic Summary: In a group of 60 dairy cow farms in the Czech Republic for the year 2012, with a production of 7,595 liters of milk per cow, average full costs of 65 thousand CZK per cow and 9.14 CZK per liter of milk were found. When sales of milk at 58,635 CZK per cow and 7.77 CZK per liter were reported, the average loss was 6,713 CZK per cow per year and 0.97 CZK per liter of milk. The largest five cost items (81.8 %) were feed (41.6 %), labour costs (14.6 %), overhead (10.7 %), cow depreciations (9.2 %) and breeding and veterinary services (5.9%). The variability of full costs and their items show the possibilities of improving the economic performance of all dairy cow breeds. Purchase milk price from July 2012 to November 2013 increased from 7.19 to 9.28 CZK per liter of milk. It can therefore be deduced that milk production in most Czech companies with breeding of dairy cows is profitable. The main factors influencing milk production results include nutrition and feeding, performance, fertility and health of cows and milk purchase prices. The improvement of the situation in breeding of dairy cows should contribute also "... support of ruminants breeding to milk production with preferences of dairy cows..." mentioned in the concept paper "Strategy for growth" (MZe, 2012). Podle 2 Obchodní zákoníku je cílem každého podnikání dosahování zisku. Platí to jak pro výrobce mléka (chovatele dojených krav), tak pro výrobce sýrů (zpracovatele mléka). Syrové mléko je pro chovatele dojnic tržním produktem, pro mlékárny hlavní surovinou. Předpokladem vysokého zisku pro zemědělce je vysoká, pro zpracovatele pak nízká nákupní cena mléka. Pro oba účastníky výroby sýrů je žádoucí vysoká jakost mléka. Příspěvek uvádí hlavní produkční a ekonomické ukazatele výroby syrového kravského mléka a hlavní faktory, které je ovlivňují. Materiál a metodika Mlékem se v tomto příspěvku rozumí syrové kravské mléko. Ukazatele jeho výroby vycházejí z údajů zjištěných u souboru 60 podniků s chovem dojených krav v roce 2012, některé údaje jsou převzaty z domácí a zahraniční literatury a z různých statistických výkazů (ČSÚ, Eurostat, Faostat, MZe, Statistisches Bundesamt aj.). Data jsou zpracována běžnými matematickými a statistickými metodami. Objem mléka je z litrů na kg převáděn koeficientem 1,027. Zahraniční data jsou z evropské na českou měnu přepočítány v kurzu 1 = 25,50 Kč. Vzhledem k vysoké variabilitě ukazatelů je nutno považovat uváděné výsledky za orientační. Výsledky a diskuse Výroba mléka v EU a v ČR Výroba mléka je organizačně, materiálově, ekonomicky a pracovně nejnáročnějším odvětvím živočišné výroby. Dojnice spolu s navazujícími kategoriemi skotu jsou hlavními konzumenty travních porostů a producenty statkových hnojiv, významný je jejich podíl na neprodukčních funkcích (rozvoj venkova, zaměstnanost, udržování krajiny aj.). Mezi roky 1990 a 2012 se především z ekonomických důvodů stavy dojnic v ČR snížily o 70 %. Zvyšování roční dojivosti krav až na kg mléka v roce 2012 (od roku 1990 nárůst téměř o 100 %) má hlavní zásluhu na poměrně stabilní výrobě a prodeji mléka v ČR v posledních letech (obr. 1 a 2). Z tab. I je patrno, že v EU-15 byl pokles stavů dojnic výrazně pomalejší (při nárůstu dojivosti na krávu o 50 % se o cca 14 % zvýšily dodávky mléka ke zpracování). Poklesem stavů dojnic je nepříznivě ovlivňována zaměstnanost v agrárním sektoru a v dalších sektorech (mlékárny, služby, doprava, výroba krmných směsí aj.), produkce statkových hnojiv aj. Zřetelně se snížily vývozy mléčných výrobků, v letech 1991 až 2012 ubylo cca 600 tis. hektarů (59 %) jednoletých a víceletých pícnin na orné půdě. Pokles stavů dojnic celkem má vliv i na pokles objemu výroby hovězího masa mezi roky 1989 a 2012 na třetinu (z cca 418 na 171 tis. tun jatečné hmotnosti). 21

22 Obr. 1 Početní stavy a dojivost krav (%) Obr. 2 Dojivost krav v ČR a v EU Tabulka I Početní stavy a užitkovost dojených krav a výroba mléka v ČR a v EU-15 Ukazatel stavy dojnic mléka na krávu dodávky mléka jedn. ČR EU tis ) % kg % mil. tun 4,59 2,58 2, ,0 4) 1 149, ,1 % Pramen: ČSÚ; MZe; Eurostat; ZMP Bilanz; Statistik Austria. 1) rok 1989; 2) rok 2013; 3) rok 1995; 4) přibližný údaj. Na jednotku plochy zemědělské půdy se v ČR v roce 2012 vyrobilo kolem 35 % mléka a 21 % jatečného skotu stejné produkce v Bavorsku. Z těchto i dalších důvodů je cílem zemědělské politiky ČR zvýšit počty dojnic a skotu celkem a zlepšit pozici živočišné výroby v rámci EU. Výrobní ukazatele souboru podniků s výrobou mléka Dojnice souboru podniků (tab. II) nadojily za rok přibližně o 500 litrů více mléka než celá populace krav v ČR a byly chovány ve větších stádech (581 krav) než cca 95 % krav v kontrole užitkovosti (KU, 281 krav). S výsledky KU za kontrolní rok 2011/12 (1) jsou srovnatelné tučnost (3,90 a 3,87 %) a obsah bílkovin v mléce (3,41 a 3,38 %), mezidobí (406 a 407 dnů) a servis perioda (SP, 122 a 121 den), zabřezávání krav (38 a 40 %) a jalovic (58 a 59 %) po 1. inseminaci, obměna stáda (34,1 a 34,6 %) aj., větší rozdíl byl u věku při 1. otelení (790 a 817 dnů). Signifikantní závislosti (P < 0,01) byly zjištěny mezi dojivostí krav na jedné straně a velikostí stáda (r = +0,315), obsahem tuku a bílkovin v mléce (r = -0,490 a -0,514), březostí krav po 1. a po všech inseminacích (r = -0,410 a -0,443), obměnou stáda (r = +0,369) aj. na straně druhé. Z koeficientů regrese vyplývá, že dojivosti vyšší o litrů mléka na krávu odpovídá nižší obsah tuku a bílkovin o 0,07 a 0,05 %, delší SP o 2,4 dne apod. Ze srovnání 19 podniků s českými strakatými (C) a 33 podniků s holštýnskými kravami (H) vyplynulo, že krávy C ve srovnání s H byly chovány v menších stádech (411 a 581 kusů), za rok nadojily o 24 % méně mléka (6 613 a litrů), o 21 dnů měly kratší mezidobí (393 a 414 dnů), o 22 dnů kratší SP (108 a 130 dnů) a o 5,7 % nižší obměnu stáda (30,4 a 36,1 %). 22

23 Tabulka II Základní ukazatele výroby mléka u souboru podniků (n = 62, 2012) Ukazatel jedn. průměr s min. max. dojnic na podnik n dojivost (mléka) na krávu litry tučnost / obsah bílkovin % 3,90 / 3,41 0,18 / 0,12 3,47 / 3,11 4,43 / 3,69 březost krav po 1. a všech insem. % 38,0 / 39,8 9,4 / 8,9 15,0 / 22,0 59,7 / 77,5 věk při prvním otelení dny mezidobí / SP 406 / / / / 176 odchov telat na 100 krav n obměna stáda krav % 34,1 7,3 16,9 56,6 Pramen: (2). Ekonomické ukazatele souboru podniků s výrobou mléka Za rok 2012 dosáhly náklady cca 68 tis. Kč na krávu, 187 Kč na krmný den (KD) a 9,14 Kč na litr prodaného mléka (tab. III). Po odpočtu vedlejších výrobků (telata a statková hnojiva) se tyto náklady snížily na cca 65 tis., 180 a 8,73 Kč. Při ceně mléka 7,77 Kč bylo dosaženo ztráty Kč na krávu, 18,40 Kč na KD a 0,97 Kč na litr mléka (míra rentability -9,8 %). Dotace podle článku 68 (1 300 Kč na krávu a 0,18 Kč na litr mléka) by vypočítanou ztrátu snížila na cca Kč na krávu, 14,85 Kč na KD a 0,79 Kč na litr. Objem případných dalších dotací se nepodařilo spolehlivě zjistit. Tab. III Ekonomické ukazatele výroby mléka v roce 2012 (soubor 60 podniků) náklady na Ukazatel, položka nákladů krávu krmný den litr mléka (Kč) (Kč) Kč % krmiva celkem ,91 3,78 41,6 pracovní náklady ,00 1,33 14,4 odpisy krav ,29 0,85 9,2 plemenářské a veterinární výkony ,02 0,54 5,9 odpisy majetku ,08 0,43 4,8 energie, opravy a udržování ,63 0,57 6,2 ostatní nákladové položky ,27 0,66 7,1 režijní náklady ,00 0,98 10,7 náklady celkem ,20 9,14 100,0 odpočet vedlejších výrobků ,26 0,41 4,4 náklady na prodané mléko celkem 1) ,04 8,73 95,6 tržby za mléko ,65 7,77 85,8 rozdíl tržeb a nákladů (zisk) ,39-0,97-9,8 Pramen: (3). 1) na litr prodaného mléka (7 595 litrů na krávu a rok). Největšími pěti položkami (81,8 %) jsou krmiva (41,6 %), pracovní náklady (14,6 %), režie (10,7 %), odpisy krav (9,2 %) a plemenářské a veterinární výkony (5,9 %). Zbývajících 18 % nákladů tvoří odpisy majetku, energie, opravy a údržba aj. Variabilita dojivosti, položek nákladů a cen mléka mezi podniky poukazuje na možnosti zlepšování ekonomiky výroby mléka. Výsledky zjištěné u souboru podniků potvrdily známý vliv užitkovosti krav na ekonomické výsledky výroby mléka (tab. IV). Mezi intervaly prodaného mléka na krávu až 7000 a nad litrů mléka klesly náklady na litr přibližně o 2 Kč a 20 %. Obdobné vztahy jsou zřejmé i z koeficientů korelace (tab. V). Lze z nich např. odhadnout, že se zvýšením dojivosti o 100 litrů mléka na krávu a rok došlo ke zvýšení nákladů o 637 Kč, tržeb za mléko o 818 Kč a zisku o 185 Kč na krávu a rok. 23

24 Tab. IV Dojivost krav a ekonomické ukazatele výroby mléka (Kč/litr mléka, 2012) Ukazatel prodej (dodávka) mléka na krávu a rok (tis. litrů) do 6 6 až 7 7 až 8 8 až 9 nad 9 počet podniků tržby (výnosy) celkem 7,72 7,85 7,78 7,71 7,71 krmiva 3,77 3,97 3,88 3,62 3,64 pracovní náklady 1,61 1,56 1,27 1,23 1,10 odpisy krav 0,95 0,98 0,80 0,79 0,77 veter. a plem. výkony 0,50 0,58 0,61 0,46 0,51 odpisy HIM 0,25 0,47 0,52 0,37 0,49 spotřeba energie 0,35 0,35 0,29 0,26 0,25 režie 1,23 1,08 0,97 1,05 0,67 náklady celkem 1) 8,99 9,83 8,82 8,32 7,81 zisk (bez dotace) -1,28-2,12-0,97-0,54-0,10 Pramen: (3). 1) po odpočtu ceny telat a statkových hnojiv. Tab. V Vztahy mezi dojivostí na krávu a ekonomickými ukazateli Dojivost na krávu x (ukazatel) změna se zvýšením dojivosti o 100 l koeficienty korelace mléka na krávu a rok (Kč) na kus na litr mléka na kus na litr mléka krmiva +0,718** -0, ,004 pracovní náklady +0,133-0,369** +36-0,014 odpisy krav +0,294* -0,251* +48-0,005 plem. a veter. výkony +0,438** -0, ,001 odpisy majetku +0,356** +0, ,005 náklady celkem +0,591** -0,325** ,039 tržby za mléko +0,951** +0, ,001 zisk (bez dotací) +0,191 +0,274* ,034 Pramen: (3). * P < 0,05; ** P < 0,01. Ekonomické ukazatele výroby mléka jsou ovlivňovány dojivostí krav, a proto nižší náklady na litr a vyšší zisk je dosahován u krav plemene H, které v roce 2012 dosáhly u hodnoceného souboru a u krav v KU o litrů a kg mléka vyšší dojivost. V přepočtu na krmný den jsou (kromě režií) všechny položky nákladů nižší u dojnic C, na litr mléka (kromě odpisů majetku a plemenářských a veterinárních výkonů) u krav H. Rozdíl v zisku (s dotací na dojnice) lze odhadnout na 0,49 Kč na litr mléka, 7,50 Kč na krmný den a Kč na krávu ve prospěch krav plemene H. V této kalkulaci není zohledněna obvykle vyšší cena prodávaných zástavových býčků, popř. masná užitkovost býků plemene C, která vypočítanou ztrátu z výroby mléka u většiny podniků s chovem českých strakatých krav kompenzuje nebo snižuje. Vedle nákladů rozhodují o ekonomice chovu krav tržby za mléko a prodaná jatečná a chovná zvířata, popř. různé ekonomické podpory a dotace. Pro uplynulé desetileté období jsou pro český sektor mléka charakteristické nižší nákupní ceny, stejně jako v celé unii jejich větší kolísání a nižší dotace než v EU-15. Z obr. 3 je zřejmé, že od ledna 2002 do října 2013 byly všechny měsíční ceny v ČR nižší než v EU-15. Rozdíl průměrů cen za všech 142 měsíců (32,65 a 27,97 za 100 kg, resp. 8,33 a 7,13 Kč za litr) dosahuje 4,68 centu (1,19 Kč) 14 % v neprospěch ČR. Za 10 měsíců roku 2013 jsou podle DairyCo (2013) ceny mléka v EU-15 o 4,8 centu (1,22 Kč) a 14,7 % za kg vyšší než v ČR (37,29 a 32,50 centu, resp. 9,50 a 8,28 Kč). 24

25 Obr. 3. Nákupní ceny mléka v EU a v ČR Obr. 4. Nákupní ceny mléka v ČR Podle statistiky MZe se v roce 2012 ceny mléka v ČR od ledna do července snížily z 8,35 na 7,19 Kč a do prosince se zvýšily na 7,80 Kč, od ledna do listopadu 2013 vykázaly další růst ze 7,93 na 9,28 Kč za litr (o 1,35 Kč a 17 %). Vykazované ceny mléka zřejmě většině chovatelů dojených krav v ČR umožňují dosahování zisku z výroby mléka. Rozdíl v cenách v EU-15 a v ČR, res. v EU- 13, je i nadále značný a při srovnatelní jakosti mléka obtížně zdůvodnitelný. Několik zahraničních údajů Pro možnost porovnání "českých" údajů se zahraničními jsou v tab. VI uvedeny ukazatele ze spolkové země Schleswig-Holstein za rok 2011 (3). Kromě v průměru příznivé ekonomiky výroby mléka je na této kalkulaci zajímavý počet farem (1 155), užitkovost krav (téměř kg mléka) a (v Německu spíše vyjímečný) výpočet úplných (vlastních) nákladů. Kromě řady výrobních ukazatelů se v rámci kalkulace zjišťuje 6 položek výnosů a kolem 20 položek nákladů chovu dojnic, samostatně se hodnotí odchov mladého skotu a výroba krmiv. Tab. VI Náklady na výrobu mléka ve spolkové zemi Schleswig-Holstein (2011) podniky Položka celkem +25 % -25 % Kč/kg % Kč/kg Kč/kg hodnoceno podniků mléka na krávu (ECM kg) tržby za mléko 8,84 87,2 8,91 8,74 tržby za zvířata 0,99 9,7 0,96 1,14 zkrmené mléko 0,07 0,7 0,06 0,07 ostatní výnosy 0,23 2,4 0,29 0,17 tržby (výnosy) celkem 10,14 100,0 10,22 10,12 Krmiva 5,21 53,4 4,52 6,01 Mzdy 1,52 15,6 1,28 1,84 odpisy majetku 0,70 7,8 0,57 0,83 opravy a udržování 0,67 6,9 0,56 0,81 ostatní položky 1,22 11,0 0,93 1,35 náklady celkem 9,76 100,0 8,37 11,47 zisk bez prémií 0,38 3,9 1,85-1,35 podíl prémií na podnik 0,96 9,8 0,83 1,14 zisk s podílem prémií 1,34 13,7 2,68-0,21 Pramen: (4). 25

26 Přínosy opatření v chovu dojnic Tab. VII uvádí odhad ekonomických přínosů několika v praxi využívaných opatření. Jsou vypočítány z vlastních podkladů nebo převzaty z odborných publikací. Uváděné přínosy jsou vzhledem k vysoké variabilitě v praxi zjišťovaných dat a k řadě dalších faktorů orientační. Tab. VII Odhad ekonomických přínosů opatření v chovu dojených krav Opatření odhad přínosu dojivost kg mléka na náklady celkem -0,30 (-0,15 až -0,50) Kč/l mléka krávu a rok zisk +0,22 (+0,05 až 0,50) Kč/kg mléka (mezi cca a kg) krmiva celkem -0,26 (-0,05 až -0,50) Kč/kg mléka obsah tuku +0,1 % zisk +0,08 Kč/kg mléka a +520 Kč/krávu a rok obsah bílkovin +0,1 % zisk +0,13 Kč/kg mléka a Kč/krávu a rok sušina +1 kg krávu/den zisk Kč/krávu/rok cena objemných krmiv -10 % zisk Kč/krávu/rok jadrná směs -50 g/kg mléka zisk K č/krávu/rok ztráty objemných krmiv -5 % zisk +0,25 (+0,16 až +0,42) Kč/kg zkrácení SP (mezidobí) nad zisk +70 (+0 až +180) Kč/den optimální délku zisk (+0 až ) Kč/den obměna stáda -5 % zisk +850 (+360 až ) Kč/krávu/rok +1 laktace produkce krav zisk Kč/krávu/rok odpisy Kč na krávu zisk +300 Kč/krávu/rok poruchy plodnosti ztráta Kč na každou krávu stáda (tiché říje, záněty, cysty aj.) ztráta až Kč na výskyt subklinická mastitida ztráta (2 500 až ) Kč/výskyt kulhání krav ztráta (1 000 až ) Kč/výskyt užitkovost výživa plodnost a zdraví Závěr Mezi faktory, které mohou ekonomiku výroby mléka v ČR zlepšit, patří výrobním podmínkám odpovídající užitkovost a dobrá plodnost krav, přiměřená obměna stáda, nízké úhyny a nutné porážky zvířat, kvalitní objemná krmiva, spolehliví ošetřovatelé, odpovídající management, příjem dotací, vysoké nákupní ceny mléka, větší politická podpora agrárního sektoru a shodné zásady zemědělské politiky ve všech státech unie. Příznivé ekonomické výsledky chovu dojnic krav jsou předpokladem dostatku kvalitní suroviny k výrobě sýrů a dalších mléčných produktů. Příspěvek byl zpracován v rámci řešení projektu NAZV čís. QJ Použitá literatura: 1. Výsledky KU a reprodukce krav. ČMSCH, a. s., 2013 ( 2. KVAPILÍK, J., SYRŮČEK, J., BURDYCH, J.: Výroba mléka v roce Náš chov, č. 7, s , KVAPILÍK, J., SYRŮČEK, J., BURDYCH, J.: Ekonomické ukazatele výroby mléka v roce Náš chov, č. 8, s , THOMSEN, J., (2012). Ergebnisse der Vollkostenauswertung der Rinderspezialberatungsringe in Schleswig-Holstein 2010/2011. LK SH ( Seznam další použité literatury je k dispozici u autora příspěvku. Kontaktní adresa: Jindřich Kvapilík, VÚŽV, v. v. i., Přátelství 815, Praha-Uhříněves Tel.: , kvapilik.jindrich@vuzv.cz 26

27 MLÉKO a SÝRY Přednášky

28

29 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ RŮST BAKTERIÍ V SAVČÍCH MLÉCÍCH Švejstil Roman, Rada Vojtěch, Musilová Šárka, Pechar Radko, Vlková Eva, Bunešová Věra, Geigerová Martina Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, Česká zemědělská univerzita v Praze Factors affecting the growth of bacteria in mammalian milks Summary: Milk as an ideal food for every newborn is not only complete source of nutrients, but also it has an outstanding effect on the composition of newborn intestinal microbiota. It contains both prebiotic oligosaccharides that are useful for the growth of some bacterial species, and several compounds that suppress the growth of undesirable species both in intestinal tract of youngs. This article is focused on the influence of milk, human milk oligosaccharides and lysozyme to intestinal bacteria. Úvod Lidská střevní mikrobiota je unikátním systémem, čítajícím až mikroorganismů (1). Plod se v děloze matky vyvíjí za sterilních podmínek, a tak kolonizace jeho trávicího traktu probíhá především během prvních dnů života. Prvními osadníky střevní mikrobioty jsou fakultativně anaerobní bakterie, které jsou schopny se množit i za aerobních podmínek. Tyto bakterie tak spotřebováním zbylého kyslíku vytvoří ideální podmínky pro ostatní anaerobní bakterie (2). Vývoj střevní mikrobioty je v tomto období ovlivňován mnoha faktory, patří mezi ně způsob porodu, okolní prostředí a výživa mateřským mlékem (3, 4). Mateřské mléko je komplexem mnoha důležitých živin, které dodávají kojenci energii a chrání jej proti nepříznivým vlivům. Zároveň má dozajista velký vliv na složení střevní mikroflóry v raném věku. Je známo, že jedinci, kteří přijímají mléko od matky, mají jiné složení střevní mikrobioty, než ti, kterým je podávána mléčná náhražka. Zatímco u matkou kojených dětí převládají ve stolici bifidobakterie, tak ve stolici dětí, kterým je podávána umělá výživa, jsou převládajícími mikroorganismy koliformní bakterie a streptokoky (5). Přítomnost bifidobakterií je přitom považována za ukazatele stability střevní mikroflóry člověka (6). Savčí mléka ovlivňují složení střevní mikroflóry různými způsoby. Nalezneme v nich jak složky podporující růst některých druhů bakterií, tak i složky, které růst některých druhů bakterií potlačují. Důležitou součástí mateřského mléka jsou oligosacharidy, které disponují těmito selektivními vlastnostmi a podporují například rozvoj bifidobakterií (7, 8). Oligosacharidy se v mateřském mléce vyskytují v množství 5 15 g/l a jejich množství klesá s dobou kojení (9), u dalších savců se obvykle vyskytují v množstvích nižších a zpravidla mají méně komplikovanou strukturu (10, 20). V kozím mléce byly naměřeny hodnoty 0,25 0,30 g/l a v mléce kravském pouze 0,03 0,06 g/l (11). Mateřské mléko se od savčích liší rovněž obsahem bílkovin, který je pouze 10 g/l, zatímco v kravském mléce se množství bílkovin průměrně pohybuje okolo 35 g/l a v mléce kozím okolo 40 g/l. Mateřské mléko má oproti tomu větší množství sacharidů (70 g/l) v porovnání s kravským (47 g/l) a kozím, které má průměrný obsah sacharidů okolo 40 g/l (12). Kromě oligosacharidů obsahují savčí mléka také složky, které růst bakterií naopak potlačují. Některé proteiny mateřského mléka (laktoferin, haptokorin, laktoperoxidasa, imunoglobuliny, lysozym) chrání kojence proti infekčním onemocněním (13). Zatímco laktoperoxidasa je důležitým mechanismem obrany proti patogenním bakteriím v kravském mléce, mateřské mléko obsahuje významné množství lysozymu. Lysozym je antimikrobiální enzym, který se v různých množstvích vyskytuje rovněž i v ostatních tělních tekutinách a brání růstu především grampozitivních bakterií, jelikož rozrušuje peptidoglykan v jejich buněčné stěně (14). Množství lysozymu v mateřském mléce dosahuje hodnot až 400 μg/ml (15), zatímco u dalších savčích mlék jsou hodnoty obsahu lysozymu i o několik řádů nižší. Król et al. (16) zaznamenali hodnoty lysozymu v kravském mléce okolo 0,01 μg/ml, v kozím mléce byly naměřeny hodnoty okolo 0,25 μg/ml (17). Vzhledem k antibakteriálním vlastnostem lysozymu je povoleno využívat jej v potravinářství pod označením E 1105 jako přídatnou látku. Lysozym izolovaný z bílků drůbežích 29

30 vajec tak může být využíván při výrobě sýrů (18), v Japonsku využívají lysozym pro zvýšení údržnosti saké (19). Cíl práce Cílem této práce bylo otestovat růst bifidobakterií v savčích mlécích, a jejich schopnost využívat oligosacharidy mateřského mléka. Dále byl změřen obsah lysozymu v savčích mlécích a také byla testována citlivost různých druhů bifidobakterií na lysozym. Materiál a metody K testování růstu v savčích mlécích byly použity dva kmeny Bifidobacterium animalis izolované z kysaných mléčných výrobků, tři kmeny bifidobakterií izolované ze stolice kojenců (2x B. bifidum, 1x B. longum) a dva kmeny bifidobakterií (B. bifidum a B. longum) izolované z probiotických preparátů. U těchto kmenů byla také ověřena citlivost na lysozym. K testování růstu na oligosacharidech mateřského mléka byly použity tři kmeny Bifidobacterium bifidum (jeden ze stolice kojence a dva sbírkové ze střeva dospělce), jeden kmen B. longum ze stolice kojence a jeden kmen B. animalis z kysaného mléčného výrobku. Všechny kmeny byly izolovány a identifikovány za použití biochemických testů a PCR podle Vlkové et al. (21). Tabulka I. Použité kmeny bifidobakterií. Kmen Původ Citlivost na lysozym (400 µg/ml) B. animalis subsp. lactis 1 kysaný mléčný výrobek ano B. animalis subsp. lactis 2 kysaný mléčný výrobek ano B. bifidum 1 lyofilizát ne B. bifidum 2 stolice kojence ne B. bifidum 3 stolice kojence ano B. bifidum 4 střevo dospělce ne B. bifidum 5 střevo dospělce ne B. longum 1 lyofilizát ano B. longum 2 stolice kojence ano B. longum 3 stolice kojence netestováno Vzorky mateřského mléka byly získány od Ústavu pro péči o matku a dítě v Praze-Podolí. Dárkyně byly tři měsíce po porodu. Vzorky mlék ostatních savců byly odebrány v demonstrační a pokusné stáji ČZU v Praze. Vzorky byly pasterovány (62,5 C, 30 min.). Čistá suspenze každého kmene byla v přibližném množství 10 7 log CFU/mL přidána do 100 μl mléka a kultivována po dobu 24 h při 37 C v mikrotitračních destičkách. Počty bifidobakterií byly spočítány za použití TPY agaru modifikovaného přídavkem mupirocinu (22). Oligosacharidy mateřského mléka byly získány za pomoci organických rozpouštědel a s využitím gelové filtrační chromatografie podle Ročkové et al. (23) a po důkladné purifikaci byly přidány v 1 % (w/w) množství do komplexního média jako jediný zdroj uhlíku. Po přidání bakteriální suspenze proběhla anaerobní kultivace po dobu 24 h při 37 C. Byly spočítány počty kolonií na konci i na počátku kultivace. Měření ph a stanovení obsahu kyseliny mléčné byla provedena pomocí přístroje Reflektoquant (Merck, Darmstadt, Německo). Pro stanovení množství lysozymu byly odebrány vzorky mateřského mléka od 35 matek z Institutu péče o matku a dítě v Praze. Dárkyně byly 10 ± 4 týdny po porodu. Dále bylo získáno 10 vzorků makačího mléka (Macaca mulatta) od společnosti Biotest (Konárovice, ČR), 8 vzorků kravského, 3 vzorky ovčího a 5 vzorků králičího mléka a 1 vzorek kozího a 2 vzorky prasečího 30

31 mleziva z demonstrační a pokusné stáje ČZU v Praze. Lysozym byl stanoven za pomoci dvou metod diskovou difúzní metodou s využitím citlivosti sbírkového kmene Micrococcus luteus na lysozym (24) a prostřednictvím metody ELISA s využitím komerční soupravy (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, USA). ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) je nepřímá metoda stanovení, při které se využívá interakcí specifických protilátek za vzniku komplexu antigen-protilátka. Pro metodu ELISA byly kvůli její vysoké citlivosti vzorky naředěny 1: Ke stanovení citlivosti bifidobakterií na lysozym bylo použito diskové difúzní metody, při které byly sledovány inhibiční zóny inokulovaného lysozymu v médiu s bifidobakteriemi. Byl použit lysozym izolovaný z vaječných bílků (Sigma-Aldrich Co. LLC, USA). Získaná data byla vyhodnocena prostřednictvím statistického programu STATGRAPHICS Centurion XV.II (verze , 2007) za pomoci Duncanovy metody analýzy rozptylu na hladině významnosti α = 0,05 pro rozdíly mezi kmeny bifidobakterií. Porovnání výsledků měření obsahu lysozymu mezi dvěma metodami bylo provedeno pomocí dvouvýběrového t-testu s rovností rozptylů. Výsledky a diskuse Při optimálním růstu produkují bifidobakterie kyselinu octovou a kyselinu mléčnou v přibližném poměru 3:2, jelikož bifidobakterie vytěží z jedné molekuly glukosy 2,5 molekuly ATP a vzniká 1,5 molekuly kyseliny octové a 1 molekula kyseliny mléčné (25). Intenzivní růst bifidobakterií je provázen nízkým konečným ph okolo 4 a produkcí kyseliny mléčné v množství větším, než 1000 mg/l. Tabulka II. Výsledky kultivace bifidobakterií v savčích mlécích. Hodnoty jsou v log CFU (kolonie tvořící jednotku) ± směrodatná odchylka tří měření. Odlišné indexy v jednotlivých sloupcích značí statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05). Kmen Mateřské Prasečí Kravské Králičí Ovčí mléko mléko mlezivo mléko mléko Počáteční koncentrace 5,94±0,46 6,00±0,68 7,38±0,25 8,16±0,68 7,50±0,20 B. animalis ssp. lactis 1 4,53±0,71 a 5,48±0,05 a 7,06±0,40 b 8,07±0,20 b 8,67±0,11 d B. animalis ssp. lactis 2 4,61±0,12 a 6,83±0,18 cd 8,21±0,01 cd 8,50±0,13 c 8,55±0,02 cd B. bifidum 1 8,70±0,09 e 7,18±0,06 d 6,78±0,03 b 7,45±0,08 a 9,36±0,04 f B. bifidum 2 8,62±0,00 de 6,69±0,44 c 8,08±0,17 c 7,27±0,10 a 9,12±0,20 e B. bifidum 3 8,21±0,01 d 7,17±0,20 d 8,23±0,01 cd 8,59±0,03 c 7,62±0,07 b B. longum 1 6,58±0,03 b 5,80±0,27 ab 8,41±0,04 d 7,88±0,33 b 8,42±0,01 c B. longum 2 7,70±0,10 c 6,00±0,19 b 6,38±0,02 a 8,91±0,09 d 6,49±0,03 a Všechny kmeny B. bifidum a kmen B. longum 2 byly schopny růst v mateřském mléce ve vysokých počtech a s průměrnou produkcí 1673 mg/l kyseliny mléčné a ph 4,2 ± 0,37. Kmen lidského původu B. longum 1 v mateřském mléce příliš nerostl, a tak u něj bylo naměřeno i nízké množství kyseliny mléčné (260 mg/l) a ph 5,2. Oba bifidobakteriální kmeny živočišného původu snížily v průběhu kultivace své počty z 6 na 4,57 ± 0,42 log CFU/mL, množství kyseliny mléčné bylo pouze 195 ± 65,36 mg/l a ph 5,65 ±0,35. Tyto kmeny tudíž v mateřském mléce nerostly a zároveň byly citlivé na lysozym. Mateřské mléko tedy podporovalo růst všech tří kmenů bifidobakterií ze stolice kojence i dvou kmenů z probiotického preparátu, ačkoli byly dva kojenecké a jeden komerční kmen citlivé na lysozym. Bifidobakterie nebyly schopny výrazněji růst v prasečím mlezivu, ani v něm nebyly inhibovány. Výsledné počty kolonií byly 6,41 ± 0,74 log CFU/mL s hodnotami kyseliny mléčné 641,7 ± 254,2 mg/l a ph 5,7 ± 0,17. Výjimkou byl kmen B. bifidum 2, který při počtu 6,69 log CFU vyprodukoval 1630 mg/l kyseliny mléčné a ph snížil na hodnotu 5,5. 31

32 Mírný růst bifidobakterií byl vypozorován v kravském mléce. Nejlépe rostl kmen B. longum 1 jehož počty vzrostly o jeden řád na konci kultivace. Průměrná hodnota vyprodukované kyseliny mléčné ale činila jen přibližně 250 mg/l a ph 5,3. Tyto hodnoty ukazují, že kravské mléko výrazně nepodporovalo růst bifidobakterií. Podobných výsledků, jako u kravského, bylo dosaženo i u ovčího mléka. Některé kmeny sice mírně narostly, ale neprodukovaly kyselinu mléčnou ve významném množství, ani nijak výrazně nesnížily ph média. Bifidobakterie tedy v ovčím mléce spíše jen přežívaly. Králičí mléko podporuje růst některých bifidobakterií. B. animalis 1 a 2, které jsou živočišného původu, nebyly inhibovány králičím mlékem, ale také v něm nerostly. Kvůli malému množství vzorku nebylo možno změřit obsah kyseliny mléčné. Tři kmeny lidského původu B. bifidum 1 a 2 a B. longum 2 v králičím mléce narostly z 7,82 log CFU/mL na 8,32 ± 1,59 log CFU/mL, ph 5,5 ± 0,87. Graf 1. Naměřené hodnoty ph po 24 hodinách kultivace. Graf 2. Naměřené hodnoty kyseliny mléčné po 24 hodinách kultivace. Při stanovení množství lysozymu v mateřském mléce byl průměrný obsah lysozymu, naměřený metodou ELISA zhruba dvakrát vyšší, než průměrný obsah naměřený diskovou difúzní metodou. Diskovou difúzní metodou byly naměřeny koncentrace v rozpětí 1 131,83 μg/ml, metodou ELISA byly naměřeny hodnoty v rozpětí 17,43 184,03 μg/ml. Předpokládáme, že metoda ELISA je schopna detekovat veškerý ve vzorku přítomný lysozym. Disková difúzní metoda je oproti tomu schopna detekovat jen antibakteriálně aktivní lysozym. V průběhu skladování se může obsah lysozymu měnit (26), předpokládáme tedy, že i jeho antibakteriální vlastnosti mohou být průběhem skladování a změnami teplot při manipulaci se vzorkem ovlivněny. 32

33 Tabulka III. Výsledky stanovení obsahu lysozymu v savčích mlécích. Vzorek Počet vzorků Lysozym (μg/ml) Difúzní metoda ELISA Mateřské mléko 35 27,91 ± 32,50 a 66,69 ± 40,04 a Makačí mléko 10 20,94 ± 24,11 neměřeno Prasečí mlezivo 2 15,85 b neměřeno Kravské mléko 8 < 1 neměřeno Ovčí mléko 3 < 1 neměřeno Kozí mlezivo 1 19,96 neměřeno Králičí mléko 5 10,07 ± 6,40 neměřeno a Statisticky průkazný rozdíl (P < 0,002). b Průměr ze dvou měření. Při testování růstu bifidobakterií v oligosacharidech mateřského mléka bylo zjištěno, že všechny kmeny bifidobakterií lidského původu byly schopny růst v oligosacharidech mateřského mléka, a to v různé míře. Kmen živočišného původu naopak své počty během kultivace nezvýšil a v oligosacharidech mateřského mléka nerostl, což potvrdily i výsledky měření ph a obsahu kyseliny mléčné po kultivaci. Tabulka IV. Růst bakterií v oligosacharidech mateřského mléka. V tabulce jsou znázorněny počty bakterií na počátku kultivace (0 h), na konci kultivace v oligosacharidech mateřského mléka (24 h OMM) a na konci kultivace v kontrolním neselektivním médiu s glukosou (24 h W+S). Hodnoty jsou v log CFU (kolonie tvořící jednotku) ± směrodatná odchylka tří měření. Odlišné indexy v prostředním sloupci značí statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05). Kmen Log CFU/mL 0 h 24 h OMM 24 h W+S B. animalis subsp. lactis 2 7,72 ± 0,01 7,33 ± 0,09 c 9,06 ± 0,06 B. bifidum 2 6,52 ± 0,24 7,80 ± 0,03 d 7,94 ± 0,01 B. bifidum 4 3,46 ± 0,03 7,12 ± 0,03 b 9,25 ±0,00 B. bifidum 5 3,08 ± 0,00 5,36 ± 0,04 a 7,98 ±0,02 B. longum 3 3,54 ± 0,05 7,94 ± 0,04 e 8,86 ±0,00 Tabulka V. Hodnoty ph a produkce kyseliny mléčné po 24 h kultivace při 37 C v oligosacharidech mateřského mléka (OMM) a neselektivním médiu s glukosou (W+S). 24 h OMM 24 h W+S Kmen kyselina mléčná kyselina mléčná ph ph (mg/l) (mg/l) B. animalis subsp. lactis 2 5, , B. bifidum 2 4, , B. bifidum 4 4, , B. bifidum 5 6, , B. longum 3 5, ,

34 Závěr Pouze mateřské mléko se ukázalo být vhodným substrátem pro růst testovaných kmenů bifidobakterií. Některé bifidobakterie lidského původu v mateřském mléce rostly i přesto, že byly citlivé na lysozym. Ostatní mléka savců neprokázala - i přes vysoký obsah laktosy a dalších živin - dostatečnou podporu růstu testovaných kmenů bakterií, včetně těch živočišného původu. Je ale třeba podotknout, že tato mléka byla dostačujícími alespoň pro přežití testovaných bakterií, tudíž například kravské mléko může být využito pro konzervaci komerčně využívaných kmenů bifidobakterií. Podobných výsledků bylo dosaženo i při testování růstu bifidobakterií na oligosacharidech mateřského mléka. Oligosacharidy podporovaly pouze růst bifidobakterií lidského původu. Poděkování Tento výzkum byl financován ze zdrojů Katedry mikrobiologie, výživy a dietetiky ČZU v Praze a ze zdrojů GAČR S Použitá literatura 1. Moore, W.E., Holdeman, L.V. Human fecal flora: the normal flora of 20 Japanese-Hawaiians. Applied Microbiology, 1974, vol. 27, s Bjursell, M.K., Martens, E.C., Gordon, J.I.,. Functional genomic and metabolic studies of the adaptations of a prominent adult human gut symbiont, Bacteroides thetaiotaomicron, to the suckling period, The Journal of Biological Chemistry, 2006, s Mackie R.I., Sghir A., Gaskins H.R. Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract. The American Journal of Clinical Nutrition. 1999, vol. 69, s Orrhage K., Nord C.E. Factors controlling the bacterial colonization of the intestine in breast-fed infants. Acta Pediatrica, 1999, vol. 430, s Chierici, R., Fanaro, S., Saccomandi, D., Vigi, V. Advances in the modulation of the microbial ecology of the gut in early infancy. Acta Paediatrica, 2003, vol. 91, s Reyed M.R. The Role of Bifidobacteria in Health. Research Journal of Medicine and Medical Sciences, 2007, vol. 2(1), s Locascio, R.G., Ninonuevo, M.R., Kronewitter, S.R., Freeman, S.L., German, J.B., Lebrilla, C.B., Mills, D.A. A versatile and scalable strategy for glycoprofiling bifidobacterial consumption of human milk oligosaccharides. Microbial Biotechnology, 2009, vol. 2, s Ward, R.E., Ninonuevo, M., Mills, D.A., Lebrilla, C.B., German, J.B. In vitro fermentation of breast milk oligosaccharides by Bifidobacterium infantis and Lactobacillus gasseri, Applied Environmental Microbiology, 2006, s Coppa, G.V., Gabrielli, O., Pierani, P., Catassi, C., Carlucci, A., Giorgi, P.L. Changes in Carbohydrate Composition in Human Milk Over 4 Months of Lactation. Pediatrics, 1993, vol. 91, s Boehm, G., Stahl, B., Oligosaccharides from milk. Journal of Nutrition, 2007, vol. 137 no. 3, s. 847S-849S. 11. Martinez-Ferez, A., Rudloff, S., Guadix, A., Henkel, C.A., Pohlentz, G., Boza, J.J., Guadix, E.M., Kunz, C. Goats milk as a natural source of lactose-derived oligosaccharides: Isolation by membrane technology. International Dairy Journal, 2006, vol. 16, s Widdowson, E.M. Harmony of growth. The Lancet, 1970, vol. 1, s Lönnerdal B. Nutritional and physiological significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition, 2003, vol. 77, s Masschalck, B., Michiels, C.W. Antimicrobial properties of lysozyme in relation to foodborne vegetativebakteria. Critical Reviews in Microbiology, 2003, vol. 29, s Clare D.A., Catignani G.L., Swaisgood H.E. Biodefense properties of milk: the role of antimicrobialproteins and peptides. Current Pharmaceutical Design, 2003, vol. 9, s Król J., Litwińczuk Z., Brodziak A., Barłowska J. Lactoferrin, lysozyme and immunoglobulin G content in milk of four breeds of cows managed under intensive production system. Polish Journal of Veterinary Sciences, 2010, vol. 13(2), s Chandan R.C., Parry R.M., Shahani K.M. Lysozyme lipase, and ribonuclease in milk of various species. Journal of Dairy Science, 1968, vol. 51, s

35 18. López-Pedemonte T.J., Roig-Sagués A.X., Trujillo A.J., Capellas M., Guamis. B. Inactivation of spores ofbacillus cereus in cheese by high hydrostatic pressure with the addition of nisin or lysozyme. Journal of DairyScience, 2003, vol. 86, s Yagima M., Hidaka Y., Matsuoka Y. Studies on egg white lysozyme as a preservative of sake. Journal of Fermentation Technology, 1968, vol. 46, s Urashima T., Saito T., Nakamura T., Messer M. Oligosaccharides of milk and colostrum in non-human mammals. Glycoconjugate Journal, 2001, vol. 18, s Vlkova E., Nevoral J., Jencikova B., Kopecčny J., Godefrooij J., Trojanova I., Rada V. Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods. Journal of Microbiological Methods, 2005, vol. 60, s Rada V., Petr J. A new selective medium for the isolation of glucose nonfermenting bifidobacteria from hen caeca. Journal of Microbiological Methods, 2000, vol. 43, s Rockova, S., Nevoral, J., Rada, V., Marsik, P., Sklenar, J., Hinkova, A., Vlkova, E., Marounek, M. Factors affecting the growth of bifidobacteria in human milk. International Dairy Journal, 2011, vol. 21, s Osserman E.F., Lawlor D.P Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine, 1966, vol. 124, s Palframan R.J., Gibson G.R., Rastall R.A. Carbohydrate preferences of Bifidobacterium species isolated from the human gut. Current Issues in Intestinal Microbiology, 2003, vol. 4, s Chang J.C., Chen C.H., Fang L.J., Tsai C.R., Chang Y.C., Wang T.M. Influence of prolonged storage process, pasteurization, and heat treatment on biologically-active human milk proteins. Pediatrics and Neonatology, 2013, vol. 54(6), s Kontaktní adresa Roman Švejstil, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, Česká zemědělská univerzita v Praze, Kamýcká 129, , Praha 6 Suchdol. svejstil@af.czu.cz 35

36 36

37 STANOVENÍ OBSAHU IMUNOGLOBULINŮ V KRAVSKÉM A KOZÍM MLEZIVU Vašíčková Markéta, Skalka Volodymyr, Čurda Ladislav Ústav mléka, tuků a kosmetiky, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Determination of the immunoglobulins in bovine and goat colostrum Summary Colostrum is the first food of young mammals produced a few days after birth (average 5 days ) and as such has an enormous influence on the further development of the individual. It is a liquid with a high nutritional value and especially strong influence on the modulation of the immune system. The most important substances found in colostrum are proteins, essential and nonessential amino acids, fatty acids, lactose, vitamins, minerals, growth factors and antimicrobials. The protein content in colostrum is increased especially by higher concentrations of immunoglobulin s, which have a major influence on the development of immunity. Determination of immunoglobulin can be done by various methods. Large potential for the determination of immunoglobulins has radial immunodiffusion, which represents a simple method based on the interaction between immunoglobulin antibodies coupled to agarose gel in RID kit. For the determination of immunoglobulins is promising SDS-PAGE electrophoresis, but further development is needed. Rapid analysis of colostrum immunoglobulin content in terms of the determination of density, which was significantly correlated to content of immunoglobulins (coefficient of determination was 95 %). The similar dependence has been demonstrated between content of immunoglobulins and refractive index of colostrum samples. Mlezivo představuje prvotní potravu mláďat savců. Jde o tekutinu bohatou na živiny i nejrůznější biologicky aktivní látky. Jednou z nejvýznamnějších složek mleziva jsou imunoglobuliny, které se výrazně podílejí na rozvoji základní obranyschopnosti mláděte. Základní vlastnosti imunoglobulinů Imunoglobuliny tvoří komplexní skupinu látek produkovanou plazmatickými buňkami, tzv. B lymfocyty. Tyto látky se výrazně podílejí na vzniku a podpoře imunity. Základní tvar imunoglobulinů můžeme charakterizovat jako tzv. Y tvar (obr. 1): Obr. 1: Struktura imunoglobulinu IgG1 C konstantní domény V variabilní domény H těžký řetězec L lehký řetězec Fc krystalizující fragment (crystallizable) Fab fragment vážící antigen (antigen binding) 37

38 Imunoglobuliny se vyskytují jako monomery nebo polymerní řetězce ze základního Y tvaru. Ten se skládá ze čtyř polypeptidových řetězců: dvou lehkých řetězců (L) s molekulovou hmotností kolem Da a dvou těžkých řetězců (H) s molekulovou hmotností v rozmezí Da, v závislosti na třídě imunoglobulinu. Struktura Y tvaru je stabilizována pomocí disulfidových vazeb, ty můžeme rozdělit na inter- a intra- molekulární. H řetězec je složen z 2 4 oblastí (domén, C), které jsou složeny z přibližně asi 110 aminokyselin, pak obsahuje variabilní amino (N) - konec (V). Lehké řetězce se skládají z částí λ nebo κ (u hovězích imunoglobulinů převažuje z 90 % λ typ). Každá z nich je zakódovaná v samostatné loci, ty jsou pak tvořeny z jedné terminální domény C a jedné amino (N) - koncové domény V. L a H řetězce se k sobě sbíhají a tím na koncích Y tvaru vzniká antigenní vazebné místo (9;3). Podle druhu C domény rozlišujeme několik tříd imunoglobulinů: Ig G, Ig A, Ig M, Ig E, Ig D. Imunoglobuliny třídy G se dělí ještě na několik podtříd: Ig G1, Ig G2. (9, 3, 7). Imunoglobuliny tvoří asi 1 % z celkových mléčných bílkovin a asi kolem 6 % ze všech syrovátkových bílkovin. Nejvíce jsou zastoupeny imunoglobuliny Ig G, Ig G1, Ig G2, Ig M a Ig A. Ig G tvoří monomery (cca 190 kda) (3, 2). Imunoglobuliny společně s laktoferinem, lysozymem a laktoperoxidasou, tvoří velmi důležitý antimikrobiální ochranný systém mléka. Biologickou funkcí imunoglobulinů v kravském mléce a mlezivu je zajistit ochranu mléčné žlázy a dodat imunologickou ochranu mláděti (teleti) před množstvím patogenů a virů (8, 3, 6). Nejvíce zastoupenou třídou imunoglobulinů v kravském mléce jsou Ig G, které tvoří % veškerých hovězích mléčných imunoglobulinů. Nejvyšší koncentrace těchto Ig se nachází v mlezivu první den po porodu. Během dalších dvou dnů jejich obsah klesá. Ig G má několik funkcí, podílí se na opsonizaci (podpora fagocytózy imunitních buněk), slouží jako prevence vazby patogenů na endoteliální výstelky, inhibují bakteriální metabolismus tím, že blokují enzymy, aglutinaci bakterií a neutralizují toxiny a viry. Na koncentraci Ig G má vliv několik faktorů jako např. hormonální a genetické, věk, nutriční stav a laktační stádium (4, 9, 7). Analytické metody stanovení imunoglobulinů Veškeré analytické metody byly aplikovány na vzorky kravského a kozího mleziva pocházejících z prvního nádoje. Kravské mlezivo pocházelo z ZD Kojčice a kozí mlezivo dodala firma Betula pentula s.r.o. V literatuře jsou nejčastěji zmiňované metody stanovení imunoglobulinů různé imunochemické metody (RID, ELISA, atd.), chromatografické metody (kapalinová chromatografie v různých modifikacích), elektroforetické metody (SDS-PAGE, atd.). Radiální imunodifuze Stanoveni imunoglobulinů v kravském mlezivu radiální imunodifuzí bylo prováděno pomocí komerčně dostupných kitů. Porovnávány byly kity dvou firem, IDBiotech a BindingSite. U obou typů kitů byly analyzovány vzorky mleziva dvakrát. Následně byla porovnávána opakovatelnost měření stejných vzorků daným kitem. Principem metody RID je difuze vzorku agarosovým gelem a následná interakce analyzovaného proteinu s navázanou specifickou protilátkou. Po vytvoření vazby antigen-protilátka se vytvoří precipitační kruh, jehož průměr slouží k přepočtu koncentrace imunoglobulinů v analyzovaném vzorku. Po aplikaci vzorku jsou agarosové destičky kultivovány v případě IDBiotech po dobu 16-24h/37 C, kit BindingSite je kultivován 72h při 25 C. Mezi prvním a druhým měření koncentrace imunoglobulinů stejných vzorků mleziva kitem IDBiotech se objevila poměrně výrazná odchylka. Tyto rozdíly v koncentraci imunoglobulinů mezi oběma pokusy mohly vyplývat ve způsobu uchovávání vzorků mleziva, ty jsou uchovávány při mrazírenských teplotách (-22 C) a každý vzorek byl alespoň jednou rozmražen a opětovně zamražen. Během analýzy imunoglobulinů pomocí radiální imunodifuze hraje důležitou roli i způsob odečtu průměru vytvořených precipitačních kruhů. U kitu IDBiotech mají vzniklé precipitační kruhy málo ostré okraje a proto mohou být odchylky, během měření s touto sadou, dány i nižším rozlišením precipitačních kruhů. Při vizuální kontrole agarosových destiček byly 38

39 vidět nerovnosti ve struktuře gelu, které mohou ovlivnit průběh precipitační reakce mezi imunoglobulinem a protilátkou. Kit BindingSite umožňuje kvantifikaci imunoglobulinů s využitím dvou metod. První metoda pracuje s kalibrační řadou, druhá metoda vychází z přepočítávací tabulky. Porovnáním hodnot získaných u stejných vzorků oběma metodami nebyl objeven statisticky významný rozdíl ve výsledcích. Proto pro další analýzy byla již využita jen metoda bez užití kalibrační řady. Při opakovaném měření nebyly odchylky mezi měřeními statisticky významné (F a t test) na rozdíl od kitu IDBiotech. Hodnoty koncentrace imunoglobulinů ve vzorcích kravského mleziva získané RID jsou uvedeny v tabulce I. Tabulka I: Koncentrace imunoglobulinů v kravském a kozím mlezivu. Rozpětí Medián p s v Výrobce kitu Ig G [mg.ml -1 ] 21,2-93,8 47,08 48,46 18,56 IDBiotech Ig G [mg.ml -1 ] 18,39-240,50 88,50 96,23 49,71 BingingSite Elfstrand et al. (2) uvádějí průměrnou hodnotu obsahu imunoglobulinu G, ve vzorcích prvního nádoje kravského kolostra v rozmezí kolem 90±7,1 mg.ml -1. Pro stanovení koncentrace imunoglobulinů užili autoři této práce také radiální imunodifuzi komerčním kitem firmy BindingSite. Bielmann et al.(1) využili ve své práci také radiální imunodifuzi pro stanovení imunoglobulinů a nalezli průměrnou hodnotu jejich obsahu 94,4 mg.ml -1. Rivero et al. (12) uvádějí jako průměrnou hodnotu obsahu imunoglobulinů ve vzorcích kravského mleziva odebraného z prvního dojení 93,3 mg.ml -1. Z porovnání naměřených hodnot s publikovanými údaji, vyplývá, že požitá RID metoda poskytuje při stanovení imunoglobulinů srovnatelné výsledky. Stanovení hustoty Dle odborné literatury existuje lineární vztah mezi hustotou a obsahem bílkovin (imunoglobulinů) v mlezivu (5). Na hodnotu hustoty má vliv především vysoký obsah globulárních proteinů, proto se vysoký obsah imunoglobulinů projevuje v hodnotě hustoty příslušného vzorku mleziva (11). Měření hustoty proběhlo na 5 vzorcích kravského a kozího mleziva. K měření byl využit automatický hustoměr, který byl pro tyto účely zapůjčen firmou Betula pendula s.r.o. Každý vzorek byl proměřen dvakrát. Naměřené hodnoty hustoty a dalších charakteristik získaných analýzou vzorků mleziva v této práci byly zpracovány graficky jako závislost hustoty na obsahu imunoglobulinů. Obr. 2: Závislost koncentrace imunoglobulinů na hustotě vzorku mleziva 39

40 Z naměřených dat je patrné, že vzorky s nejvyšší hodnotou koncentrace imunoglobulinů, v tomto případě č. 62, který má koncentraci Ig 128,5 mg.ml -1, má i nejvyšší naměřenou hodnotu hustoty 1,0705 g.l -1 a i nejvyšší obsah hrubých bílkovin 16,472 %. Rozsah naměřených hustot je 1,0516-1,0705 g.l -1 pro kravské mlezivo a 1,0301-1,0495 g.l -1 pro kozí mlezivo. Z naměřených rozsahů lze vidět, že hustota nabývá poměrně širokého rozmezí hodnot, což koreluje s vysokou variabilitou ve složení vzorků mleziva. Měření indexu lomu Další rychlou metodou pro analýzu obsahu bílkovin (resp. imunoglobulinů) ve vzorcích mleziva je v literatuře často zmiňovaná metoda měření indexu lomu světla vzorku. Měření indexu lomu světla případně stupňů Brix se vyznačuje dobrou korelací vůči obsahu bílkovin (imunoglobulinů) ve vzorcích mleziva. Tato metoda také omezuje vliv teploty vzorku, který výrazný při měření hustoty (10). Problémem při měření indexu lomu jsou tukové kuličky a kaseinové micely, které mohou zkreslovat výsledky měření. Takovýto vliv lze eliminovat úpravou vzorku, nutné je dbát na čistotu měřicího hranolu a vhodnou vrstvu vzorku (10). Obr. 3: Závislost indexu lomu na koncentraci Ig Ze závislosti indexu lomu na koncentraci imunoglobulinů je patrný lineární charakter (obr. 3). Při porovnání koeficientu determinace (R 2 ) získaného z grafického porovnání indexu lomu a obsahu imunoglobulinů, je zřejmé, že lépe se osvědčil vztah mezi indexem lomu a obsahem hrubých bílkovin (R 2 =97,36%) a procent Brix na obsahu hrubých bílkovin (R 2 =97,33%). Nižší je pak korelace mezi indexem lomu, procenty Brix a koncentrací imunoglobulinů (R 2 =80,66 %; R 2 =80,46 %). SDS-PAGE elektroforéza SDS-PAGE elektroforéza se ukázala být vhodnou metodou pro kvalitativní analýzu proteinů kravského i kozího mleziva. Spojením profilu markeru bílkovin (standardu) a zón jednotlivých separovaných proteinů lze identifikovat hlavně zóny imunoglobulinů, které jsou v mlezivu zastoupeny v poměrně vysokém množství, jak již prokázala radiální imunodifuze. S využitím softwaru SigmaGel proběhl pokus o kvantifikaci proteinů separovaných SDS-PAGE elektroforézou. Při porovnání hodnot koncentrace imunoglobulinů získaných kvantifikací SDS-PAGE elektroforézy a radiální imunodifuze je zřejmé, že hodnoty koncentrace imunoglobulinů se u některých vzorků značně liší a naopak u některých je odchylka v rozmezí rozsahu koncentrace Ig ve vzorku použitého standardu (94,5±27,03 mg.ml -1 ). Problém s odchylkou koncentrace imunoglobulinů u vzorků stanovených pomocí elektroforézy od koncentrace z radiální imunodifuze mohl být způsoben volbou standardu u kvantifikace imunoglobulinů pomocí SDS-PAGE elektroforézy. 40

41 Tabulka II: Průměrné hodnoty obsahu imunoglobulinů, dle SDS-PAGE elektroforézy a srovnání s RID SDS-PAGE RID Vzorek c (Ig) [mg.ml -1 ] c (Ig) [mg.ml -1 ] Δ c Ig p s v p s r 60 57,49 7,10 63,13 11,30-5, ,31 8,56 64,50 5,32-3, ,69 4,35 132,00 50,07-55, ,89 4,75 113,56 46,19-48, ,41 8,62 NA a NA a NA a ,53 4,16 NA a NA a NA a ,21 4,89 NA a NA a NA a 444 6,05 1,64 NA a NA a NA a 72 70,66 8,24 54,88 3,32 15, ,17 5,52 69,13 0,66-6, ,71 6,84 82,63 15,73-10, ,81 4,99 240,50 NA a -134, ,15 7,32 NA a NA a NA a ,38 3,14 NA a NA a NA a ,33 3,49 NA a NA a NA a ,81 1,90 NA a NA a NA a a neanalyzováno Závěr Standardní avšak zdlouhavou a finančně náročnou metodu RID lze pro rychlou kontrolu obsahu imunoglobulinů nahradit měřením hustoty nebo indexu lomu. Při kvantifikaci pomocí SDS-PAGE elektroforézy byly zjištěny poměrně velké odchylky, především pro vzorky s vyšším obsahem imunoglobulinů. Poděkování: Práce vznikla za finanční podpory Ministerstva zemědělství (projekt QJ ) Použitá literatura: 1) Bielmann V., Gillan J., Perkins N. R., Skidmore A. L. Godden S., Leslie K. E.: An evaluation of Brix refractometry instruments for measurement of colostrum quality in dairy cattle. Journal Dairy Science 93, (2010). 2) Elfstrand L., Lindmark-Mansson H., Paulsson M., Nyberg L., Akesson B.: Immunoglobulins, growth factors and growth hormone in bovine colostrum and the effects of processing. International Dairy Journal 12, (2002). 3) Farrell H. M., Jimenez-Flores R., Bleck G. T., Brown J. E., Creamer L. K., Hicks C. L., Hollae C. M., Ng-Kwai-Hang K. F., Swaisgood H. E.: Nomenclature of the proteins of cows milk - sixth revision. Journal Dairy Science 87, (2004). 41

42 4) Fukumoto L. R., Li-Chan E., Kwan L., Nakai S.: Isolation of immunoglobulins from cheese whey using ultrafiltration and immobilized metal affinity chromatography. Food Research International 27, (1994) 5) Fleenor W. A., Stott G. H.: Hydrometer test for estimation of immunoglobulin concentration in bovine colostrum. Journal Dairy Science 63, (1980). 6) Hammer C. J., Quigley J. D., Ribeiro L., Tyler H. D.: Characterization of a colostrum replacer and a colostrum supplement containing IgG concentrate and growth factors. Journal Dairy Science 87, (2004). 7) Liu G., Zhang Ch., Wang J., Bu D., Zhou L., Zhao S., Li S.: Canonical correlation of milk immunoglobulins, lactoferrin concentration and Dairy herd improvement data of Chinese Holstein cows. Livestock Science 128, (2010). 8) Mehraa R., Marnilab P., Korhonen H.: Milk immunoglobulins for health promotion. International Dairy Journal 16, (2006). 9) Madureira A. R., Pereira C. I., Gomes A. M. P., Pintado M. E., Malcata F. X.: Bovine whey proteins Overview on their main biological properties. Food Research International 40, (2007). 10) Moore D. A., Taylor J., Hartman M. L., Sischo W. M.: Quality assessments of waste milk at a calf ranch. Journal Dairy Science 92, (2009). 11) Pritchett L. C., Clive G. C., Hancock D. D., Besser T. E.: Evaluation of the hydrometer for testing immunoglobulin G1 concentrations in Holstein colostrum. Journal Dairy Science 77, (1994). 12) Rivero M. J., Valderrama X., Haines D., Alomar D.: Prediction of immunoglobulin G content in bovine colostrum by near-infrared spectroscopy. Journal of Dairy Science 95 (3), (2012). Kontaktní adresa: Ing. Vašíčková Markéta Ingredia s.r.o.; Pobočka: Příborská 818, Frýdek-Místek, 73801; marketa.vasickova@ingredia.cz 42

43 VLIV EMULZNÍ ENKAPSULACE BUNĚK L. CASEI LAFTI L-26 DO MLÉČNÉ BÍLKOVINNÉ MATRICE NA JEJICH ŽIVOTASCHOPNOST V RŮZNÝCH PODMÍNKÁCH Horáčková Šárka, Sedláčková Pavla, Plocková Milada Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT v Praze The influence of the emulsion encapsulation of L. casei Lafti L-26 cells into milk protein matrix on thein viability in different conditions Summary: Influences of encapsulation of Lactobacillus casei Lafti L-26 cells on their viability in fresh cheese stored in brine solution and in the conditions simulating those in gastrointestinal tract compared with free cells was studied in this work. The encapsulation did not have effect on the stability of cells during long-term storage in cheese but significantly increased the viability of cells at low ph (ph 2). The encapsulation also positively influenced the viability of cells during termization heating at 65 C. No effect of encapsulation was found when the metabolic activity of free and encapsulated cells was compared. Některé vědecké studie potvrzují, že určité probiotické bakterie vykazují slabé přežívání jak v tradičních fermentovaných výrobcích jako je jogurt, tak i v dalších druzích potravin hlavně díky přítomnosti kyseliny mléčné, nízkému ph, přítomnosti peroxidu vodíku nebo vysokému obsahu kyslíku. 1 K zajištění dostatečného množství probiotických mikroorganismů se mohou používat různé metody, např. přídavek nutrientů pro tyto bakterie jako jsou peptidy a aminokyseliny, přídavek prebiotik nebo jejich enkapsulace. 2 Enkapsulace mikrobiálních buněk je fyzikálně-chemický nebo mechanický proces, který vede k vytvoření částic o průměru mezi µm. V potravinářském průmyslu má enkapsulace několik použití - kontrola oxidačních reakcí, maskování chutí, barvy či zápachu. Hlavním důvodem enkapsulace probiotik je ale zvýšení jejich stability v potravině. Enkapsulace rovněž umožňuje kontrolované uvolnění buněk v živé a metabolicky aktivní formě v gastrointestinálním traktu. 3 Proces enkapsulace může probíhat i přirozeně během bakteriálního růstu. Vytváření exopolysacharidů, které obalují buňku, následně snižuje permeabilitu přes tento materiál, a chrání tak buňku vůči nepříznivým podmínkám okolního prostředí. 4 Při použití enkapsulace je nutné sledovat stabilitu enkapsulovaných buněk, vlastnosti materiálu použitého pro enkapsulaci a také, zda je celý tento systém vhodný pro finální aplikaci. Materiály, které se k enkapsulaci používají, jsou nejčastěji polysacharidy jako alginát, karagenan, škrob a jeho deriváty, arabská guma, xanthan a některé bílkoviny jako želatina či bílkoviny mléka. 2 Většina mléčných bílkovin má amfifilní strukturu odpovědnou za výborné povrchové vlastnosti mají schopnost stabilizovat emulze díky své struktuře a míře agregace, která je závislá na ph, iontové síle a teplotě roztoku. 5 Mléčné bílkoviny mají výborné schopnosti vytvářet gely, což již bylo využito k přípravě enkapsulovaných probiotik. 4,6 Cílem této práce bylo ověřit, zda enkapsulace probiotického mikroorganismu Lactobacillus casei Lafti L-26 do mléčné bílkovinné matrice může zvýšit stabilitu tohoto mikroorganismu v čerstvém sýru skladovaném v solném nálevu a při průchodu gastrointestinálním traktem. Byla rovněž porovnána termostabilita volných a enkapsulovaných buněk během termizačního záhřevu. Materiál a metody: Použité mikroorganismy Lactobacillus casei Lafti L-26 DSM Food Specialties, Nizozemsko; komerční probiotický kmen Smetanová kultura FD, Laktoflora MILCOM a.s., Česká republika (Lactococcus lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris, L. lactis subsp. diacetylactis) Enkapsulace buněk K enkapsulaci probiotických buněk laktobacilů do mléčné bílkovinné matrice byla použita emulzní metoda dle Heidebacha a kol. 7, která byla modifikována přídavkem 0,5 % hm. lecitinu jako emulgátoru do oleje. 8 43

44 Stanovení počtu buněk a koncentrace kyseliny mléčné Počet neenkapsulovaných buněk byl stanoven plotnovou metodou po příslušném ředění fyziologickým roztokem na MRS agaru, ph 5,6. Kultivace probíhala po dobu 48 h při 37 C v CO 2 kultivátoru (10 % obj.). Počet enkapsulovaných buněk byl stanoven rovněž plotnovou metodou za stejných podmínek, ale první ředění vzorku bylo provedeno v citrátovém pufru (20 g citrátu sodného v 1 l vody, ph 7,5), což umožnilo kompletní uvolnění buněk z jednotlivých mikrokapslí. Z důvodu přítomnosti dalších mikroorganismů při skladovacím pokusu v čerstvém sýru byl počet L. casei Lafti L-26 stanoven na selektivním MRS agaru s vankomycinem (10 µg/ml), u kterého bylo ph upraveno na 6,2. Koncentrace kyseliny mléčné byla stanovena za použití přístroje RQflex plus 10 (Merk, Darmstadt, Německo) s testovacími proužky pro reflektometrické stanovení dle návodu výrobce. Skladovací pokus K porovnání stability neenkapsulovaných a enkapsulovaných buněk během skladování byl použit laboratorně vyrobený čerstvý sýr, který byl následně skladován v solném nálevu. Sýr byl vyroben z pasterizovaného mléka (72 C, 20 s) o tučnosti 3,5 % hm. za použití 4 % obj. inokula základní kultury (Smetanová kultura FD, Laktoflora MILCOM a.s., ČR) a syřidla Naturen Premium 145 (Chr. Hansen, Dánsko). Po výrobě byl sýr skladován v solném nálevu (16 % hm. NaCl). Do mléka pro přípravu sýrů byly přidány rovněž čerstvě nakultivované buňky L. casei Lafti L-26 nebo mikrokapsle s těmito mikroorganismy tak, aby jejich počáteční koncentrace byla cca KTJ/g. Sýry byly skladovány při 6 8 C po dobu 4 týdnů, každý týden byly odebírány vzorky k analýze. U všech vzorků byla sledována aktivní kyselost (měřeno na ph metru (3020 ph Meter, Jenway, Velká Británie) se skleněnou elektrodou při pokojové teplotě) a aktivita vody na přístroji Aqua Lab CX3 (Decagon Inc., USA). Sušina sýrů byla stanovena vážkově při C sušením do konstantní hmotnosti (ČSN ) 9. Výsledky jsou průměrem ze dvou nezávislých výrob sýrů. Termostabilita buněk Po kultivaci v MRS bujónu (ph 5,6; 18 h, 37 C, 10 % obj. CO 2 ) byly buňky odstředěny, promyty fyziologickým roztokem a resuspendovány v obnoveném odstředěném mléce, které bylo následně zahříváno na vodní lázni po dobu 5 min a 10 min při 65 C. Na začátku a na konci příslušného záhřevu byly odebrány vzorky pro stanovení počtu buněk plotnovou metodou. Stejný postup byl aplikován pro enkapsulované buňky. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ze 3 stanovení. Simulace podmínek trávicího traktu Simulace podmínek trávicího traktu byla adaptována dle metod Botes a kol. 10 a Guglielmotti a kol. 11 Buňky nebo enkapsulované buňky byly promyty a přeneseny do roztoku HCl (ph 2) s přídavkem 0,5 % hm. NaCl a 0,3 hm. % pepsinu 170 U/g (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Po dvou hodinách inkubace při 37 C v CO 2 atmosféře (5 % obj.) bylo ph upraveno na 6,8 ± 0,2 (pomocí 10 % hm. NaOH) a přidány 0,3 % hm. žlučových solí (Merck, Německo) a 0,1 % hm. pankreatinu 165 U/mg (Sigma-Aldrich). V čase 4 a 6 h od začátku pokusu byly opět odebrány vzorky pro stanovení počtu buněk. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr z 3 stanovení. Výsledky a diskuse: Sýr obsahuje v porovnání např. s jogurtem vyšší obsah sušiny, tuku a má i vyšší ph, což má za následek větší ochranu pro probiotické mikroorganismy během skladování a při průchodu gastrointestinálním traktem. 12 V této práci byl pro skladování zvolen čerstvý sýr v solném nálevu, u kterého by se díky nižší aktivitě vody mohla předpokládat nižší stabilita bakteriálních buněk. Z výsledků uvedených v tabulce I je ale patrné, že v tomto prostředí byly enkapsulované i neenkapsulované buňky velmi stabilní po celou dobu sledování. Ke stejnému závěru dospěl i Mirzaei a kol. 12 při 28 denním skladování volných a enkapsulovaných buněk (alginát) Lactobacillus acidophilus La5. Tímto autorem ale byl prokázán pozitivní vliv enkapsulace až při dlouhodobém skladování (182 dní), kdy byl zaznamenán pokles volných buněk o 5 řádů (log KTJ/g) v porovnání s poklesem pouze o 1 řád u buněk enkapsulovaných. Během skladování došlo 44

45 k poklesu obsahu sušiny ze 44,4 % hm. na 31,4 % hm. u sýrů s volnými buňkami, resp. 34,2 % hm. u enkapsulovaných buněk. Aktivita vody, která významně ovlivňuje bakteriální růst, se během skladování snížila z 0,96 na 0,93. Tabulka I Stabilita volných a enkapsulovaných buněk L. casei Lafti L-26 při skladování v čerstvém sýru ve slaném nálevu při 6 8 C Volné buňky Enkapsulované buňky Doba skladování Počet Počet ph aktivita vody (týdny) (log KTJ/g) (log KTJ/g) ph aktivita vody 0 9,10 ± 0,02 5,16 0,96 9,00 ± 0,01 5,04 0,97 1 9,00 ±0,01 5,35 0,93 8,90 ± 0,02 5,1 0,93 2 8,9 ± 0,02 5,31 0,93 8,80 ± 0,01 5,21 0,93 3 n/a n/a n/a n/a n/a n/a 4 8,7 ± 0,02 5,17 0,93 8,60 ± 0,03 5,17 0,93 n/a... nestanoveno Jedním z důležitých faktorů použití probiotik je zajištění jejich životaschopnosti během průchodu trávicím traktem. V další části práce bylo testováno, zda má enkapsulace vliv na stabilitu buněk v podmínkách simulující trávicí trakt. Výsledky pokusu jsou uvedeny na obr. 1. Je patrné, že enkapsulace měla výrazný ochranný charakter, který se projevil zvláště v podmínkách nízkého ph. Po dvou hodinách inkubace bylo snížení počtu volných buněk výrazně vyšší, než tomu bylo u buněk enkapsulovaných. K podobným závěrům dospěl i Madureira a kol. 13, který studoval ochranný efekt syrovátkové matrice na L. casei Lafti L-26, L. acidophilus Lafti L-10 a Bifidobacterium animalis. Rovněž v další studii 14 byl potvrzen ochranný vliv enkapsulace buněk L. rhamnosus LC705 v dvojité emulzi voda - v oleji - ve vodě za použití koncentrované sladké syrovátky jako emulgátoru. Počet buněk (log KTJ/ml) Volné buňky Enkapsulované buňky Čas (h) Obr. 1. Stabilita volných a enkapsulovaných buněk L. casei L-26 v podmínkách simulujících trávicí trakt 45

46 V poslední části práce byl zkoumán vliv enkapsulace buněk na stabilitu během termizačního záhřevu, výsledky jsou uvedeny v tabulce II. Při použití enkapsulace došlo k úbytku buněk při 5minutovém záhřevu o 4 řády, zatímco u volných buněk o 5,5 řádu; při 10 minutovém záhřevu o 6 řádů, resp. o 5 řádů. Je tedy zřejmé, že enkapsulované buňky vykazují vyšší termostabilitu, což může být využito v technologiích, které termizační záhřev vyžadují. Tabulka II Vliv tepelného záhřevu na přežívání volných a enkapsulovaných buněk L. casei Lafti L-26 Čas Volné buňky (log KTJ/ml) Enkapsulované buňky (log KTJ/ml) 0 8,62 9,43 Tepelný záhřev 65 C/5 min 3,04 5,20 65 C/10 min 2,60 4,15 Na závěr experimentů byl proveden test, zda enkapsulace ovlivňuje metabolickou aktivitu buněk pomocí měření ph media a koncentrace vzniklé kyseliny mléčné během 48hodinové kultivace volných i enkapsulovaných buněk v MRS bujónu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce III. Tabulka III Vliv enkapsulace na metabolickou aktivitu buněk L. casei Lafti L-26 Čas (h) Volné buňky Enkapsulované buňky L. casei kys. mléčná L. casei kys. mléčná ph ph (log KTJ/ml) (g/l) (log KTJ/ml) (g/l) 0 7,5 5,56 1,54 8,2 5,66 0, ,4 3,85 14,5 9,7 3,63 17,3 48 9,3 3,64 25,4 9,7 3,63 24,2 Jak je z tabulky patrné, hodnoty ph a koncentrace kyseliny mléčné v médiu jsou po 48 h kultivace obdobné, enkapsulace tedy neovlivnila metabolickou aktivitu buněk, což je důležité z technologického hlediska pohledu. Závěr: Z uvedených výsledků vyplývá, že mlékárenské výrobky mohou být dobrým nosičem probiotických mikroorganismů. Při dlouhodobém skladování buněk L. casei Lafti L-26 v čerstvém sýru uskladněném ve slaném nálevu nebyly zjištěny významné rozdíly v úhynu buněk volných a enkapsulovaných. Vysoká stabilita neenkapsulovaných buněk může být způsobena i velkou odolností použitého mikroorganismu, a proto bude v následujícím výzkumu ověřen vliv enkapsulace v případě citlivějších mikroorganismů jako jsou např. bifidobakterie. Enkapsulace významně ochraňovala buňky před nepříznivými podmínkami trávicího traktu. Při nízkém ph došlo ke snížení počtu neenkapsulovaných buněk asi o 5 řádů, zatímco enkapsulované buňky byly v tomto prostředí stabilní. Enkapsulace rovněž zvýšila termostabilitu buněk. Poděkování: Práce byla podpořena grantem Ministerstva zemědělství ČR č. QI 111B053 z programu Výzkum v agrárním komplexu VAK s počátkem řešení projektů v roce 2011, z podprogramu Udržitelný rozvoj agrárního sektoru. 46

47 Použitá literatura: 1. De Vos P., Faas M. M., Spasojevic M., Sikkema J.: Encapsulation for preservative of functionality and targeted delivery of bioactive food components. International Dairy Journal 20, (2010). 2. Burgain, J., Gaiani, C., Linder, M., Scher, J.: Encapsulation of probiotic living cells: From laboratory scale to industrial applications. Journal of Food Engineering 104, (2011). 3. Nazzaro, F., Orlando, P., Fratianni, F., Coppola, R.: Microencapsulationin food science and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology 23, 1-5 (2011). 4. Heidebach, T., Först, P., Kulozik, U. (2010): Influence of casein-based microencapsulation on freezedrying and storage of probiotic cells. Journal of Food Engineering 98, s Livney, Y. D.: Milk proteins as vehicles for bioactives. Current Opinion in Colloid and Interface Science 15, (2012). 6. Reid A. A., Champagne C. P., Gardner N., Fustier P., Vuillemard J. C.: Survival in food systems of Lactobacillus rhamnosus R011 microentrapped in whey protein gel particles. Journal of Food Science 72, M31-M37 (2007). 7. Heidebach, T., Först, P., Kulozik, U.: Microencapsulation of probiotic cells by means of rennet-gelation of milk proteins. Food Hydrocolloids 23, (2009). 8. Lisová I., Horáčková Š., Kováčová R., Rada V., Plocková M.: Emulsion encapsulation of Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 with the addition of lecithin. Czech Journal of Food Science 31, (2013). 9. ČSN ISO Metody zkoušení mléka a tekutých mléčných výrobků, Praha Botes M., Van Reenen C.A., Dics L.M.T.: Evaluation of Enterococcus mundtii ST4SA and Lactobacillus plantarum 423 as probiotics by using a gastro-intestinal model with infant milk formulations as substrate. International Journal of Food Microbiology 128, (2008). 11. Guglielmotti D. M., Marcó M.B., Golowczyc M., Reinheimer J.A., Del L. Quiberoni A.: Probiotic potential of Lactobacillus delbrueckii strains and their phage resistant mutants. International Dairy Journal 17, (2007). 12. Mirzaei, H., Pourjafar, H., Homayouni, A.: Effect of calcium alginate and resistant starch microencapsulation on the survival rate of Lactobacillus acidophilus La5 and sensory properties in Iranian white brined cheese. Food Chemistry 132, (2012). 13. Madureira, A. R., Amorim, M., Gomes, A. M., Pintado, M. E., Malcata, F. X.: Protective effect of whey cheese matrix on probiotic strains exposed to simulated gastrointestinal conditions. Food Research International 44, (2010). 14. Pimentel-González, D. J., Campos-Montiel, R. G., Lobato-Calleros, C., Pedroza-Islas, R.: Encapsulation of Lactobacillus rhamnosus in double emulsions formulated with sweet whey as emulsifier and survival in simulated gastrointestinal conditions. Food research International 42, (2009). Kontaktní adresa: Ing. Šárka Horáčková, CSc.; Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT, Technická 5, Praha 6; sarka.horackova@vscht.cz 47

48 48

49 PRODUKCIA ORGANICKÝCH KYSELÍN KULTÚROU LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS NCFM HOWARU DOPHILUS V ZÁVISLOSTI OD ZLOŽENIA MÉDIA A ATMOSFÉRY Mančušková Tatiana, Medveďová Alžbeta, Valík Ľubomír Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Slovenská technická univerzita v Bratislave Production of Organic Acids by Lactobacillus acidophilus NCFM Howaru Dophilus Depending on the Media and the Atmospheric Composition Summary: A probiotic strain Lb. acidophilus NCFM Howaru Dophilus is currently a significant part of many dairy products and dietary supplements. This work deals with the impact of growth medium and atmospheric composition on the organic acids production during the cultivation of NCFM strain in MRS broth and milk. The ultra-heat treated milk and the MRS broth with the addition of a sterile solution of the selected substrates (glucose, fructose, maltose, lactose, sucrose, tryptone, cysteine hydrochloride, cell-free culture supernatant of Fresco) were used. The inoculated media were incubated without shaking at 37 ±0.5 C aerobically or to study the effect of the atmosphere in the presence of 15 % CO 2. The media samples were analyzed for organic acids content by the capillary isotachophoresis. Based on the intensive production of the lactic acid without significant changes in concentrations of other detectable acids it can be concluded that the strain belongs to the obligate homofermentative lactobacilli. Depending on the growth media and the atmosphere composition, the lactic acid concentration in the early stationary growth phase ranged from 1.12 g.l -1 (at 15 % CO 2 ) to g.l -1 (with glucose) in MRS broth and from 1.13 g.l -1 (15 % CO 2 ) to g.l -1 (with tryptone) in milk. The maximum lactic acid production rate was set as 1.83 g.l -1.h -1 in MRS broth and as 0.15 g.l -1.h -1 in milk. The results suggest that the limiting factors for growth and metabolism of Lb. acidophilus NCFM are not only carbohydrates, but free amino acids too. V súčasnosti môžeme pozorovať zvýšený dopyt po kvalitných a bezpečných potravinách so zvýšenou nutričnou hodnotou a bez chemickej konzervácie. Navyše si spotrebitelia čoraz viac uvedomujú význam rovnováhy črevného systému pre ich celkový zdravotný stav. Na dopyt trhu reaguje potravinársky priemysel vývojom a produkciou výrobkov s obsahom probiotických kultúr. Medzi probiotické kultúry patrí aj kmeň Lactobacillus acidophilus NCFM Howaru Dophilus, ktorý je už od 70-tych rokov 20. storočia bežne používaný ako súčasť mliečnych výrobkov a doplnkov výživy 1. Európsky úrad pre bezpečnosť potravín vo svojom nedávnom stanovisku 2 potvrdil, že uvedený kmeň môže posilniť prirodzené obranné mechanizmy ľudského tela a posilniť odolnosť voči rôznym infekčným agens. Inhibíciou patogénnych mikroorganizmov, kompetíciou o výživu a/alebo väzbové miesta na epitelových bunkách hostiteľa a produkciou špecifických a/alebo nešpecifických metabolitov môže kultúra Howaru predchádzať vzniku bakteriálnych infekcií. Toto tvrdenie podporili aj štúdie antimikrobiálnej aktivity probiotika voči patogénom počas jeho spoločnej kultivácie so Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Salmonella typhimurium a Clostridium perfringens 3,4,5. Pre priemyselné využitie pri fermentácii potravinárskych výrobkov však nie je rast a metabolizmus Lb. acidophilus NCFM v týchto matriciach dostatočne intenzívny, čo súvisí so skutočnosťou, že jeho pôvodným stanoviskom je črevný systém človeka. Podobne, ako ďalší zástupcovia tohto rodu, ani kmeň Howaru nedisponuje genetickou výbavou pre syntézu vitamínov, aminokyselín a kofaktorov a na svoj rozvoj vyžaduje komplexný a dostatočný prísun živín. Vo svojom genóme však kóduje významné množstvo rôznych transportných a fermentačných systémov 6, ktoré mu umožňujú prítomné živiny využívať. Z týchto dôvodov sa predkladaná práca zaoberá možnosťami stimulácie rastu a metabolizmu probiotického kmeňa NCFM s cieľom určiť vhodné podmienky pre technologické spracovanie produktov s jeho obsahom. Materiál a metódy Použité kultúry Monokultúra Lactobacillus acidophilus NCFM Howaru Dophilus je komerčná kultúra od spoločnosti Danisco A/S (Kodaň, Dánsko). Pre účely štúdie nám ju poskytla spoločnosť Rajo, a. s. (Bratislava, Slovensko). 49

50 Zmesná kultúra Fresco DVS 1010 je komerčná kultúra od spoločnosti Christian Hansen (Hørsholm, Dánsko), ktorá pozostáva z bakteriálnych druhov Lactococcus lactis ssp. lactis, Lc. lactis ssp. cremoris a Streptococcus thermophilus a bola poskytnutá firmou Rajo, a. s.. Inokulácia a kultivácia Základná suspenzia kultúry Howaru bola pripravená kultiváciou v MRS bujóne pri 37 ±0,5 C a 5 % CO 2 počas 24 h. Následne bola inokulovaná do predtemperovaného MRS bujónu, resp. UHT mlieka s prídavkom vybraných substrátov na výslednú koncentráciu približne 10 3 KTJ.ml -1 v 3 paralelných sériách. Vzorky boli uchovávané pri 37 ±0,5 C staticky aeróbne (pre štúdium vplyvu atmosféry staticky v atmosfére s obsahom 15 % CO 2 ). Príprava substrátov Roztoky glukózy, fruktózy, maltózy, sacharózy, laktózy, tryptónu a cysteínhydrochloridu boli pripravené rozpustením potrebného množstva substrátu v demineralizovanej vode. Bezbunkový supernatant (CFS) kultúry Fresco bol pripravený odstredením (3300 ot./min, 20 min) jej základnej suspenzie pripravenej kultiváciou v UHT mlieku pri 30 C počas 24 h. Z takto pripravených roztokov bolo potrebné množstvo pridané do kultivačných médií cez mikrofilter ( 45 μm). Stanovenie obsahu kyseliny mliečnej a kyseliny citrónovej V pravidelných časových intervaloch boli z kultivačných médií odoberané vzorky na analýzu organických kyselín, ktoré boli po odstredení MRS bujónu (3300 ot./min, 10 min), resp. filtrácii UHT mlieka upraveného na ph 4,6 vhodne zriedené, prefiltrované cez mikrofilter ( 20 μm) a injektované do analyzátora. Pre posúdenie vplyvu prídavku substrátov na produkciu organických kyselín boli vzorky odobrané v čase inokulácie a na konci exponenciálnej fázy rastu. Následne boli upravené ako v predchádzajúcom postupe a injektované do analyzátora. Separácia a stanovenie organických kyselín bola uskutočnená pomocou kapilárneho elektroforetického analyzátora EA 102 (Villa Labeco, Spišská Nová Ves, Slovensko) v predseparačnej kolóne pri jednosmernom elektrickom prúde veľkosti 250 μa s použitím elektrolytického systému A5 (vodiaci elektrolyt: HCl, c = 1, mol.dm -3, kys. aminokaprónová, c = 1, mol.dm -3, metylhydroxycelulóza, w = 0,1 %, ph 4,25; zakončujúci elektrolyt: kys. kaprónová, c = 5, mol.dm -3, 3-hydroxymetylaminometán, c = 5, mol.dm -3, ph 4,5 5,0) a vodivostného detektora. Zastúpenie organických kyselín bolo vyhodnotené pomocou izotachoforetického programu ITPPro32 (Villa Labeco, Spišská Nová Ves, Slovensko). Stanovenie aktívnej kyslosti kultivačných médií V čase odberu vzoriek na analýzu organických kyslín bola pomocou ph metra (WTW GmbH, Weilheim, Nemecko) so sklenou elektródou stanovovaná tiež aktívna kyslosť médií. Overenie schopnosti produkovať acetoín Pre overenie schopnosti produkovať acetoín bol kmeň Lb. acidophilus NCFM podrobený Voges-Proskauerovmu testu 7. Výsledky a diskusia Za účelom štúdia metabolickej aktivity Lb. acidophilus NCFM v MRS bujóne a v UHT mlieku boli vzorky médií podrobené izotachoforetickej analýze. Dynamika produkcie organických kyselín v MRS bujóne a v UHT mlieku Vplyv základného kultivačného média na metabolizmus Lb. acidophilus NCFM bol vyhodnotený ako závislosť produkcie kyseliny mliečnej a kyseliny citrónovej od času kultivácie a typu kultivačného média. Výsledky sú zosumarizované v tabuľke I. V rámci analýzy bola zaznamenaná intenzívna produkcia kyseliny mliečnej, na druhej strane však v žiadnej zo vzoriek nebola pozorovaná zmena koncentrácie ostatných stanoviteľných kyselín (kyselina octová, propiónová, mravčia, jablčná, jantárová, asparágová, vínna). Toto zistenie je v súlade s poznatkami uvedenými Görnerom a Valíkom 8, podľa ktorých sa druh Lactobacillus acidophilus zaraďuje do skupiny obligátne homofermentatívnych laktobacilov. 50

51 Tabuľka I Produkcia kyseliny mliečnej a kyseliny citrónovej počas kultivácie Lb. acidophilus NCFM v MRS bujóne a v mlieku v závislosti od času (Δc KM produkcia/spotreba kyseliny mliečnej, Δc KC produkcia/spotreba kyseliny citrónovej, ND kyselina nebola detegovaná) MRS bujón UHT mlieko Čas Δc KM Δc KC Čas Δc KM Δc KC ph ph (h) (g.l -1 ) (g.l -1 ) (h) (g.l -1 ) (g.l -1 ) 0 6,54 ND 0,00 0 6,52 0,00 0,00 6 6,54 0,12 0,03 6 6,51 0,00-0, ,63 2,84 0, ,48 0,11 0, ,23 13,83 0, ,13 0,64-0, ,06 15,23-0, ,74 1,65-0, ,03 15,73-0, ,13 3,55-0, ,03 16,24-0, ,73 5,17-0, ,01 15,95-0, ,23 7,07-1, ,04 12,66-1, ,98 13,65-2,10 Ako možno vidieť na obr. 1a, počas kultivácie v MRS bujóne študovaný mikroorganizmus začal produkovať kyselinu mliečnu už po veľmi krátkom čase (6 h) od inokulácie a v čase prebiehajúcej až končiacej exponenciálnej fázy jeho rastu (18 h) bol zaznamenaný začiatok najintenzívnejšej tvorby kyseliny mliečnej. V priebehu nasledujúcich 6 hodín sa podiel tejto kyseliny zvýšil o takmer 11 g.l -1, čo predstavuje rýchlosť produkcie r MRS,KM,6-18 = 1,83 g.l -1.h -1. Približne 30 hodín od inokulácie bolo dosiahnuté maximum produkcie kyseliny mliečnej v MRS bujóne (Δc MRS,KM,30 = 15,23 g.l -1 ) a ďalšie zvyšovanie jej koncentrácie bolo v porovnaní s predchádzajúcim nárastom zanedbateľné (r MRS,KM,30-54 = 0,042 g.l -1.h -1 ). V súvislosti s obsahom kyseliny citrónovej bolo počas rastových fáz študovanej kultúry pozorované jej slabé zvýšenie s produkciou 0,46 g.l -1 do 18 hodín od inokulácie. V 24. hodine, kedy sa kultúra Howaru za daných podmienok dostávala do stacionárnej fázy rastu, však už bol pozorovaný úbytok kyseliny citrónovej a klesajúci trend bol zachovaný až do absolútneho vyčerpania citrátov približne v 54. hodine. Spotreba kyseliny citrónovej v priebehu kultivácie môže byť spôsobená schopnosťou kultúry utilizovať citráty za vzniku sekundárnych metabolitov, napr. senzoricky aktívnych látok diacetylu a acetoínu 9. Schopnosť produkcie acetoínu bola potvrdená aj Voges-Proskauerovým testom. Metabolická aktivita kmeňa NCFM v mliečnom médiu bola v porovnaní s výsledkami získanými pri analýze rastu v MRS bujóne výrazne pomalšia, čo dokumentuje aj obr. 1b. Začiatok produkcie kyseliny mliečnej možno odhadnúť na 18. hodinu, čo v porovnaní s predchádzajúcim pokusom predstavuje oneskorenie o 12 hodín a pokým v MRS bujóne došlo v 30. hodine k postupnému utlmeniu produkcie kyseliny mliečnej, v mlieku bol v tomto čase metabolizmus najintenzívnejší. Rýchlosť produkcie kyseliny mliečnej medzi 24. a 96. hodinou dosahovala hodnotu r mlieko,km,24-96 = 0,15 g.l -1.h -1, čo je približne 12-násobne pomalšie ako maximálna rýchlosť produkcie kyseliny mliečnej v MRS bujóne. Okrem päťkrát dlhšieho času potrebného na dosiahnutie rovnakej koncentrácie kyseliny mliečnej (Δc KM = 13,83 g.l -1 v MRS bujóne v 24. hodine a Δc KM = 13,65 g.l -1 v mlieku v 120. hodine) sa tiež znížil jej maximálny výťažok oproti predchádzajúcemu pokusu, a to približne o 14 %. Vo vývoji obsahu vyprodukovanej kyseliny citrónovej bol pozorovaný podobný trend ako vo vzorkách MRS bujónu. Maximálna koncentrácia (Δc mlieko,kc,18 = 0,50 g.l -1 ) bola dosiahnutá v 18. hodine od inokulácie a po tomto čase sa jej obsah kontinuálne znižoval rýchlosťou r mlieko,kc, = -0,017 g.l -1.h

52 Obr. 1. Grafické znázornenie vývoja produkcie/spotreby kyseliny mliečnej a kyseliny citrónovej počas kultivácie Lb. acidophilus NCFM v MRS bujóne (1a) a v mlieku (1b) a príslušné hodnoty ph Vplyv prídavku substrátov na produkciu organických kyselín v UHT mlieku Okrem priebehu produkcie, resp. spotreby organických kyselín v závislosti od času bol sledovaný tiež vplyv zloženia rastového média a zloženia atmosféry na kyselinotvornú aktivitu Lb. acidophilus NCFM. Vo vzorkách MRS bujónu s prídavkom vybraných substrátov boli výsledky stanovenia organických kyselín v 27. hodine od inokulácie študovanej kultúry navzájom veľmi podobné (Δc KM,MRS = 12,74 ±1,17 g.l -1 ; v k = 9,2 % a Δc KC,MRS = 0,89 ±0,15 g.l -1 ; v k = 16,3 %). Z obr. 1a vyplýva, že produkcia kyseliny mliečnej v tomto médiu je veľmi intenzívna, v čase odberu vzoriek dosahuje metabolická aktivita kmeňa NCFM štandardne svoje maximum a rozdiely medzi vzorkami sú z uvedeného dôvodu minimálne. Výsledky analýzy produkcie organických kyselín v UHT mlieku sú zosumarizované v tab. II. U jednoduchých cukrov (glukózy a fruktózy), ktoré priamo vstupujú do katabolickej dráhy sacharidov a disacharidu laktózy, ktorá je prirodzenou zložkou mlieka, možno po porovnaní s údajmi získanými v rámci štúdia dynamiky metabolizmu kultúry Howaru v mlieku, konštatovať, že prídavok týchto látok nemal na produkciu kyselín výrazný vplyv. Prídavok ďalších disacharidov (maltózy a sacharózy) sa v produkcii organických kyselín odzrkadlil vo viac než trojnásobnom zvýšení koncentrácie kyseliny mliečnej v 31. hodine inkubácie oproti predchádzajúcim pokusom. Počas analýzy bol zistený tiež nezvyčajne vysoký obsah kyseliny citrónovej vo vzorke mlieka suplementovaného sacharózou (Δc KC,mlieko,sach = 1,70 g.l -1 ). Táto skutočnosť však môže súvisieť s neštandardne nízkou (až o 67 % oproti bežnému mlieku) koncentráciou citrátov v samotnom pôvodnom médiu, ktorá bola zistená pri vyšetrení vzorky odobratej z rovnakého pokusu v čase inokulácie. K najrýchlejšiemu poklesu aktívnej kyslosti došlo v mlieku s obsahom tryptónu. Izotachoforetická analýza ukázala, že zníženie ph súviselo s prudkým, až šesťnásobným zvýšením produkcie kyseliny mliečnej vplyvom prídavku substrátu oproti čistému mlieku a hodnota Δc KM,mlieko,tryp = 11,57 g.l -1 je najvyššou koncentráciou uvedenej kyseliny, ktorá bola v mliečnom médiu dosiahnutá. Na úkor tvorby kyseliny mliečnej sa však znížila miera utilizácie kyseliny citrónovej, ktorá v čase odberu vzorky dosahovala úroveň Δc KC,mlieko,tryp = 0,45 g.l -1. Zníženie času potrebného pre úplnú fermentáciu mlieka pri výrobe jogurtov a zvýšenie kyselinotvornej aktivity kultúry zákysovej (S. thermophilus, Lb. delbruecki) aj probiotickej (Lb. acidophilus) zaznamenali v podobných podmienkach tiež Zhao a kol. 10. Je teda zrejmé, že kazeínový hydrolyzát s vysokým obsahom bioaktívnych oligopeptidov môže stimulovať metabolizmus probiotických mikroorganizmov. 52

53 Tabuľka II Zmeny koncentrácie kyseliny mliečnej a kyseliny citrónovej počas kultivácie Lb. acidophilus NCFM v mlieku v závislosti od zloženia média a atmosféry (Δc KM produkcia/spotreba kyseliny mliečnej, Δc KC produkcia/spotreba kyseliny citrónovej) Substrát čas (h) ph Δc KM (g.l -1 ) Δc KC (g.l -1 ) glukóza 0,2 % (w/v) 27 4,79 1,98-0,72 fruktóza 0,2 % (w/v) 27 5,50 1,89-0,29 maltóza 0,2 % (w/v) 31 4,61 6,76-0,68 sacharóza 0,2 % (w/v) 31 4,39 8,09 1,70 laktóza 0,5 % (w/v) 30 5,46 2,14-0,21 tryptón 0,5 % (w/v) 26 4,22 11,57 0,45 CFS 5 % (v/v) 27 4,58 6,38-0,73 CFS 10 % (v/v) 27 4,79 5,64 0,48 CysHCl 0,5 % (w/v) 26 5,20 2,25-0,26 CO 2 15 % 27 5,66 1,13 0,45 minimum 26,0 4,22 1,13-0,73 maximum 31,0 5,66 11,57 1,70 aritmetický priemer 27,9 4,92 4,78 0,02 s d 2,0 0,50 3,45 0,76 v k (%) 7,1 10,2 72, Prítomnosť bezbunkového supernatantu (CFS) kultúry Fresco v rastovom médiu sa pri oboch pridaných objemoch (5 a 10 %, v/v) odzrkadlila v približne trojnásobnom zvýšení koncentrácie kyseliny mliečnej vo vzorke. Množstvo pridaných metabolitov kultúry Fresco nemalo výrazný vplyv na rýchlosť metabolizmu a dokonca je pravdepodobné, že pri 10 %-nom prídavku CFS došlo k neskoršiemu naštartovaniu metabolizmu, čo dokumentuje stále kladný podiel vyprodukovanej kyseliny citrónovej (Δc KC,mlieko,CFS10 = 0,48 g.l -1 ), ako aj neskorší pokles hodnoty ph. Uniformita výsledkov vzoriek MRS bujónu zaznamenaná pri štúdiu vplyvu zloženia média na produkciu organických kyselín nebola zachovaná v prípade zmeny atmosféry. Koncentrácia kyseliny mliečnej v 27. hodine sa v oboch médiách pohybovala na úrovni Δc KM,CO2 = 1,1 g.l -1 a obsah vyprodukovanej kyseliny citrónovej dosahoval hodnoty Δc KC,MRS,CO2 = 1,02 g.l -1, resp. Δc KC,mlieko,CO2 = 0,45 g.l -1. Podľa Hoga a Pyuna 11 a Singha a kol. 12, nižšia metabolická aktivita kmeňa NCFM za anaeróbnych podmienok môže súvisieť s faktom, že CO 2 môže inhibovať niektoré metabolické dráhy v dôsledku jeho väzby na špecifické enzýmy alebo proteíny. Záver Na základe získaných výsledkov možno konštatovať, že oneskorený pokles hodnôt ph počas kultivačných pokusov v mlieku v porovnaní s pokusmi v MRS bujóne, nebol spôsobený len pufrovacou kapacitou mliečnej matrice 13, ale predovšetkým pomalšou produkciou kyseliny mliečnej v tomto médiu. S vysokou mierou istoty tak možno predpokladať, že pre metabolizmus kultúry Howaru je prostredie syntetického živného média vhodnejšie než reálne mliečne prostredie. Zatiaľ čo prídavkom rôznych sacharidov sa nedosiahla výrazná stimulácia metabolizmu študovaného kmeňa, prídavok produktov metabolizmu kultúry Fresco a kazeínového hydrolyzátu mal na správanie Lb. acidophilus NCFM Howaru Dophilus výrazný vplyv. Výsledky naznačujú, že limitujucim faktorom sú teda vo významnej miere nielen sacharidy, ale aj voľné aminokyseliny. 53

54 Poďakovanie Práca bola podporená grantom MŠ SR VEGA č. 1/0495/13. Použitá literatúra: 1. Sulek, K. Frandsen, H. L. Smedsgaard, J. Skov, T. H. Wilcks, A. Licht, T. R. Metabolic footprint of Lactobacillus acidophilus NCFM at different ph. Metabolomics. 8, 2012, s EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies. Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to the substantiation of health claims related to various and reduction of gastrointestinal discomfort, decreasing potentially pathogenic gastro-intestinal microorganisms, improved lactose digestion, intestinal flora/digestive health, defence against vaginal pathogens and increasing IL-10 production and/or enhancing the activity of natural killer cells (further assessment) pursuant to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/2006. EFSA Journal. 10:8:2858, 2012, s Dobson, A. E. Sanozky-Dawes, R. B. Klaenhammer, T. R. Identification of an operon and inducing peptide involved in the production of lactacin B by Lactobacillus acidophilus. Journal of Applied Microbiology. 103, 2007, s Collado, M. C. Meriluoto, J. Salminen, S. Role of commercial probiotic strains against human pathogen adhesion to intestinal mucus. Letters in Applied Microbiology. 45, 2007, s Kim, Y. Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80:7, 2012, s Altermann, E. Russel, W. M. Azcarate-Peril, M. Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102:11, 2005, s Rao, S. P. N. IMViC Reactions. Dostupné na internete: [cit ] 8. Görner, F. Valík, Ľ. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé centrum, s., ISBN Havkin-Frenkel, D. Belanger, F. Biotechnology in Flavor Production. Hoboken: Wiley-Blackwell, s., ISBN Zhao, Q. Z. Wang, J. S. Zhao, M. M. Jiang, Y. M. Chun, C. Effect of casein hydrolysates on yogurt fermentation. Food Technology and Biotechnology. 44:3, 2006, s Hong, S. I. Pyun, Y. R. Membrane damage and enzyme inactivation of Lactobacillus plantarum by high pressure CO 2 treatment. International Journal of Food Microbiology. 63, 2001, s Singh, P. Wani, A. A. Karim, A. A. Langowski, H., C. The use of carbon dioxide in the processing and packaging of milk and dairy products: A review. International Journal of Dairy Technology. 65:2, 2012, s Simpson, B. K. Nollet, L. M. L. Toldrá, F. Benjakul, S. Paliyath, G. Hui, Y. H. Food Biochemistry and Food Processing. 2. vyd. Hoboken: Wiley-Blackwell, s., ISBN Kontaktná adresa: Ing. Tatiana Mančušková, Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, FCHPT STU v Bratislave, Radlinského 9, Bratislava, Slovenská republika, tatiana.mancuskova@stuba.sk 54

55 KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ LACTOBACILLUS DELBRUECKII SUBSP. BULGARICUS POMOCÍ qpcr Mühlhansová Andrea, Jebavá Iva, Plocková Milada Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT Praha Determination of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus using qpcr Summary: Molecular methods are being increasingly applied to detect, quantify and study microbial population in food. The objective of the presented work was to develop a PCR-based method for quantitative determination of the L. delbrueckii subsp. bulgaricus and compare this method with classical plate count methods. Four pairs of primers were designed targeting the genes encoding N-acetylmuramidase and amidase. Primers were tested on positive and negative controls, PCR assays were optimized. As a specific probes, we selected primers labeled as LDB0224(1) targeting N-acetylmuramidase (Ldb_0224) of L. delbrueckii subsp. bulgaricus detection. Real-time PCR assays were developed for the absolute quantification of L. delbrueckii subsp. bulgaricus in broth and commercial yoghurts. Cultures quantification in broth obtained by qpcr differed significantly from classical bacterial counts. For example, enumeration using plating methods was CFU ml -1 contrary to CFU ml -1 obtained using qpcr. Higher cell number obtained by qpcr could be affected by the presence of intact DNA coming from dead cells. In contrast, the results of qpcr in commercial yoghurt were lower than results obtained by classical bacterial enumeration. This may indicate that DNA extraction from yogurts was insufficient or that qpcr assays were influenced by inhibitors. Úvod: Jogurtová kultura se skládá ze dvou druhů bakterií mléčného kvašení, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a Streptococcus thermophilus (6). Mezi hlavní pozitivní vlastnosti těchto mikroorganismů patří především technologická funkce, spojená s rychlou produkcí kyseliny mléčné a řady senzoricky aktivních metabolitů např. acetaldehyd. Některé kmeny jogurtové kultury navíc disponují schopností produkovat bakteriocíny tj. protektivní funkcí (1). L. delbrueckii subsp. bulgaricus má velký význam v potravinářství. Používá se především při výrobě jogurtů, ale také při výrobě jogurtových mlék a sýrů (4). Dle vyhlášky MZe č. 77/2003 Sb. musí počet protosymbiotické směsi L. delbruecki subsp. bulgaricus a S. thermophilus dosahovat v jogurtu alespoň 10 7 KTJ g -1. L. delbrueckii subsp. bulgaricus můžeme stanovit pomocí plotnových metod s využitím diagnostického média MRS. Stanovení počtu těchto charakteristických kmenů v jogurtu probíhá dle ČSN ISO 7889 (571420) při 37 C anaerobně po dobu 72 h. V současné době jsou metody založené na polymerázové řetězové reakci (PCR), konkrétně kvantitativní PCR (qpcr) přednostně používány k detekci, identifikaci a kvantifikaci, jak patogenů, tak prospěšných populací mikroorganismů. Kvantitativní PCR umožňuje sledovat kontinuálně každý krok reakce. Je proto rychlejší, vysoce citlivá, specifická a umožňuje současně detekci několika odlišných mikroorganismů najednou. Mezi hlavní aplikace qpcr v potravinářství patří kontrola probiotických produktů (kvantifikace probiotických bakterií), hodnocení přežití bakterií v gastrointestinálním traktu jedince a její možné zařazení mezi probiotika. Dále je to pozorování vývoje populace např. startovacích kultur, detekce bakterií mléčného kvašení (BMK) produkující biogenní aminy, specifická detekce a kvantifikace v mléčných produktech, kontrola životaschopnosti a metabolické aktivity BMK např. při zrání sýrů. Cíle práce: Návrh specifických primerů pro detekci a kvantifikaci L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Návrh a optimalizace izolace DNA z potravinové matrice. Návrh vhodné metody absolutní kvantifikace pomocí qpcr. Porovnat metodu absolutní kvantifikace qpcr se standardními plotnovými metodami. 55

56 Materiál a metody: Použité kmeny: Tabulka I Použité kmeny L. delbrueckii subsp. bulgaricus Druh Zdroj Kmen Biotop Původ L. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC nd USA CCDM 767 izolát sbírkového kmene nd CCDM 364 jogurt nd ICT nd nd ATCC, Americká sbírka typových kultur, Rockville, Maryland, USA CCDM, Česká sbírka mléčných mikroorganismů, Praha, Česká republika ICT, Ústav mléka, tuků a kosmetiky, FPBT, VŠCHT, Praha, Česká republika nd, není determinovaný Stanovení počtu charakteristických mikroorganismů v jogurtu Pro stanovení počtu laktobacilů vyskytujících se v jogurtech byla použita plotnová metoda, technika přelivu. Na Petriho misky byl pipetován 1 ml vhodného desítkového ředění vzorku jogurtu a takto připravený vzorek byl přelit kultivačním médiem MRS o ph 5,4. Následovala anaerobní kultivace mikroorganismu při 37 C po dobu 72 h. Návrh a testování primerů V genových bankách byly vyhledány: a) Sekvenované kmeny L. delbrueckii subsp. bulgaricus b) Ortologické geny k Lhv_190 a Lhv_191. Návrh primerů k detekci L. delbrueckii subsp. bulgaricus se skládal z: (i) vyhledávání dostupných bioinformatických dat v NCBI genové bance ( (ii) nalezení podobných sekvencí v genové bance pomocí BLASTu ( (iii) porovnání sekvencí pomocí CLUSTALW ( (iv) nalezení specifického místa v sekvenci a (v) návrhu primerů v tomto specifickém místě pomocí Primer 3 ( Před syntézou primerů byla pro kontrolu specificity provedena in silico PCR ( Pro testování specificity primerů pomocí qpcr s použitím interkalačního barviva SYBR Green byly použity jakožto pozitivní a negativní kontroly různé druhy rodu Lactobacillus a S. thermophilus. Izolace DNA u testovaných kmenů byla provedena z čistých kultur. Na závěr byla provedena analýza amplifikačních grafů, HRM analýza a gelová elektroforéza PCR produktů. Izolace DNA Izolace DNA z čistých kultur probíhala pomocí komerčně dostupného kitu DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). Bylo vyzkoušeno pět metod izolace DNA z jogurtů s využitím DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) a PowerFood Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.). Absolutní kvantifikace Pro absolutní kvantifikaci byl vybrán primer LDB 0224 (1). Příprava mixu je uvedena v tab. II. Průběh reakce pro primer LDB 0224 (1): 3 min při 94 C iniciační denaturace, následovalo 39 cyklů: 30 s denaturace při 95 C, připojení primerů při 62 C 30 s a elongace řetězce při 72 C 30 s. 56

57 Tabulka II Složení PCR mixu pro absolutní kvantifikaci PCR Mix Výrobce Objem [μl] iq SYBR Green Supermix BioRad 10 Primer Fwd (10 μm) Generi Biotech 1 Primer Re (10 μm) Generi Biotech 1 Demineralizovaná sterilní voda - 6 Izolovaná DNA Qiagen 2 Celkový objem 20 Standardy byly pipetovány do reakce v triplikátu stejně jako vzorky. Do Každé reakce byla přidána kontrola NTC (No Template Control) v duplikátu. Výsledky a diskuze: Návrh a testování primerů Pro návrh primerů byly využity geny peptidoglykan hydrolas z důvodu zjištění, že tyto geny jsou u BMK ubikvitní a přitom druhově specifické. Byly navrženy čtyři páry primerů pro L. delbrueckii subsp. bulgaricus, které jsou uvedeny v tab. III. Pro kontrolu specifity byla použita in silico PCR. In silico PCR potvrdila, že daný amplifikovaný produkt se nachází v celém genomu pouze jednou, což je důležité pro následnou kvantifikaci pomocí qpcr. Např. gen 16S rrna není vhodný pro absolutní kvantifikaci, neboť se může nacházet v celém genomu vícekrát. Tabulka III Navržené primery pro L. delbrueckii subsp. bulgaricus Název primeru Označení genu Sekvence 5 3 Velikost produktu [bp] LDB 0224(1) ldb0224 Fwd:AATTACACGGCCAAGGTAGCC Re:GAGGTACATCCGCTTCTTGC 153 LDB 0224(2) ldb0224 Fwd:ATGAGAGAAGATTTTTGACTGG Re:TAAAAAGGCATCGCTGGTAG 129 LDB 0224(3) ldb0224 Fwd:ATGAGAGAAGATTTTTGACTGG Re:ACTTCTTGGACGTCTTCTGC 169 LDB 0225 ldb0225 Fwd:AAGTCTCCCATTACCTGGGC Re:CGGAACTAGCAGTGCTTGAA 222 Kvantitativní stanovení Absolutní kvantifikace v čistých kulturách byla provedena pro referenční kmen ATCC pomocí vybraného specifického primeru. Byl použit specifický primer (LDB 0224 (1)) a byl optimalizován teplotní režim. Při každé reakci byla pipetována nová kalibrační křivka v triplikátu. Výsledky jsou hromadně uvedeny v tab IV. Hodnoty naměřených výsledků pomocí qpcr jsou vyjádřeny jako průměr ze tří měření se směrodatnou odchylkou. Absolutní kvantifikace je založená na srovnání hodnoty C T s kalibrační křivkou generovanou z amplifikace známého množství cílového genu. Proto musí být důkladně stanovena standardní křivka templátu (7). 57

58 Obr. 1 Kalibrační křivka pro primer LDB 0224 (1) Tabulka IV Kvantifikace referenčního kmenu L. delbrueckii subsp. bulgaricus jako čisté kultury Kmen L. delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC Počty L. delbrueckii subsp. bulgaricus [KTJ ml -1 ] qpcr LDB 0224 (1) [KTJ ml -1 ] 5, , ± 1, Tabulka V Kvantifikace L. delbrueckii subsp. bulgaricus v komerčních jogurtech Vzorek Počty L. delbrueckii subsp. bulgaricus [KTJ g -1 ] 1. stanovení 2. stanovení Počty qpcr L. delbrueckii subsp. LDB 0224 (1) [KTJ g -1 bulgaricus ] [KTJ g -1 ] qpcr LDB 0224 (1) [KTJ g -1 ] Bio jogurt bílý 3, , ± 6, , , ± 2, Olma Klasik bílý jogurt Zott Natura bílý jogurt Milblu bílý jogurt bez tuku 1, , ± 3, , , ± 1, , , ± 4, , , ± 1, , , ± 1, , , ± 1, Selský bílý jogurt 1, , , ± 5, Activia bílá zrající v kelímku Activia jogurt borůvkový Natural jogurt bílý 1, , ± 1, , , ± 1, , , ± 9, , , ± 6, , , ± 2, , , ± 3,

59 Důvodem pro vyšší počty mikroorganismů získaných pomocí qpcr oproti plotnovým metodám může být: (i) přítomnost DNA z mrtvých buněk, (ii) přítomnost živých buněk, ale nekultivovavatelných forem, (iii) fakt, že jedna KTJ na plotně může být generována z více než jedné buňky, a (iv) použití PCR primerů, které se zaměřují na proměnlivý počet multikopií cílového genu jako je např. 16S rrna (7). Pro rozlišení mezi živými a neživými buňkami se používájí chemikálie jako ethidium monoazid (8) nebo propidium monoazid (2). Obě tyto chemikálie mohou penetrovat do membrány a poté se navázat na DNA po fotoindukci azidové skupiny (3). Živé buňky s nedotčenou membránou jsou nepropustné pro tyto interkalační barviva, které jednoduše pronikají do buněk s porušenou membránou (2). Počty získané pomocí plotnových metod jsou vyšší než pomocí qpcr. Pravděpodobným důvodem je nezdařená extrakce nukleových kyselin. Ve druhém stanovení je patrné zlepšení metody extrakce DNA. Plotnové metody udávají opět vyšší výsledky než qpcr. Rozdíl ovšem již není tak markantní. Ve srovnání s plotnovými metodami je qpcr mnohem rychlejší, více citlivější a specifičtější metodou. U kvantitativního stanovení pomocí plotnových metod se uvádí až 30 % chyba stanovení. Kvantitativní PCR umožňuje detekci jak mrtvých buněk tak živých, ale i buněk, které se nepodařilo vykultivovat tzv. nekultivovatelných mikroorganismů. Izolace nukleových kyselin a příprava qpcr může být automatizovaná a na základě použití detekčního systému může být i poměrně levná a proto vhodná pro rutinní analýzy. Kvantitativní PCR nevyžaduje post-amplifikační analýzu (7). Přesnost qpcr je ovlivněná použitými primery, kvalitou templátové DNA, přítomností inhibitorů a manipulací a uskladněním vzorků, primerů a dalších reagencií pro qpcr. Co se týče vzorků z potravin speciální pozornost, musí být zaměřena na inhibitory reakce, efektivitu extrakce DNA a potenciální kontaminaci (5). Závěr: Byly navrženy čtyři páry primerů pro L. delbreuckii subsp. bulgaricus (LDB 0224 (1), LDB 0224 (2), LDB 0224 (3), LDB 0225) Všechny primery byly funkční, některé však nebyly dostatečně specifické. Na základě testování primerů v čistých kulturách při použití pozitivních a negativních kontrol byly vybrány specifické primery. Podmínky výběru byly následující a) primer musel amplifikovat pozitivní kontroly v nízkých cyklech, b) nesměl amplifikovat negativní kontroly. Těmto podmínkám vyhovoval navržený primer LDB 0224 (1). Optimalizace eseje byla vyzkoušena při kvantifikaci v bujonu, tedy v čistých kulturách. Výsledky pomocí qpcr byly o čtyři řády vyšší pomocí qpcr (2, KTJ ml -1 ) vůči plotnovým metodám (5, KTJ ml -1 ) v případě L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Z výsledků vyplývá, že eseje fungují výborně. Vyšší počty získané pomocí qpcr mohou být ovlivněny přítomností mrtvých buněk. Bylo analyzováno osm komerčně dostupných vzorků jogurtů různých značek. Byly provedeny dvě na sobě nezávislé izolace DNA a dvě stanovení pomocí qpcr dvou různých šarží jogurtů. Všechny jogurty vyhovovaly dle plotnových metod vyhlášce MZe č. 77/2003 Sb. Jogurt s nejvíce mikroorganismy (3, KTJ g -1 ) byl Olma Klasik bílý jogurt a Selský bílý jogurt Hollandia. Z důvodu náročné extrakce DNA z potravinové matrice a možné inhibici různých látek (tuk, proteiny, ionty Ca 2+ ) plotnové metody vycházely většinou o řád více než qpcr. 59

60 Použitá literatura: 1. Canani R., Cirillo P., Gianluca T., Cesarani L., Spagnuolo M., De Vincenzo A.: Probiotics for treatment of acute diarrhoea in children. Br. Med. J. 335, (2007). 2. García-Cayuela T., Tabasco R., Peláez C., Requena T.: Simultaneous detection and enumeration of viable lactic acid bacteria and bifidobacteria in fermented milk by using propidium monoazide and real-time PCR. Int. Dairy J. 19, (2009). 3. Justé A., Thomma B., Lievens B.: Recent advances in molecular techniques to study microbial communities in food-associated matrices and processed. Food Microbiol. 25, (2008). 4. Klaenhammer T., Altermann E., Arigoni F., Bolotin A., Breidt F., Broadbent J., Cano R., Chaillou S., Deutscher J., Gasson M., van de Guchte M.: Discovering lactic acid bacteria by genomics. Antonie van Leeuwenhoek. 82, (2002). 5. Martínez N., Martín Cruz M., Herrero A., Fernández M., Alvarez M., Ladero V.: qpcr as a powerful tool for microbial spoilage quantification: Significance for food quality. Trends Food Sci. Technol. 22, (2011). 6. Miller D. M., Dudley E. G., Roberts R. F.: Technical note: Development of quantitative PCR method for monitoring strain dynamics during yogurt manufacture. J. Dairy Sci. 95, (2012). 7. Postollec F., Falentin H., Pavan S., Combrisson J., Sohier D.: Recent advances in quantitative PCR (qpcr) applications in food microbiology. Food Microbiol. 28, (2011). 8. Rudi K., Moen B., Dromtorp S., Holck A.: Use of ethidium monoazide and PCR in combination for quantification of viable and dead cells in complex samples. Appl. Environ. Microbiol. 120, (2005). Kontaktní adresa: Andrea Mühlhansová, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha6, Česká republika, andrea@muhlhans.com 60

61 KVANTIFIKÁCIA RASTU A METABOLIZMU DRUHU GEOTRICHUM CANDIDUM V MODELOVOM BUJÓNE Koňuchová Martina, Šípková Anna, Valík Ľubomír Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita v Bratislave Quantification of Geotrichum candidum growth and metabolism in model broth Summary: Geotrichum species are widely distributed in the nature. The best known representative, Geotrichum candidum, is a regular component of dairy products microflora and plays an important role in the ripening of cheese. In this work, a growth dynamics of selected collection strains (Galactomyces candidus CBS , Geotrichum candidum CBS , CBS , CBS and Geotrichum bryndzae CCY ) and isolates of G. candidum originating from traditional dairy products, is presented. Their growth was studied in a model broth containing peptone and sodium lactate at 25 C. The results demonstrated that the growth potential of monitored strains and isolates achieved similar values, while dispersion of these values around the arithmetic mean (coefficient of variation) reached 21 %. The abilities of all used strains to utilize lactic acid and release ammonia were also studied. These properties are involved in the deacidification of the cheese surface which permits the growth of less acid-tolerant microorganisms. Each used microorganism was able to consume lactate and release ammonia and as a result of these activities the ph of the broth increased. However, the observed pattern of the lactate assimilation was different. Some studied strains started to utilize lactate after entering the stationary phase. In the second group the lactate consumption was observed earlier. At the end of the cultivations, the amount of produced ammonia varied from 249 to 971 mg.l -1. Úvod Druh G. candidum sa vyskytuje v rôznych prostrediach, ako sú napr. pôda, tráva, siláž, rastliny, ovocie, kŕmne zmesi, hmyz, tráviaci trakt človeka a iných cicavcov 1,2,3. Okrem toho ho možno často izolovať aj zo surového mlieka, či jeho výrobkov. Využíva sa pri výrobe mäkkých syrov kamembertského typu a zároveň aj čerstvých syrov vyrábaných z ovčieho, kravského a kozieho mlieka. Táto vláknitá huba je často prítomná aj v tradičných slovenských mliečnych výrobkoch, akými sú ovčí hrudkový syr a bryndza 4,5. Druh G. candidum sa rozmnožuje relatívne rýchlo, jeho generačný čas je jeden z najnižších medzi eukaryotmi, konkrétne 1,1 h pri 30 C v kvapalnom médiu 1. Na agarových pôdach vytvára biele, hladké, často maslovité, plstnaté a zamatové kolónie. Vláknitá huba G. candidum je schopná rásť v prostredí bez obsahu vitamínov a s obmedzeným množstvom fosforu a dusíka. V porovnaní s baktériami je druh G. candidum, podobne ako iné vláknité huby a kvasinky, tolerantnejší voči nepriaznivým podmienkam prostredia, ako sú nízka teplota, nízka hodnota ph a nízky obsah kyslíka. Rast G. candidum môžeme pozorovať v rozsahu od 5 do 38 C, s optimom pri 25 C 5,6. Dokáže rásť v širokom rozsahu ph hodnôt: od 3 až po 11, s optimom okolo 5,5 až 6,0. V súvislosti so zníženým obsahom kyslíka v prostredí sa zistilo, že táto vláknitá huba je schopná rásť pri mikroaerofilných podmienkach. Je obzvlášť odolná voči zníženému obsahu kyslíka a zvýšenému obsahu oxidu uhličitého. Rast tejto vláknitej huby klesá lineárne so znižujúcou sa koncentráciou kyslíka pod 3 % 1. Druh G. candidum nevykazuje toleranciu voči zníženým hodnotám aktivity vody (a v ), a teda je citlivý na obsah soli v médiu 6. Vláknité huby vplyvom svojej metabolickej aktivity môžu spôsobiť narušenie, či dokonca úplné znehodnotenie potraví. Rod Geotrichum je známy svojim rýchlym rastom na technologických zariadeniach, nástrojoch a náradí, ktoré sa dostáva do kontaktu s potravinami. Prítomnosť G. candidum na povrchu masla, hydiny, v smotane a smotanových syroch je nežiaduca 7. Rast tejto vláknitej huby na masle môže spôsobiť hydrolytické žltnutie 8. Premnoženie G. candidum na povrchu mäkkých syrov spôsobuje rozklad mliečneho tuku a proteínov, čím dochádza k nežiaducej zmene senzorických vlastností a vzhľadu. Vznikajú nedostatky ako sú nedostatočne pevná kôra syra, nerovnomerné pokrytie povrchu syra mycéliom a klzká kôra 1,4. Geotrichum candidum je kvasinkovitá vláknitá huba, ktorá sa v potravinárskom priemysle 61

62 využíva i v pozitívnom slova zmysle, na zlepšenie akosti niektorých mliečnych výrobkov. Kultúrne kmene G. candidum majú významné postavenie najmä v procese zrenia syrov 2,4. G. candidum sa používa v mliekarenskom priemysle ako prídavná kultúra do polotvrdých, čerstvých, mäkkých kravských, ovčích a kozích syrov 2. Ak kmene G. candidum prevládajú na povrchu syra, sú zodpovedné za zloženie, súdržnosť a hrúbku ich kôry, a zároveň dodávajú syrom rovnomerný biely a zamatový povlak 1. Táto mikromycéta dokáže vplyvom svojej proteolytickej, aminopeptidázovej a lipolytickej aktivity vytvárať aj viacero senzoricky významných zložiek a redukuje horkosť. Vďaka svojej schopnosti štiepiť laktát a uvoľnovať amoniak spôsobuje alkalizáciu povrchu syra a následne umožňuje rozvoj acido-senzitívnych mikroorganizmov. Tieto prospešné technologické vlastnosti sú podmienené morfotypom a použitým kmeňom vláknitej huby. Dôkladný skríning rozmanitosti kmeňov G. candidum je dôležitý pri výbere nových technologicky vhodných kmeňov pre syrársky priemysel 1,3. Práve z tohto dôvodu sme sa v našej práci zamerali nielen na sledovanie rastového potenciálu vybraných kmeňov a izolátov druhu G. candidum, ale aj na ich schopnosť alkalizovať použité živné médium. Materiál a metodika V práci boli použité zbierkové kmene Galactomyces candidus CBS , Geotrichum candidum CBS , CBS a CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Holandsko). Geotrichum bryndzae CCY nám poskytol Ing. Pavol Sulo, CSc. (Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave). Použité izoláty G. candidum (A, B, C, D, G, H, I, J, K a L) boli izolované z bryndze a ovčieho hrudkového syra a ich pôvod spolu s identifikáciou sú uvedené v práci Hudecová 9. Všetky použité mikroorganizmy sme uchovávali na šikmom agare s obsahom odstredeného sušeného mlieka (SMA, Merck, Darmstadt, Nemecko) pri teplote 5 ±1 C. Zamerali sme sa na sledovanie dynamiky rastu vybraných zbierkových kmeňov a izolátov druhu G. candidum v modelovom bujóne s obsahom peptónu a laktátu sodného. Súbežne so sledovaním rastových charakteristík sme skúmali aj schopnosť sledovaných kmeňov a izolátov G. candidum utilizovať laktát, uvoľňovať amoniak a zvyšovať hodnotu ph. Ako médium pre kultivačné experimenty sme použili modelový bujón podľa Adour a kol. 10 s modifikovaným zložením. Bujón obsahoval peptón, kvasničný extrakt a laktát sodný 11. Hodnotu ph sme upravili pomocou 6 M HCl na 4,6. Štandardnú suspenziu buniek zbierkových kmeňov i izolátov G. candidum určenú na inokuláciu vzoriek modelového bujónu sme pripravili zo 48 až 72 hodinovej kultúry vyrastenej na povrchu SMA agaru pomocou vytrepania do fyziologického roztoku. Modelový bujón sme inokulovali 1 % prídavkom príslušného desiatkového riedenia základnej suspenzie 12 použitej kultúry, tak aby počiatočná koncentrácia G. candidum nepresiahla N KTJ.ml -1. Jednotlivé série experimentov sme uskutočnili v dvoch paralelných pokusoch. Vzorky bujónu sme inkubovali aeróbne, bez miešania, pri teplote 25 ±1 C. V určených časových intervaloch sme odoberali 1 ml vzorky na stanovenie denzity jednotlivých zbierkových kmeňov a izolátov G. candidum na SMA agare (Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko) podľa STN EN ISO Výsledky sme vyjadrili ako počet kolónií tvoriacich jednotiek na mililiter bujónu (KTJ.ml -1 ). Súčasne s mikrobiologickým vyšetrením modelového bujónu sme vykonávali aj meranie ph. Aktívnu kyslosť vzoriek sme merali pomocou ph-metra (Inolab ph 720, WTW GmbH, Weilheim, Nemecko) vybaveného sklenou kombinovanou elektródou (SenTix 81, WTW GmbH, Weilheim, Nemecko). Ďalej sme sledovali schopnosť druhu G. candidum asimilovať laktát a uvoľňovať amoniak. Vo vybraných časových intervaloch, súčasne s analýzou počtov G. candidum, sme merali množstvo prítomného laktátu v odobratých vzorkách s využitím testovacích prúžkov Reflectoquant určených na stanovenie kyseliny mliečnej (Merck s.r.o., Bratislava, Slovensko). Jednotlivé vzorky bujónu sme najprv centrifugovali pri rpm počas 5 minút. Na analýzu sme odobrali vrchný podiel roztoku a vhodne ho zriedili tak, aby predpokladaný obsah laktátu spadal do koncentračného rozsahu testovacích pásikov Reflectoquant. Samotné meranie prítomnej kyseliny mliečnej pomocou reflektometra RQflex 10 (Merck s.r.o., Bratislava, Slovensko) sme uskutočnili podľa návodu. 62

63 Množstvo prítomného amoniaku v modelovom bujóne sme stanovovali pomocou destilácie s vodnou parou na Parnas-Wagnerovej aparatúre 14 a následnou spätnou titráciou odmerným roztokom kyseliny sírovej. Pred samotnou destiláciou sme jednotlivé vzorky bujónu centrifugovali pri rpm počas 5 minút. Množstvo prítomného amoniaku sme stanovovali na konci experimentov vo vzorkách, ktoré boli odobrané v 240 hodine. Výsledné počty sledovaných kmeňov, zmena ph počas experimentov, ako aj utilizácia laktátu boli vyhodnotené nástrojom prediktívnej mikrobiológie, konkrétne Baranyiho modelom 15. Výsledky a diskusia Napriek tomu, že G. candidum je vláknitá huba, počas jej rastu v tekutom médiu dochádza k spontánnej fragmentácii mycélia. Okrem toho sa považuje za mikroorganizmus podobný kvasinkám. Vzhľadom na tieto skutočnosti možno dynamiku jeho rastu sledovať aj v tekutom médiu. Všetky pozorované zbierkové kmene a izoláty sa v modelovom bujóne s obsahom peptónu a laktátu sodného dokázali množiť exponenciálne. Počas rastu všetkých sledovaných zástupcov druhu G. candidum nebola pozorovaná lag-fáza. Tento jav môže súvisieť s podmienkami stanovenia počtov vláknitej huby. Tie boli vyšetrované jeden krát do dňa, ale vzhľadom na vyššiu hodnotu inkubačnej teploty (25 C) nebolo možné pri danej frekvencii očkovaní lag-fázu zachytiť. Pre ilustráciu sú na obr. 1 znázornené rastové čiary dvoch študovaných zástupcov vláknitej huby G. candidum (izolát J, zbierkový kmeň G. candidum CBS ) počas ich kultivácie v modelovom bujóne inkubovanom pri 25 C. Okrem priebehu rastu môžeme sledovať aj dynamiku zmeny ph bujónu a množstva laktátu. Obr. 1. Rastové čiary izolátu J (1a) a zbierkového kmeňa G. candidum CBS (1b) spolu s dynamikou zmeny ph a priebehom asimilácie laktátu Obidva kmene (obr. 1) potrebovali na dosiahnutie stacionárnej fázy približne rovnaký čas, a to 74 hodín. Adour a kol. 10 zaznamenali vyčerpanie laktátu a následné zastavenie rastu kmeňa G. candidum Geo17 v bujóne s obsahom peptónu a laktátu sodného kultivovaného pri 25 C za 5 dní, čo je v porovnaní s dosiahnutím stacionárnej fázy sledovaných zástupcov druhu G. candidum v tejto sérii experimentov v priemere o 2 dni neskôr. Exponenciálna fáza zbierkového kmeňa G. candidum CBS bola charakterizovaná rastovou rýchlosťou Gr = 0,081 log.ktj.ml -1.h -1. Rýchlosť množenia izolátu J dosiahla hodnotu (0,077 log.ktj.ml -1.h -1 ) takmer identickú s priemernou hodnotou rastovej rýchlosti všetkých pozorovaných zástupcov druhu G. candidum (Gr = 0,076 ±0,016 log.ktj.ml -1.h -1, v k = 21,0 %, tab. 1). Adour a kol. 16 dosiahli pri kultivácii G. candidum Geo17 v bujóne s obsahom glukózy, chloridu amónneho, leucínu, anorganických fosfátov a EDTA inkubovanom pri 25 C hodnotu 63

64 rýchlosti množenia o 20 % vyššiu v porovnaní s priemernou hodnotou dosiahnutou v tejto sérii experimentov. Počty zbierkového kmeňa G. candidum CBS boli na začiatku pokusu nastavené na nižšiu hodnotu (N z = 1,05 log.ktj.ml -1 ) ako pri izoláte J (N z = 1,71 log.ktj.ml -1 ). Na konci experimentu bola zaznamenaná vyše 6 násobne vyššia hodnota denzity buniek zbierkového kmeňa oproti jeho začiatočným počtom (N k = 6,43 log.ktj.ml -1 ). Konečné počty izolátu J (N k = 6,58 log.ktj.ml -1 ) sa líšili od priemernej hodnoty konečných počtov všetkých zástupcov o 0,31 log.ktj.ml -1 (N k = 6,27 ±0,58 log.ktj.ml -1 ). Tabuľka I Priemerné hodnoty rastových parametrov sledovaných zástupcov druhu G. candidum v modelovom bujóne a ich štatistické charakteristiky. Aritmetický priemer Rastová rýchlosť Začiatočná koncentrácia Konečná koncentrácia 0,076 log KTJ.ml -1.h -1 1,45 log KTJ.ml -1 6,27 log KTJ.ml -1 Smerodajná odchýlka Variačný koeficient 0,016 log KTJ.ml -1.h -1 0,28 log KTJ.ml -1 0,58 log KTJ.ml -1 21,0 % 19,6 % 9,3 % Medián 0,078 log KTJ.ml -1.h -1 1,57 log KTJ.ml -1 6,37 log KTJ.ml -1 Interval 0,061 log KTJ.ml -1.h -1 0,90 log KTJ.ml -1 2,38 log KTJ.ml -1 Popri mikrobiologickom vyšetrovaní modelového bujónu sme sledovali aj schopnosť zbierkových kmeňov a izolátov druhu G. candidum toto médium alkalizovať, spotrebovávať kyselinu mliečnu a uvoľňovať amoniak. Utilizácia laktátu je vlastnosť významná najmä pri zvyšovaní ph hodnoty syra a následne pre podporu rozvoja iných mikroorganizmov. Alkalizácia média je spôsobená nielen metabolizovaním laktátu, ale aj deamináciou aminokyselín s následnou produkciou amoniaku 10. Pred začiatkom experimentov sme ph modelového bujónu upravili na 4,6 a následne sme súčasne so stanovením počtov vláknitej huby merali i aktívnu kyslosť modelového bujónu. Pri všetkých kultiváciách sme v bujóne pozorovali nárast ph hodnoty. V priemere ph hodnota bujónu vzrástla zo začiatočnej hodnoty ph z = 4,53 ±0,09 (v k = 1,9 %) na konečnú hodnotu ph k = 8,17 ±0,17 (v k = 2,1 %). Podobné hodnoty konečného ph (8,4 ±0,1) zaznamenali aj Adour a kol. 10 pri kultivácii kmeňa G. candidum Geo17, v bujóne s obsahom peptónu a laktátu sodného inkubovanom pri 25 C. Vzrast ph hodnoty bujónu pri všetkých kultiváciách prebiehal s predchádzajúcou lagfázou, ale jej dĺžka sa líšila v závislosti od pozorovaného zbierkového kmeňa alebo izolátu. Lagfáza ph bujónu počas kultivácie zbierkového kmeňa G. candidum CBS dosiahla hodnotu 58 h (obr. 1b). Lag-fáza ph bujónu inokulovaného izolátom J (obr. 1a) dosiahla kratšiu hodnotu (λ = 28,0 h). Izolát J sa ukázal ako kmeň, ktorý je schopný ph hodnotu modelového bujónu zvýšiť z 4,44 na hodnotu 8,08 (ph k ph z = 3,64). Zbierkový kmeň G. candidum CBS hodnotu ph zvýšil o 3,38 (ph z = 4,67; ph k = 8,05). Pri sledovaní dynamiky asimilácie laktátu sme zhrnutím nadobudnutých výsledkov dospeli k záveru, že študovaných zástupcov druhu G. candidum možno rozdeliť na dve skupiny. Do prvej 64

65 patria tie zbierkové kmene a izoláty, pri kultivácii ktorých sme pokles množstva prítomného laktátu pozorovali už v prvých dňoch ich rastu. Druhá skupina pozorovaných zástupcov druhu G. candidum začala metabolizovať laktát až po dosiahnutí stacionárnej fázy. Navyše izoláty a zbierkové kmene asimilujúce laktát bez predchádzajúcej lag-fázy (izoláty H, I, K a L a zbierkové kmene G. candidum CBS , CBS a G. bryndzae CCY ) dosiahli aj podobné rýchlosti asimilácie laktátu (od -0,008 g.1-1.h -1 do -0,021 g.1-1.h -1 ). Sledovaní zástupcovia G. candidum patriaci do druhej skupiny dosahovali rýchlosti asimilácie laktátu v rozsahu od -0,027 g.1-1.h -1 do -0,085 g.1-1.h -1, avšak počas priebehu jeho spotreby vykazovali rozdielne dlhé lag-fázy. Pri meraní konečnej koncentrácie laktátu možno znovu pozorovaných zástupcov rozdeliť do dvoch skupín. Do prvej patria tie vzorky, pri ktorých množstvo laktátu kontinuálne klesalo, čiže pokus bol skončený pred dosiahnutím stacionárnej fázy asimilácie laktátu (izoláty B, H, I, K, L a zbierkové kmene G. candidum CBS , CBS , CBS a Ga. candidus CBS ). Naopak, zvyšné izoláty využívali laktát len po určitú hranicu, za ktorou už nenastalo ďalšie znižovanie jeho množstva v bujóne. Adour a kol. 10 uvádzajú, že G. candidum je vláknitá huba, ktorá dokáže deaminovať určité aminokyseliny. Uvoľnený amoniak následne vplýva na vzrast ph hodnoty syra a práve tento jav je kľúčovým faktorom v procese dozrievania syrov. Súčasne je amoniak aj dôležitou zložkou arómy syra 10. Z tohto dôvodu je potrebné určiť, ktoré kmene druhu G. candidum sú schopné tvoriť amoniak a stanoviť jeho množstvo. V modelovom bujóne za vyššie spomínaných podmienok dokázali všetky skúmané zbierkové kmene a izoláty vytvárať amoniak a jeho vyprodukované množstvo sa líšilo v závislosti od sledovaného izolátu. Izolát J aj zbierkový kmeň G. candidum CBS dokázali alkalizovať médium na podobnú konečnú hodnotu ph (8,0; obr. 1a a 1b). Zo stanovených množstiev vytvoreného amoniaku pre izolát J (c NH3 = 424 mg.l -1 ) a uvedený zbierkový kmeň (c NH3 = 722 mg.l -1 ) je pravdepodobné, že podobné zvýšenie ph hodnoty modelového bujónu bolo výsledkom kombinácie rôznych intenzít spotreby laktátu a produkcie amoniaku. Izolát J v porovnaní so zbierkovým kmeňom rýchlejšie utilizoval laktát (v laktát,j = -0,028 g.1-1.h -1 ; v laktát,cbs = -0,008 g.1-1.h -1 ), ale vyprodukoval nižšie množstvá amoniaku. V práci Adour a kol. 10 pri kultivácii kmeňa G. candidum Geo17 v bujóne s obsahom peptónu a laktátu sodného namerali o 38 % viac uvoľneného amoniaku ako bola priemerná hodnota dosiahnutá v tejto sérii experimentov (c NH3 = 540 ± 199 mg.l -1 ). Záver V predloženej práci bol vyhodnotený rastový potenciál zástupcov druhu G. candidum v modelovom bujóne pri 25 C. Všetky sledované kmene a izoláty sa dokázali množiť a rásť a ich koncentrácia sa zvyšovala s priemernou rastovou rýchlosťou Gr = 0,076 ±0,016 log.ktj.ml -1.h -1 (v k = 21,0 %). Priemerná denzita všetkých pozorovaných zástupcov druhu G. candidum na začiatku pokusu dosahovala 1,45 ±0,28 log.ktj.ml -1 (v k = 19,6 %). V stacionárnej fáze koncentrácia buniek vzrástla v priemere na 6,27 ±0,58 log.ktj.ml -1 (v k = 9,3 %). S ohľadom na hodnoty variačných koeficientov a medzu spoľahlivosti použitej mikrobiologickej zrieďovacej kultivačnej metódy na stanovenie počtu kvasiniek a plesní (16-52 %) záverom možno usúdiť, že dynamika rastu sledovaných izolátov sa významne nelíšila. Počas kultivácie sme zaznamenali zvýšenie ph hodnôt modelového bujónu z počiatočnej priemernej hodnoty 4,53 ±0,09 (v k = 1,0 %) na konečnú hodnotu 8,17 ±0,17 (v k = 2,1 %). Všetky študované izoláty a zbierkové kmene dokázali asimilovať laktát a vytvárať amoniak. Priebeh asimilácie laktátu sa v prípade niektorých izolátov líšil. Niektoré ho dokázali využívať až po dosiahnutí stacionárnej fázy rastu, iné už skôr. Pozorovaný zástupcovia dokázali produkovať amoniak v množstvách od 249 do 971 mg.l -1. Poďakovanie: Táto práca vznikla aj vďaka grantu MŠ SR VEGA 1/0495/13. 65

66 Použitá literatúra: 1. BOTHA, A. Geotrichum. In ROBINSON R.K. Encyclopedia of Food Microbiology. London: Academic Press, ISBN , p Dostupné tiež v HTML verzii na: < ( ). 2. BOUTROU, R., GUÉGUEN, M. Interests in Geotrichum candidum for cheese technology. In International Journal of Food Microbiolog,y, 2005, vol. 102, s HUDECOVÁ, A. Kvantifikácia vplyvu faktorov prostredia a vzájomných vzťahov medzi mikroorganizmami v potravinách. Dizertačná práca. Slovenská technická univerzita, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Bratislava, 2011, 223 s. 4. MACÁKOVÁ, M. Analýza rastu a metabolizmu druhu Geotrichum candidum. Diplomová práca. Slovenská technická univerzita, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Bratislava, 2013, 89 s. 5. HUDECOVÁ, A., VALÍK, Ľ., LIPTÁKOVÁ, D. Surface growth of Geotrichum candidum: Effect of the enviromental factors on its Dynamics. In Potravinárstvo, 2011, vol. 5, p THAMMAVONGS, B., PANOFF, J. M., GUÉGUEN, M. Phenotypic adaptation to freeze thaw stress of the yeast-like fungus Geotrichum candidum. In International Journal of Food Microbiology, 2000, vol. 60, FRÖHLICH-WYDER, M.-T. Yeasts in dairy products. In BOEKHOUT, T. ROBERT, V. Yeasts in food. Abington: Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC, ISBN X, p KORNACKI, J.L., FLOWERS, R.S., BRADLEY, R.L. Microbiology of butter and related products. In MARTH, E.H., STEELE, J.L. Applied dairy microbiology. 2. vyd. New-York: Marcel Dekker, Inc., ISBN X, p POTTIER, I., GENTE, S., VERNOUX, J. P., GUÉGUEN, M. Safety assessment of dairy microorganisms: Geotrichum candidum. In International Journal of Food Microbiology, 2008, vol. 126, p ADOUR, L., COURIOL, C., AMRANE, A., PRIGENT, Y. Growth of Geotrichum candidum and Penicillium camembertii in liquidmedia in relation with the consumption of carbon and nitrogen sources and the release of ammonia and carbon dioxide. In Enzyme and Microbial Technology, 2002, vol. 31, p ADOUR, L., BUDE, F., ABDELTIF, A. Sequential use of ammonium and leucine as nitrogen sources during growth of Geotrichum candidum on a glucose based medium. In Electronic Journal of Biotechnology, 2010, vol. 13, no. 1, p STN ISO Mikrobiológia: Všeobecné pokyny na prípravu riedení pri mikrobiologickom skúšaní. Bratislava: Slovenský ústav technickej normalizácie, 1997, 12 s. 13. STN ISO Mikrobiológia: Všeobecné pokyny na stanovenie počtu kvasiniek a plesní. Metóda počítania kolónií kultivovaných pri 25 C. Bratislava: Slovenský ústav technickej normalizácie, 1997, 6 s. 14. BARANYI, J., ROBERTS, T.A., Mc.CLURE, P. A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. In Food Microbiology. 1993, vol. 10, p SACRISTÁN, N., GONZÁLEZ, L., CASTRO., J. M., FRESNO, J. M., TORNADIJO, M. E. Technological characterization of Geotrichum candidum strains isolated from a traditional Spanish goats milk cheese. In Food Microbiology, 2012, vol. 30, p PRÍBELA, A. Analýza potravín: cvičenie. 1. vyd. Bratislava: Slovenská vysoká škola technická v Bratislave, Edičné stredisko SVŠT, ISBN , 394 s. Kontaktná adresa: Ing. Martina Koňuchová, Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, Bratislava, Slovenská republika, martina.konuchova@stuba.sk 66

67 MIKROBIÁLNE ZLOŽENIE MÁJOVEJ BRYNDZE: VÝSLEDKY KULTIVAČNEJ A NEKULTIVAČNEJ ANALÝZY Koreňová Janka 1, Kuchta Tomáš 1, Pangallo Domenico 2, Šaková Nikoleta 2 1 NPPC - VÚP, Oddelenie mikrobiológie, molekulárnej biológie a biotechnológií, Bratislava 2 Slovenská akadémia vied, Ústav molekulárnej biológie, Bratislava Microbial Composition of May Bryndza Cheese Culture Based and Non-culture Based Analysis Results Summary: 7 samles of May bryndza cheese were obtained from 7 small enterprises in Slovakia mountains. Quantitative culture-based data were obtained for lactobacilli, lactococci, coliforms, E. coli, staphylococci, coagulasepositive staphylococci, yeasts, fungi and Geotrichum spp. Diversity of prokaryotes and eukaryotes was studied by non-culture approach based on amplification of 16S rdna and internal transcribed spacer region, coupled to denaturing gradient gel electrophoresis and sequencing. The culture based data demonstrated presence of lactococci in density CFU/g, lactobacilli CFU/g, when differences between samples were not found. Density of Geotrichum spp. Was CFU/g in one case was 10 6 CFU/g. All samples were met the requirements Regulation (EC) No 2073/2005, there were found density of coagulase-positive staphylococci at lower value of limit (10 4 CFU/g) in two samples only. Non-culture based approach was contributed to determine Lactococcus lactis subsp. lactis, Galactomyces geotrichum a Galactomyces candidum in all samples, Streptococcus spp. in. 6 samples, Leuconostoc spp. in 5 samples and other species Enterococcus, Lactobacillus, Serratia. Completly it were found out 3 10 species of procaryotes and 5 9 species of eucaryotes. Diverzita a dynamika mikroflóry ovčieho syr je zo široka študovaná najmä v krajinách okolo stredozemného mora [1, 2], menej poznatkov je dostupných z centrálnej a východnej Európy [3, 4]. Bryndza je tradičný ovčí slovenský syr vyrobený drvením a mletím vyzretého ovčieho alebo zmesi ovčieho a kravského hrudkového syra a ich miešaním so soľným roztokom. Charakteristické senzorické vlastnosti bryndze sú dané prirodzenou mikroflórou obsiahnutou v surovom ovčom mlieku a ovčom hrudkovom syre a charakteristickým spôsobom výroby, čím sa odlišuje od výroby iných druhov ovčieho syra vyrábaných mimo územia Slovenska. Značka Slovenská bryndza je zapísaná v Registri Chránených zemepisných označení EÚ (CHZO) [5]. Májová bryndza je zaužívaný názov pre bryndzu vyrobenú z ovčieho hrudkového syra, na výrobu ktorého sa použilo mlieko oviec, ktoré sa na jar pasú na prvej zelenej paši. V predloženej práci sme charakterizovali 100% ovčiu májovú bryndzu zo 7 malých výrobní salašníckeho typu z hľadiska obsahu baktérií, húb a kvasiniek kultivačnými a nekultivačnými technikami založenými na analýze DNA. Vzorky bryndze: Na izoláciu mikroorganizmov sa použili selektívne médiá a špecifické podmienky kultivácie určené pre kultiváciu mliečnych baktérií, kvasiniek a plesní. Vzorky bryndze sa spracovali odobratím 10 g vzorky a zmiešaním s 90 ml peptónovej vody, následnou homogenizáciou na prístroji Stomacher 400 počas 1 min pri strednej intenzite, a desiatkovým riedením v peptónovej vode. Kultivačná analýza: Koliformné baktérie a E. coli sa kvantifikovali na kultivačnej pôde Chromocult C (Merck) počas 24 h pri teplote 37 C. Stafylokoky ako rod sa kvantifikovali na kultivačnej pôde Baird-Parker agar (Merck) počas 48 h pri teplote 37 C. Koagulázová aktivita sa stanovila použitím súpravy Rabbit Plasma (BioRad), inkubácia 24 h pri teplote 37 C. Kvasinky, plesne a Geotrichum spp. sa kvantifikovali na pôde GYECH agar (HiMedia) počas 5 dní pri 25 C, morfológia kolónií sa určovala mikroskopicky. Laktobacily sa kvantifikovali anaeróbne na kultivačnej pôde MRS agar (Merck) počas 72 h pri teplote 37 C. Laktokoky sa kvantifikovali aeróbne na kultivačnej pôde M17 agar (Merck) počas 48 h pri teplote 30 C. 67

68 Nekultivačná analýza: DNA extrakcia: Celková DNA bola izolovaná z 1 g bryndze miešaním za podmienok 45 C počas 30 min. v 20 ml 2% citranu sodného so sklenenými guľôčkami, následne bola odobratá vrstva tuku a použil už overený postup izolácie pomocou chaotropickej extrakcie na tuhej fáze použitím DNeasy Tissue kit (Qiagen) [6]. Bakterálna 16S rdna a ITS fragment eukaryontov boli amplifikované použitím primerov 27F - Lac2 a 27F - 685R pre baktérie a ITS1 ITS4 pre eukaryonty. Produkty PCR boli klonované do buniek E. coli metódou Shotgun cloning, klony boli amplifikované a analyzované DGGE elektroforézou, ktorá slúži na odlíšenie a selekciu klonov pred konečnou sekvenačnou analýzou podľa Sangera [7]. Výsledky: 7 vzoriek májovej 100% ovčej bryndze zo siedmich salašníckych výrobní na Slovensku bola charakterizovaná kultivačnými metódami z hľadiska obsahu celkového počtu mikroorganizmov, koliformných baktérií, E. coli, stafylokokov, laktobacilov, laktokokov, kvasiniek, plesní a Geotrichum spp. Sumárne kultivačné mikrobiologické výsledky obsahu kyslomliečnych, resp. kontaminujúcich mikroorganizmov v bryndzi sú uvedené v Tabuľke 1 a v Tabuľke 2. Tabuľka I Výsledky kultivačnej analýzy kyslomliečnych baktérií, kvasiniek a Geotrichum spp. zo 7 vzoriek bryndze (A G) vzorka bryndze kvasinky (KTJ/g) Geotrichum spp. (KTJ/g) laktokoky (KTJ/g) laktobacily (KTJ/g) A 3,2 x ,6 x ,0 x ,2 x 10 7 B 1,0 x ,0 x ,4 x ,5 x 10 7 C 3,3 x ,2 x ,2 x ,5 x 10 8 D 4,6 x ,4 x ,3 x ,6 x 10 8 E 9,6 x ,9 x ,7 x ,2 x 10 8 F 3,1 x ,3 x ,2 x ,6 x 10 8 G 1,9 x ,2 x ,3 x ,4 x 10 8 Tabuľka II Výsledky kultivačnej analýzy kontaminujúcich baktérií a plesní zo 7 vzoriek bryndze (A G) vzorka bryndze koliformné b. (KTJ/g) E. coli (KTJ/g) stafylokoky (KTJ/g) KPS* (KTJ/g) iné plesne (KTJ/g) L. mono** (dôkaz) A 3,7 x ,6 x ,2 x 10 7 <10 3 < B 3,6 x ,0 x ,8 x ,5 x 10 4 < C 5,1 x ,2 x ,9 x 10 6 <10 3 3,6 x D 1,3 x 10 5 <10 3 6,8 x ,6 x 10 3 > E 2,0 x 10 5 <10 3 2,7 x 10 6 <10 3 1,8 x F 9,0 x ,6 x ,8 x ,6 x 10 4 < G 1,6 x ,4 x ,7 x 10 5 <10 3 < *koagulázo-pozitívne stafylokoky ** Listeria monocytogenes 68

69 Vo vzorkách boli kultivačne zistené počty laktokokov v hladine KTJ/g a laktobacilov KTJ/g, pričom medzi jednotlivými výrobňami neboli podstatné rozdiely. Geotrichum spp. bolo vo vzorkách zistené v hladine KTJ/g, v jednom prípade 10 6 KTJ/g (Tab. I). Obsah koagulázopozitívnych stafylokokov zodpovedal požiadavkám Nariadenia EÚ [...], v dvoch vzorkách bola zistená koncentrácia na dolnej hranici limitu. Vyšší počet koliformných baktérií ( ; v jednom prípade 10 6 KTJ/g) a E. coli (< ) KTJ/g) môže byť zapríčinený nedostatkami v hygiene výroby, ale tiež môže významne poukazovať na nedostatočnú kompetíciu kyslomliečnych baktérií na začiatku zrenia ovčieho hrudkového syra (Tab. II). Výsledky korešpondujú s faktom, že syr bol vyrobený z nepasterizovaného ovčieho mlieka a rozvoj mikrobiálnych populácií bol ponechaný výhradne na kompetícii [8]. Tabuľka III Výsledky nekultivačnej analýzy eukaryontov použitím primerov ITS1 ITS4 zo 7 vzoriek bryndze (A G) Por. Vzorka bryndze č. Kmeň A B C D E F G 1 Candida glabrata 25 2 Candida zeylanoides 1 3 Claroideoglomus etunicatum 4 4 Cladosporium tenuissimum 3 5 Debaryomyces hansenii Fusarium oxysporum 1 7 Fusarium tricinctum Galactomyces candidum Galactomyces geotrichum Galactomyces reessii 3 11 Gymnoascus reesii Kluyveromyces lactis Lacazia loboi Penicillium citrinum Penicillium purpurogenum 1 16 Pichia fermentans Pholiota adiposa Physcia stellaris 3 19 Trichosporon coremiiforme 5 20 Trichosporon insectorum 1 21 Yarrowia lipolytica Z eukaryotickej populácie boli nekultivačnými metódami vo všetkých siedmich vyšetrovaných vzorkách zistené druhy Galactomyces geotrichum a Galactomyces candidum. Eukaryotická populácia ďalej pozostávala z kvasiniek rodov Candida, Debaryomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, ktoré sú typicky prítomné v bryndzi aj iných syroch (Laurenčík et al., 2008; Chebeňová-Turcovská et al., 2011). V troch analyzovaných vzorkách letnej bryndze (E, F, G) boli detegované vláknité huby, ktoré súvisia so sekundárnou kontamináciou z prostredia. Patogénna kvasinka Trichosporon bola identifikovaná v jednej vzorke (Tab. III). 69

70 Tabuľka IV Výsledky nekultivačnej analýzy baktérií použitím špecifických primerov 27F - Lac2 na DNA zo vzoriek A - G a univerzálnych primerov 27F 685R na DNA zo vzoriek bryndze A* a B*. Por. Vzorka bryndze č. Kmeň A A* B B* C D E F G 1 Enterobacter ludwigii 1 2 Enterococcus durans 1 3 Enterococcus faecium Enterococcus hirae 1 5 Hafnia alvei 1 6 Lactobacillus gallinarum 2 7 Lactobacillus helveticus Lactobacillus paracasei subs. paracasei 1 9 Lactobacillus plantarum Lactococcus lactis 11 Lactococcus lactis subsp. cremoris Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus lactis subsp. hordniae Lactococcus raffinolactis 1 15 Leuconostoc mesenteroides 1 16 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Leuconostoc pseudomesenteroides Rothia nasimurium 1 20 Serratia grimesii 1 21 Serratia liquefaciens 1 22 Serratia plymuthica 1 23 Serratia proteamaculans Serratia quinivorans 2 25 Streptococcus gallolyticus 1 26 Streptococcus lutetiensis 1 27 Streptococcus macedonicus Streptococcus parauberis Streptococcus salivarius 7 30 Streptococcus uberis 1 31 Streptococcus thermophilus

71 Na nekultivačnými analýzu DNA prokaryontov sa použili špecifické primery (27F - Lac2) a univerzálne primery (27F 685R). Použitím týchto dvoch párov primerov sa preukázala rozdielnosť kvalitatívneho bakteriálneho zastúpenia (vzorky A* a B*) (Tab IV). Markantný podiel bakteriálnej mikroflóry vo všetkých analyzovaných vzorkách tvoril rod Lactococcus, predovšetkým druh Lactococcus lactis subsp. lactis. Ďalej bola zistená DNA baktérií rodu Streptococcus (v 6 vzorkách), Leuconostoc (v 5 vzorkách) Enterococcus, Lactobacillus, Serratia a ďalšie rody (Tab. IV). Celkovo bolo v jednotlivých vzorkách bryndze zistených 3-10 druhov baktérií a 5 9 druhov eukaryontov. Záver: Aplikácia kultivačne nezávislých metód neumožnila zachytenie niektorých bakteriálnych druhov zistených kultivačne, preto pre získanie komplexného obrazu mikrobiálnych spoločenstiev je potrebné použiť kombináciu oboch metód kultivačnej aj nekultivačnej analýzy. Získané údaje budú východiskom pre nasledujúci aplikovaný výskum bryndze, pre jej špecifikáciu na základe vedeckých poznatkov, pre zvýšenie a odlíšenie kvality bryndze. Poděkování: Táto práca je súčasťou projektu financovaného Agentúrou na podporu výskumu a vývoja (APVV ). Použitá literatúra: 1. Rantsiou, K., Urso, R., Dolci, P., Comi, G., Cocolin, L., Microflora of Feta cheese from four Greek manufacturers. Int. J. Food. Sci. Nutr. 126, Fuka, M.M., Engel, M., Skelin, A., Redžepović, S., Schloter, M., Bacterial communities associated with the production of artisanal Istrian cheese. Int. J. Food. Sci. Nutr. 142, Alegría, Á., Szczesny, P., Mayo, B., Bardowski, J., Kowalczyk, M., Biodiversity in Oscypek, a traditional Polish Cheese, determined by culture-dependent andindependent approaches. Appl. Environ. Microbiol. 78, Berta, G., Chebeňová, V., Brežná, B., Pangallo, D., Valík, L., Kuchta, T., Identification of lactic acid bacteria in Slovakian bryndza cheese. J. Food Nutr. Res. 48, NARIADENIA KOMISIE (ES) č. 676/2008 zo 16. júla 2008, ktorým sa zapisujú niektoré názvy do Registra chránených označení pôvodu a chránených zemepisných Slovenská bryndza (CHZO) 2008/L189/19 (PGI) 6. Chebeňová-Turcovská, V., Ženišová, K., Kuchta, T., Pangallo, D., Brežná, B., Cultureindependent detection of microorganisms in traditional Slovakian bryndza cheese. Int. J. Food Microbiol. 150, Pangallo, D., Šaková, N., Koreňová, J., Puškárová, A., Kraková, L., Valík, Ľ., Kuchta, T.: Microbial diversity and dynamics during the production of May bryndza cheese. International Journal of Food Microbiology 170 (2014) Valík, Ľ., Mikrobiológia syrov. In: Görner, F., Valík, Ľ. (Eds.), Aplikovanámikrobiológia požívatín. Malé centrum, Bratislava, pp Kontaktná adresa: Ing. Janka Koreňová, NPPC - Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, Bratislava, 02/ , korenova@vup.sk 71

72 72

73 CESTY PRENOSU LISTERIA MONOCYTOGENES VO VÝROBNIACH TRADIČNÝCH SLOVENSKÝCH SYROV Minarovičová Jana, Koreňová Janka, Kaclíková Eva, Kuchta Tomáš Oddelenie mikrobiológie, molekulárnej biológie a biotechnológie, NPPC-Výskumný ústav potravinársky, Bratislava Transmition Routs of Listeria monocytogenes in Slovak Traditional Cheese Producers Summary: Listeria monocytogenes is an important food-borne pathogen that causes listeriosis. Human listeriosis can couse consumption of animal origin food like unpasteurized milk, meat and ready-to-eat food. Production of cheeses and bryndza from unpasteirized milk has long-term tradition in Slovakia. In particular in unpasteurized cheese industries, contamination by L. monocytogenes is thought to occur most frequently in food-processing environments. Frequently persists in food-processing environments despite of rigorous sanitation procedures. Monitoring of L. monocytogenes in two different small hand-made un-pasteurized ewes cheese producers were done in Samples from food processing environment, raw materials, final producs and waste water were analysed by conventional cultivation method [1], by moleculer methods based on polymerase chain reaction (real-time PCR [2]) and typing method based on PFGE [3] and molecular serotyping [4]. Typing methods serve for traceableness of routs of transmition and source of L. monocytogenes contamination in cheese chain. Listeria monocytogenes je významný potravinársky patogén, ktorý spôsobuje závažné ochorenie listeriózu. Listeriózy u ľudí sú najčastejšie spôsobené konzumáciou potravín živočíšneho pôvodu, najmä surového mlieka, mäsa a potravín určených na priamy konzum. Výroba syrových výrobkov a bryndze z nepasterizovaného ovčieho mlieka majú na Slovensku svoju dlhodobú tradíciu. Kontaminácia syrárskych výrobní v mnohých prípadoch začína surovinou alebo zdrojmi z vonkajšieho prostredia výrobne (prach, hmyz, voda, pôda). Prelomenie hygienickej bariéry môže viesť k osídleniu vnútorného prostredia výrobne, ktoré môže viesť až k perzistencii niektorých odolných kmeňov L. monocytogenes. V rokoch sa vykonal monitoring výskytu L. monocytogenes v troch syrárskych prevádzkach. Odoberali sa suroviny, hotové výrobky, stery z výrobného prostredia (plochy v priamom kontakte s potravinou, plochy, ktoré neboli v priamom kontakte s potravinou), odpadové vody a vzorky z prostredia. Vzorky sa analyzovali klasickou kultivačnou metódou [1] ako aj molekulárno-biologickými metódami na princípe polymerázovej reťazovej reakcie (real-time PCR). Spolu sa analyzovalo 400 vzoriek, pričom v 8 vzorkách sa detegovala a aj potvrdila L. monocytogenes. Najčastejšími zdrojmi L. monocytogenes boli handra na utieranie nôh pred vstupom do výrobne, mucholapka, textilný filter z dojacieho zariadenia, senáž, ovčia hrudka, bryndza priamo z výroby a plastová nádoba. Izolované kmene sa potvrdili pomocou real-time PCR [2] a charakterizovali pomocou typizačných metód molekulárnou serotypizáciou [4] a pulznou gélovou elektroforézou (PFGE) [3]. Typizácia kmeňov nám umožnila vystopovať cesty prenosu a zdroje kontaminácie v syrárskych výrobniach, ako aj určiť cesty prenosu. Hoci výskyt L. monocytogenes bol sporadický a finálny výrobok bol vždy negatívny, treba dôsledne dodržiavať zásady správnej hygienickej a výrobnej praxe, k čomu môže prispieť aj častý mikrobiologický monitoring hygienického stavu výrobného procesu. Metodika odberu a spracovania vzoriek Vzorky boli odobraté z dvoch syrárskych výrobní vyrábajúcich bryndzu z nepasterizovaného ovčieho mlieka počas roka tak, aby boli zachytené všetky ročné obdobia. Syrárska výrobňa bola klasifikovaná podľa výskytu L. monocytogenes v minulosti na L. monocytogenes pozitívnu prevádzku a L. monocytogenes negatívnu prevádzku. Štvrťročne sa odobralo 50 vzoriek z každej výrobne. Vo vzorkách boli zahrnuté stery zo zariadenia, ktoré je v priamom kontakte s potravinou, stery zo zariadenia neprichádzjúceho do priameho kontaktu s potravinou, suroviny, hotové výroby a odpadové vody. Vzorky sa počas transportu do laboratória 73

74 skladovali pri 4 C a do 24 h sa spracovali podľa harmonizovaného protokolu. Vzorky sterov sa odobrali z povrchov 30 x 30 cm pomocou špongiových steroviek s neutralizačným roztokom (3M, St. Paul, USA). Kvapalné vzorky sa odobrali v objeme 500 ml do sterilných sklených vzorkovníc a na analýzu sa použilo 10 ml sedimentu, ktorý sa získal centrifugáciou pri 2175 g (Sorwall RT 6000D, DuPont, Waltham, USA). Potravinové vzorky sa použili v množstve 25 g. Vzorky sa analyzovali podľa ISO :1996 a súčasne sa na dôkaz L. monocytogenes použila rýchla alternatívna real-time PCR [2]. Vyizolované a potvrdené kolónie L. monocytogenes sa typizovali pomocou multiplexnej PCR (Doumith a kol., 2004) a celogenómovou restrikčnou analýzou (ApaI, AscI) (PFGE, PulsNet Protocol)[3]. Výsledky a diskusia Celkovo sa analyzovalo 400 vzoriek z oboch typov výrobní počas štyroch ročných období. V prvej výrobni označenej ako L. monocytogenes negatívna prevádzka boli pozitívne štyri vzorky, čo predstavuje 2% pozitívnych vzoriek z 200 odobratých vzoriek. Zdrojmi kontaminácie boli handra na čistenie obuvi pred vstupom do výrobne, hmyz zachytený na mucholapke vo výrobni, celulózový filter z dojaceho zariadenia a senáž (fermenované seno na kŕmenie oviec v zimných mesiacoch). Typizačnými metódami sa izoláty L. monocytogenes zaradili do sérotypu 1/2a a pulzotypov 3,6,7 a 8. Lokalizácia pozitívnych odberových miest umožnila definovať zdroje a cesty kontaminácie, ktoré v tomto prípade indikujú priamu kontamináciu z vonkajšieho prostredia. V druhej výrobni označenej ako L. monocytogenes pozitívna prevádzka boli pozitívne štyri vzorky na prítomnosť L. monocytogenes, čo predstavuje 2%. Zdrojmi kontaminácie v tomto prípade bol ovčí hrudkový syr z nepasterizovaného ovčieho mlieka zvážaný z rôznych salašov, bryndza odobratá priamo z výrobne, balička bryndze a plastová nádoba, ktorá nie je v priamom kontakte so surovinou alebo finálnym výrobkom. Serotypizácia odlíšila tri základné sérotypy L. monocytogenes 1/2a, 1/2c a 4b a pomocou PFGE sa definovali tri pulzotypy 1, 3 a 5, pričom pulzotyp 1 sa vyskytol u izolátu z bryndze ako aj u izolátu z baličky. Rovanký typ pulzotypu poukazuje na krížovú kontamináciu. Výsledky získané zo slovenských prevádzok boli porovnané s výsledkami krajín participujúcich v riešenej práci. Z výsledkov vyplýva, že naši výrobcovia syrov mali najmenej kontaminovanú prevádzku kmeňmi L. monocytogenes (2% pozitívnych vzoriek). Na základe charakterizácie ciest prenosu išlo o náhodnú sporadickú kontamináciu z vonkajšieho prostredia, pričom nikdy nebola zistená prítomnsosť L. monocytogenes vo finálnom výrobku expedovanom do tržnej siete. Výsledky získané zo slovenských syrárskych výrobní boli porovnané s výsledkami partnerských krajín (Rakúsko, Rumunsko, Írsko, Španielsko, Grécko), ktoré boli spoluriešiteľmi práce. Vo všetkých spoluriešiteľkých krajinách zachytili vyšší počet pozitívnych vzoriek (od 4,6% do 23%). Vyšší počet pozitívnych vzoriek môže súvisieť s veľkosťou výrobne, rôznorodosťou typu mliečnych výrobkov, rôznou surovinou, zložitosťou výrobného zariadenia, technológiou výroby (napr. syry zrejúce pod mazom) ako aj schopnosťou niekorých kmeňov L. monocytogenes perzistovať v syrárskych prevádzkach [5]. Záver Predložená práca je zameraná na sledovanie ciest prenosu L. monocytogenes vo výrobniach tradičných slovenských syrov. Nízky výskyt pozitívnych vzoriek (2%), najmä sterov z prostredia neprichádzajúceho do priameho styku s potravinou, naznačuje sporadickú kontamináciu neperzistujúcimi kmeňmi. Správna hygienická a výrobná prax a jej dôsledné dodržiavanie je nevyhnutnou podmienkov k zabezpečeniu kvalitného a zdravotne bezpečného výrobku. Pravideľný mikrobiologický monitoring výrobného prostredia môže včas odhaliť zdroje kontaminácie, čo umožňuje efektívne eliminovať možnú kontamináciu finálneho výrobku. 74

75 Poďakovanie Táto práca je riešená v rámci medzinárodného projektu PROMISE č , FP7-KBBE Literatúra 1. Anonymous, ISO :1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. Part 1: Detection method, International Organization for Standardization (ISO), Geneva, Switzerland. 2. Oravcová, K., Kaclíková, E., Krascsenicsová, K., Pangallo, D., Brežná, B., Siekel, P., Kuchta, T. (2006). Detection and quantification of Listeria monocytogenes by 5 -nuclease polymerase chain reaction targeting the acta gene. Letters in Applied Microbiology 42: Standardized Protocol for Molecular Subtyping of Listeria monocytogenes by Pulsed-Field GelElectrophoresis Doumith, M., Buchrieser, C., Glaser, P., Jacquet, Ch., Martin, P. (2004). Differentiation of the Major Listeria monocytogenes Serovars by Multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology 42: Fox, E., Hunt, K., O'Brien, M., & Jordan, K. (2011). Listeria monocytogenes in Irish farmhouse cheese processing environments. International Journal of Food Microbiology 145:S39-S45. Kontaktná adresa Ing. Jana Minarovičová, PhD. NPPC-VÚP Bratislava, Priemyselná 4, Bratislava, Slovenská republika, tel , minarovicova@vup.sk 75

76 76

77 MOŽNOSTI REDUKCIE A DEGRADÁCIE BIOGENNYCH AMÍNOV V MODELOVÝCH PODMIENKACH Greif Gabriel, Greifová Mária, Kováčová Monika Fakulta chemickej a potravinárskej technologie STU Bratislava Reduction ability and the degradation of biogenic amines in model conditions Summary: Work has focused on possibility of microbial degradation of biogenic amines in model conditions. In the first section of experiments, we examined the ability of selected lactobacilli (12 strains of L. plantarum, 10 strains of L. paracasei / casei) decrease the concentration of histamine and tyramine in a phosphate buffer, respectively. MRS medium. Lactobacillus plantarum 17L1 after 24 h of the stationary cultures lowering the initial concentrations of tyramine by 18%, reduced by other lactobacilli in the range of 6-18%. Consequently, we decarboxylase negative strain of Lactobacillus paracasei 21L10 subjected to co-culture experiments with strains of lactobacilli, lactococci and enterococci able to produkonať tyramine. For all measurements, we tried to find out as our chosen ratio of input concentrations strains is able to influence the final concentration of tyramine. Results showed that the the lowest formation of tyramine was the best aspect of initial concentration of inoculum (L. paracasei 21L10 / lactobacilli, lactococci and enterococci) is 1:0.2. However, a significant influence on the final concentration of tyramine in co-culture had the composition of the substrate (glucose / lactose) MRS/M17. Vysoké hladiny biogénnych amínov (BA) sa často vyskytujú v potravinách, v ktorých prebieha mikrobiálna aktivita počas ich zrenia a skladovania. Ide predovšetkým o ryby, fermentované mäsové výrobky, fermentovanú zeleninu, syry, víno a pivo. Najčastejšie sa vysoký obsah BA prejavuje ako otrava potravinami. Za normálnych podmienok, v priebehu procesu prijímania potravy v ľudskom gastrointestinálnom systéme, sú nízke množstvá absorbovaných BA metabolizované na fyziologicky menej aktívne degradačné produkty. Tento detoxikačný systém, ktorý poskytuje ochranu proti malým množstvám BA normálne vyskytujúcich sa v potravinách, zahŕňa špecifické enzýmy: monoaminooxidázy (MAO), diamínooxidázy (DAO) a polyamínooxidázy (PAO). Tieto enzýmy sa nachádzajú v tráviacom trakte a môžu zamedziť vstrebávaniu BA do krvného obehu, ale majú však len určitú kapacitu, ktorá nezvládne nadmerný príjem BA. V prípade alergických jednotlivcov alebo pri príjme vysokého množstva BA v potravinách, detoxikačný systém nie je schopný dostatočne odstrániť tieto BA. Okrem toho niektoré lieky (napr. antihistaminiká, psychofarmaká s antidepresívnym účinkom, lieky na liečbu Alzheimerovej a Parkinsonovej choroby) znižujú aktivitu MAO a DAO (Latorre-Moratalla a kol., 2010). Putrescín a kadaverín znižujú aktivitu DAO pri odbúravaní histamínu, pretože majú vyššiu afinitu k DAO, tým sa vyčerpá DAO pre histamín (Al Bulushi a kol., 2009). A taktiež u jedincov s chorobami tráviaceho traktu (gastritída, žalúdočne vredy) je aktivita aminooxidáz nižšia ako u zdravých jedincov. Medzi ďalšie faktory znižujúce výkonnosť detoxikačného systému patria alkohol, káva, čaj a cigarety. Ak je detoxikácia neefektívna, BA sa ľahko absorbujú a dostávajú do krvného obehu, čo vedie k vzniku toxických účinkov (McCabe-Sellers a kol., 2006). Detoxikačný systém histamínu v ľudskom tele sa skladá z dvoch rôznych enzýmov, z DAO a histamín-nmetyltransferázy (HNMT). Tieto enzýmy sú schopné odbúrať primerané množstvo histamínu na netoxické produkty. Prostredníctvom enzýmu HNMT je imidazolový kruh metylovaný za vzniku 1- metylhistamínu, ktorý je ďalej metabolizovaný MAO, pričom vzniká 1-metylimidazol acetaldehyd. Konečným produktom tejto reakcie, pri ktorej sa zúčastňuje enzým aldehyd- dehydrogenáza, je kyselina 1-metylimidazol octová (Toyo oka, 2008). BA sú fyziologicky inaktivované aminooxidázami. Tieto enzýmy sú schopné katalyzovať oxidačnú deamináciu BA za vzniku príslušného aldehydu, peroxidu vodíka a amoniaku. Enzýmy MAO a DAO sú prítomné u vyšších organizmoch a taktiež ich činnosť bola opísaná u niektorých baktérii. Oxidačnú deamináciu amínov katalyzujú tiež dehydrogenázy (Yamashita a kol., 1993; Siddiqui a kol., 2000; Zaman a kol., 2011). Niektoré kmene baktérii z rodov, predovšetkým Brevibacterium, Staphylococcus, Micrococcus, Lactobacillus, Pediococcus a iné, vykazujú 77

78 aminooxidázovú a dehydrogenázovú aktivitu, čím sa môžu podieľať na degradácii BA (Leuschner a Hammes, 1998; Garcia-Ruiz a kol., 2011). Tieto baktérie môžu byť súčasťou štartovacích kultúr, ktoré sa využívajú pri výrobe fermentovaných potravín. Štartovacie kultúry potrebujú optimálne podmienky pre svoj rast, aby prevládali nad baktériami, ktoré sú zodpovedné za produkciu BA. Kmeň Brevibacterium linens, ktorý sa podieľa pri výrobe syrov zrejúcich pod mazom (Romadúr), produkuje oxidázy a vykazuje vysoký potenciál pri degradácii histamínu a tyramínu (Osman, 2004). Kyslomliečne baktérie L. plantarum, L. casei a L. paracasei, ktoré sa aplikujú hlavne v mliekarenskom priemysle na výrobu niektorých syrov, kefíru a iných fermentovaných výrobkov, majú schopnosť degradovať BA. L. plantarum sa uplatňuje pri degradácii putrescínu, histamínu a tiež nepatrne tyramínu. U druhov L. casei a L. paracasei bola preukázaná vysoká aktivita pri degradácii putrescínu, tyramínu a rovnako tak histamínu (Garcia-Ruiz a kol., 2011). L. sakei, ktorý sa používa pri výrobe klobás ako štartovacia kultúra, je schopný degradovať histamín. P. acidilactici uplatňujúci sa pri výrobe fermentovaných mliečnych výrobkov, zeleniny, rýb a mäsa preukazuje schopnosť degradovať histamín (Lauschner a kol., 1998). Aminooxidázová aktivita bola tiež preukázaná u niektorých mikroskopických vláknitých húb. Najlepšiu schopnosť degradovať BA (histamín, tyramín, putrescín) vykazujú najmä rody Penicillium a Alternaria. Niektoré druhy rodu Penicillium sa využívajú pri výrobe plesnivých syrov. P. citrinum má vysokú schopnosť degradovať histamín, tyramín a putrescín. Aj ďalší zástupcovia rodov Aspergillus, Fusarium a Cladosporium vykazujú schopnosť degradovať BA (Cueva a kol., 2012). Práca je zameraná na schopnosť mikrobiálnej degradácie biogénnych amínov v modelových podmienkach formou kokultivacie dekarboxyláza negatívneho kmeňa Lactobacillus paracasei 21L10 s kmeňmi laktobacilov, laktokokov a enterokokov schopných produkonať tyramín. Materiály a metódy Mikroorganizmy V experimentoch sa použili mikroorganizmy izolované z ovčích hrudkových syrov. Rod Lactococcus: L. lactis: 10S5; rod Lactobacillus: L. plantarum: 219, L718, K816, K817, 16L5, 17L1, 17L3, 18L2, 18L6, 19L3, 26L2, 30L2; L. paracasei: 113, 211, 21L10, 11L5, 21L5, 20L3, 314; L. brevis: 2L11 L. reuteri: 2L7; L. casei: CCM 7088, CCM 4791, CCM 4798, Lc, L26, L 198; kmeň (Lc) bol zapožičaný od MVDr. Lauková A., CSc. z Ústavu fyziológie zvierat SAV, Košice a kmene (L26, L198) boli zapožičané od doc. Ing. Plockovej M., PhD. z VŠCHT Praha Česká republika, rod Enterococcus: E. faecalis: 5E3; E. faecim: 1E8; E. durans: 7E9. Kultivačné médiá MRS bujón: 5,22 g bujónu sa rozpustí v 100 ml vody, ph sa upraví na 5,7 ± 0,2, pipetuje po 9 ml do skúmaviek, uzavrie a sterilizuje pri 121 C po dobu 20 min. Kokultivačné médiá: MRSX a M17X bujón. Bujóny s prídavkom tyrozínu. RP-HPLC stanovenie koncentrácií tyramínu v MRS X bujóne Prítomnosť tyramínu v MRS X bujóne sa sledovala po predkolónovej derivatizácií s dansyl chloridom vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou na reverznej fáze RP-HPLC, použitím UV detektora (254 nm). Ako mobilná fáza sa použil roztok acetonitrilu a deionizovanej vody v pomere 8:2. Kvantitatívne stanovenie tyramínu sa robilo pomocou kalibračnej krivky. 78

79 Výsledky a diskusia Vplyv kokultivácií Lactobacillus paracasei 21L10 s prídavkom inokula laktobacilov Na základe poznatkov z predchádzajúcich zistení sme pre kokultiváciu použili kmeň L. paracasei 21L10. Následne pre kokultiváciu sme vybrali kmene heterofermentatívne, dekarboxyláza pozitívne z rodu Lactobacillus a to L. brevis 2L11 a L. reuteri 2L7. Výsledné koncentrácie tyramínu po 24 h kokultivácii sú uvedené na Obr. 1. Ako vyplynulo z našich stanovení výsledné koncentrácie tyramínu pri objemoch kultivačného média 0,2 1 cm 3 L. reuteri 2L7 boli rôzne (Obr. 1D), naproti tomu u kmeňa L. brevis 2L11 koncentrácia tyramínu dosiahla hodnotu 1254,94 ± 13,87 mg.dm -3 (Obr. 1A.). Avšak pri kokultivácii L. brevis 2L11 a L. reuteri 2L7 s kmeňom L. paracasei 21L10 (Obr. 1B, C a 1E, F) došlo k významnejšiemu ovplyvneniu rastu a tým aj k poklesu produkcie tyramínu. A L. brevis 2L11 B C L. reuteri 2L7 D E F c TYR [mg.dm -3 ] c TYR [mg.dm -3 ] ,0 0,3 0,6 0, ,0 0,3 0,6 0,9 0,0 0,3 0,6 0,9 Prídavok inokula [dm -3 ] x ,0 0,3 0,6 0, ,0 0,3 0,6 0,9 0,0 0,3 0,6 0,9 Prídavok inokula [dm 3 ] x 10-3 Obr. 1. Vplyv prídavku inokula kmeňov L. brevis 2L11 (0,2-1 cm 3 ) (A ), L. brevis 2L11 a L. paracasei 21L10 (1 cm 3 a 0,2-0,8 cm 3 ) (B ), L. brevis 2L11, L. paracasei 21L10 (0,2-0,8 cm 3 a 1 cm 3 ) (C ) a kmeňov L. reuteri 2L7 (0,2-1 cm 3 ) (D ), L. reuteri 2L7 a L. paracasei 21L10 (1 cm 3 a 0,2-0,8 cm 3 ) (E ), L. reuteri 2L7 a L. paracasei 21L10 (0,2-0,8 cm 3 a 1 cm 3 ) (F ) na produkciu tyramínu v MRS X bujóne pri 37 C. Výsledky sú porovnateľné so štúdiami, ktoré ukázali, že tvorbe biogénnych amínov v Nham (thajská fermentovaná klobása) môže byť zabránené prídavkom L. plantarum BCC Okrem toho, prídavok L. plantarum BCC 9546 do Nham, ktorý bol inokulovaný tyramín pozitívnym kmeňom L. brevis BCC produkoval nižší obsah tyramínu ako Nham inokulovaný iba samotným L. brevis BCC Z výsledkov vyplýva, že štartovacia kultúra L. plantarum BCC 9546 má schopnosť znižovať obsah tyramínu v Nham obsahujúcu dekarboxylázovo - pozitívne baktérie (Tosukhowong, Visessanguan, Pumpuang a kol., 2011). Vplyv kokultivácie Lactococcus lactis 10S5 s prídavkom inokula Lactobacillus paracasei 21L10 V tejto časti práce sme sa zamerali na vplyv kokultivácie Lactococcus lactis 10S5 s Lactobacilus paracasei 21L10, ktoré boli izolované z ovčieho hrudkového syra. Na porovnanie sme použili dve rôzne médiá MRSX bujón a M17X bujón. M17X bujón namiesto glukózy obsahuje laktózu, čiže sme navodili podobné modelové podmienky ako sú v mlieku. Z uvedených výsledkov (Obr. 2.) je vidieť, že pri kultivácii samotného kmeňa L. lactis 10S5 v MRSX bujóne (Obr. 2A.) nemal vplyv objem pridaného inokula. L. lactis 10S5 na produkciu tyramínu. Výsledná koncentrácia bola 1266,07 mg.dm -3 pri počiatočnej koncentrácií tyrozínu 1668 mg.dm -3, čo predstavuje 75,9%-nú výťažnosť tyramínu. Pri kokultivácii s kmeňom L. paracasei 21L10 (pričom objem inokula L. lactis 10S5 bol 1 cm 3 ) aplikované množstvo inokula L. paracasei 21L10 (0,2 0,8 cm 3 ) signifikantne znížilo obsah tyramínu, ktorý úmerne klesal až na hodnotu 271,38 mg.dm -3 (Obr. 2B). Najvýznamnejšie ovplyvnil výslednú koncentráciu tyramínu prídavok 1 cm 3 inokula L. paracasei 21L10 (Obr. 2C). 79

80 MRSX bujón M17X bujón 1200 A B C 1200 A B C c TYR [mg.dm -3 ] c TYR [mg.dm -3 ] ,0 0,3 0,6 0, ,0 0,3 0,6 0,9 0,0 0,3 0,6 0,9 Prídavok inokula [dm 3 ] x ,0 0,3 0,6 0, ,0 0,3 0,6 0,9 0,0 0,3 0,6 0,9 Prídavok inokula [dm 3 ] x 10-3 Obr. 2. Vplyv prídavku inokula kmeňov L. lactis 10S5 (0,2-1 cm 3 ) (A ), L. lactis 10S5 a L. paracasei 21L10 (1 cm 3 a 0,2-0,8 cm 3 ) (B ), L. lactis 10S5 a L. paracasei 21L10 (0,2-0,8 cm 3 a 1 cm 3 ) (C ) na produkciu tyramínu v MRSX bujóne pri 37 C a vplyv prídavku inokula kmeňov L. lactis 10S5 (0,2-1 cm 3 ) (A 1 ), L. lactis 10S5 a L. paracasei 21L10 (1 cm 3 a 0,2-0,8 cm 3 ) (B 1 ), L. lactis 10S5 a L. paracasei 21L10 (0,2-0,8 cm 3 a 1 cm 3 ) (C 1 ) na produkciu tyramínu v M17X bujóne pri 37 C. Mikroorganizmus Lactococcus lactis je vo všeobecnosti známy ako baktéria mliečneho kysnutia a používa sa ako štartovacia kultúra pri výrobe mliečnych fermentovaných výrobkov. Práve preto, nás zaujímalo ako sa bude správať v médiu s obsahom laktózy a či vybrané kokultivácie s kmeňom 21L10 budú mať relevantný vplyv na obsah tyramínu po ukončení kultivácie. Zistenia uvedené na (Obr. 2 M17X bujón) ukázali, že výsledky pri rôznych pomeroch obsahu inokula daných kmeňov sú porovnateľné a ich hodnota koncentrácie tyramínu bola okolo 1200 ± 26,43 mg.dm -3. Ako ukázali následné výsledky (neuvádzane v tejto práci) kmeň L. paracasei 21L10 je schopný len pomalého rastu v médiu M17 obsahujúcom disacharid laktózu, preto sa nemohli významne prejaviť jeho deaminačné schopnosti. Vplyv kokultivácií Lactobacillus paracasei 21L10 s prídavkom inokula enterokokov Baktérie z rodu Enterococcus sú bežne prítomné v rôznych oblastiach životného prostredia. Sú často izolované z fermentovaných potravín a to najmä z mliečnych, mäsových výrobkov alebo olív. Ich prítomnosť je často spojená so syrmi, ktoré sú vyrobené z ovčieho alebo kozieho mlieka, kde tvoria zložky ako tzv. ne-štartovacie baktérie mliečneho kvasenia (NSLAB - Non Starter Lactic Acid Bacteria). Enterokoky hrajú veľmi dôležitú úlohu pri zrení syrov hlavne kvôli ich metabolickej aktivite, ktorá ovplyvňuje konečné senzorické vlastnosti syrov (Foulquie Moreno, Sarantinopoulo, Tsakalidou a kol., 2006). V súčasnej dobe boli enterokoky široko aplikované vo výrobe fermentovaných potravín a pre ich využitie ako konzervačných látok sa uvažovalo či nie sú všeobecne považované za bezpečné (GRAS - Generaly recognize as safe). Ich úloha je stále veľmi kontroverzná predovšetkým niektoré ich vlastnosti, ako je schopnosť produkovať virulentné faktory, ich odolnosť voči mnohým antibiotikám a tiež schopnosť tvorby biogénnych amínov (Franz, Stiles, Schleifer a kol., 2003, Ogier Serror, 2008). Práve pre tieto vlastnosti nás zaujímalo ako sa budú správať v prostredí, v ktorom sa okrem kmeňov Enterococcus nachádza aj iný kmeň dekarboxylázovo negatívny L. paracasei 21L10. Experimenty s výslednými koncentráciami tyramínu pri kokultivácii L. paracasei 21L10 a E. faecalis 5E3, E. faecim 1E8, a E. durans 7E9 sú znázornené na Obr. 3. Pri pozornom porovnaní konečného obsahu tyramínu pri jednotlivých kombináciách kokultivácií môžeme skonštatovať, že sú pomerne zhodné. Úbytok množstva tyramínu je najvyšší pri pomere kmeňov 1:0,2. Najnižšia koncentrácia tyramínu (4,69 mg.dm -3 ) je zaznamenaná pri kombinácii kmeňov L. paracasei 21L10 a E. durans 7E9 v pomere 1:0,2 (Obr. 3C 3.). 80

81 Výsledky experimentov zaznamenaných v tejto časti práce je možné porovnať s prácou autorov Herrero-Fresno, Martínez, Sánchez-Llana (2012), kde ako kmeň redukujúci biogénne amíny použili Lactobacillus casei, ktorý mal schopnosť redukovať tyramín produkovaný kmeňom Enterococcus durans. Tyramín je najúčinejší zo skupiny tzv. vazoaktívnych amínov, t.j. látok zvyšujúcich krvný tlak. Tyramín môže pri podávaní liekov inhibujúcich MAO vyvolať hypertenzívnu krízu so silnými bolesťami hlavy, krvácaním do mozgu a zlyhaním srdca. Miernejšie intoxikácie tyramínom sa prejavujú ako migrény (Křížek a Kalač, 1998). Pre pacientov liečených inhibítormi MAO by nemal príjem tyramínu prekročiť 6 mg počas štyroch hodín (Křížek a Kalač, 1998). Predovšetkým pre tieto dôvody je potrebné nájsť vhodné riešenia ako zabrániť akumulácii biogénnych amínov vo fermentovaných produktoch a na druhej strane významne neovplyvniť jeho organoleptické vlastnosti A 1 Enterococcus faecalis 5E3 300 B C 1 c TYR [mg.dm -3 ] Enterococcus faecim 1E8 0 0,0 0,3 0,6 0, ,0 0,3 0,6 0,9 0,0 0,3 0,6 0,9 Prídavok inokula [dm 3 ] x Enterococcus durans 7E9 300 A B C A B C c TYR [mg.dm -3 ] c TYR [mg.dm -3 ] ,0 0,3 0,6 0, ,0 0,3 0,6 0,9 0,0 0,3 0,6 0,9 Prídavok inokula [dm 3 ] x ,0 0,3 0,6 0, ,0 0,3 0,6 0,9 0,0 0,3 0,6 0,9 Prídavok inokula [dm 3 ] x 10-3 Obr. 3. Vplyv kokultivácie L. paracasei 21L10 a E. faecalis 5E3 (1), L. paracasei 21L10 a E. faecium 1E8 (2), L. paracasei 21L10 a E. durans 7E9 na produkciu tyramínu v MRSX médiu pri 37 C (A 1, A 2, A 3 - produkcia tyramínu kmeňmi 5E3, 1E8, 7E9 pri množstve inokula 0,2; 0,5; 0,8; 1 cm 3 ; B 1, B 2, B 3 - produkcia tyramínu pri pomere kmeňov 21L10: (5E3, 1E8, 7E9) = (0,2; 0,5; 0,8) : (1); C 1, C 2, C 3 - produkcia tyramínu pri pomere kmeňov 21L10: (5E3, 1E8, 7E9) = (1) : (0,2; 0,5; 0,8). Poďakovanie: Táto práca bola podporená projektom VEGA 1/0879/12. 81

82 Použitá literatúra Al Bulushi, I., Poole, S., Deeth, H. C., Dykes, G. A. (2009). Biogenic amines in fish: Roles in intoxication, spoilage, and nitrosamine formation. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 49, Cueva, C., García-Ruiz, A., Gonzáles-Rompinelli, E., Bartolome, B., Martín-Álvarez, P. J., Salazar, O., Vincente, M. F., Bills, G. F., Moreno-Arribas, M. V. (2012). Degradation of biogenic amines by vineyard ecosystem fungi. Potencial use in winemaking. Journal of Applied Microbiology, 112, Foulquie Moreno MR, Sarantinopoulo P, Tsakalidou E a De Vuyst L.: The role and application of enterococci in food and health. International Journal of Food Microbiology,106, 1 24, Franz, C.M.A.P., Stiles, M.E., Schleifer, K.H. a Holzapfel, W.H.: Enterococci in foods a conundrum for food safety. International Journal of Food Microbiology, 88, García-Ruiz, A., Gonzáles-Rompinelli, E. M., Bartolomé, B., Moreno-Arribas, M. V. (2011) Potential of wine-associated lactic acid bacteria to degrade biogenic amines. International Journal of Food Microbiology, 148, Herrero-Fresno, A., Martínek, N., Sánchez-Llana, E., Díaz, M., Fernández, M., Martin M.C., Lafeto, V a Alvarez, MA.: Lactobacillus casei strains isolated from cheese reduce biogenic amine accumulation in an experimental model. International Journal of Food Microbiology 157, Křížek, M. a Kalač, P.: Biogenní amíny v potravinách a jejich role ve výživě. Czech Journal of Food Science, 16, Latorre-Moratalla, M. L., Bover-Cid, S., Talon, R., Garriga, M., Zanardi, E., Ianieri A., Fraqueza, M. J., Elias, M., Drosinos, E. H., Vidal-Carou, M. C. (2010). Strategies to reduce biogenic amine accumulation in traditional sausage manufacturing. LWT-Food Sci. Technol., 43, Leuschner, R. G., Hammes, W. P. (1998). Degradation of histamine and tyramine by Brevibacterium linenns during surface ripening on Munster cheese. Journal of Food Protection, 61, Leuschner, R. G., Heidel, M., Hammes, W. P. (1998). Histamine and tyramine degradation by food fermenting microorganisms, International Journal of Food Microbiology, 39, McCabe-Sellers, B. J., Staggs, C. G., Bogle, M. L. (2006). Tyramine in foods and monoamine oxidase inhibitor drugs: A crossroad where medicine, nutrition, pharmacy, and food industry converge. J. Food Compos. Anal., 19, Ogier, J.C. a Serror, P.: Safety assessment of dairy microor- ganisms: The Enterococcus genus. International Journal of Food Microbiology, 126, Osman, M. M. (2004). Factors affecting the antifungal properties of Brevibacterium linens, International Dairy Journal, 14, Siddiqui, J. A., Shoeb, S. M., Takayama, S., Shimizu, E., Yorifuji, T. (2000). Purification and characterization of histamine dehydrogenase from Nocardioides simplex IFO The Federation of European Microbiological Societes Microbiology letters, 189, Toyo oka, T. (2008). Separation assay of histamine and its metabolites in biological specimens. Biomedicinal chromatography, 22, Tosukhowong, A., Visessanguan, W., Pumpuang, L., Tepkasikul, P., Panya, A. a Valyasevi, R.: Biogenic amine formation in Nham, a Thai fermented sausage, and the reduction by commercial starter culture, Lactobacillus plantarum BCC Food Chemistry 129, Yamashita, M., Sakaue, M., Iwata, N., Sugino, H., Murooka, Y. (1993). Purification and characterization of monoamine oxidase from Klebsiella aerogenes. J. Ferm. Bioeng., 76, Zaman, M. Z., Abu Bakar, F., Jinap, S., Bakar, J. (2011). Novel starter cultures to inhibit biogenic amines accumulation during fish sauce fermentation. International Journal of Food Microbiology, 145, Kontaktná adresa: Ing. Gabriel Greif, PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technologie STU Bratislava, Radlinského 9, Bratislava; gabriel.greif@stuba.sk 82

83 TERNÁRNÍ SMĚSI TAVICÍCH SOLÍ OBSAHUJÍCÍ CITRONAN SODNÝ A JEJICH VLIV NA TVRDOST MODELOVÝCH TAVENÝCH SÝRŮ Salek Richardos Nikolaos 1), Buňka František 1), Černíková Michaela 1), Nagyová Gabriela 1), Kuchař Dalibor 2), Bačová Helena 1), Mynarčíková Lucie 1) 1) Ústav technologie potravin, FT UTB ve Zlíně 2) Fosfa akciová společnost Ternary mixtures of emulsifying salts containing trisodium citrates and its influence on texture parameters of processed cheese Summary: The aim of the study was to evaluate the impact of the ternary mixtures composition consisted of phosphate and citrate emulsifying salts (trisodium citrate TSC; disodium phosphate DSP; tetrasodium diphosphate TSPP; and sodium salt of polyphosphate P20) on hardness of processed cheese during a 30-day storage. Four types of ternary mixtures (DSP:TSPP:P20; DSP:TSPP:TSC; DSP:TSC:P20; TSC:TSPP:P20) were tested. All mixture types were utilized at shifting proportions with a step of 20% and some ratios with a 50% step. Samples without and with ph modification (the target ph value was ) were analysed. The observation of the hardness of samples was realized after 2, 9, and 30 days of storage at 6 C. A significant increase on hardness was observed at DSP:TSPP ratio (1:1 3:4) with constant P20 contents ( 60%). In the absence of P20 in the ternary mixtures, the hardest products were those consisting of TSC and TSPP (~ 1:1). The ph modification caused a significant change in the absolute values of hardness of the processed cheese while the latter trends remained. Úvod Tavený sýr můžeme charakterizovat jako viskoelastickou matrici, jejíž základní surovinou jsou sýry v různém stádiu zralosti. Klíčovou složkou při výrobě tavených sýrů jsou tzv. tavicí soli, které obvykle tvoří sodné soli fosforečnanů, polyfosforečnanů anebo citronanů. 1 3 Základní úlohou tavicích solí je iontová výměna sodných za vápenaté ionty v kaseinové matrici sýra. Z nerozpustného parakaseinanu vápenatého se stává rozpustnější parakaseinan sodný, jehož jednotlivé molekuly se v systému taveniny mohou pohybovat a přispívat k emulgaci tuku a vazbě vody. 1,4 Schopnost podporovat iontovou výměnu sodných za vápenaté ionty se u jednotlivých tavicích solí liší. V obecné rovině platí, že schopnost podpořit iontovou výměnu roste v následující posloupnosti (uvažovány jsou sodné soli): citronany monofosforečnany < difosforečnany < < trifosforečnany < polyfosforečnany s delším řetězcem. 1 3,5 El-Bakry et al. 6 tvrdí, že citronany podporují iontovou výměnu ve vyšší míře ve srovnání s monofosforečnany. Tavicí soli (zejména fosforečnanového typu) však ovlivňují i proces tvorby sítě (gelu) v chladnoucí matrici taveniny a přispívají tak k formování finální struktury taveného sýra. Procesu utváření finální matrice během chladnutí a následného skladování říkáme krémování. Jedná se o širokou škálu různých interakcí, zejména o vápenaté a disulfidické můstky, hydrofobní a elektrostatické interakce, vodíkové můstky a vazby fosforečnan-vápenatých komplexů. 1,2,5 Jednotlivé tavicí soli jsou schopny ovlivnit tvorbu gelu různými cestami. 2,3,7,8 Dosavadní práce však byly prováděny pouze se sodnými solemi fosforečnanů. 9,10 V praxi lze ovšem předpokládat také zahrnutí citronanů do směsi tavicích solí, což může mít vliv na intenzitu iontové výměny sodných za vápenaté ionty a tím i na dispergaci kaseinu. 2,11 Tato hypotéza však nebyla na základě dostupné literatury experimentálně ověřena. Cílem práce bylo porovnat tvrdost modelových tavených sýrů vyrobených s využitím ternárních směsí fosforečnanových (hydrogenfosforečnan sodný DSP; difosforečnan sodný TSPP; sodná sůl polyfosforečnanu se střední délkou řetězce n 20 P20) a citronanových (citronan sodný TSC) tavicích solí (testovány byly 4 typy ternárních směsí: DSP:TSPP:P20, DSP:TSC:P20, DSP:TSPP:TSC, TSC:TSPP:P20). 83

84 Materiál a metody Surovinová skladba (sýry holandského typu s 50 % w/w obsahu sušiny a 30 % w/w tuku v sušině, zralost 7 týdnů; máslo s 84 % w/w obsahu sušiny a 82 % w/w tuku v sušině; pitná voda) pro výrobu modelových roztíratelných tavených sýrů byla navržena tak, aby cílová hodnota obsahu sušiny tavených sýrů byla 40 % w/w a obsah tuku v sušině byl 50 % w/w. Jako tavicí soli byly použity ternární směsi obsahující citronan sodný (TSC), dále byly využívány DSP, TSPP a sodná sůl polyfosforečnanu (P20). Vznikly 4 typy ternárních směsí: DSP:TSPP:P20, DSP:TSC:P20, DSP:TSPP:TSC a TSC:TSPP:P20. Vzorky s ternární směsí DSP:TSPP:P20 byly pro tuto část studie používány jako kontrolní (srovnáváno s předchozími studiemi 9,10 ). Všechny 4 typy ternárních směsí sodných solí fosforečnanů byly aplikovány v procentuálních poměrech s krokem po 20 % s rozšířením o některé specifické poměry s 50 % některých solí (100:0:0; 80:20:0; 60:40:0; 50:50:0; 40:60:0; 20:80:0; 0:100:0; 80:0:20; 60:20:20; 40:40:20; 20:60:20; 0:80:20; 60:0:40; 40:20:40; 20:40:40; 0:60:40; 50:0:50; 30:20:50; 20:30:50; 0:50:50; 40:0:60; 20:20:60; 0:40:60; 20:0:80; 0:20:80; 0:0:100; celkem 26 variant). Všechny ternární směsi byly dávkovány v celkové koncentraci 3 % w/w tavicích solí (množství počítáno na celkovou hmotnost taveniny). Následně byly vyrobeny modelové vzorky, u nichž bylo ph upraveno do optimální oblasti pro ph roztíratelných tavených sýrů s cílem dosáhnout hodnot v intervalu 5,60 5,80. K úpravě ph byly použity NaOH nebo HCl (c = 1 mol l -1 ). Modelové vzorky byly vyráběny stejným způsobem jako produkty bez úpravy ph. Vypočtené množství kyseliny nebo zásady (množství stanoveno na základě kalibračního modelu vytvořeného v minulých letech) bylo přidáváno do výrobního zařízení při C (cca s před dosažením tavicí teploty). O vypočtené množství přídavku NaOH nebo HCl byl snížen přídavek vody (pro dosažení konstantního obsahu sušiny a tuku v sušině). K výrobě modelových vzorků bylo použito zařízení Vorwerk Thermomix TM 31-1 (Vorwerk & Co., GmbH, Wuppertal, Německo). Tavicí teplota (90 C) byla udržována po dobu 1 minuty (celkový čas tavení minut). Horká tavenina byla dávkována do válcových polypropylenových kelímků (průměr 52 mm, výška 50 mm), které byly uzavřeny hliníkovými víčky. Vzorky byly zchlazeny do dvou hodin od výroby na teplotu 6±2 C, při které byly dále uchovávány do okamžiku analýz. Produkty byly testovány 2., 9. a 30. den skladování (6±2 C; den výroby byl označen jako 1. den). U modelových vzorků byl stanoven obsah sušiny (podle ISO 5534:2004) a byly zjišťovány hodnoty ph (měřeno ph metrem s vpichovou elektrodou (phspear, Eutech Instruments, Oakton, Malaysia). Tvrdost modelových vzorků byla měřena penetrací pomocí texturního analyzátoru TA.XTPlus (Stable Micro Systems Ltd., Godalming, Velká Británie). Využívána byla válcová sonda o průměru 20 mm (rozsah deformace 25 %, rychlost sondy 2 mm s -1 ). Ze zátěžové křivky popisující závislost vynaložené síly (N) na čase (s) byla stanovena tvrdost, jako maximální síla potřebná k dosažení požadované deformace. 3 Hodnocení intenzity dispergace kaseinu vychází z měření optické hustoty. 7 Předpokládá se, že čím nižší je optická hustota, tím intenzivnější dispergace kaseinu se dosáhne. Jako modelový systém sloužilo sušené odstředěné mléko (Moravia Lacto, a. s., Jihlava, Česká republika), které bylo rozmícháno v deionizované vodě v množství, které odpovídalo 5 % w/v. Po dobrém rozmíchání a rozpuštění (cca 1 hodina míchání při laboratorní teplotě) a přídavku azidu sodného (0,02 % w/v), bylo ph systému upraveno na hodnotu 5,80 ± 0,01 (roztoky HCl) a ponecháno přes noc (asi 18 hodin) při laboratorní teplotě pro stabilizaci prostředí. Následně byly aplikovány 4 typy ternárních směsí v procentuálních poměrech stejných jako poměry při výrobě tavených sýrů. Ternární směsi tavicích solí byly přidávány v celkové koncentraci 0,3 % w/v. Po aplikaci tavicích solí byla směs opět 10 minut míchána a následně bylo ph upraveno na hodnotu 5,80 ± 0,01 (roztoky NaOH nebo HCl). Dalších 50 minut byla směs míchána při pokojové teplotě. Následně byla změřena optická hustota při = 700 nm (UV VIS Spectrophotometer, UV Mini 1240, Německo). Výsledky byly vyjádřeny relativně vzhledem k optické hustotě disperze odstředěného mléka, do kterého nebyly přidány tavicí soli (nastaveno jako 100 %). Výsledky byly podrobeny neparametrické analýze rozptylu s využitím Kruskall-Wallisova a Wilcoxonova testu (Unistat 5.5 software; Unistat, London, UK). 84

85 Výsledky a diskuze U všech testovaných variant modelových vzorků byl zjišťován z obsah sušiny, který se pohyboval v intervalu 40,25 41,01 % w/w. Toto rozpětí je možné považovat za akceptovatelnou shodu obsahu sušiny u jednotlivých variant tavených sýrů. Nejvyšší hodnoty y ph byly dosaženy při samostatném použití DSP, TSPP a TSC (P<0,05). Hodnoty phh u tavených sýrů s individuálněě aplikovaným P20 se pohybovalyy se v intervalu 5,31 5,,36. Pokud byly použity pouze DSP, TSPP a TSC (bez polyfosforečnanů), pak byly hodnoty ph tavených sýrů s vysokéé (nad 6,40; P<0,05). Se zvyšujícím se podílem polyfosforečnanů hodnoty ph modelových vzorků postupně klesaly (P<0,05). Vliv zahrnutí TSC do vzorků byl obdobný jako působení DSP neboo TSPP. Při rostoucím zastoupení P20 signifikantně klesaly hodnoty ph modelových vzorků ů (P<0,05). Výsledky korespondují s prací Lu et al. 11. U modelových tavených sýrů, kde k byly upravovány hodnoty ph (zamýšlená cílová oblast 5,60 5,80), byloo reálně dosaženo hodnot ph v rozmezí 5,68 5,82. Vzhledem k tomu, že výroba byla realizována z reálných surovinn (přírodní sýry a máslo), pak lze dosažené rozmezí považovat za akceptovatelné. V průběhu 30denního skladování při 6 C došloo k mírnému poklesu ph modelových vzorků, které se u většiny vzorků pohybovalo v rozsahu 0,1 0,2 (P<0,05). Obr. 1. Tvrdost (N) modelových tavených sýrů vyrobených s ternárními směsmi tvořenými hydrogenfosforečnanem sodným (DSP), difosforečnanem sodným (TSPP) a sodnou solí polyfosforečnanu (P20). Modelové tavenéé sýry byly skladovány 2, 9 a 30 dnů při 6 C. Prezentovány jsou výsledky dvou typů vzorků bez úpravy ph (B) a s úpravou ph (S). Při vyhodnocení výsledků tvrdosti modelových tavených sýrů, kam byly tavicí soli aplikovány individuálně (Obr. 1 4), bylo zjištěno, že tvrdost vzorků s TSC je vyšší než u produktů s DSP (P 0,05) a dokonce mírně vyšší vee srovnání s výrobky obsahujícími TSPP. V případěě samostatněě použitých tavicích solí (DSP, TSPP, TSC a P20) byl vzorek s P20 hodnocen jako j tavený sýr s nejvyšší pevností (P 0,05). Při konstantním obsahu P % v ternárních směsích tavicích solí byl pozorován rapidní nárůst tvrdosti výrobkůů při specifickém poměru DSP a TSPPP pohybujícím se v intervalu 1:1 3:4. Pokudd se poměr DSP a TSPP (při konstantním obsahu P20) vychýlil z hodnot 1:1 3:4, došloo k rychlému poklesu hodnot tvrdosti. Vlivv specifického poměru DSP a TSPP slábl při rostoucím obsahu P20 v ternárních směsíchh (P<0,05).. Při rostoucím obsahu P20 nad 60 % již hodnota poměru DSP a TSPP tvrdost vzorkůů praktickyy neovlivnila (P 0,05; srovnávány modelové tavené sýry s konstantní dobou skladování). Tento obecný vývoj závislostii tvrdosti modelových tavených sýrů na složení ternárních směsí tavicích solí byl pozorován u vzorkůů 85

86 bez ohledu na dobu skladování modelových vzorků (Obr. 1). Při P rostoucíí době skladování byl pozorován nárůst absolutních hodnot tvrdosti tavených sýrů (P<0,05; srovnávány vzorky vyrobené s konstantním poměrem DSP:TSPP:P20). Obr. 2. Tvrdost (N) modelových tavených sýrů vyrobených s ternárními směsmi tvořenými hydrogenfosforečnanem sodným (DSP), citronanem sodným (TSC) a sodnou u solí polyfosforečnanu (P20). Modelové tavené sýry byly skladovány 2, 9 a 30 dnů při 6 C. Prezentovány jsou výsledky dvou typů vzorků bez úpravy ph (B) a s úpravou ph (S). Obr. 3. Tvrdost (N) modelových tavených sýrů vyrobených s ternárními směsmi tvořenýmicitronanem sodným (TSC), difosforečnanem sodným (TSPP) a sodnou solí polyfosforečnanu (P20). Modelové tavenéé sýry byly skladovány 2, 9 a 30 dnů při 6 C. Prezentovány jsou výsledky dvou typů vzorků bez úpravy ph (B) a s úpravou ph (S). 86

87 Obr. 4. Tvrdost (N) modelových tavených sýrů vyrobených s ternárními směsmi tvořenými hydrogenfosforečnanem sodným (DSP), difosforečnanem sodnýmm (TSPP) a citronanem sodným (TSC). Modelové tavené sýry byly skladovány 2, 9 a 30 dnů při 6 C. Prezentovány jsou výsledky dvou typů vzorků bez úpravy ph (B) a s úpravou ph (S). Z výsledků získaných s použitím ternární směsi DSP: TSC:P20 (Obr. 2) lze usoudit, že s narůstajícím zastoupením TSC a P20 v neprospěch DSP se zvyšovala tvrdost modelových vzorků (P 0,05). Intenzivnější zvyšování tvrdosti vzorků bylo pozorováno zejména při zvyšujícím se podílu P20 (P 0,05). Výsledky tvrdosti tavených sýrů obsahujících ternární směsi tavicích solí sestávajících z TSC, TSPP a P20 jsou ukázány na Obr. 3. Při nulovém zastoupení P20 bylo pozorováno, že nejpevnější jsou výrobky se zastoupením TSC a TSPP v poměru přibližně 1:1 (P 0,05). Při odchýlení se od tohoto poměruu (na obě strany) se tvrdost tavených sýrů signifikantněě snižovala (P 0,05). Tento jev však byl pozorován pouze při absenci tavicí soli P20. S rostoucí koncentrací P20 se zvyšovalaa také tvrdost modelových vzorků tavených sýrůů (P 0,05). Při konstantním obsahu P20 se tvrdost vzorků mírně snižovala s klesajícím k obsahem TSC. Většina posledně zmíněných změn však nebyla signifikantní (P 0,05). V případě aplikace ternárních směsí tavicích solí složených z DSP, TSPP a TSC (viz Obr. 4) byl rovněž identifikován specifický poměr DSP a TSPP (přibližně 1:1 3:4), který vedee k signifikantnímu zvýšení tvrdosti tavených sýrů. Se snižující se koncentrací k DSP a TSPP a naopak zvyšujícím se zastoupením TSC však vliv tohoto specifického poměru rapidně klesá (P 0,05). Již při 40% zastoupení TSC je vliv specifického poměru na tvrdost tavených sýrů zanedbatelný (P 0,05). Pokud byla koncentrace TSC vyšší než 40 % (v ternární směsi tavicích solí), pak tvrdostt tavených sýrů rostla při rostoucím obsahu TSPP a TSC a s klesající koncentrací DSP. Z Obr. 4 je rovněž patrný vliv specifického poměru TSC a TSPP (při nulové koncentraci DSP) na tvrdostt tavených sýrů (P 0,05), který byl pozorován i v Obr. 3. Při rostoucí koncentraci DSP v ternárních směsích byl však vliv specifického poměru TSC a TSPP na tvrdost tavených sýrůů prakticky zanedbatelný. Úprava hodnot ph do optimální oblasti vedla k signifikantní změně hodnot tvrdosti tavených sýrů (P 0,05; Obr. 1 4). Pokud bylyy hodnoty ph snižovány, pak se pevnost modelových vzorků zvyšovala. Naopak pokud bylyy hodnoty ph modelových tavených sýrůů 87

88 zvyšovány, docházelo k poklesu pevnosti produktů. Výše popsané trendy závislosti tvrdosti modelových tavených sýrů na skladbě tavicích solí sestávajících z DSP, TSPP, TSC a P20 však zůstaly obdobné, signifikantně se měnily pouze absolutní hodnoty pevnosti vzorků (P 0,05). V průběhu třicetidenního skladování tavených sýrů docházelo rovněž k signifikantní změně tvrdosti vzorků. S narůstající dobou skladování se zvyšovala i pevnost tavených sýrů (Obr. 1 4). Při individuálně aplikovaných fosforečnanech bylo zjištěno, že se stupeň dispergace kaseinu zvyšuje s rostoucím počtem fosforů lineárně vázaných v molekule fosforečnanu (P<0,05), což koresponduje s řadou dříve provedených studií. 5,7 V případě ternárních směsí s TSC intenzita dispergace kaseinu rapidně narůstala při zvyšující se koncentraci sodné soli polyfosforečnanu (P20; P<0,05). Vliv TSPP a TSC na dispergaci kaseinu v modelovém systému byl prakticky obdobný (P 0,05). Samostatně aplikovaný TSC vedl k vyšší intenzitě dispergace kaseinu ve srovnání s DSP, ale naopak k méně rozsáhlé dispergaci kaseinu ve srovnání s P20. Se zvyšujícím se zastoupením DSP v ternárních směsích klesala také intenzita dispergace kaseinu (P<0,05). Při výrobě tavených sýrů hrají fosforečnanové tavicí soli zásadní roli při dispergaci přítomných kaseinů a následně při utváření finální matrice tavených sýrů při tzv. procesu krémování. Další úlohou tavicích solí je úprava ph a jeho stabilizace. 12,13 S rostoucí délkou řetězce sodných solí fosforečnanů roste také schopnost iontové výměny (sodných iontů za vápenaté ionty). Schopnost citronanu sodného dispergovat kasein v modelovém systému byla srovnatelná s účinností difosforečnanu sodného. Přídavek tavicích solí vede k dispergaci kaseinu, která je tím intenzivnější, čím účinnější je iontová výměna. 2 Podle Shirashoji et al. 8 a Cunha et al. 14 dispergace kaseinu úzce souvisí s utvářením matrice tavených sýrů. Intenzivnější dispergace kaseinu umožní těmto bílkovinám lépe rozvinout své emulgační a hydratační schopnosti a stabilizovat ve směsi přítomný tuk i vodu. S rostoucím rozsahem procesů hydratace proteinů a emulgace tuku narůstá také intenzita interakcí v tavenině a tím také intenzita zesíťování kaseinů. Čím vyšší je stupeň zesíťování v matrici výrobku, tím tužší tavený sýr je možné očekávat. 5,6,8 Tvrdost tavených sýrů rostla při samostatné aplikaci testovaných tavicích solí v následujícím pořadí: DSP < TSC TSPP < P20. Samotné procesy dispergace kaseinu však nepostačují k vysvětlení specifického poměru DSP:TSPP (přibližně 1:1 3:4), které byly v naší práci pozorovány a při kterých dochází k rapidnímu nárůstu tvrdosti tavených sýrů. Zdůvodnění existence specifického poměru DSP:TSPP bylo hledáno zejména ve schopnosti difosforečnanů podporovat tvorbu gelu mléčných bílkovin. Svou roli zde pravděpodobně sehrává i schopnost monofosforečnanů proniknout mezi síťující se kaseiny a vázat zde pevně vodu. 2,8,11 Mizuno & Lucey 2 uvádí, že existuje určitá optimální koncentrace difosforečnanů pro efektivní tvorbu gelu. Nadměrná nebo naopak nedostatečná koncentrace difosforečnanů může vést k tvorbě jen velmi slabých gelů. Souvislost mezi snižováním tvrdosti tavených sýrů s poměrem DSP:TSPP v intervalu 1:1 3:4 a současným zvyšováním koncentrace P20 lze hledat zejména ve schopnosti polyfosforečnanů udělit kaseinům negativní náboj, což má pravděpodobně za následek snížení intenzity hydrofobních interakcí dispergovaných kaseinů a tudíž i nižší tuhost výsledné matrice. 2,8 Až na binární směsi TSC a TSPP (resp. při nulovém zastoupení třetí testované složky) je možné vliv složení ternárních směsí obsahujících TSC na tvrdost tavených sýrů vysvětlit s využitím schopnosti směsí dispergovat kasein. Až na výše uvedenou výjimku tvrdost tavených sýrů korelovala s vlivem aplikovaných ternárních směsí tavicích solí na intenzitu dispergace kaseinu v modelovém systému mléka. Podle Mizuno & Lucey 5 a Lu et al. 11 se TSC neváže na kaseiny a nezapojují se do procesu zesíťování kaseinové matrice. V případě binární směsi TSC a TSPP byl však pozorován specifický poměr, přibližně na úrovni 1:1, který dokázal zvýšit tvrdost sledovaných vzorků. Zdůvodnění pravděpodobně nenajdeme ve vzájemné interakci TSC a TSPP a následném zapojení do kaseinové matrice. Určitým vodítkem pro vysvětlení může být (obdobně jako již výše), že difosforečnany (TSPP) jsou efektivní v podpoře tvorby gelu kaseinových proteinů pouze tehdy, jsou-li v optimální koncentraci vzhledem k obsahu proteinů. 2 Přídavkem TSP může být koncentrace TSPP upravena tak, že dosáhne svého optima pro podporu tvorby gelu kaseinových proteinů. Navíc se TSC nezapojuje do tvorby nové sítě, a proto efekt difosforečnanů na zesíťování kaseinů TSC neruší. 5,7,11 88

89 Poděkování: Práce byla podpořena projekty Interní grantové agentury Univerzity Tomáše Bati ve Zlíně (projekty IGA/FT/2013/010 a IGA/FT/2014/001) financovaných ze zdrojů specifického výzkumu univerzity. Použitá literatura: 1. Guinee, T.P., M. Carić and M. Kaláb Pasteurized processed cheese and substitute/imitation cheese products. P.F.Fox, L.H.McSweeney & T.P.Cogan (Eds.). Major cheese Group (3rd ed.). Cheese: Chemistry, physics and microbiology 2: London, UK:Elvesier Applied Science. 2. Mizuno, R. and J.A. Lucey Properties of Milk Protein Gels Formed by Phosphates. Journal of Dairy Science, 90: Weiserová, E., L. Doudová, L. Galiová, L. Žák, J. Michálek, R. Janiš and F. Buňka The effect of combinations of sodium phosphates in binary mixtures on selected texture parameters of processed cheese spreads. International Dairy Journal, 21(12): Shirashoji, N., J.J. Jaeggi and J.A. Lucey Effect of Trisodium Citrate Concentration and Cooking Time on the Physicochemical Properties of Pasteurized Process Cheese. Journal of Dairy Science. 89: Mizuno, R. and J.A. Lucey Effects of Emulsifying Salts on the Turbidity and Calcium-Phosphate Protein Interactions in Casein Micelles. Journal of Dairy Science. 88: El-Barky, M., E. Duggan, E.D. O Riordan and M. O Sullivan Effect of chelating salt type on casein hydration and fat emulsification during manufacture and post-manufacture functionality of imitation cheese. Journal of Food Engeneering. 102: Kaliappan, S. and J.A. Lucey Influence of mixtures of calcium-chelating salts on the physicochemical properties of casein micelles. Journal of Dairy Science, 94: Shirashoji, N., J.J. Jaeggi and J.A. Lucey Effect of sodium hexametaphosphate concentration and cooking time on the physicochemical properties of pasteurized process cheese. Journal of Dairy Science. 93: Buňka, F., Doudová, L., Weiserová, E., Kuchař, D., Michálek, J., Slavíková, S., Kráčmar, S The effect of different ternary mixtures of sodium phosphates on hardness of processed cheese spreads. International Journal of Food Science and Technology 47: Buňka, F., Doudová, L., Weiserová, E., Kuchař, D., Ponížil, P., Začalová, D., Nagyová, G., Pachlová, V., and Michálek, J The effect of ternary emulsifying salt composition and cheese maturity on the textural properties of processed cheese. International Dairy Journal 29: Lu, Y., N. Shirashoji and J.A. Lucey Effects of ph on the Textural Properties and Meltability of Pasteurized Process Cheese Made with Different Types of Emulsifying Salts. Journal of Food Science. 73: E363 E Marchesseau,, S., E. Gastaldi, A. Laguade a J.-L. Cuq Influence of ph on Protein Interactions and Microstructure of Process Cheese. Journal of Dairy Science. 80: Kawasaki, Y. (2008). Influence of creaming on the properties of processed cheese and changes in the structure of casein during cheese making. Milchwissenschaft. 63: Cunha, C. R., R. Grimaldi, M. R. Alcântara and W. H. Viotto Effect of the type of fat on rheology, functional properties and sensory acceptance of spreadable cheese analogue. International Journal of Dairy Technology. 66: Kontaktní adresa: Doc. Ing. František Buňka, Ph.D., Ústav technologie potravin, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, nám. T. G. Masaryka 275, Zlín, tel.: , bunka@ft.utb.cz. 89

90 90

91 STUDIUM VLIVU ph NA SEPARACI LAKTOSY A SOLÍ PŘI MEMBRÁNOVÉ NANOFILTRACI SYROVÁTKY Hinková Andrea, Židová Petra, Pour Vladimír, Henke Svatopluk, Bubník Zdeněk Ústav sacharidů a cereálií, VŠCHT Praha The effect of ph on separation of lactose and salts during membrane nanofiltration of cheese whey Summary: The main goal of this work was to optimise conditions for ultrafiltration and nanofiltration of cheese whey. Ultrafiltration carried out on ceramic membranes (Membralox, Pall) having a cut-off 500 nm served to protein removal. Obtained permeate was further treated by nanofiltration. Filtration kinetics, lactose rejection and protein content of natural whey was measured. Nanofiltration experiments were carried out on three different membranes; two flat polymeric membranes NF-245 (Dow Chemicals) a TFC-100 (Koch) and one spiral wound module NTR7450-S2F (Nitto Denko). The conditions were 35 C and trans-membrane pressure 15 bar, ph 5.0 or 6.5. Ultrafiltration permeate steady state flow rates were l/h.m 2.bar. These values were strongly affected by pure water flux which reflects membrane permeabilty and an efficiency of membrane cleaning. Lactose rejection was nearly zero and protein rejections were in between % for concentration factors Nanofiltration steady-state flow rates were l/h.m 2.bar on flat membranes, and very low on a spiral wound membrane due to high concentration factors achieved (twice as higher as on flat membranes). Lactose rejection was % and higher ph caused higher rejection of ions. Úvod Zpracování syrovátky a následné využití přítomných nutričně významných složek stále představuje výzvu pro použití membránových separačních procesů. V současnosti se touto problematikou zabývá značná část vědeckých prací. Pan [1] stejně jako Atra [2] se ve svých studiích zabývali vlivem tlaku na výkon filtrace. Vliv ph a teploty na zanášení membrány ve své práci popisuje Rice [3]. Cílem zpracování syrovátky pomocí ultra- a nanofiltrace je úplná separace proteinů a dále zisk koncentrátu laktosy, která neobsahuje soli. Nanofiltračních membrány pro odsolování syrovátky jsou vyráběny komerčními firmami po celém světě. Z deklarovaných vlastností dostupných membrán je tak možnost zvolit si takovou membránu, která bude přesně separovat námi požadované látky. Na druhou stranu, je separace na nanofiltračních membránách značně ovlivněna fyzikálně chemickými podmínkami jako teplota, tlak, koncentrace složek, viskozita, ph a řada dalších. V této práci byl sledován vliv ph na separaci laktosy a solí přítomných v roztoku. Během této práce byly použity roztoky naturální syrovátky a dále pak modelové roztoky, které se svým složením měly přiblížit naturální syrovátce. Byly zkoušeny ploché nanofiltrační membrány a jeden spirálně vinutý modul. Materiál a metody Ultrafiltrace Všechny ultrafiltrační pokusy byly prováděny na ultrafiltrační stanici TIA (Bollene, Francie). Filtrační jednotka může být osazena několika keramickými membránami MEMBRALOX (Francie) s celkovou plochou 2 x 0,24 m 2. Pracovní podmínky stanice jsou: max. teplota 85 C, provozní tlak 0,6 MPa, rozsah ph 0,5-13,5. Pro všechny ultrafiltrační pokusy byly použity keramické tubulární membrány Membralox (Pall, Francie) o velikosti pórů 500 nm. Nanofiltrace Pro filtrační pokusy prováděné na plochých polymerních membránách byla používána filtrační stanice ARNO 600 (Mikropur, Česká republika). Tato stanice je určena pro operace NF a RO s maximálním výkonem na vstupu až 600 l/h. Ke všem nanofiltračním pokusům na plochých membránách byla použita dynamická cela DC 76 s plochou membrány 0,0044 m 2. Pracovní 91

92 podmínky stanice jsou: max. teplota 75 C, provozní tlak 6 MPa. Pro filtrační pokusy na spirálně vinutém modulu byla použita filtrační stanice TIA NF/RO systém (Bollene, Francie). Tato stanice umožňuje umístění dvou spirálně vinutých modulů. Filtrační plocha při plném membránovém osazení stanice je 2x2,5m 2. Pracovní podmínky této stanice jsou: maximální tlak 40barů, max. teplota 50 C. Nanofiltrační experimenty byly prováděny na třech typech membarán dvou plochých polymerních membránách NF-245 (Dow Chemicals) a TFC-100 (Koch) a jednom spirálně vinutém modulu NTR-7450 (Nitto Denko). Filtrované roztoky Jako filtrační medium byla používána naturální syrovátka a modelové roztoky. Naturální slaná syrovátka byla dovážena z Mlékárny Dolní Přím a upravována na ultrafiltrační stanici. Vlastnosti naturální syrovátky shrnuje Tabulka I. Permeát z ultrafiltrace byl dále používán jako nátok na nanofiltraci. Složení modelových roztoků bylo KCl (5,4 g/l), NaCl (1,7 g/l), CaCl 2 (0,5 g/l), MgCl 2 (0,4 g/l) a laktosa (80 g/l). Soli a laktosa byly rozpuštěny v demineralizované vodě a ph bylo upravováno pomocí HCl a NaOH (měřeno ph metrem THERM ; ALMEMO, Německo). Tabulka I Přehled ultrafiltračních pokusů a vlastností naturální syrovátky. Ultrafiltrace Obsah sušiny [% hm.] ph 92 Obsah laktosy [g/l] Obsah proteinů [g/l] UF1 8,39 6,52 69,90 6,97 UF2 10,46 6,34 73,44 5,93 UF3 10,50 6,47 74,57 5,93 UF4 9,40 6,10 75,72 6,04 UF5 8,47 6,07 88,33 6,17 Analytické metody Obsah proteinů byl stanovován pomocí kapalinové chromatografie HPLC system (Agilent Technologies, Německo) s UV/VIS detektorem (TSP Spectra System UV 200, Německo). Obsah laktosy v nátocích byl měřen na aniontové chromatografii HPAEC/ PAD (Dionex, USA). Obsah iontů se měřil pomocí izotachoforetického analyzátoru Ionosep 2003 (Recman, Česká Republika). Výpočty Během práce byly počítány hodnoty zdánlivých rejekcí iontů R i [%] vyjádřené vztahem (1), kde Cip je množství složky i v permeátu lomená hodnotou Cif množství složky i v nátoku. Ri = 1- (Cip/Cif ) (1) Hmotnostní koncentrační faktor MCF [1] byl vyjádřen jako podíl hmotnosti nátoku a permeátu. Vodní výkon filtrací J v [l/hod.m 2 ] byl vyjádřen vztahem (2), kde KT je viskozitní koeficient pro teplotu 20 C, P je průtok permeátu [l/h], p je tlak [bar], S je plocha filtrační membrány [m 2 ]. J v = (P*KT)/(S*p) (2) Výkon v ustáleném stavu J s [l/h.m 2 ] se získal z rovnice (3) kde J i je tok permeátu v čase t [min], a a b jsou konstanty vypočítané programem Microsoft Solver [4]. J i = J s + a e (-b.t) (3) U filtrací, kde se získalo jen malé množství permeátu a ustálený stav nebyl dosažen, se počítal střední výkon filtrace J [l/h.m 2 ], který je vyjádřen rovnicí (4), kde Vp je celkový objem permeátu, S je plocha membrány a τ je celkový čas filtrace. V p J = (4) τ. S

93 Výsledky a diskuse Ultrafiltrace Bylo provedeno pět ultrafiltračních pokusů, během nichž byla sledována filtrační kinetika. Výsledky a podmínky těchto měření jsou uvedeny v Tabulce II. Během ultrafiltrací bylo dosaženo ustáleného stavu. Typický průběh ultrafiltrace (UF5) je vidět na Obr. 1, kdy dochází k prudkému snížení počátečního výkonu vlivem zanášení membrány. Z Tabulky II jsou patrné výrazné rozdíly v hodnotách výkonů v ustálených stavech (v rozmezí 7 44 l/h.m 2.bar) při jednotlivých pokusech. Tyto výkyvy jsou způsobeny rozdílnou hodnotou počátečních vodních výkonů, která úzce souvisí s kvalitou čištění membrán. Pro čištění ultrafiltračních membrán byl zpočátku používán pouze 1% chlornan sodný. Toto čištění se však ukázalo jako nedostatečné (UF1 a 2) a k čištění se poté začal používat komerční výrobek Ultrasil 115 v kombinaci s 1% kyselinou dusičnou. Tato forma čištění se ukázala jako vysoce efektivní, neboť je schopna vyčistit membrány na hodnotu vodního výkonu nových membrán. Tabulka II Výsledky filtrační kinetiky během UF experimentů; J V je vodní výkon před filtrací, J S je výkon v ustáleném stavu, MCF- hmotnostní koncentrační faktor, T je teplota, p tlakový rozdíl, τ je celkový čas filtrace. Ultrafiltrace J V J S T p MCF τ [l/h.m 2.bar] [l/h.m 2.bar] [ C] [bar] [1] [min] UF1 697,7 6, ,1 310 UF2 135,3 8, ,2 102 UF3 1266,7 32, ,5 170 UF4 1443,1 31, ,5 230 UF5 1747,0 44, ,6 480 Obr. 1. Typický průběh ultrafiltrace UF5 naturální syrovátky. Teplota 20 C, tlakový rozdíl 2 bary 93

94 Nanofiltrace Nanofiltrační pokusy byly rozděleny na dvě části. První část experimentů se zabývala filtracemi modelových roztoků na plochých polymerních membránách. Byly srovnávány vlastnosti membrán NF-245 a TFC-100 při separaci laktosy a iontů (draslíku, sodíku, vápníku a hořčíku). Filtrace probíhaly při konstantních podmínkách vždy tak dlouho, aby bylo dosaženo MCF v rozmezí 1-1,2. Všechny filtrace byly provedeny duplicitně z důvodu minimalizování chyb měření. Tabulka III uvádí výsledky kinetiky a faktory rejekcí sledovaných složek modelových roztoků. Rejekce hořčíku nejsou v Tabulce III uvedeny, protože v nanofiltračních permeátech nebyl hořčík detekován. Stejný jev byl pozorován na membráně NF-245 i pro vápník. Tyto výsledky ukazují na fakt, že obě membrány téměř dokonale zadržují dvojmocné ionty zatímco jednomocné ionty částečně prochází membránou. Tabulka III Výsledky kinetiky a separačních vlastností při nanofiltračních experimentech na plochých polymerních membránách. Teplota filtrace byla 35 C a tlak 15 barů, J v vodní výkon, J střední výkon, τ je celkový čas filtrace, MCF- hmotnostní koncentrační faktor a R jsou rejekce pro jednotlivé složky (laktosa, draslík, sodík a vápník). Membrána TFC-100 NF-245 ph J v [l/h.m 2.bar] J [l/h.m 2.bar] τ [min] MCF [1] R lac [%] R K [%] R Na [%] R Ca [%] 4,5 5,58 3, ,06 96,38 44,1 26,6 90,7 5 7,86 3, ,12 95,1 41,6 18,6 95,3 5,5 5,91 3, ,12 96,4 43,1 25,9 93,3 6 5,42 3, , ,5 39,4 91,2 4,5 9,91 4, ,11 99,8 43,4 40,9 5 10,05 6, ,12 99,6 26,9 16,2 5,5 8,55 5, ,12 98,8 41,3 35,7 6 9,44 6, ,12 94,3 47,5 50,4 Druhá část nanofiltračních měření se věnovala filtracím naturální syrovátky a to jak na plochých membránách tak na spirálně vinutém modulu. V této části bylo provedeno šest sérií duplicitních měření. Filtrace probíhaly při konstantní teplotě 35 C a tlaku 15 barů. Během těchto pokusů byl sledován vliv ph na filtrační kinetiku a separaci sledovaných složek syrovátky. Na spirálně vinutém modulu bylo dosaženo ustáleného stavu, zatímco na plochých polymerních membránách se tohoto stavu dosáhnout nepodařilo. Z Tabulky IV je rovněž patrné, že použití spirálně vinutého modulu vedlo k dosažení vyššího koncentračního faktoru. Výkon filtrace byl opět ovlivňován počáteční hodnotou vodního výkonu, stejně jako v případě UF a proto byl na čištění membrán již od počátku práce kladen důraz. Pro čištění bylo používáno komerčních výrobků Ultrasilu 115 a Ultrasilu 73. Dále byla stejně jako u nanofiltrací modelových roztoků sledována separační účinnost NF. V Tabulce V jsou uvedeny výsledky rejekcí. Hořčík není v tabulce uveden ze stejného důvodu jako v případě filtrací modelových roztoků. Je vidět (Obrázek 2), že na plochých membránách vyšší ph způsobuje vyšší rejekci laktosy (až 99,8%), zatímco na spirálně vinutém modulu je vyšší rejekce laktosy sledována při nižším ph. Stejně jako při separaci modelových roztoků je na plochých membránách vidět výrazně vyšší zádrž dvojmocných iontů oproti jednomocným, oproti tomu na spirálně vinutém modulu zádrž dvojmocných iontů dosahuje přibližně stejných hodnot jako zádrž iontů jednomocných. 94

95 Tabulka IV Výsledky filtrační kinetiky na spirálně vinutém modulu a dvou plochých membránách, MCF je hmotnostní koncentrační faktor, J je výkon filtrace, *hodnota výkonu v ustáleném stavu počítaná podle Cheryanovy rovnice, ** hodnota středního výkonu filtrace, J v je vodní výkon, τ je celkový čas filtrace, podmínky: teplota 35 C, tlak 15 barů. Membrána ph J [l/h.m 2.bar] J v [l/h.m 2.bar] MCF [1] τ [min] NTR-7450-S2F 6,47 0,04 * 14,97 2, NTR-7450-S2F 5,00 0,05 * 12,29 3, TFC-100 6,50 3,10 ** 5,92 1, TFC-100 5,01 2,70 ** 5,70 1, NF-245 6,40 4,30 ** 9,32 1, NF-245 4,98 4,15 ** 7,87 1, Tabulka V Vliv ph na faktor rejekce (R) laktosy, chlóru, draslíku, sodíku a vápníku na nanofiltračních membránách. Membrána NTR-7450-S2F TFC-100 NF-245 ph R lactose [%] 95,3 97,4 99,8 97,2 99,8 98,8 R Cl -[%] 11,4 9,7 66,1 56,9 47,3 37,2 R K + [%] 38,1 67,4 60,8 40,8 33,8 R Na +[%] 38,9 60,8 62,9 44,8 8,9 R Ca 2+[%] 41,7 45,9 85,6 76,0 Obrázek 2: Vliv ph na rejekci laktosy při filtraci naturální syrovátky na plochých membránách NF-245, TFC-100 a spirálně vinutém modulu NTR-7450, podmínky: teplota 35 C, tlak 15 barů. 95

96 Závěr Během pěti ultrafiltračních měření, při kterých byla sledována filtrační kinetika, bylo dosaženo ustáleného stavu. Hodnoty ustáleného stavu byly v rozmezí hodnot 6,9-44,51 l/h.m 2.bar Hodnoty výkonu filtrace byly značně ovlivněny předchozím čištěním membrán. Nižší vodní výkon před filtrací znamenal výrazně nižší výkon filtrace. Během filtrace docházelo k výraznému zanášení membrán. Tento fouling vedl ke snížení výkonu filtrace až o 70%. První část nanofiltačních pokusů byla zaměřena na ploché membrány a filtraci modelových roztoků. Během těchto měření se nepodařilo dosáhnout ustáleného stavu. Hodnoty středního výkonu se pohybovaly od 3,00-3,36 l.hod.m 2 na membráně TFC-100 a od 4,91-6,15 l.hod.m 2 na membráně NF-245. Na obou membránách byly zjištěny vysoké hodnoty rejekce laktosy a to od 93-99,38%. Stejně tak byla na obou membránách pozorována téměř úplná zádrž bivalentních iontů, zatímco jednomocné ionty membránou procházely. Druhá část nanofiltačních pokusů byla věnována filtrací naturální syrovátky. Na spirálně vinutém modulu bylo dosaženo ustáleného stavu a to 0,04-0,05 l/h.m 2.bar. Na plochých polymerních membránách ustálený stav nenastal a hodnoty středních výkonů se pohybovaly v rozmezí 3,1-4,3l/h.m 2.bar. Použitím spirálně vinutého modulu pro NF naturální syrovátky se zvýšila hodnota koncentračního faktoru na zhruba dvojnásobek oproti filtracím na plochých membránách. Rejekce laktosy při filtracích naturální syrovátky byly v rozmezí 95,3-99,8%. Vyšší hodnota ph na membránách NF-245 a TFC-100 vedla i k vyšším rejekcím všech sledovaných iontů. Srovnáním třech sledovaných membrán byla jako nejvhodnější pro odsolování syrovátky shledána membrána NF-245. Tato membrána oproti ostatním vykazuje vyšší zádrž laktosy a nejnižší rejekci sledovaných iontů. Pro další posuzování je však nezbytné vyzkoušení této membrány ve formě spirálně vinutého modulu, neboť jako plochá polymerní membrána z důvodu malé filtrační plochy vykazuje nízký výkon filtrace a není proto možné dosáhnout vyššího faktoru zkoncentrování. Použitá literatura: 1. PAN, K., SONG, Q., WANG, L., CAO, B. A study of demineralization of whey by nanofiltration membrane. Desalination, 2011, vol. 276, no. 2-3, p ATRA, R., VATAI, G., BEKASSY-MOLNA,R E., BALINT, A. Investigation of ultra- and nanofiltration for utilization of whey protein and lactose. Journal of Food Engineering, 2005, vol. 67, no. 3, p RICE, G., KENTISH, S, O CONNOR, A., STEVENS, G., LAWRENCE, N., BARBER, A. Fouling behaviour during the nanofiltration of dairy ultrafiltration permeate. Desalination, 2006, vol. 199, no. 1-3, p CHERYAN, M. (ed.). Ultrafiltration and microfiltration handbook. 2 nd ed. Urbana, Illinois, USA: Technomic Publishing Company, p ISBN Kontaktní adresa: Ing. Vladimír Pour, CSc., Ústav sacharidů a cereálií, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6, vladimir.pour@vscht.cz, tel.:

97 DEMINERALIZACE SYROVÁTKY POMOCÍ ELEKTRODIALÝZY Ečer Jiří 1, Kinčl Jan 1, Čurda Ladislav 2 1 MemBrain s.r.o., 2 Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT Praha Demineralization of whey by electrodialysis Summary: Whey is a by-product in the manufacture of cheese, quark and casein. Whey contains mainly proteins, lactose, vitamins and minerals. The electrodialysis is able to remove up to 90% of minerals from whey. Demineralization increases the value of whey and others derived products such as demineralized whey powder. Electrodialysis is a membrane process, wherein the DC electric field driving force moves dissociated constituents of salts in aqueous solution. Ion separation is controlled by the ion-exchange membranes through which only some particular kind of ions is transported depending on their electric charge. We tested natural sweet whey, sweet whey concentrated by evaporation and acid whey concentrated and partially demineralized by nanofiltration on a laboratory, on a pilot plant and partly also on an industrial equipment. We monitored influence of membrane resistance and influence of temperature on the electrodialysis capacity. Higher electrodialysis capacity was observed when using membranes with lower resistance. Temperature has a significant influence on the course of electrodialysis. The increase of temperature by 1 C increases performance of electrodialysis by approximately 2.8%. Electrodialysis capacity for demineralization of sweet whey concentrated by evaporation was much higher than for acid whey concentrated by nanofiltration. Úvod Syrovátka, vznikající při výrobě různých sýrů, tvarohů a kaseinu, je nejrozšířenějším vedlejším produktem mlékárenského průmyslu. Podle typu (sladká, kyselá, kaseinová) syrovátka obsahuje 5,0 až 6,5 % sušiny, z toho kromě jiného 0,4 až 0,8 % bílkovin, 3,8 až 5,0 % laktosy a 0,5 až 0,8 % minerálních látek. Pomocí elektrodialýzy lze ze syrovátky odstranit až 90 % minerálních látek, tím se zvýší užitná hodnota syrovátky a z ní vyrobených dalších produktů, jako je například demineralizovaná sušená syrovátka. Princip elektrodialýzy Elektrodialýza je membránový proces, kde působením stejnosměrného elektrického pole dochází k pohybu disociovaných složek solí ve vodném roztoku (1) (2). Kationty pohybující se ke katodě jsou propouštěny kation-výměnnými membránami a zadržovány anion-výměnnými membránami, a naopak anionty přitahované k anodě jsou propouštěny anion-výměnnými membránami a zadržovány na kation-výměnných membránách. Kombinací obou druhů membrán se docílí přechodu iontů ze vstupního roztoku diluátu (odsolený proud) do koncentrovaného proudu koncentrátu. Obr. 1. Schéma procesu elektrodialýzy (3) 97

98 Vodivost diluátu závisí na obsahu solí. V průběhu procesu, kdy postupně dochází ke snižování obsahu solí v diluátu, se tedy snižuje i jeho vodivost. Pro konkrétní typ produktu lze zpětně na základě měření vodivosti poměrně přesně určit koncentraci solí v tomto produktu. Cíl testů Ověřit závislost průběhu demineralizace naturální sladké syrovátky a sladké syrovátky zahuštěné odparem pomocí elektrodialýzy na teplotě. Porovnat výkon elektrodialýzy při použití standardních membrán RALEX C(A)MH-PES a nízkoodporových membrán RALEX C(A)MH-PES-LR. Porovnat výkon elektrodialýzy při zpracování sladké syrovátky zahuštěné odparem a nanofiltrované kyselé syrovátky. Experimentální část 1. Analytické metody Během testů byla měřena vodivost a ph kalibrovaným multimetrem WTW ph/cond340. Sušina byla stanovována v sušárně při 105 C po dobu 24 h, popel spalováním v peci při 550 C po dobu 24 h. 2. Vstupní suroviny 3. Sladká syrovátka naturální, zahuštěná odparem i sušená (pro přípravu obnoveného roztoku) pocházela z Moravia Lacto a.s. Jihlava, nanofiltrovaná kyselá syrovátka pocházela ze závodu Madeta Jindřichův Hradec. Tabulka I Parametry vstupních surovin. Syrovátka Sušina [ Bx] Vodivost [ms/cm] Popel v sušině [%] sladká obnovená 6,0 5,19 8,14 sladká naturální 6,0 5,10 8,27 sladká evaporovaná 17,0 11,23 8,25 kyselá nanofiltrovaná 19,5 8,45 9,08 4. Vliv teploty Vliv teploty byl testován na laboratorní jednotce P EDR-Z (MemBrain s.r.o.) se svazkem EDR-Z/10-0,8 (MemBrain s.r.o.) s membránami RALEX CMH-PES a AMH-PES (MEGA a.s.). K experimentům byla použita obnovená sušená syrovátka o sušině 6 Bx. Testy probíhaly při teplotách 10, 20 a 30 C. Výkon elektrodialýzy je možné vyjádřit pomocí průměrné intenzity toku solí v gramech přes 1 m 2 membrány za 1 hodinu [g.m -2.h -1 ]. Obvykle demineralizace probíhá při teplotě 15 C, proto výkon elektrodialýzy při této teplotě byl brán jako 100 %. Následně byly tyto výsledky ověřeny na pilotní jednotce P1 EDR-Y (MemBrain s.r.o.) se svazkem EDR-Y/50-0,8 (MemBrain s.r.o.) složeným z membrán stejného typu jako v případě laboratorní jednotky. Testy probíhaly při teplotách 15 a 40 C s naturální sladkou syrovátkou (6 Bx) a se sladkou syrovátkou zahuštěnou odparem (17 Bx). 98

99 Obr. 2 Závislost výkonu elektrodialýzy na teplotě 5. Srovnání standardních a nízkoodporových membrán Plošný odpor R A [Ω.cm 2 ] nízkoodporových membrán RALEX C(A)MH-PES-LR s jiným typem ionexu je o 15 % nižší než plošný odpor standardních membrán RALEX C(A)MH-PES. Testy probíhaly na pilotní jednotce P1 EDR-Y se svazkem EDR-Y/50-0,8. K experimentům byla použita sladká syrovátka zahuštěná odparem (17 Bx) a nanofiltrovaná kyselá syrovátka (19,5 Bx). Tabulka II Byla sledována doba, za kterou bylo dosaženo komerčně požadovaného stupně odsolení (stupeň odsolení D50 odpovídá 4,0 %, D70 2,5 % a D90 1,0 % obsahu popela v sušině). Syrovátka sladká evaporovaná kyselá nanofiltrovaná Stupeň odsolení D50 D70 D90 Membrána Čas Zkrácení Čas Zkrácení Čas Zkrácení [min] [%] [min] [%] [min] [%] standardní 35,9 55,4 113,2 20,0 18,5 nízkoodporová 28,7 45,2 95,6 15,6 standardní 68,8 109,2 175,1 5,6 8,2 nízkoodporová 64,9 100,2 154,4 11,8 Rozdíl v trendu je dán poměrem obsahu monovalentních a vícevalentních iontů v obou druzích syrovátek. U nanofiltrované syrovátky je tento poměr výrazně posunut směrem k vícevalentním iontům. Tabulka III Následně byly výsledky ověřeny na průmyslovém zařízení EWDU P15 2x EDR-II/250. Syrovátka sladká evaporovaná Stupeň D50 D70 D90 odsolení Čas Zkrácení Čas Zkrácení Čas Zkrácení Membrána [min] [%] [min] [%] [min] [%] standardní 27,3 46,2 112,9 15,0 12,1 11,5 nízkoodporová 23,2 40,6 99,9 První svazek elektrodialyzačního zařízení byl osazen nízkoodporovými membránami, druhý svazek membránami standardními. Při testu jednotlivých typů membrán byl vždy jeden svazek pod napětím, druhý nikoliv. 99

100 6. Porovnání výkonu elektrodialýzy při zpracování různých druhů syrovátek K porovnání výkonu elektrodialýzy při demineralizaci sladké syrovátky zahuštěné odparem a nanofiltrované kyselé syrovátky byly použity výsledky předchozích testů standardních a nízkoodporových membrán. Menší snížení výkonu při vyšším stupni demineralizace souvisí s poměrným obsahem monovalentních a vícevalentních iontů. Během elektrodialýzy se monovalentní ionty převádějí rychleji, proto při vyšším stupni demineralizace se poměr iontů u obou druhů syrovátek srovnává. Tabulka IV Porovnání výkonu elektrodialyzačního zařízení při demineralizaci sladké syrovátky zahuštěné odparem a nanofiltrované kyselé syrovátky. Membrána standardní nízkoodporová Stupeň odsolení D50 D70 D90 Syrovátka sladká evaporovaná kyselá nanofiltrovaná sladká evaporovaná kyselá nanofiltrovaná Čas [min] Výkon [%] Čas [min] Výkon [%] Čas [min] Výkon [%] 35,9 100,0 55,4 100,0 113,2 100,0 68,8 52,1 109,2 50,7 175,1 64,7 28,7 100,0 45,2 100,0 95,6 100,0 64,9 44,2 100,2 45,0 154,4 61,9 Vyhodnocení Teplota má významný vliv na výkon demineralizace elektrodialýzou. Průměrné zvýšení výkonu elektrodialýzy činilo 2,8 % / 1 C. Použití nízkoodporových membrán v elektrodialyzačním zařízení zvyšuje výkon elektrodialýzy v případě demineralizace na obsah popela v sušině 1 % pro sladkou syrovátku zahuštěnou odparem o 10 až 15 % a pro nanofiltrovanou kyselou syrovátku cca o 10 %. Při nižším stupni demineralizaci (D50 a D70) je výkon elektrodialýzy pro nanofiltrovanou kyselou syrovátku přibližně poloviční oproti sladké syrovátce zahuštěné odparem. Při hlubší demineralizaci (D90) je výkon zhruba o 40 % nižší. Poděkování: Práce byla řešena za finanční podpory Ministerstva průmyslu a obchodu ČR v rámci projektu Progresivní technologie zpracování slané syrovátky z výroby sýrů, program TIP č. FR-TI1/470, a v rámci projektu Speciální membrány pro rozvoj a intenzifikaci elektromembránových technologií, program TIP č. FR-TI4/507, s využitím infrastruktury Membránového inovačního centra (č.p. CZ.1.05/2.1.00/ ). Použitá literatura: 1. Mulder, Marcel. Basic Principles of Membrane Technology. Dordrecht : Kluver Academic Publishers, ISBN Noble, R. D. a Stern, S. A. Membrane Separations Technology, Principles and Applications. Amsterdam : Elsevier Science B.V, ISBN Processes. [Online] MEGA a.s., [Cited: 01 03, 2014.] Kontaktní adresa: Jiří Ečer, MemBrain s.r.o., Pod Vinicí 87, Stráž pod Ralskem 100

101 ELEKTRODIALÝZA KYSELÉ SYROVÁTKY Diblíková Lenka 1, Kubová Aneta 1, Štětina Jiří 1, Kinčl Jan 2, Čurda Ladislav 1 1 Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT Praha; 2 MemBrain s.r.o., Stráž pod Ralskem Electrodialysis of acid whey Summary: The effect of temperature (10-40 C) and ph (3-7) on acid whey electrodialysis (ED) was determined using a lab-scale ED-Z mini unit (MemBrain s.r.o., Stráž pod Ralskem). During the process time, ions removal efficiency and final products properties were observed. Samples of diluates were taken at the beginning and in the end of ED and also as defined conductivity values (25, 50, 75, 85%) were reached. The efficiency of desalination was assessed by the decline of ash content, the amount of minerals by ISE and AAS, organic acids were quantified by HPLC/UV. At 40 C 90% desalination was reached in 20 minutes, at 10 C the same degree of desalting was reached in 45 minutes. Minerals were removed in order K + > Cl - > Na + > > Ca 2+ > Mg 2+. Monovalent ions in the range of 86-99%, divalent in 68-76%. Lactic acid was preferably removed at 10 C, the decline was 82%. The effect of ph on ED was minimal. Minerals were desalted as follows K + ( 97-99%), Na + ( 91-95%), Ca 2+ ( 31-87%) and Mg 2+ ( 52-80%). Combination of both factors led to a confirmation of previous results. Acid whey is preferably desalted at higher temperatures and natural ph. Úvod: Kyselá syrovátka vzniká jako vedlejší produkt při výrobě tvarohů a kyselých sýrů 1. Celosvětově její produkce neustále narůstá (v r byla na úrovni 180 mil.tun/rok) 2, s tím roste i potřeba a nutnost mlékáren tuto surovinu dále zpracovávat a zužitkovávat. Dávno již syrovátka neplatí za odpadní produkt, naopak je dnes ceněna jako zdroj důležitých a nutričně zajímavých složek. Mezi tyto patří syrovátkové proteiny, laktosa, vitamíny nebo minerální látky 3. Průměrné složení je uvedeno v tab. I. Především syrovátkové proteiny pak nacházejí uplatnění v potravinářském průmyslu pro své funkční vlastnosti. Používají se jako emulgátory, při stabilizaci pěn nebo při tvorbě gelů 4. Tabulka I Složení kyselé syrovátky 3 Syrovátka (%) kyselá Syrovátka (mg/100g) kyselá sušina 5-7 Ca popeloviny 0,8 Na bílkoviny 0,5-1,0 K laktosa 4,5 Cl tuk 0,1 Mg 11 kys. mléčná 0,4 Laktát 600 Fosfát ph 4,8-5,0 Citrát Při následném zpracování kyselé syrovátky se často objevují problémy způsobené jak vysokým obsahem minerálních solí, tak kyseliny mléčné. Soli ovlivňují především chuť a nutriční hodnotu, kyselina mléčná způsobuje problémy při sušení a dodává kyselou chuť. V řadě aplikací v potravinářském průmyslu je tedy třeba nejprve tyto látky odstranit 5. Nejčastěji se za tímto účelem využívají dva procesy nanofiltrace a elektrodialýza 6. Nanofiltrace se přednostně používá tam, kde postačí částečné odsolení syrovátky cca o % (např. výroba zmrzlin, pekárenských výrobků) nebo před vlastní ED. Elektrodialýza umožňuje naproti tomu odstranit až 95 % nežádoucích látek. Takto upravená syrovátka se používá zejména pro výrobu kojenecké dětské výživy nebo specifické dietetické doplňky 7. Elektrodialýza je membránový separační proces, při němž dochází k migraci iontů skrze nabité membrány vlivem působení stejnosměrného elektrického proudu. Elektrodialyzační blok tvoří série střídajících se katexových a anexových membrán, umístěných mezi katodou a anodou. 101

102 Kationty v roztoku vlivem působení elektrické pole putují ke katodě, procházejí katexovými membránami a na anexových jsou zadržovány. Anionty naopak. Vzniká tak odsolený proud diluát a proud o soli obohacený koncentrát. Elektrody omývá elektrodový roztok, který se vlastní separace neúčastní 8,9. Cílem této práce bylo sledovat vliv vybraných provozních faktorů (teplota a ph) na průběh elektrodialýzy kyselé syrovátky. Materiály a metody: Výchozí surovinou pro ED byla nezahuštěná a zahuštěná kyselá syrovátka. Elektrodialýza byla provedena na laboratorní jednotce ED-Z mini s kapacitou 2 litry diluátu a koncentrátu. Jako elektrodový roztok byl použit síran sodný (10 g/l), koncentrát tvořila destilovaná voda okyselená konc. HNO 3 na ph 2. Elektrodialýza probíhala za konstantního napětí 20 V, při průtoku 30 l/h. Použitý ED blok sestával z 11 kationvýměnných heterogenních membrán typu RALEX CMH-PES a 10 anionvýměnných membrán RALEX AMH-PES (MEGA a.s.., Stráž pod Ralskem) tvořících 10 membránových párů. Rozměr efektivní plochy membrán byl mm, což odpovídá celkové efektivní ploše membrán 640 cm 2 Vzdálenost mezi dvěma membránami činila 1 mm. Před a po každém pokusu byla jednotka vyčištěna v 5 krokovém sledu: voda 10 min, 5% NaOH 60 min, voda 10 min, 5 % HNO 3 60 min, voda 2 10 min. V průběhu elektrodialýzy byly sledovány celkový čas procesu, změny ph, vodivosti, teploty, napětí a proudu. Vzorky diluátů byly odebrány na začátku, na konci a po dosažení 25, 50, 75, 85 % poklesu vodivosti suroviny. Elektrodialýza byla ukončena při 90 % poklesu vodivosti diluátu. U suroviny a finálních produktů byly stanoveny sušina (ČSN ISO 6731), bílkoviny (ČSN ISO 8968), ph, vodivost, bod tuhnutí, popeloviny (ČSN ISO 8070), obsah minerálních látek pomocí AAS a ISE a obsah organických kyselin na HPLC/UV (Polymer IEX H, mm, 60 C; eluent 0,1% TFA 0,6 ml/min, UV detekce 210 nm). Průběžně odebrané vzorky byly analyzovány na obsah základních minerálních látek a organických kyselin. Výsledky a diskuse: Vliv teploty V první části experimentu byl sledován vliv teploty (10, 20, 30, 40 C) na průběh elektrodialýzy kyselé nezahuštěné syrovátky (Povltavské mlékárny a.s, Sedlčany). ED probíhaly za konstantního napětí 20 V, průtoku čerpadel 30 l/h, objemu diluátu a koncentrátu 1000 ml a elektrodového roztoku 250 ml. Stabilní teplota byla zajištěna připojením termostatu k ED jednotce. Složení a vlastnosti suroviny a výsledných produktů uvádí tab. II. Průběh ED v čase je zobrazen na obr. 1. Celková doba elektrodialýzy se zkracovala s rostoucí pohyblivostí iontů při vyšších teplotách. Při teplotě 40 C bylo odsolení 90 % dosaženo za 20 minut, k 50% odsolení došlo již během prvních 5 minut. Při teplotě 10 C bylo 90% odsolení dosaženo za 45 minut. Tabulka II Fyzikálně chemické parametry suroviny a produktů v závislosti na teplotě; ED 90 % Materiál ph vodivost sušina popeloviny HB ČB - ms/cm % hm. % poklesu % hm. % hm. Surovina 3,82 6,720 4,32-0,63 0,29 Diluát 10 C 3,81 0,613 4,26 92,0 0,59 0,21 Diluát 20 C 3,62 0,667 4,23 92,0 0,62 0,22 Diluát 30 C 3,65 0,610 4,16 87,1 0,59 0,18 Diluát 40 C 3,63 0,602 3,50 90,3 0,61 0,18 HB...hrubé bílkoviny, ČB... čisté bílkoviny 102

103 Obr. 1 Závislost poklesu vodivosti diluátu na celkovém čase elektrodialýzy Minerální látky byly demineralizovány v pořadí K + > Cl - > Na + > Ca 2+ > Mg 2+. Nejúčinnější odsolení bylo dosaženo při teplotě 40 C, jak je patrné z tab. III. Jednomocné ionty byly odstraněny v rozsahu %, dvojmocné v rozmezí %. Nejvyšší pokles koncentrace kyseliny mléčné byl zaznamenán při 10 C, úbytek činil 82 %. Jelikož však konkrétní rozdíl koncentrací není významný, může být větší pokles způsoben 2,5 x delší celkovou dobou ED. Z organických kyselin je diskutována právě kyselina mléčná, neboť její obsah je řádově vyšší než u ostatních kyselin a protože způsobuje technologické problémy při sušení syrovátky. Tabulka III Procentuální pokles koncentrace jednotlivých iontů a kyselin v závislosti na teplotě ED Materiál Čas ED (min) k. mléčná Ca 2+ Cl - K + Na + Mg 2+ % poklesu Diluát 10 C 45 81,6 61,3 99,2 96,0 77,5 59,7 Diluát 20 C 30 76,4 68,6 99,2 97,3 84,2 68,8 Diluát 30 C 25 79,8 66,0 99,0 98,2 66,8 54,5 Diluát 40 C 20 77,1 76,1 99,3 98,7 86,3 67,5 Vliv ph V dalších experimentech byl sledován vliv ph v rozmezí 3-7 na průběh elektrodialýzy. ED probíhaly při laboratorní teplotě, ostatní podmínky pokusu byly shodné jako v předchozím případě. Jako výchozí surovina byla použita zahuštěná kyselá syrovátka (Polabské mlékárny a.s., Poděbrady). Zahuštění bylo provedeno pomocí reversní osmózy na sušinu % hm.. Syrovátka byla okyselena pomocí HCl či H 3 PO 4, pro alkalizaci byl použit roztok KOH. Složení a vlastnosti suroviny a výsledných produktů uvádí tab. IV. Průběh ED v čase není zobrazen, neboť jednotlivé křivky vykazují téměř shodný profil. Z tab. V vyplývá, že nejlépe a nejrychleji byla syrovátka zbavena solí při neupraveném ph (tj. ph 4,3), 90% odsolení bylo dosaženo za cca 100 min. Nejvyšší účinnost demineralizace v blízkosti isoelektrického bodu bílkovin (ph 4,6) je dána menší mírou foulingu bílkovin na membránách, jelikož tyto mají nulový celkový náboj 10. Při ph < 4 se celkový čas ED prodloužil o asi 30 min, při ph 5 trvala elektrodialýza v průměru o 15 min déle. 103

104 Minerální látky byly odstraňovány v pořadí K + > Cl - >Na + > Ca 2+ > Mg 2+, což je dáno jejich pohyblivostí a selektivitou membrán 11. Jednomocné ionty byly separovány v rozsahu %, dvojmocné v rozmezí %. U vápenatých iontů byl při ph 6 a 7 pozorován značný pokles ve schopnosti přecházet přes membrány, odstraněno bylo pouze % Ca 2+. Příčinou je pravděpodobně ztráta náboje v důsledku vazby na přítomné fosforečnany 12. Tabulka IV Fyzikálně chemické parametry suroviny a produktů v závislosti na ph; ED 90 % ph suroviny ph diluátu vodivost sušina popeloviny HB ČB ms/cm % hm. % poklesu % hm. % hm. 3,01 a 4,16 1,342 14,33 92,3 1,13 0,32 3,08 b 3,98 1,354 15,24 94,2 1,03 0,28 4,32 4,63 1,384 14,87 91,3 1,08 0,33 5,04 4,76 1,328 14,30 92,5 1,09 0,32 5,98 5,36 1,714 14,55 85,8 0,89 0,19 7,00 6,04 1,489 13,62 79,5 1,03 0,24 a ph upraveno HCl, b ph upraveno H 3 PO 4, HB...hrubé bílkoviny, ČB... čisté bílkoviny Tabulka V Procentuální pokles koncentrace jednotlivých iontů a kyselin v závislosti na ph ph suroviny čas ED (min) k. mléčná Ca 2+ Cl - K + Na + Mg 2+ % poklesu 3, ,3 86,9 97,8 98,9 94,3 80,0 3, ,3 86,7 99,8 99,4 95,0 72,1 4, ,8 85,15 99,5 99,2 94,5 80,1 5, ,8 73,3 99,6 99,5 94,0 77,6 5, ,6 30,3 99,6 97,4 91,1 73,2 7, ,8 33,2 99,4 97,4 92,5 51,9 Kombinace vlivu teploty a ph V posledním experimentu byl sledován vliv kombinace teploty a ph na odsolení zahuštěné kyselé syrovátky (Polabské mlékárny a.s., Poděbrady). Zvoleno bylo ph 3 a 4, kdy byl stupeň odsolení nejvyšší, a teploty 10, 20 a 30 C. Hodnota ph suroviny byla upravena pomocí H 3 PO 4. ED probíhaly za podmínek shodných jako v předchozích pokusech, k jednotce byl připojen termostat pro zajištění konstantní teploty v průběhu demineralizace. Složení a vlastnosti suroviny a výsledných produktů uvádí tab. VI. Závislost ED na čase není doložena, neboť jednotlivé křivky vykazují obdobný průběh, v grafu nerozlišitelný. 104

105 Tabulka VI Fyzikálně chemické parametry suroviny a produktů v závislosti na teplotě a ph; ED 90 % Materiál ph 3 (H 3 PO 4 ) ph 4 ph vodivost sušina popeloviny HB ČB - ms/cm % hm. % poklesu % hm. % hm. Surovina 2,95 13,68 17,79-1,25 0,75 Diluát 10 C 3,70 1,301 14,80 93,9 1,09 0,33 Diluát 20 C 3,96 1,347 14,49 94,7 1,07 0,30 Diluát 30 C 3,72 1,323 14,67 93,2 1,08 0,31 Surovina 4,28 12,95 16,85-1,28 0,75 Diluát 10 C 4,50 1,341 14,53 91,9 1,10 0,21 Diluát 20 C 4,33 1,324 13,71 92,8 1,08 0,26 Diluát 30 C 4,43 1,309 13,71 92,8 1,04 0,31 HB...hrubé bílkoviny, ČB... čisté bílkoviny Byly potvrzeny výsledky předchozích pokusů, nejlépe a v nejkratším čase byla demineralizována syrovátka bez úpravy ph a při teplotě 30 C. 90 % odsolení 1 L zahuštěné syrovátky bylo dosaženo za 80 min. Stejného stupně odsolení při ph 3 bylo dosaženo o 10 min později. Při teplotě 10 C byla rychleji odsolena syrovátka při ph 3 než při neupraveném ph. Prodloužení celkové doby ED je adekvátní navýšení sušiny suroviny oproti nezahuštěné syrovátce. Tabulka VII Procentuální pokles koncentrace jednotlivých iontů a kyselin v závislosti na teplotě a ph Materiál ph 3 (H 3 PO 4 ) ph 4 čas ED (min) k. mléčná Ca 2+ Cl - K + Na + Mg 2+ % poklesu Diluát 10 C ,4 85,8 99,7 99,4 96,1 76,2 Diluát 20 C ,6 92,2 99,7 99,5 97,5 76,2 Diluát 30 C 90 86,5 91,2 99,7 99,4 96,1 73,6 Diluát 10 C ,0 90,3 99,5 99,5 95,9 75,5 Diluát 20 C 95 85,8 85,3 99,4 99,5 95,7 74,7 Diluát 30 C 80 86,8 86,4 99,3 99,3 94,7 76,6 Při 90% odsolení kyselé zahuštěné syrovátky byl zaznamenán pokles obsahu kyseliny mléčné v rozsahu %. Koncentrace K +, Cl - a Na + poklesla o %, procentuální pokles vápenatých a hořečnatých iontů byl % (tab. VII). Závěr: Elektrodialýza má v mlékárenském průmyslu velký potenciál. Umožňuje rychle, efektivně a s nízkými provozními náklady eliminovat minerální látky obsažené v syrovátce. Poskytuje řadu výhod oproti ostatním metodám separace minerálních látek a lze ji poměrně snadno začlenit do stávající mlékárenské technologie. Získaná data potvrzují její vysokou účinnost rovněž při odstranění solí a organických kyselin u kyselé zahuštěné syrovátky (sušina % hm.), která je díky jejich zvýšenému obsahu obtížně využitelným vedlejším produktem výroby tvarohů a kyselých sýrů. Nejdůležitějším procesním parametrem ovlivňujícím průběh elektrodialýzy je teplota. Bylo prokázáno, že rychlost a účinnost odsolení se zvyšuje s rostoucí teplotou, nejlepších hodnot bylo dosaženo při 40 C. Vliv ph není výrazný, nejlépe je syrovátka demineralizována při ph v blízkosti isoelektrického bodu proteinu. 105

106 Poděkování: Tato práce vznikla za účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum MŠMT. Použitá literatura: 1. PANESAR, P.S.; et al. Bioutilisation of whey for lactic acid production. Food Chemistry, 2007, vol. 105, s Bulletin of the International Dairy Federation (438/2009). The World Dairy Situation, Brussels, Belgium: International Dairy Federation. 3. KILARA, A. Dairy processing and quality assurance. UK: John Wiley & Sons, KINSELLA, J.E.; WHITEHEAD, D.M. Proteins in Whey: Chemical, Physical, and Functional Properties. Advances in Food Nutrition Research, 1989, vol. 33, s GREITER, M.; et al. Desalination of whey by electrodialysis and ion exchange resins: analysis of both processes with regard to sustainability by calculating their cumulative energy demand. Journal of Membrane Science, 2002, vol. 210, s GERNIGON, G.; et al. Encyclopedia of Dairy Sciences. (2nd ed.). London: Elsevier Applied Science, SISO, I.M.G. The biotechnological utilization of cheese whey: a review. Bioresource Technology, 1996, vol. 57, s SIENKIEWICZ, T.; RIEDEL, L.C. Whey and whey utilization. (2nd ed.). Gelsenkirchen-Buer, Germany: Verlag Th. Mann, ONDRUŠEK, M.; ČERNÍN, A.; NEJEDLÝ, J. Elektrodialyzační jednotka ED-Z mini: technická dokumentace. Stráž pod Ralskem: Mega a.s., STRATHMANN, H. Electrodialysis, a mature technology with a multitude of new applications. Desalination, 2010, vol. 264, s SADRZADEH, M.; RAZMI, A.; MOHAMMADI, T. Separation of different ions from wastewater at various operating conditions using electrodialysis. Separation and Purification technology, 2007, vol. 54, s MCGUFFEY, M.K.; et al. Solubility and aggregation of commercial a-lactalbumin at neutral ph. International Dairy Journal, 2007, vol. 17, Kontaktní adresa: Lenka Diblíková, Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT Praha, Technická 5, diblikoe@vscht.cz 106

107 Plakátová sdělení

108

109 VLIV VYBRANÝCH GENOTYPŮ KAPPA-KASEINU NA SLOŽENÍ A TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI MLÉKA OD DOJNIC ČESKÉHO STAKATÉHO SKOTU Velecká Milena, Javorová Jana, Falta Daniel, Andrýsek Jiří, Večeřa Milan, Chládek Gustav, Palík Jiří, Studený Stanislav Ústav chovu a šlechtění zvířat, Mendelova univerzita v Brně Effect of selected genotypes of kappa-casein on composition and technological properties of milk from Czech Fleckvieh cows Summary: The aim of the experiment was to evaluate the effect of selected genotypes of kappa-casein composition and technological properties of milk from Czech Fleckvieh cows during 1 year. Monitoring was carried out in the period from 28th September 2011 to 24th October 2012 in farm GenAgro Říčany, a.s. (GPS 49 12' "N, 16 23'42.666" E). Milk samples (n = 126) from 18 dairy cows (daughters of a bull RAD 198) were analysed. Individual milk samples were collected from the evening milk yield. Dairy cows (at different stages of lactation) were divided into three groups according to the kappa-casein genotype (AA, AB and BB). Analysis of the milk samples, depending on the genotype of the kappa-casein it was found that milk cows with genotype kappa-casein AA contained the most fat (4.58%), lactose (4.97%), protein (3.36%) and solids non-fat (9.09%). Milk samples from cows with genotype AB kappa-casein contained the lowest fat content (4.19%), lactose (4.82%), protein (3.25%) and solids non-fat (8.79%). As regards of technological properties milk samples came from cows with genotype kappa-casein AA had fastest rennet coagulation time (191 sec) than genotype kappa-casein AB and BB (AB sec; BB s). When evaluating the quality of the curd has been found that milk from cows with genotype kappa-casein BB had a better quality of the curd (Class 1.56) than genotypes kappa-casein AB (class 1.94). In conclusion, we can confirm that the degree of polymorphism is closely related to the content components and technological properties of milk. Úvod Mléko je nenahraditelným zdrojem výživných látek důležitých pro růst lidského organismu 1. Obsahuje plnohodnotné živočišné bílkoviny 2. Mléčné bílkoviny jsou charakteristické složky pouze pro mléko 3 a podmiňují technologické vlastnosti mléka (kvasnost a syřitelnost) 4. Čisté bílkoviny jsou rozděleny na dvě skupiny: kaseinové a syrovátkové bílkoviny. Kaseinové bílkoviny byly objeveny v roce 1814, kdy Berzelius popsal první metodu separace kaseinu z kravského mléka 5 a patří k nejlépe probádaným bílkovinám. Z hlediska rozdělování bílkovin patří mezi složené proteiny. Kaseiny jsou směsí různých kaseinů 3, u kterých je známa aminokyselinová skladba a struktura 6. Kravské mléko obsahuje čtyři typy frakcí kaseinových bílkovin: α s1 -kaseiny, α s2 -kaseiny, β-kaseiny a κ-kaseiny, které jsou produkty specifických genů 7. κ-kasein představuje 8-15 % z celkového obsahu bílkovin a skládá se ze 169 zbytků aminokyselin 8. Je jedinou frakcí kaseinu, která obsahuje sirné aminokyseliny, cystein a methionin 9. κ-kasein se vyskytuje v sedmi genetických variantách 10 A, B, C, E, F, G, H. Nejrozšířenější jsou varianty A a B. Jednotlivé varianty ovlivňují produkci, složení a zpracovatelské vlastnosti mléka, včetně výtěžnosti sýra 8. Objevuje nutnost individuálního i skupinového přístupu k dojnicím s přihlédnutím ke stádiu laktace. Změny jednotlivých mléčných parametrů v průběhu laktace si vyžadují přesnou kvantifikaci 11. Vyšší vypovídací schopnost mají individuální vzorky mléka díky vazbě na konkrétní organismus, jeho klinické projevy, metabolismus a užitkovost. Trend sledování složek mléka je zřejmý v celém světě 12. Vliv plemenných hodnot rodičů se podílí jednak na obsahu mléčných složek, a také na dojivosti dcer 13. Vliv otce je mezi 10-17% 14. Otcem vybraných dcer byl Rainer RAD 198, který je zlepšovatel mléčné užitkovosti. Rainer však má také dobré plemenné hodnoty pro exteriér (zejména vemeno a končetiny) 15. Materiál a metodika Vliv vybraných genotypů kappa-kaseinu dojnic na složení a technologické vlastnosti mléka byl sledován u souboru 18 dojnic plemene český strakatý skot na soukromé farmě GenAgro Říčany, 109

110 a.s. (GPS 49 12' "N, 16 23'42.666" E). Sledování proběhlo v průběhu jednoho roku (od 28. září 2011 až 24. října Dojnice byly na první až třetí laktaci a 16 až maximálně 361 dnů po otelení. Všechny dojnice byly ve volném boxovém ustájení, krmeny ad libitum a chovány ve stejných podmínkách. Individuální vzorky mléka byly odebrány z večerních nádojů dojnic. Genotypy kappa-kaseinu byly zjišťovány na ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat na Mendelově univerzitě v Brně. U každého vzorku byla provedena izolace DNA pomocí QIAamp DNA Blood Mini Kitu (Qiagen). Testované markery byly dvakrát amplifikovány pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). K detekci bodových mutací v polymorfních místech genů byla dvakrát použita technika polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP). Dojnice tvořily tři skupiny stejnoměrně rozdělených podle genotypu kappa-kaseinu (homozygoti AA a BB a heterozygot AB). Analýza individuálních vzorků mléka proběhla vždy následující den. U individuálních vzorků mléka byly sledovány: obsah tuku, bílkovin, laktózy, tukuprosté sušiny na přístroji Julie C5 Automatic (Scope Electric). Dále byla ve vzorcích mléka stanovena syřitelnost podle metody od Čejny 16 s použitím nefelo-turbidimetrického snímače koagulace bílkovin. Po šedesáti minutách byla posouzena a porovnána jakost sýřeniny s tabulkou podle Gajdůška 17. Hodnoty jednotlivých rozborů byly zpracovány s použitím Microsoft Excel 2007 a programu Statistica 9.0. Mezi jednotlivými sledovanými genotypy byla provedena jednofaktorová analýza rozptylu. Výsledky a diskuze Analýza vlivu vybraných genotypů kappa-kaseinu dojnic na složení a technologické vlastnosti mléka je znázorněna v Tab. I. Tabulka I Složení a technologické vlastnosti individuálních vzorků mléka u různých genotypů kappa-kaseinu Parametr AA AB BB průměr Tuk % 4,58 4,19 4,28 4,35 Laktóza % 4,97 4,82 4,84 4,87 Bílkoviny % 3,36 3,25 3,31 3,31 Tukuprostá sušina % 9,09 8,79 9,00 8,96 Syřitelnost sec Kvalita sýřeniny třída 1,94 1,94 1,56 1,77 Analýzou mléka v závislosti na genotypu kappa kaseinu bylo zjištěno, že mléko s variantou kappa-kaseinu AA mělo nejvyšší obsah mléčných složek: tuku (4,58 %), laktózy (4,97 %), bílkovin (3,36 %) a tukuprosté sušiny (9,09 %). Vzorky mléka od dojnic s genotypem kappa-kaseinu AB obsahovaly naopak nejnižší sledovaných složek: obsah tuku (4,19 %), laktózy (4,82 %), bílkovin (3,25 %) a tukuprosté sušiny (8,79 %). Individuální vzorky mléka od dojnic s genotypem BB vykazovaly průměrné hodnoty obsahu tuku (4,28 %), laktózy (4,84 %), bílkovin (3,31 %) a tukuprosté sušiny (9,00 %). Pokud jde o technologické vlastnosti, tak nejrychleji koagulace bílkovin proběhla u genotypu kappa-kaseinu AA (191 sec) a naopak nejpomaleji u fenotypů kappa-kaseinu AB a BB (AB sec; BB 194 sec). Při hodnocení kvality sýřeniny dosáhl genotyp kappa-kaseinu BB nejlepší sýřeniny (třída 1,56) a genotypy kappa-kaseinu AB nejhorší sýřeniny (třída 1,94). Mezi kvalitami sýřenin u genotypů kappa-kaseinu AB a BB byl statisticky průkazný (P < 0,05). Dojnice genotypu BB vykázaly nejvyšší procento bílkovin a tuku a naopak nejvyšší procento bílkovin v porovnání s genotypem AA a AB 18, což neodpovídá našim výsledkům. Pozitivní vliv genotypu BB na technologické vlastnosti mléka, zejména rychlost sýření, vyšší produkci sýřeniny, nižší množství syrovátkového prachu, atd. a naopak negativní vliv genotypu AA již byl publikován 19. Nejběžnější alela A se vyskytuje přibližně v 60 % u Českého strakatého skotu. 110

111 Je považována za původní a ostatní alely se od ní odlišují jednotlivými substituenty. Alela B (ČESTR 36 %) pravděpodobně zlepšuje technologické vlastnosti mléka, zejména ve vztahu k výrobě sýrů 20. Závěr Závěrem můžeme konstatovat, že mléko od dojnic s genotypem kappa kaseinu AA obsahovalo nejvíce mléčných složek a docházelo u něj i k nejrychlejší koagulaci bílkovin. Na rozdíl od mléka od dojnic s genotypem kappa kaseinu BB, jenž obsahovalo nejméně obsahových složek a ke koagulaci bílkovin docházelo nejpozději. Tato práce podporuje tvrzení, že jednotlivé varianty genotypu kappa kaseinu ovlivňují produkci, složení a zpracovatelské vlastnosti mléka, včetně výtěžnosti sýra. Poděkování: Tato práce byla vytvořena za podpory IGA 2/2013. Použitá literatura: 1. Herian, K. Mlieko nie běžná potravina. Mliekarstvo. 2006, 2, stránky Kopáček, J. Oslava mléka. Mliekarstvo. 2007, Holec, J. et al. Hygiena a technologie mléka a mléčných výrobků. Praha: SP : autor neznámý, str ISBN: Zadražil, K. Mlékařství: (přednášky). Praha: ISV : Živočišná výroba (Česká zemědělská univerzita), str ISBN Rozdělení dusíkatých látek mléka a jejich význam pro výrobu sýrů. Chládek, G., Čejna, V. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická Univerzita v Brně, Farmářská výroba sýrů a kysaných mléčných výrobků II. stránky ISBN: Gajdůšek, S. Laktologie. Brno : MZLU, str. 84. ISBN Roginski, H., Fuquay, J.W., Fox, P.F. Encyclopedia of Dairy Science /Volume three/. London : Academic Press, stránky ISBN Vliv genotypu pro bílkoviny na mléčnou užitkovost. Dvořáková, J., Kuprová, V., Stádník, L., Louda, F. Praha : Česká zemědělská univerzita v Praze, Den mléka stránky ISBN Analýza mléčné užitkovosti holštýnských dojnic v závislosti na genotypu kapa kaseinu. Průšová, V., Doležal, O. Praha : Česká zemědělská univerzita v Praze, Den mléka stránky ISBN Velíšek, J. Chemie potravin 1. Tábor : OSSIS, str Sv. 2. vydání. ISBN Vliv stádia laktace na vybrané mléčné ukazatele holštýnských dojnic na první laktaci. Čejna, V., Chládek, G. [editor] R., Ryant, P., Fryščáková, E., Středa, T. Cerkal. Brno : Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, MendelNet'04 Agro. str. 33. ISBN Ticháček, A. et al. Poradenství jako nástroj bezoečnosti v prvovýrobě mléka. Šumperk : Agritec s.r.o., str. 86. ISBN Vaněk, D., Štolc, L. Chov skotu a ovcí: (přednášky pro Bc.). Praha : ČZU, str ISBN Kopecký, Josef. Chov skotu (Velká zootechnika). Praha : SZN, str , Anonym. Fer RAD [Online] [Citace: ] Zkušenosti z mlékárny se syřitelností mléka ve vazbě dodavatele mléka. Čejna, V. Rapotín : Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Sborník příspěvků z mezinárodního semináře na téma výrobní zemědělská praxe a potravinářské biotechnologické úpravy pro zvýraznění pozitivních zdravotních vlivů mléka a mléčných výrobků. stránky ISBN Gajdůšek, S. Mlékařství II (cvičení). Brno : MZLU, str. 84. ISBN

112 18. Eenennaam, A., Medrano, J.F. Milk Protein Polymorphisms in California Dairy Cattle. Journal of Dairy Science. 1991, 74, stránky Effect of genetic polymorphism of bovine milk proteins on cheese yield under practical conditions. Erhardt, G. et al. Lillehammer : autor neznámý, Book of Abtracts 47th Annual Meeting ofeaap. str Polymorfismus mléčných bílkovin u skotu. Kott, T. et al. Praha : Česká zemědělská univerzita v Praze, Den mléka stránky ISBN Kontaktní adresa: Ing. Milena Velecká, Ústav chovu a šlechtění zvířat, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1/1665, Brno, Česká republika. milca.velecka@seznam.cz. 112

113 VLIV DOBY MRAŽENÍ NA VYBRANÉ PARAMETRY BAZÉNOVÝCH VZORKŮ MLÉKA DOJNIC HOLŠTÝNSKÉHO PLEMENE Javorová Jana, Velecká Milena, Falta Daniel, Andrýsek Jiří, Večera Milan, Chládek Gustav Ústav chovu a šlechtění zvířat, Mendelova univerzita v Brně Effect of freezing time on selected parameters of bulk milk samples from Holstein breed Summary: Aim of the experiment was to evaluate effect of freezing time on selected parameters of bulk milk samples from Holstein breed. Existence of specific changes in the milk composition and properties during storage, by freezing is important in case of the need to preserve and analyze samples later. Milk samples was obtained in herd of Holstein cows from University farm in Žabčice. Sampling period was once a week (from to ). In laboratory was this initial sample divided in the same division ratio to samples: 0, 24 hours, 7 days, 28 days. Sample 0 was immediately analyzed. Other samples were stored in a freezer and analyzed after 24 hours, 7 days and 28 days. The average values of the measured parameters for all samples (n=172) throughout the whole study period were: ph 6.61, titratable acidity 6.54 SH, fat content 3.86 %, protein content 3.20 %, lactose content 4.77 %, solids non fat (SNF) 8.68 %, freezing point of milk C, rennet coagulation time 209 sec., curd quality class 2. Statistically very highly significant difference (P 0.001) between not frozen (0) and frozen milk samples (24 hours, 7 days and 28 days) was found in case of fat content, SNF, protein content, lactose content and freezing point of milk. Only for comparing not frozen milk 0 and milk frozen for 24 hours were found statistically significant differences in fat content (P 0.05) and SNF (P 0.01). When comparing the freezing time of milk between them was found a statistically significant difference (P 0.05) in the case of SNF between milk frozen 24 hours and 28 days. Úvod Obvykle je mléko chlazené nebo zmrazené kvůli zpomalení kažení 1. V čerstvě nadojeném mléce se přirozeně vyskytují inhibiční látky, které jsou účinné 0,5 až 4 hodiny po nadojení 2. Při rychlém a hlubokém mražení (pomocí dusíku) by nemělo dojít k tvorbě větších krystalů v mléce 3. Zmrazování a rozmrazování mléka, obvykle s vyšším množstvím tuku, obecně způsobuje částečné shlukování tukových globulí z důvodu rostoucích ledových krystalů, které tisknou globule k sobě. Tomu může zabránit předchozí homogenizace a rychlé zmrazení. Pokud vlivem zmrazení dojde ke krystalizaci laktózy, tak můžeme po rozmrazení pozorovat agregaci kaseinových micel. Pokud agregace není příliš silná, je možné ji rozrušit mícháním při nízké teplotě (např. 5 C), ale u mraženého mléka, které bylo skladováno dlouhou dobu při -18 C je tato agregace nevratná 1. Materiál a metodika Bazénové vzorky mléka pocházely od dojnic holštýnského plemene chovaných na Školním zemědělském podniku v Žabčicích. Mléko z ranního dojení bylo odebíráno 1x týdně v období od do (n = 172). Bazénový vzorek mléka (zchlazený ihned po nádoji na 7 C) byl po dobu přepravy do laboratoře uložen v termoboxu. Po převozu byl tento počáteční bazénový vzorek zahřán na teplotu 35 C a poté rozdělen do 4 vzorkovnic (po cca 250 ml mléka), čímž vznikly 4 vzorky. Vzorek 0 byl ihned analyzován, vzorek 24 hod byl uložen do mrazáku (-18 C) a rozborován následující den, vzorek 7 dní byl uložen do mrazáku a rozborován za 7 dní, obdobně tomu bylo u vzorku 28 dní. Zmrazené vzorky byly v den analýzy rozmrazeny ve vodní lázni na 35 C a opatrně promíchány. Obsahové složky mléka a tukuprostá sušina (TPS) byly měřeny na přístroji Julie C5 Automatic (Scope Electric) pracující na principu termoanalýzy. Aktivní kyselost byla měřena ph-metrem CyberScan 510. Titrační kyselost byla zjištěna dle metodiky Soxhlet-Henkela titrací vzorku hydroxidem sodným. Syřitelnost byla měřena pomocí nefeloturbidického snímače koagulace mléka dle metodiky 4. Kvalita sýřeniny byla zjišťována po inkubaci zasýřeného mléka dle metodiky 5 a zařazena do tříd jakosti 1 5. Čím nižší číslo, tím vyšší jakost. Bod mrznutí mléka byl zjištěn pomocí automatického kryoskopu Cryostar 1 (Funke Gerber). Výsledky analýz byly statisticky zpracovány a průměrné hodnoty měřených parametrů (dle délky uchování) porovnány mezi sebou. 113

114 Výsledky a diskuze Průměrné hodnoty jednotlivých měřených parametrů v rámci různé doby skladování jsou uvedeny v tabulce I. Průměrné hodnoty měřených ukazatelů u všech vzorků (n=172) za celé sledované období byly: ph 6,61, titrační kyselost 6,54 SH, obsah tuku 3,86 %, obsah bílkovin 3,20 %, obsah laktózy 4,77 %, tukuprostá sušina (TPS) 8,68 %, bod mrznutí mléka -0,556 C, syřitelnost 209 sec., třída kvality sýřeniny 2. V tabulce II jsou uvedeny korelační vztahy v rámci sledovaných parametrů a doby mražení. Byl zjištěn statisticky velmi vysoce průkazný (P 0,001) rozdíl mezi mlékem nemraženým (0) a zmraženým (v případě 24 hod., 7 dní i 28 dní) v obsahu tuku, TPS, bílkovin, laktózy a bodu mrznutí. V případě porovnání nemraženého mléka 0 a mraženého 24 hod u obsahu tuku šlo o statisticky průkazný rozdíl (P 0,05) a v případě TPS o vysoce statisticky průkazný rozdíl (P 0,01). Dle některých autorů dochází při mražení mléka k poměrně velkým změnám ve struktuře jeho složek 1. V jiných experimentech byl v případě rychlého a hlubokého zamražení a uchování vzorku po dobu 1 měsíc vliv zamražení malý, v podstatě v rámci hodnoty povolené opakovatelnosti (± 0,02 %) pro složkové ukazatele. Při skladování takového vzorku po dobu měsíců již dochází k větší oscilaci naměřených hodnot 2. S mléčnými složkami jsou těsně spjaty i další ukazatele, např. TPS, která podléhá vlivům, které působí na její jednotlivé hlavní složky (bílkoviny, laktóza a minerální látky) 6. Zmrazené mléko je velmi stabilní při teplotách nižších než -28 C, ačkoliv může stále dojít k oxidaci lipidů 1. Ostatní rozdíly měřených parametrů (ph, titrační kyselost, syřitelnost a kvalita sýřeniny) mezi zmraženými vzorky a nezmraženým vzorkem 0 byly statisticky neprůkazné (P 0,05). Při porovnání doby mražení mléka mezi sebou byl zjištěn statisticky průkazný rozdíl (P 0,05) v případě TPS mezi mlékem zmraženým 24 hod a 28 dní. Ostatní rozdíly v rámci sledovaných parametrů a doby mražení byly statisticky neprůkazné (P 0,05). Tabulka I Průměrné hodnoty jednotlivých měřených parametrů v rámci různé doby skladování. Parametr Jednotky Průměr celé měření (n=172) 0 24 hod 7 dní 28 dní ph 6,61 6,6 6,64 6,61 6,59 Titrační kys. SH 6,54 6,61 6,57 6,52 6,45 Tuk % 3,86 4,14 3,88 3,74 3,65 TPS % 8,68 8,49 8,69 8,74 8,84 Bílkovina % 3,20 3,11 3,2 3,22 3,25 Laktóza % 4,77 4,66 4,5 4,8 4,86 Bod mrznutí C -0,556-0,544-0,601-0,559-0,565 Syřitelnost sec Kval. sýřeniny třída

115 Tabulka II Vztahy měřených parametrů mezi jednotlivými intervaly doby skladování vzorků Parametr Intervaly dle doby uchování vzorků 0 x 24 hod 0 x 7 dní 0 x 28 dní 24 hod x 7 dní 24 hod x 28 dní 7 dní x 28 dní ph N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. Titrační kys. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. Tuk * *** *** N.S. N.S. N.S. TPS ** *** *** N.S. * N.S. Bílkovina *** *** *** N.S. N.S. N.S. Laktóza *** *** *** N.S. N.S. N.S. Bod mrznutí *** *** *** N.S. N.S. N.S. Syřitelnost N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. Kval. sýřeniny N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S.-P>0,05, *-P 0,05, **-P 0,01, ***-P 0,001 Závěr Můžeme konstatovat, že u vzorků mléka podrobených mražení (24 hodin, 7 dní i 28 dní) byl zjištěn statisticky průkazný rozdíl mezi naměřenými hodnotami obsahových složek oproti mléku nemrazenému. Technologické vlastnosti (mimo bodu mrznutí) nevykazovaly vlivem mrazení průkazné změny. Je ovšem nutné připustit, že zjištěné množství obsahových složek (resp. hodnoty tukuprosté sušiny) se měnilo i vlivem doby skladování v mrazáku. Poděkování: Tento výzkum byl podporován grantovým projektem IGA TP 2/2013 Použitá literatura: 1. Walstra, P., Woulters, J. T. M., Geurts, T. J.: Dairy science and techno-logy. 2nd ed. Boca Raton : CRC/Taylor & Francis, New York, 2006, 782 s. 2. Hanuš, O., Hering, P., Genčurová, V., Motyčka, Z., Jedelská, R., Kopecký, J.: Validation of deep freezing of pilot samples for checking of time stability of indirect analyses of basic milk composition and for their long shelf-life. Validace hlubokého zamrazování pilotních vzorků pro kontrolu stability výsledků nepřímých analýz základního složení mléka a pro jejich dlouhodobou údržnost. Acta univ. agric. et silvic. Mendel. Brun., ISSN , LVI, 5, 2008, Seydlová, R.: Inhibiční látky v mléce. Mlékařské listy Zpravodaj, 1998;45: Přibyla, L., Čejna, V.: Porovnání vizuální a nefelo turbidimetrické metody pro měření syřitelnosti mléka, s In Den mléka ČZU Praha, 2006, 172 s. 5. Gajdůšek, S.: Mlékařství II: (cvičení). 1. vyd. MZLU Brno, 1997, 84 s. 6. Doležal, O. et al.: Mléko, dojení, dojírny. 1. vyd. Agrospoj Praha, 2000, 241 s. Kontaktní adresa: Ing. Jana Javorová, Ústav chovu a šlechtění zvířat, Mendelova univerzita v Brně Zemědělská 1, Brno, Česká republika, jana.javorova@mendelu.cz 115

116 116

117 ÚČINNOSŤ POSTDIPINGU NA PRÍRODNEJ BÁZE V PREVENCII MASTITÍD Katarína Kirchnerová 1, Martina Vršková 1, Vladimír Foltys 2, Jan Říha 2, Robert Kadlec 3, Sharaf Eldeen Idriss 4 1 Národné poľnohospodárske a potravinárske centrum, VÚŽV Nitra, Slovenská republika 2 Bentleyczech, s.r.o., Česká republika; 3 Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o., Praha 4 Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Slovenská republika The efficiency of post-diping based on natural in prevention of mastitis Summary FarmGuard ApiBalm Dip is product based on natural, which is designed to carry out the post-diping the milking cows. The manufacturer states that the product helps treatment udder after milking and udder teats creates a antibacterial film. The aim of this experiment is to verify the antimicrobial effect of the described product. For this purpose, different concentrations were used resource in the medium - broth and verify the possibility of growth 5 mastitis bacterial strains in this medium. Furthermore, in five bacterial strains identified zone of inhibition caused by means ApiBalm Dip. Experiment verifies the antibacterial barrier effect in the case of surface-treated infectious agent in the environment as well as its inhibitory effect on the growth ability of 5 selected mastitis bacterial strains. Úvod Balzam na vemeno ApiBalm dip je prírodní tekutý krém vyrobený z levandulového oleja a liečivých bylín. Slúží ako postdiping k ošetreniu vemena po dojení, ukludneniu pokožky. Prírodné aktívne látky sú rýchle absorbované ceckami a vytvára nemastný povlak vo forme tenkého neviditeľného filmu, ktorý ako mechanicky tak biochemickou aktivitou znemožňuje prienik škodlivých mikroorganizmov cez kanálik cecku a poškodenú kožu. Zároveň umožňuje koži voľne dýchať. Prípravok má repelentný účinok - odpudzuje hmyz. Nedráždi pokožku struku - neobsahuje jód ani ďalšie chemická dráždidla (1). Dezinfekcia strukov po dojení je akceptovaná ako dôležitá súčasť štandardných preventívnych postupov proti mastitíde dojníc. Dôležitý je dezinfekčný účinok proti kontaktným patogénom ako sú Staphylococcus aureus a Streptococcus agalactiae. Hoci účinok proti environmentálnym patogénom ako Escherichia coli je sporný, je dezinfekcia strukov po dojení efektívnym manažérskym postupom vo väčšine stád. Výber dezinfekčného prostriedku by mal byť založený na preukázanej účinnosti, ktorá je vyžadovaná pre registráciu prípravku na veterinárne použitie (2). Účelom dippingu ceckov vemena bezprostredne po dojení je zneškodnenie kontaktných, mastitídu spôsobujúcich patogénnych mikroorganizmov, ktoré sa môžu nachádzať na povrchu struku, vrátane otvoreného ceckového kanálika predtým, ako majú možnosť kolonizovať a infikovať cecok. Pre najlepší možný efekt je dôležité aplikovať postdipping bezprostredne po sňatí nástrčiek, skôr ako sa kanálik začne zatvárať a skôr ako baktérie majú možnosť začať sa pomnožovať. Do prípravkov pre postdipping sa používa viacero typov chemikálií (jodofóry, chlorhexidín, hypochloridy, quartérne amóniové bázy, dodecyl benzénové deriváty a bariérové látky, ktoré z gélovitých substancií prechádzajú na plastifikované povlaky). Avšak pri týchto prípravkoch je pri nesprávnej manipulácii určité riziko prieniku rezíduí použitých chemikálií do mlieka. Ekologicky a z hľadiska bezpečnosti potravín sú vhodnejšie prípravky na báze prírodných zložiek (3, 4, 5). Prechod zo státia na sucho do laktácie je vysoko rizikovým obdobím pre dojnice. Najväčšou výzvou v tomto období je zabránenie vzniku mastitídy, pričom najproblematickejšie sú environmentálne baktérie. Jalovice sú prevažne infikované koagulázo negatívnymi stafylokokmi, zatiaľ čo koliformné baktérie sú schopné spôsobiť infekciu u dojníc v ďalších laktáciách (6). Najvýznamnejšou zmenou v epizootológii mastitíd dojníc v poslednom období je výrazný nárast výskytu mastitíd vyvolaných "environmentálnymi" patogénnymi baktériami, predovšetkým inými streptokokmi ako Streptococcus agalactiae. Najčastejšie sa uvádza výskyt baktérie 117

118 Streptococcus uberis a Escherichia coli. Streptococcus uberis je pôvodcom mastitíd predovšetkým vo veľkých stádach dojníc a má schopnosť získavať odolnosť voči účinku antibiotík a niektorých dezinfekčných prípravkov. Etiológiu environmentálnych mastitíd doplňujú aj baktérie Staphylococcus spp. a Serratia spp.. V posledný rokoch bol medzi patogénnymi pôvodcami mastitíd zaznamenaný pokles výskytu Staphylococcus aureus (z 30 na 10%), nárast výskytu Streptococcus agalactiae (z 15 na 20%), Streptococcus uberis (z 9 na 16%), Escherichia coli (z 15,5 na 28%), a pomerne stabilný 8% výskyt Eneterococcus spp. (7, 8, 9, 10). Stratégie, ktoré umožňujú uzatvorenie ceckového kanálika a neantibiotické prípravky sú vhodným prostriedkom na prevenciu týchto infekcií. Cieľom tohto pokusu je overiť antimikrobiálny účinok popísaného prípravku. Materiál a metódy FarmGuard ApiBalm Dip 1l - šarža č , doba expirácie: 10/11. Bakteriálne kmene - čisté kultúry - Česká zbierka mikroorganizmov (CMM, Boli použité nasledujúce bakteriálne kultúry: Enterococcus faecalis CCM4224 Streptococcus agalactiae CCM6187 Serratia marcescens CCM303 Staphylococcus aureus CCM3953 Escherichia coli CCM3954 Na kultiváciu sme použili: krvný agar, Mueller-Hinton agar ako médium pre roztok prípravku s prídavkom baktérií. Štandardná mikrotitračná doštička 12 x 8.7 mm terčíky k určení zón inhibície. Bežné vybavenie mikrobiologického laboratória. Za účelom určenia rastových schopností bakteriálnych kmeňov za prítomnosti rôznych koncentrácií ApiBalm Dip sme navrhli nasledujúci design doštičky: Stĺpce Riadky Rôzne koncentrácie prípravku ApiBalm Dip : 1. Enterococcus faecalis 1. ApiBalm Dip 100 μl:100 μl HM broth 2. Streptococcus agalactiae = 500 μl/1. ml 3. Serratia marcescens 2. ApiBalm Dip10 μl:190 μl HM broth = 50 μl/ml 4. Staphylococcus aureus 3. ApiBalm Dip 1 μl:200 μl HM broth = 5 μl/ml 5. Escherichia coli 4. ApiBalm Dip 0,1 μl:200 μl HM broth 6. prázdná pozice = 0.5 μl/ml 7. kontrolní vzorek - bez bakterií 5. ApiBalm Dip 0,01 μl:200 μl HM broth 8. Enterococcus faecalis = 0.05 μl/ml 9. Streptococcus agalactiae 6. ApiBalm Dip 0,001 μl:200 μl HM broth 10. Serratia marcescens = μl/ml 11. Staphylococcus aureus 7. kontrola - bez adice ApiBalm Dip 200 μl 12. Escherichia coli HM broth 8. prázdná pozice 118

119 Obr. 1. Design pokusu - mikrotitračná doštička Z popísanej mikrotitračnej doštičky sme spravili dva typy kultivácií: určenie zóny inhibície (vzorky zo stĺpcov 1.-4., 7 riadok sme kultivovali na Petriho miskách s krvným -agarom a 7 mm terčíky s nanesenými 10, 15 a 30 μl ApiBalm Dip. Miska obsahovala kontrolný terčík a priamy prídavoki ApiBalm dipu vo forme 2 kvapiek 15 μl umiestnených mimo terčíky. Misky sme kultivovali za popísaných podmienok. Táto časť experimentu popisuje interakciu povrchu ošetreného pomocou prípravku s infekčným prostredím bakteriálnej povahy. stanovení CPM po kultivácii vzoriek s rôznymi koncentráciami prípravku v roztoku HM agaru a bakteriálnych kmeňov - riadky pre všetky vybrané kmene. Táto časť experimentu je zameraná priamo na antibakteriálnu schopnosť prípravku a efektu jeho koncentrácie na schopnosť inhibície rastu vybraných kmeňov mastitidních baktérií. Všetky vzorky sme kultivovali na agarových miskách pre všetky zvolené koncentrácie a kmene baktérií. Koncentrácia baktérií v roztoku: 108/1 ml. Čas/teplota kultivácie: 20 h/37 0 C. Výsledky a diskusia Stanovenie zón inhibície Tabuľka I Výsledky stanovenia zón inhibície pre rôzne množstvá prípravku ApiBalm Dip. Zóna inhibície (mm, 7mm terčík) Bakteriálny kmeň Množstvo ApiBalm Dip μl μl μl μl wth disc Môžeme konštatovať, že priemer zón inhibície je priamo úmerný množstvu prípravku aplikovaného na terčík. Najlepšieho výsledku sme dosiahli pri množstve 15 μl prípravku u kmeňa Staphylococcus aureus CCM3953 (15 mm) (Obr. 2) a kmeňa Streptococcus agalactiae CCM6187 (12 mm). Priemerná zóna inhibície pre rôzne množstvá prípravku bola mm pre 119

120 Staphylococcus aureus CCM3953, mm pre Escherichia coli CCM3954 (Obr. 3), mm pre Serratia marcescens CCM303, mm pre Enterococcus faecalis CCM4224, mm pre Streptococcus agalactiae CCM6187. Kvapky prípravku umiestnené priamo do kultivačného média vykázali väčšiu schopnosť likvidácie baktérií (väčšie zóny inhibície) ako rovnaké množstvá umiestnená na terčíky. Obr. 2. Výsledky určenia zón inhibície pre Staphylococcus aureus CCM3953, Obr. 3. Výsledky určenia zón inhibície pre Escherichia coli CCM3954. Stanovenie CPM Roztoky o rôznych koncentráciách prípravku v roztoku HM agaru a bakteriálnych kmeňov sme kultivovali na miskách s krvným agarom po dobu 20 hodín a teplote 37 0 C. Obrázky ukazujú výsledky kultivácie, v tabuľke 2 uvádzame výsledky stanovenia CPM pre všetky kultivácie. Tabuľka II Počet CPM po kultivácii roztokov HM agaru a baktérií s rôznymi koncentráciami ApiBalm Dip. ***** - maximálny počet CPM. CPM po kultivaci roztoků HM agaru, bakteriálních kmenů a různých koncentrací ApiBalm Dip. Bakteriální kmen Koncentrace ApiBalm Dip μl/ml - - ** * * 50 μl/ml * * *** * *** 5 μl/ml ** ** ***** *** ***** 0.5 μl/ml ***** ** ***** **** ***** Z výsledkov uvedených v tabuľke 2 je zrejmé, že rôzne koncentrácie ApiBalm Dip ovplyvňujú rastové schopnosti vybraných bakteriálnych kmeňov. Najlepších výsledkov sme dosiahli u Enterococcus faecalis CCM4224 a Streptococcus agalactiae CCM6187, kde bol CPM po kultivácii pod hranicou detekcie vo vzorke s 500 μl/ml koncentráciou ApiBalm Dip. Zvlášť je zjavný vplyv koncentrácie prípravku pre inhibíciu rastu u Enterococcus faecalis CCM4224, ApiBalm Dip v závislosti na koncentrácii v roztoku redukoval CPM z úrovne ***** pod úroveň detekcie. Rast kmeňa Streptococcus agalactiae CCM6187 bol inhibovaný na úroveň ** už od koncentrácie 0.5 μl/ml. Enterococcus faecalis CCM4224 bol inhibovaný na rovnakej úrovni 120

121 od koncentrácie 5 μl/ml. Serratia marcescens CCM303 preukázal najvyššiu rezistenciu na účinok ApiBalm Dip - z úrovně ***** na úroveň ** v závislosti na koncentrácii prípravku v roztoku. Rastové schopnosti Staphylococcus aureus CCM3953 a Escherichia coli CCM3954 boli inhibované na úroveň *** od koncentrácie 50 μl/ml resp. 500 μl/ml. Obr Výsledky stanovenia CPM po kultivácii s rôznymi koncentráciami ApiBalm Dip. Enterococcus faecalis CCM4224 (Obr. 4), Streptococcus agalactiae CCM6187 (Obr. 5), Serratia marcescens CCM303 (Obr. 6), Staphylococcus aureus CCM3953 (Obr. 7), Escherichia coli CCM3954 (Obr. 8). Záver Prípravok ApiBalm Dip vykázal antimikrobiálnu aktivitu v oboch typoch popísaných experimentov. Množstvo aplikovaného prípravku málo vplyv na veľkosť zón inhibície u 5 vybraných kmeňov mastitídnych baktérií. Priemerná zóna inhibície určená pomocou terčíkovej metódy bola v pokuse mm. Výsledky tiež ukázali lepší antibakteriálny účinok prípravku pri priamej aplikácii na bakteriálne kolónie. Bol preukazný ako bariérový efekt prípravku, tak priama antimikrobiálna aktivita. ApiBalm Dip inhiboval rastové schopnosti všetkých vybraných bakteriálnych kmeňov v závislosti na jeho koncentrácii v kultivačnom médiu s baktériami. Výsledky pre rôzne koncentrácie záviseli na type jednotlivých bakteriálnych kmeňov, ale na základe výsledkov môžeme tvrdiť, že koncentrácia 500 μl/ml prípravku ApiBalm efektívne inhiboval rast všetkých skúmaných bakteriálnych kmeňov. Poďakovanie Príspevok bol vytvorený s podporou projektu MIA CR VG Rapid Decision Systems for Food Safety ( , MV0/VG) a realizáciou projektu CEGEZ č , na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja a za technickej pomoci firmy Bentley Czech, s.r.o. 121

122 Použitá literatúra LAM T. J. et al : Udder disinfection and mastitis in cattle. Tijdschr. Diergeneeskd. Jul;120(13): SALERNO T. et al : In vitro algaecide effect of sodium hypochlorite and iodine based antiseptics on Prototheca zopfii strains isolated from bovine milk. Res. Vet. Sci. Apr;88(2): CASTRO S. I. et al : Effects of iodine intake and teat-dipping practices on milk iodine concentrations in dairy cows. J. Dairy Sci. Jan;95(1): PYORÄLÄ S : Mastitis in post-partum dairy cows. Reprod. Domest. Anim. Jul;43 Suppl 2: BUSHNELL R. B. 1984: The importance of hygienic procedures in controlling mastitis. Vet. Clin Anim. Pract. Jul;6 (2): FOLTYS V. - KIRCHNEROVÁ K : Changes in mastitis patogens development and their sensitivity to antibiotics in dairy industry. Biotechnology, Medzin. ved. konf. České Budějovice, ČR, : Scientific Pedagogical Publishing, Č. Budějovice, s CD, ISBN X. 9. FOLTYS V. - KIRCHNEROVÁ K : Vývoj výskytu mastitídnych patogénov a nové metódy ich stanovenia v prvovýrobe mlieka. In: Hygiena alimentorum. XXVIII medzinárodná vedecká konferencia. Štrbské Pleso Vysoké Tatry, SR, Recenzovaný zborník, Košice, UVL, s , ISBN: FOLTYS V. - KIRCHNEROVÁ K : Etiológia mastitíd v priebehu laktácie. Acta fytotechnica et zootechnica, 12, s ISSN X. Kontaktná adresa Ing. Katarína Kirchnerová, PhD., Národné poľnohospodárske a potravinárske centrum, Výskumný ústav živočíšnej výroby Nitra - Ústav systémov chovu, Hlohovecká 2, Lužianky, Slovenská republika, kirchnerova@cvzv.sk 122

123 TESTY URČENÉ NA RÝCHLU DETEKCIU MASTITÍD V POROVNANÍ S KLASICKÝMI METÓDAMI Vršková Martina 1, Kirchnerová Katarína 1, Foltys Vladimír 2, Říha Jan 2, Sharaf Eldeen Idriss 3 1 Národné poľnohospodárske a potravinárske centrum, VÚŽV Nitra, Slovenská republika 2 Bentleyczech, s.r.o., Česká republika 3 Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Slovenská republika Tests designed for rapid detection of mastitis compared to traditional methods Summary SomaTest used to estimate the somatic cells count (SCC) in milk. MicroMast is a diagnostic kit for rapid microbiological testing individual milk samples in order to identify the agents of infectious mastitis. For testing commercial tests were taken 37 individual milk samples. We then measured the SCC device SomaCount Bentley. In mastitis samples no was SCC significantly increased, confirming the findings of mastitis only in samples no. 22 and no. 24 was lower than 200x10 3 /1ml SCC, which does not award mastitis. Samples no with negative mastitis, somatic cell count was less than 200x10 3 /1ml. Use MicroMast test us in two cases confirmed the presence of G- genera (Enterobacteriaceae), in 20 cases the incidence G+ genera (Staphylococcus and Streptococcus), the other 7 samples intense presence G+ (+ +) bacteria. SomaTest preparation showed 100% correct results and expressed as a reliable means of finding dairy cattle udder inflammation. Use MicroMast test is appropriate to distinguish G+ and G- agents of mastitis in samples with higher SCC or confirmed mastitis by the preparation SomaTest. Úvod Mastitída je multifaktoriálne ochorenie mliečnej žľazy spôsobené infekčnými alebo enviromentálnymi baktériami, prípadne nebakteriálnymi faktormi ako je mechanické dráždenie vemena, nevhodné postupy pri dojení, stres a pod. Má značný ekonomický dopad na chovateľa, či už prostredníctvom zníženého množstva vyprodukovaného mlieka, zvýšením množstva neštandardného mlieka (kvôli vysokému počtu somatických buniek), nákladmi na liečbu alebo predčasným vyradením dojnice z chovu. Mastitída znižuje množstvo vyprodukovaného mlieka a zároveň dochádza aj k jeho fyzikálnym, mikrobiologickým a chemickým zmenám (5). Zvyšuje sa podiel srvátkových bielkovín (hlavne imunoglobulínov) na úkor kazeínu, redukuje sa množstvo laktózy, zvyšuje sa obsah voľných mastných kyselín a mení sa rovnováha minerálov (1). Ako pri všetkých ochoreniach aj tu je lacnejšia prevencia ako následná liečba. Preventívne opatrenia spočívajú už v genetickej selekcii zvierat, vo vybilancovaní výživy, eliminácii stresu, zabezpečení čistého a suchého prostredia a dodržiavaní hygieny pri získavaní mlieka (9). Kolektív autorov (6) uviedol, že metódy hodnotenia kvality mlieka sú v mnohých krajinách založené na množstve obsiahnutých buniek (či už somatických alebo mikrobiálnych) v jednom mililitri vyprodukovaného mlieka určeného na konzumáciu alebo ďalšie spracovanie. Ako najviac sledovaný ukazovateľ určujúci zdravie mliečnej žľazy je počet somatických buniek (PSB). Tento ukazovateľ je mliekarňami určený ako kľúčový parameter pri zatrieďovaní a speňažovaní vyprodukovaného mlieka na farmách. Zároveň je aj indikátorom výskytu mastitídy (1). PSB je daný najmä počtom bielych krviniek v 1 ml mlieka (6). PSB sa sleduje na rôznych úrovniach: individuálna vzorka mlieka odobraná z jednotlivých štvrtiek vemena od jednej dojnice zmiešaná vzorka mlieka zo všetkých štvrtiek vemena od jednej dojnice vzorka mlieka zo zásobného tanku, čo predstavuje zmiešanú vzorku mlieka za celé stádo dojníc V ostatnom desaťročí celosvetovo dominujú u prežúvavcov "environmentálne" mastitídy dojníc vyvolané patogénnymi baktériami ľahko prežívajúcimi v prostredí, predovšetkým inými streptokokmi ako Streptococcus agalactiae. Najčastejšie sa uvádza výskyt baktérie Streptococcus uberis a Escherichia coli. Streptococcus uberis je pôvodcom mastitíd predovšetkým vo veľkých stádach dojníc. K masovému rozšíreniu S. uberis prispela aj jeho schopnosť získavať odolnosť voči účinku antibiotík a niektorých dezinfekčných prípravkov. Etiológiu environmentálnych mastitíd 123

124 doplňujú aj baktérie Staphylococcus spp. a Serratia spp. (2, 3, 4, 7). Medzi patogény zaraďujeme aj Mycoplasma bovis, ktorá sa zistí u dojníc s klinickými príznakmi až po neúspešnej liečbe a opakovanej negatívnej bakteriologickej kultivácii (8). V práci sme hodnotili spoľahlivosť detekcie zvýšeného počtu PSB a schopnosť rozlíšenia G+ a G- baktérií dvoma komerčnými testami (SomaTest, MicroMast) oproti klasickým metódam. Materiál a metódy Vzorky mlieka Pre testovanie diagnostických prostriedkov sme odobrali 37 individuálnych vzoriek mlieka od dojníc. Z toho 32 vzoriek (č. 1-32) od problematických dojníc s pozitívnym nálezom mastitídy na základe vysokého PSB z výsledkov kontroly úžitkovosti, a 5 vzoriek (č ) s negatívnym nálezom mastitídy, s nízkym PSB z výsledkov kontroly úžitkovosti. Vo vzorkách mlieka sme stanovili PSB pomocou prietokovej cytometrie na prístroji SomaCount Bentley a vzorky sme bakteriologicky vyšetrili. Diagnostické prípravky Somatest slúži k odhadu počtu somatických buniek (PSB) v mlieku a detekuje latentné mastitídne infekcie jednotlivých štvrtiek vemena. MicroMast je diagnostická súprava na rýchle mikrobiologické vyšetrenie individuálnych vzoriek mlieka za účelom zistenia pôvodcov infekčných mastitíd. Oba testované prípravky sme aplikovali podľa pokynov výrobcu v priložených návodoch na použitie. Výsledky a diskusia V tejto kapitole sa budeme venovať našim výsledkom, keďže každý prípravok je postavený na inej chemickej báze, je problematické nájsť vhodné literárne pramene na porovnanie. SomaTest Počet somatických buniek zmeraný prístrojom v mastitídnych vzorkách č bol výrazne zvýšený, čo potvrdilo nález mastitídy (Tab. I). Len vo vzorkách č. 22 a č. 24 bol PSB nižší ako 200/1ml, čo nezodpovedá nálezu mastitídy. Testovaný diagnostický prípravok SomaTest potvrdil nález mastitídy vo vzorkách č (obr. 1), včítane vzoriek č. 22 a č. 24, kde napriek nízkemu počtu somatických buniek odhalil prítomnosť zápalu potvrdenú nálezom patogénneho mikroorganizmu referenčným laboratóriom ako aj výsledkami PSB z kontroly úžitkovosti. Potvrdil taktiež negativitu vzoriek č (obr. 2). Obr. 1. Vzorka 1, 2, 3, 4 Obr. 2. Vzorka 36,

125 Vzťah medzi pozitivitou reakcie (-, +, ++, +++) a počtom somatických buniek v sledovaných vzorkách znázorňuje obr. 3. Na základe zisteného PSB môžeme teda konštatovať, že vzorky č boli skutočne od dojníc postihnutých mastitídou a vzorky č od dojníc so zdravým vemenom. Obrázok 3 ukazuje, že s počtom somatických buniek v mlieku stúpa pozitivita zistená SomaTestom, čo znamená, že SomaTest spoľahlivo rozlišuje vzorky s menej a výrazne zhoršenou kvalitou (++ od a +++ od PSB/ml v sledovanom súbore vzoriek). Tabuľka I Výsledky stanovenia počtu somatických buniek prístrojom SomaCount Bentley a vyhodnotenie vzoriek pomocou diagnostického prípravku SomaTest. PSB Soma Test* Č. vzorky 10* 3 /1ml modrofialová počet

126 3 2 1 PSB 10*3/1ml vo vzťahu k počtu Obr. 3. Vzťah medzi počtom somatických buniek v 1 ml vzorky mlieka a počtom znamienok + pridelených vzorke na základe reakcie na diagnostický prípravok SomaTest podľa návodu na vyhodnotenie MicroMast Výsledky rozlíšenia G- a G+ baktérií v sledovaných vzorkách sú uvedené v tabuľke II. Tabuľka II Výsledky nálezu bakteriálnych pôvodcov infekčných mastitíd dojníc referenčnou metódou a diagnostickou súpravou MicroMast. Referenčná metóda MicroMast** Č. vzorky G- G+ G- G+ G+- 1Enterobakt StaphSp E.Coli StaphA StrepU StaphA StaphSp StaphSp Microc.L Microc.L E.Coli Microc.L StaphA StaphA StaphSp Past. M StaphA StaphSp StaphSp StaphA StaphSp StaphA StaphA Enterobakt StaphA E.Coli E.Coli

127 Patogénne G- baktérie boli referenčnou metódou zistené v siedmich vzorkách mlieka. Z toho v troch vzorkách boli zistené aj pomocou selektívneho kultivačného agaru pre G- baktérie súpravy MicroMast a v štyroch vzorkách G- baktérie pomocou selektívneho kultivačného agaru pre G- baktérie súpravy MicroMast zistené neboli (obr. 4). V jednej vzorke bol zistený výskyt G- baktérií MicroMast testom bez potvrdenia referenčnou metódou. Zostávajúcich 29 vzoriek bolo bez nálezu G- baktérií referenčnou metódou i MicroMast testom. Na základe týchto výsledkov môžeme konštatovať, že G- baktérie boli MicroMast testom potvrdené približne v 50% pozitívnych vzoriek, a až na jednu výnimku všetky negatívne vzorky boli MicroMast testom potvrdené ako negatívne. Patogénne G+ baktérie boli referenčnou metódou zistené v 20 vzorkách mlieka. Pomocou selektívneho kultivačného agaru pre G+ baktérie súpravy MicroMast boli zistené G+ baktérie v každej z týchto 20 vzoriek (obr. 5). Avšak pomocou MicroMast súpravy boli zistené G+ baktérie i v ďalších 16 sledovaných vzorkách bez nálezu G+ baktérií referenčnou metódou, z toho v 6 vzorkách s výsledkom ++. V jednej vzorke č. 36 nebol nález G+ baktérií obomi metódami. Na základe týchto výsledkov je potrebné konštatovať, že k zisteniu výskytu G+ baktérií pomocou MicroMast súpravy prišlo i vo vzorkách, ktoré boli na základe PSB uznané ako mastitídne, i keď referenčná metóda nezachytila žiaden konkrétny patogén. Ak vychádzame z predpokladu, že vzorky č pochádzajú od dojníc s mastitídou, použitie MicroMast testu nám v dvoch prípadoch potvrdzuje výskyt G- Enterobaktérií, v 20 prípadoch výskyt G+ rodov Staphylococcus a Streptococcus, v ďalších 7 vzorkách intenzívny (++) výskyt G+ baktérií. Vzorky č od dojníc so zdravým vemenom vykázali slabý (+) výskyt G+ baktérií. Vo vzorkách s nízkym počtom PSB prípadný nález G- alebo G+ baktérií nie je dôkazom mastitídy, jedná sa tu zrejme o výskyt nepatogénnych mikrooganizmov. Obr. 4. Vzorka č. 1 Obr. 5. Vzorka č. 6 Záver Osobitné hygienické opatrenia musia obsahovať zásady mikrobiologických kritérií a zásady získavania mlieka od zdravých dojníc. Pre prvovýrobu mlieka je najväčší problém rýchla identifikácia problémových dojníc a určenie patogénov, ktoré spôsobujú zápaly mliečnych žliaz. Preto sme sa snažili za použitia komerčných testov objektívne zhodnotiť ich použitie a dať prvovýrobcovi návod na ich používanie. Prípravok SomaTest vykázal 100% správnych výsledkov a prejavil sa ako spoľahlivý prostriedok na zistenie zápalu vemena dojníc. Použitie MicroMast testu je vhodné na rozlíšenie G+ a G- pôvodcov mastitíd vo vzorkách so zvýšeným PSB alebo s potvrdenou mastitídou pomocou prípravku SomaTest. 127

128 Poďakovanie Tento článok bol vytvorený realizáciou projektu CEGEZ č , na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja a za technickej pomoci firmy Bentley Czech, s.r.o. Použitá literatúra 1. AULDIST, M Milk Quality and Udder Health (Effect on Processing Characteristics). Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition), p , 2. FOLTYS V. - KIRCHNEROVÁ K : Changes in mastitis patogens development and their sensitivity to antibiotics in dairy industry. Biotechnology, Medzin. ved. konf. České Budějovice, ČR, : Scientific Pedagogical Publishing, Č. Budějovice, s CD, ISBN X. 3. FOLTYS V. - KIRCHNEROVÁ K : Vývoj výskytu mastitídnych patogénov a nové metódy ich stanovenia v prvovýrobe mlieka. In: Hygiena alimentorum. XXVIII medzinárodná vedecká konferencia. Štrbské Pleso Vysoké Tatry, SR, Recenzovaný zborník, Košice, UVL, s , ISBN: FOLTYS V. - KIRCHNEROVÁ K : Etiológia mastitíd v priebehu laktácie. Acta fytotechnica et zootechnica, 12, s ISSN X. 5. HALASA, T., - NIELEN, M., - DE ROOS, A. P. W. et al Production loss due to new subclinical mastitis in Dutch dairy cows estimated with a test-day model. J. Dairy Sci. 92: doi: /jds KELLY, A. L. - LEITNER, G. - MERIN, U Milk Quality and Udder Health (Test Methods and Standards). Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition), p , 7. NAPEL, J. HAAS, Y. JONG, G. et al Characterization of distributions of somatic cell counts. J. Dairy Sci. 92: doi: /jds NICKERSON, S.C. 2011a. Mastitis pathogens Contagious pathogens. Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition), p NICKERSON, S.C. 2011b. Mastitis Therapy and Control Management Control Options. Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition), p Kontaktná adresa Ing. Martina Vršková, PhD., Národné poľnohospodárske a potravinárske centrum, Výskumný ústav živočíšnej výroby Nitra - Ústav systémov chovu, Hlohovecká 2, Lužianky, Slovenská republika, vrskova@cvzv.sk 128

129 PREDIKCIA ZVODNENIA OVČIEHO MLIEKA TESTOVANIE ZVOLENÉHO MODELU NA MLIEKU KRAVSKOM Tomáška Martin 1, Hanuš Oto 2, Hofericová Margita 1, Jedelská Radoslava 3, Chrachalová Katarína 1, Kološta Miroslav 1 1 Výskumný ústav mliekárenský, a.s.; Žilina, Slovensko 2 Výzkumný ústav mlékárenský, s.r.o.; Praha; Česká republika 3 Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o.; Rapotín; Česká republika Prediction of adulteration of sheep s milk with water testing of the selected model on cow s milk Summary: 310 samples of raw cow milk from 4 dairies were analysed for freezing point by the reference cryoscopic method and by FTIR, along with other tests, like total cell counts, somatic cell counts, fat, protein, lactose, solids, urea and casein. Measured data were analysed and statistically treated. Results of freezing point, measured by both methods, correlated significantly, but not markedly (r = ; R 2 = ). Equivalent of the freezing point obtained from FTIR was more dependent on composition of milk, in comparison to the results from the cryoscope. The conclusions from the study will be utilised in finding of suitable model for prediction of possible adulteration of raw sheep s milk with water. Here it is more complicated to estimate addition of water, as composition of sheep s milk is very variable and also limit for freezing points is not established in general. Úvod Ovčie mlieko hrá významnú úlohu v slovenskom mliekarstve. To sa na Slovensku spracováva jednak tradičným spôsobom a vtedy sa najčastejšie distribuuje formou predaja z dvora, alebo sa vykupuje, podobne ako mlieko kravské a spracováva sa v mliekarňach v oveľa väčších objemoch na rôzne mliečne výrobky (1). Kým pri vlastnom spracovaní výrobca vie čo kupuje, pri nákupe nákupcom/spracovateľom tento preveruje kvalitu nakupovanej suroviny. Nedávnym problémom bolo falšovanie ovčieho mlieka mliekom kravským prípadne kozím. Dostupnosťou rýchlych imunochemických testov a možnosťou ich výkonu nielen v laboratóriu, ale priamo pri výkupe mlieka, sa tieto nekalé praktiky výrazne a rýchlo eliminovali. Problémom zostáva dôkaz zvodnenia ovčieho mlieka. Toto eventuálne falšovanie je zatiaľ problematicky dokázateľné, pretože nástroje na jeho odhalenie, používané pri kravskom mlieku tu majú určité obmedzenia: neexistuje všeobecne platný limit teploty tuhnutia ovčieho mlieka, limity na minimálnu hodnotu beztukovej sušiny a hustoty mlieka (ako podporných ukazovateľov) sú stanovené STN z roku 1995 a nemusia byť aktuálne (2), variabilita ovčieho mlieka je oveľa väčšia, čo je dané výraznými zmenami v jeho zložení počas sezóny, ale aj plemenom, ktoré ho produkuje (3). Cieľom práce bolo otestovať predikciu zvodnenia mlieka pomocou metódy FTIR. Analyzovať dosiahnuté výsledky s inými meraniami, použijúc surové kravské mlieko ako modelovú matricu. Materiál a metódy Na skúšanie bolo použitých 310 bazénových vzoriek surového kravského mlieka, ktoré pochádzali zo 4 rôznych mliekární. Vzorky boli odoberané paralelne ako nekonzervované, resp. konzervované Acidiolom (MERCK, Darmstadt, Nemecko). Vzorky boli skúšané do 48 hodín po odbere, pričom do doby vykonania skúšky boli uchovávané pri teplote 1 C až 8 C. Nekonzervované vzorky boli skúšané na teplotu tuhnutia referenčnou kryoskopickou metódou (CryoStar I, Funke-Gerber, Nemecko) (4). Konzervované vzorky boli skúšané na množstvo tuku, bielkovín, laktózy, beztukovej sušiny a ekvivalent teploty tuhnutia metódou FTIR na zariadení MilkoScan 6000 FT (FOSS, Hillerød, Dánsko) (5), na celkový počet mikroorganizmov metódou laserovej prietokovej 129

130 cytometrie na zariadení BactoScan FC (FOSS, Hillerød, Dánsko) (6) a na počet somatických buniek metódou prietokovej cytometrie na zariadení Fossomatic 5000 (FOSS, Hillerød, Dánsko) (7). Všetky metódy boli pravidelne kontrolované pomocou interných a externých referenčných vzoriek a medzilaboratórnych porovnaní. Namerané výsledky boli analyzované pomocou SW Excel (Microsoft, Redmond, USA). Výsledky a diskusia Dátový súbor výsledkov vzoriek meraný na kryoskope bol nasledovný: n = 310, priemerná hodnota = -0,530 C, smerodajná odchýlka = 0,180 C, max = -0,498 C, min = -0,670 C. Dátový súbor výsledkov vzoriek meraný FTIR bol nasledovný: n = 310, priemerná hodnota: = -0,524 C, smerodajná odchýlka = 0,070 C, max = -0,487 C, min = -0,544 C. Na úvod treba zdôrazniť, že modul merania teploty na MilkoScane nebol adjustovaný na lokálne podmienky, to znamená, že sa využila iba built-in kalibrácia s hodnotami smernice/posunutia 1/0. To môže byť jedna z príčin rozdielnych charakteristík dátových súborov. Takisto vzorky merané na kryoskope neboli konzervované, kým na MilkoScane boli konzervované. Okrem toho do súboru dát boli zámerne zaradené aj výsledky z jednej mliekarne, ktorá vykazovala u viacerých vzoriek extrémne nízke hodnoty teploty tuhnutia, pri meraní na kryoskope (<-0,600 C) n = 42, priemerná hodnota = -0,553 C, nie však na MilkoScane n = 42, priemerná hodnota = -0,522 C. V ďalšom sú analyzované závislosti nameraných vlastností vzoriek mlieka, teda vzťah k teplote tuhnutia meranej kryoskopicky aj FTIR. Z Tab. I je zrejmé, že vzťah medzi teplotou tuhnutia meranou referenčnou metódou na kryoskope a FTIR je síce štatisticky významný aj pri zohľadnení všetkých dát (n = 310) korelácia 0,314, čo však nie je výrazná korelácia, vzhľadom na to, že sa jedná o meranie tej istej vlastnosti, hoci principiálne inými metódami. A len 9,88% variability v teplote tuhnutia meranej FTIR je vysvetliteľných variabilitou v teplote tuhnutia meranej kryoskopicky a naopak. Po vylúčení mliekarne s problematickými (nízkymi) hodnotami teploty tuhnutia (n = 268) sa korelácia a variabilita mierne zvýšila na 0,432, resp. 18,67% - viď Obr. 1. Z uvedenej analýzy je tiež zrejmé, že vzťahy medzi ekvivalentom teploty tuhnutia (FTIR) a ostatnými vlastnosťami mlieka, ako množstvo močoviny, beztukovej sušiny, laktózy, bielkovín a kazeínu sú významné a logické. Naopak vzťah medzi teplotou tuhnutia meranou kryoskopicky bol významný iba u močoviny (ktorá je osmoticky aktívna) a celkovým počtom mikroorganizmov, čo je v tomto prípade skôr náhoda (8). Obr. 1. Vzťah medzi meraním teploty tuhnutia surového kravského mlieka referenčnou kryoskopickou metódou a pomocou FTIR na zariadení MilkoScan. 130

131 Tabuľka I Štatistické porovnanie merania teploty tuhnutia iných vlastností surového kravského mlieka x y n R 2 r TT MilkoScan TT Kryoskop y = 0,264x + 456, ,0988 0,314*** TT Kryoskop TT MilkoScan y = 0,7815x + 120, ,0988 0,314*** TT MilkoScan Tuk y = 0,9925x + 519, ,0015 0,0387ns Bielkoviny y = 7,432x + 497, ,0192 0,1386* Laktóza y = 17,796x + 439, ,0639 0,2528** BTS y = 16,105x + 380, ,1399 0,374*** log PSB y = -3,5902x + 532, ,0059 0,0768ns Močovina y = 0,0226x + 518, ,1642 0,4052*** Kazeín y = 9,6857x + 496, ,0198 0,1407* log CPM y = -0,4502x + 524, ,0004 0,02ns TT Kryoskop Tuk y = 4,6434x + 510, ,0052 0,0721ns Bielkoviny y = 10,936x + 491, ,0067 0,0819ns Laktóza y = 15,473x + 456, ,0078 0,0883ns BTS y = 8,3427x + 455, ,0061 0,0781ns log PSB y = 4,8253x + 518, ,0017 0,0412ns Močovina y = 0,1074x + 504, ,5826 0,7633*** Kazeín y = 14,801x + 488, ,0072 0,0849ns log CPM y = -7,6058x + 540, ,0177 0,133* Záver Meranie teploty tuhnutia surového kravského mlieka pomocou FTIR sa vo svete bežne využíva, ako účinný skríningový nástroj na odhalenie jeho zvodnenia. Je pravda, že toto falšovanie sa pri mlieku kravskom vyskytuje naozaj iba ojedinele. Napríklad v roku 2013 bolo v SL EXAMINALA vyskúšaných vzoriek surového kravského mlieka, pričom priemerná hodnota teploty tuhnutia bola -0,526 C a iba 6% vzoriek malo hodnotu teploty tuhnutia vyššiu, ako -0,515 C, čo sa považuje za eventuálne zvodnené mlieko. Aj preto bolo ťažšie do uvedenej štúdie zaradiť vzorky reálne zvodnené. Pre aplikáciu získaných poznatkov na model surového ovčieho mlieka, kde zvodnenie je doposiaľ problematicky preukázateľné, bude potrebné: V prípade stratégie merania správnych hodnôt teploty tuhnutia vykonať reprezentatívny plošný a celosezónny monitoring vzoriek surového ovčieho mlieka pomocou kryoskopickej metódy, zaradiť vzorky umelo zvodnené a vykonať spoľahlivú úpravu smernice/posunutia metódy FTIR, ktorá bude reprezentovať lokálne vlastnosti surového ovčieho mlieka. Posúdiť vplyv konzervácie vzoriek. Zvážiť aj alternatívny spôsob odhadu zvodnenia a to na základe distribúcie početnosti dát takisto reprezentatívneho súboru vzoriek surového ovčieho mlieka, meraného výlučne metódou FTIR, bez úpravy smernice/posunutia, spolu s ostatnými vlastnosťami mlieka, najmä beztukovou sušinou. 131

132 Poďakovanie: Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy č. APVV a Ministerstvom zemědělství ČR na základe rozhodnutia RO0514. Použitá literatúra: 1. Herian, K Prínos ovčích mliečnych výrobkov pre zdravie ľudí. Mlékařské listy zpravodaj, 25 (143), I VI. 2. STN Ovčie mlieko. Úrad pre normalizáciu, metrológiu a skúšobníctvo SR, Bratislava. 3. Park , Y.W., Juárez, M., Ramos, M., Haenlein, G.F.W Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk. Small Ruminants Research, 68 (1-2), STN EN ISO Mlieko. Stanovenie teploty tuhnutia. Termistorová kryoskopická metóda (Referenčná metóda) (ISO 5764:2009). Slovenský ústav technickej normalizácie, Bratislava. 5. STN Stanovenie zloženia mlieka infračerveným absorpčným analyzátorom. Úrad pre normalizáciu, metrológiu a skúšobníctvo SR, Bratislava. 6. STN Automatizované stanovenie mikroorganizmov v surovom mlieku s priamym počítaním bakteriálnych buniek. Slovenský ústav technickej normalizácie, Bratislava. 7. STN EN ISO Mlieko. Stanovenie počtu somatických buniek. Časť 2: Návod na obsluhu zariadenia na elektronické počítanie častíc fluorescenčnou optickou metódou (ISO :2006). Slovenský ústav technickej normalizácie, Bratislava. 8. Hanuš, O., Frelich, J., Tomáška, M., Vyletělová, M., Genčurová, V., Kučera, J., Třináctý, J The analysis of relationships between chemical composition, physical, technological and health indicators and freezing point in raw cow milk, Czech J. Anim. Sci., 55, (1) Kontaktná adresa: Ing. Martin Tomáška, PhD., Výskumný ústav mliekárenský, a.s.; Dlhá 95, Žilina, Slovensko tomaska@vumza.sk 132

133 VÝZNAMNÉ SKUPINY MIKROORGANISMŮ V KRAVSKÉM, KOZÍM A OVČÍM MLÉCE Z RŮZNÝCH FAREMNÍCH CHOVŮ Kalhotka Libor 1, Dostálová Lenka 1, Přichystalová Jitka 1, Šustová Květoslava 2, Velecká Milena 3 1 Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, 2 Ústav technologie potravin, 3 Ústav chovu a šlechtění zvířat, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně Important groups of microorganisms in cow's, goat's and sheep's milk from the various farm's breeding Summary: The aim of this work was to determine extend of microbial contamination of raw milk in individual seasons. Raw milk (6 farms), goat milk (3 farms) and sheep milk (3 farms) were analyzed. Milk was produced on farms of different way of farming and with a different number of milked animals. Samples were regularly taken once per season. In milk, following groups of microorganisms were determined by standard methods: total count of microorganisms (TCM), psychrotrophic microorganisms, Enterobacteriaceae, lactic acid bacteria (lactobacilli), enterococci, aerobic and anaerobic thermoresistant microorganisms (TMRae, TMRan), micromycetes (yeast and moulds). In raw cow milk, these numbers of microorganisms were found: TCM CFU/ml, psychrotrophic microorganisms CFU/ml, Enterobacteriaceae from units up to 10 4 CFU/ml, LAB CFU/ml, enterococci CFU/ml, TMRae and TMRan from units up to 10 4 resp CFU/ml and micromycetes CFU/ml. In goat and sheep milk, counts of microorganisms were: TCM CFU/ml, psychrotrophic microorganisms CFU/ml, Enterobacteriaceae CFU/ml, LAB from units up to 10 5 KTJ/ml, enterococci CFU/ml, TMRae and TMRan from units up to 10 5 CFU/ml and micromycetes from units up to 10 4 KTJ/ml. From the results, evident differences of microbial milk contamination between individual farms and seasons can be seen. Objectively, high counts of microorganisms could be caused by faults of sampling by workers at farms. Thus, microbiological analysis should be repeated in the next seasons not only because of this reason. Úvod Mléko je sekret mléčné žlázy savců určený pro výživu jejich mláďat. Tomu tedy odpovídá i jeho složení, které má zaručit příjem všech nutričně významných látek. Pro průmyslové zpracování a lidskou výživu se využívá především mléko kravské v mnohem menší míře pak také mléko kozí a ovčí. 1 Kozí mléko se v základním složení podobá mléku kravskému, v průměru obsahuje okolo 12,6 % sušiny, 3,4 % bílkovin, 3,8 % tuku, 4,3 % laktosy a 0,8 % minerálních látek. 2 Obsah základních složek s výjimkou laktosy je u ovčího mléka vyšší. 3 Složení a další vlastnosti tedy z mléka činí ideální substrát pro rozvoj kontaminujících mikroorganismů. Mléko od zdravých zvířat obsahuje poměrně malé množství mikroorganismů, které jsou usazeny především ve strukovém kanálku a přecházejí do mléčné cisterny vemene. Počet mikroorganismů v mléce při opuštění vemene bývá 10 1 až 10 3 resp KTJ/ml, v mléce od zvířete s ochablým strukovým svěračem i 10 5 KTJ/ml. Jsou zde zastoupeny bakterie rodu Micrococcus, Enterococcus, koryneformní bakterie, méně často pak například některé stafylokoky. U nemocných zvířat se pak vyskytují např. Streptococcus agalactie, S. dysgalactiae, Staphylococcus aureus, E. coli, Klebsiella aj. 4, 5 Mléko je v průběhu dojení vystaveno sekundární kontaminaci z okolního prostředí, dojicího zařízení, rukou dojiče, vemene aj. 6, 4 Kvalita hygieny mléka má mikrobiologický význam, který se mění, pokud jde o druhy a počty, podle podnebí, počasí, pastvy, laktace, ustájení, zdravotního stavu, vedení stáda atd. Pokud je obsah bakterií příliš nízký, nejen že se poruší patogenní mikroflóra, ale i přirozená nepatogenní, která má výrazný vliv na vlastnosti mléčných výrobků vyrobených ze syrového mléka. 7 Po nadojení musí být mléko uchováváno tak, aby se zamezilo další kontaminaci a rozvoji již přítomných mikroorganismů. Stěžejní význam má především zchlazení mléka. Mléko musí být v případě, že je sváženo každý den, ihned zchlazeno na teplotu nejvýše 8 C, v případě, že svoz není prováděn každý den, zchlazeno na teplotu nejvýše 6 C. Požadavky na chlazení nemusí být dodrženy, je-li mléko zpracováno do 2 h po nadojení nebo je z technologických důvodů souvisejících s výrobou některých výrobků nezbytná vyšší teplota a příslušný orgán ji povolí

134 Kritéria hygienické kvality syrového mléka jsou uvedena v Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 ve znění pozdějších změn. Obsah mikroorganismů při 30 C (na ml) má být v syrovém kravském mléce a v mléce od jiných druhů (klouzavý geometrický průměr za dvouměsíční období, alespoň dva vzorky za měsíc). Pokud je však mléko od jiných druhů zvířat než od krav určeno pro výrobu mléčných výrobků ze syrového mléka postupem, který nezahrnuje tepelnou úpravu, musí mléko obsahovat mikroorganismů na ml. Tato obecně platná kritéria lze doplnit dalšími hodnotami, které vycházejí z ČSN a které se týkají kravského mléka. Počet psychrotrofních mikroorganismů by měl být do v 1 ml, počet termorezistentních mikroorganismů do 2000 v 1 ml, počet koliformních bakterií nejvýše 1000 v 1 ml a sporotvorné anaerobní bakterie by měly být v 0,1 ml negativní. Cílem této práce bylo zjistit míru mikrobiální kontaminace syrového kravského, kozího a ovčího mléka z různých faremních chovů v jednotlivých ročních obdobích. Materiál a metody Vzorky syrového kravského, kozího a ovčího mléka z farem s různým stylem hospodaření a s různým počtem dojených zvířat (Tab. I) byly sterilně odebrány a v chladu dopraveny k mikrobiologickým analýzám. Vzorky byly odebírány vždy jednou za dané roční období s výjimkou farmy Kr6, kde byly vybrané skupiny mikroorganismů sledovány ve více intervalech. V mléce byly standardními postupy stanoveny následující skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů (CPM) na GTK-AB při 30 C za 72 h, psychrotrofní mikroorganismy na GTK při 6,5 C za 10 dní, bakterie č. Enterobacteriaceae na VČŽG při 37 C za 24 h, bakterie mléčného kysání (laktobacily) na MRS ph 5,7 při 37 C za 48 h při anaerobní kultivaci, enterokoky na Slanetz-Bartley agaru (Merck, Germany) při 37 C za 48 h, aerobní a anaerobní termorezistentní mikroorganismy (TMRae, TMRan) po inaktivaci 85 C/10 min. na GTK při 30 C za 72 h a mikromycety (kvasinky a plísně) na GKCH při 25 C za h. Použité živné půdy pocházely od MILCOM - Tábor. Po uplynutí doby kultivace byly odečteny charakteristické narostlé kolonie a výsledek byl po přepočtení vykázán jako KTJ/ml. V rámci dlouhodobého sledování u farmy Kr6 byly na přání zadavatele sledovány bakterie ml. kysání na MRS agaru při 30 C za 72 h aerobně, koliformní bakterie na VRBL agaru a enterokoky na COMPASS Enterococcus agar při 44 C za 24 h, živné půdy pocházely od Biokar Diagnostics, Francie. Tabulka I Charakteristika farem Farma Druh mléka Plemeno Typ chovu Počet dojených zvířat Kr1 kravské HF konvenční 90 Kr2 kravské 80% kříženci na bázi HF konvenční 61 Kr3 kravské Holštýnské černostrakaté konvenční 407 Kr4 kravské HF konvenční 300 Kr5 kravské Český strakatý skot konvenční 15 Kr6 kravské HF konvenční 500 Ko1 kozí Koza bílá krátkosrstá konvenční 131 Ko2 kozí Koza bílá krátkosrstá konvenční 18 Ko3 kozí Kříženci anglonubijské kozy ekologický 20 Ov1 ovčí Lacaune konvenční 83 Ov2 ovčí Východofríská ekologický 11 Ov3 ovčí Lacaune ekologický 100 Kr1 Kr6, Ko1 Ko3 a Ov1 Ov3 jednotlivé farmy, HF - Holštýnsko-fríské plemeno 134

135 Výsledky a diskuse Výsledky mikrobiologických analýz jsou uvedeny v Tabulkách II až IV. Kravské mléko pocházelo z farem s konvenčním způsobem hospodaření. Ustájení skotu je volné boxové s podestýlkou slámy nebo separátu (Kr3) a s dojením na dojírně, pouze farma Kr5 má stání vazné s podestýlkou slámy a dojení probíhá na stání. V syrovém kravském mléce (Tab II) byla zjištěna tato rozpětí počtů mikroorganismů: CPM KTJ/ml, psychrotrofní mikr KTJ/ml, bakterie č. Enterobacteriaceae jednotky až 10 4 KTJ/ml, bakterie mléčného kysání (laktobacily) KTJ/ml, enterokoky KTJ/ml, TMRae a TMRan jednotky až 10 4 resp KTJ/ml, mikromycety KTJ/ml. Tabulka II Počty mikroorganismů ve vzorcích kravského mléka v KTJ/ml Farma Období CPM Lbc. Enterob. Enterok. TMR Psychrotr. Mikromyc. aerob. anaerob. Kr1 zima 1.2 x x x x x 10 2 jaro 8.6 x x x x 10 2 léto 4.6 x x x x x 10 2 podzim 2.4 x x x x průměr 7.7 x x x x x 10 2 Kr2 zima 2.0 x x x 10 2 jaro 7.0 x x x x 10 3 léto 2.7 x x x x 10 2 podzim 4.2 x x x průměr 3.4 x x x x 10 3 Kr3 zima 3.3 x x x x x x 10 3 jaro 1.1 x x x x x 10 3 léto 3.9 x x x x x x 10 2 podzim 4.0 x x x x x x x 10 2 průměr 3.1 x x x x x x x x 10 3 Kr4 zima 1.1 x x x x x x 10 2 jaro 1.1 x x x x 10 2 léto 3.8 x x x x x 10 2 podzim 4.8 x x x x x 10 2 průměr 5.2 x x x x x x 10 2 Kr5 zima 7.0 x x x x 10 2 jaro 7.4 x x x x 10 3 léto 2.7 x x 10 2 ND 1.0 x ND 2.0 x podzim 2.6 x x x x průměr 2.7 x x x x x 10 2 Kr6 zima 7.3 x x x x x x x 10 3 jaro 8.0 x x x x x 10 2 léto 7.0 x x x x x 10 2 podzim 2.2 x x x x x x x 10 2 průměr 5.6 x x x x x x x x 10 3 CPM celkový počet mikroorganismů, Lbc laktobacily, Enterob. - bakt. č. Enterobacteriaceae, Enterok. enterokoky, TMR termorezistentní mikroorganismy aerobní a anaerobní, Psychrotr. psychrotrofní mikroorganismy, Mikromyc. mikromycety, ND - nedetekováno 135

136 Jak se pohybují počty některých skupin mikroorganismů ve sledovaném časovém období v mléce z vybrané farmy (Kr6) ukazuje Tab III. Z výsledků je dobře patrné, že zvláště hodnoty CPM jsou v průběhu celého sledovaného období ustáleny až na výjimky na hodnotách řádově 10 4 KTJ/ml, což odpovídá mikrobiologickým požadavkům. V zářijovém termínu došlo ke zvýšení CPM nad stanovenou mez stejně, jako tomu bylo u vzorků ze stejného období uvedených v Tab II. Z tohoto důvodu také došlo k překročení limitu u průměrné hodnoty za sledované období (viz Tab II). Průměrné hodnoty CPM u ostatních farem splňují předepsané požadavky počtů CPM v 1 ml. Výskyt vyšších počtů CPM v mléce z farem, kde se dojí na stání oproti mléku z farem s volným boxovým stáním a dojením na dojírně, jak jej uvádí literatura 9 se u dosavadních výsledků nepotvrdil. Rovněž vliv sezónnosti na změny v CPM nelze podle zatímních výsledků prokázat. Tabulka III Počty mikroorganismů v kravském mléce z farmy Kr6 v log KTJ/ml Datum CPM BMK Koli Enterok. Psychrotr. Kvasinky Plísně ,56 1,82 2,20 1,63 3,19 2,25 0, ,36 2,20 2,67 1,31 ND 1,75 0, ,46 1,92 2,98 1,72 6,33 1,83 ND ,46 2,55 2,20 1,44 ND 2,18 ND ,10 2,05 2,10 1,40 3,41 2,07 ND ,38 2,28 2,00 1,63 2,70 2,07 ND ,90 2,35 3,79 2,23 4,08 2,10 ND ,53 2,35 2,46 1,60 ND 2,08 ND ,73 2,26 2,21 2,96 4,01 2,56 0, ,27 3,00 3,03 2,51 3,48 2,62 ND ,51 3,43 2,66 1,19 3,52 3,93 2, ,80 3,02 2,58 1,91 2,83 2,28 ND ,23 2,94 2,38 1,35 2,26 2,50 0, ,98 3,10 1,50 1,64 2,13 3,28 ND ,91 2,96 3,57 1,73 3,58 2,54 0, ,66 3,19 3,74 1,57 4,04 1,90 1, ,73 2,60 4,79 2,05 3,35 1,54 1, ,66 3,86 2,29 2,15 3,29 2,20 1, ,79 3,54 2,00 2,10 3,41 3,10 1, ,89 3,69 3,30 2,06 4,03 2,71 1,82 průměr 4,49 2,75 2,72 1,81 2,98 2,38 0,65 Vysvětlivky: CPM celkový počet mikroorganismů, BMK - bakterie mléčného kysání, Koli koliformní bakterie, Enterok. enterokoky, Psychrotr. psychrotrofní mikroorganismy; ND - nedekovatelné Jestliže výsledky analýz naznačují, že mikrobiologická kvalita syrového kravského mléka je na sledovaných farmách na dobré úrovni a technologie získávání je zvládnutá, jinak je tomu u mléka kozího a ovčího (Tab IV). V kozím a ovčím mléce byly zjištěny tyto hodnoty počtů mikroorganismů: CPM KTJ/ml, psychrotrofní mikr KTJ/ml, bakterie č. Enterobacteriaceae od KTJ/ml, bakterie mléčného kysání (laktobacily) jednotky až 10 5 KTJ/ml, enterokoky KTJ/ml, TMRae a TMRan jednotky až 10 5 KTJ/ml, mikromycety jednotky až 10 4 KTJ/ml. Zjištěné hodnoty jsou až na výjimky obdobné jako u dřívějších analýz. 10,11 Patrné jsou zde výrazné rozdíly mezi jednotlivými farmami bez ohledu na to, jestli jde o farmu hospodařící konvenčním způsobem nebo ekologicky. Na výslednou kvalitu mléka zde působí řada faktorů. 4,6,7,9 Vysoké CPM v kozím a ovčím mléce mohou být způsobeny především nedostatky v čištění a sanitaci dojícího zařízení, pokud je používáno, nebo nedostatečnou hygienou při ručním dojení. Významnou roli rovněž může hrát rychlost zchlazení nadojeného mléka a čistota chladících nádob. 136

137 Tabulka IV Počty mikroorganismů ve vzorcích kozího a ovčího mléka v KTJ/ml Farma Období CPM Lbc. Enterob. Enterok. TMR Psychrotr. Mikromyc. aerob. anaerob. Ko1 jaro 2.8 x x x x x x 10 3 léto 2.3 x x x x x x 10 3 podzim 7.0 x x x x x x x 10 2 průměr 1.9 x x x x x x x x 10 3 Ko2 jaro 2.3 x x x x x x x x 10 4 léto 1.1 x x x x x 10 2 podzim 1.1 x x x x x x x 10 3 průměr 1.1 x x x x x x x ,4 x 10 3 Ko3 jaro 7.1 x x x ND 1.2 x x 10 3 léto 2.3 x x x < podzim 1.2 x x x x x x 10 3 průměr 4.0 x x x x x x 10 3 Ov1 jaro 3.8 x x x x x x x 10 4 léto 3.8 x x x x x x 10 4 podzim 5.9 x x x x x x x x 10 4 průměr 3.4 x x x x x x x x 10 4 Ov2 jaro 4.5 x < 10 2 ND x x léto 4.5 x x podzim 8.3 x ND x průměr 1.7 x x x Ov3 jaro 4.5 x x x x x 10 2 léto 1.1 x x x x x x 10 2 podzim 5.2 x x x x x x x x 10 4 průměr 2.2 x x x x x x x x 10 3 Vysvětlivky: viz TabII Velmi zajímavé výsledky byly zjištěny u farmy Ov2 s ekologickým hospodařením. Počty většiny analyzovaných skupin mikroorganismů zde byly výrazně nižší oproti ostatním farmám chovajícím ovce nebo kozy. Závěr Z výsledků analýz vzorků syrového mléka, které ale reprezentují první ucelený rok analýz, jsou patrné rozdíly v mikrobiální kontaminaci mléka mezi jednotlivými farmami i mezi ročními obdobími. Syrové kravské mléko až na výjimky odpovídalo požadavkům vyplývajícím z Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 ve znění pozdějších změn a svědčí o dobře zvládnuté technologii na jednotlivých farmách. Z pohledu mikrobiologických požadavků je naopak problematická produkce syrového kozího a ovčího mléka. Na vysoké počty mikroorganismů je však nutno pohlížet s určitou rezervou, neboť mohly být zapříčiněny chybami při odběru vzorků mléka pracovníky farem. Nejen z tohoto důvodu je nutné v následujících obdobích mikrobiologické analýzy zopakovat. Poděkování Práce vznikla s podporou projektu NAZV KUS QJ

138 Použitá literatura 1. ŠTĚTINA, J. ( 2012): Vlastnosti mléka a jeho základní ošetření. In: Kadlec, P., Melzoch, K., Voldřich, M. (Eds.): Technologie potravin Přehled tradičních potravinářských výrob. Key-Publishing, Ostrava, s , ISBN HERIAN, K. (2008): Ovčie a kozie mliekarstvo na Slovensku. In KUCHTÍK, J., ŠUSTOVÁ, K., FALTA, D., LUŽOVÁ, T. Farmářská výroba sýrů a kysaných mléčných výrobků V. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, s , ISBN KUCHTÍK, J., ŠUSTOVÁ, K., HORÁK, F. (2012): Mléko. In: Horák, F. (Eds.): Chováme ovce. Brázda, Praha, s , ISBN HEJLOVÁ, Š. (1997): Mikrobiologie mléka a mléčných výrobků. In: Cempírková, R., Lukášová, J., Hejlová, Š. (1997). Mikrobiologie potravin. Scriptum JU ZF České Budějovice: 165 p. ISBN GÖRNER, F., VALÍK, Ľ. (2004): Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Malé Centrum, Bratislava, 528 s. ISBN MALÁ, G., ŠVEJCAROVÁ, M., KNÍŽEK, J., PEROUTKOVÁ, J. (2010): Je mikrobiologická kvalita ovčího mléka ovlivněna způsobem dojení? In: Šustová, K., Kuchtík, J., Kalhotka, L., Jůzl, M., Falta, D. Farmářská výroba sýrů a kysaných mléčných výrobků VII. Mendelova univerzita v Brně, s ISBN KALANTZOPOULOS, G. (2003): Kvalita ovčieho a kozieho mlieka z pohľadu IDF. Mliekarstvo 34 č. 4, p JANŠTOVÁ, B. (2013): Kvalita syrového mléka. In: Sýkora, V., Kuchtík, J., Šustová, K. Farmářská výroba sýrů a kysaných mléčných výrobků X. Mendelova univerzita v Brně: s. 7-10, ISBN CEMPÍRKOVÁ, R., SAMKOVÁ, E., VYLETĚLOVÁ, M. (2012): Celkový počet mikroorganismů. In: Vyletělová, E. (Eds.): Mléko: produkce a kvalita. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, s , ISBN KALHOTKA, L., ŠUSTOVÁ, K., HŮLOVÁ, M., PŘICHYSTALOVÁ, J. (2013): Important groups of microorganisms in raw goat milk and fresh goat cheeses determined during lactation. The Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. sv. 2, č. 5, s ISSN URL: KALHOTKA, L., PŘICHYSTALOVÁ, J., DOSTÁLOVÁ, L., ŠUSTOVÁ, K., KRÁLÍČKOVÁ, Š. (2013): Mikroflóra kozího mléka z konvenčního a ekologických chovů v průběhu laktace. In: 26. Kongres Československé společnosti mikrobiologické. Praha-Bratislava: Československá společnost mikrobiologická, s ISBN Kontaktní adresa: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, xkalhotk@node.mendelu.cz 138

139 SÚ SYRY ZO SUROVÉH MLIEKA BEZPEČNÉ? Medveďová Alžbeta, Studeničová Adriana, Mančušková Tatiana, Valík Ľubomír, Veronika Ferenčíková Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, STU Bratislava, Slovenská republika Are cheeses from raw milk safe? Summary: Changes in microbial quality of lump cheeses manufactured from raw ewes milk or cows milk from milk vending machines were studied throughout 7 days of fermentation at 18 C or 15 C, for ewes and cows milk in order. The density of lactic acid bacteria (LAB), Staphylococcus aureus and Escherichia coli were determined, continuously. Also the ph value dynamic was analyzed at the same time intervals. All together, 8 cows cheeses were prepared from two different vending machines in summer and in winter and 2 ewes cheeses without and 4 ewes cheeses with addition of lactic acid bacteria culture. Based on the results, growth dynamic of all microorganisms as well as the ph value decrease was slower in cheeses made in winter. No significant differences were observed in the maximal counts of microorganisms related to the season. However, the counts of S. aureus in 88 % of cheeses exceeded the EU limit of 10 4 CFU.g -1, probably due to the slow ph value descent. Also the Slovak Food Codex limit for E. coli maximal density of less than 10 4 CFU.g -1 was significantly exceeded. On the other hand, the addition of a starter culture resulted in fast ph value decrease down to 5.0 during first hours of fermentation and the EU and Slovak limits were in compliance for both studied microbial contaminants. Results suggest that raw milk cheeses can be made only if the HACCP standards are fulfilled and the proper addition of active LAB are presented to keep undesirable S. aureus and E. coli under control. Chov oviec, rovnako ako aj produkcia ovčieho mlieka predstavujú na Slovensku tradičné odvetvie v poľnohospodárstve. S ohľadom na zachovanie národných tradícií sa surové ovčie mlieko používa na výrobu ovčieho hrudkového syra, ako medziproduktu na výrobu slovenského tradičného syra bryndze, ktorá má štatút chráneného výrobku. Navyše dopyt konzumentov po minimálne opracovaných potravinách so sebou priniesol aj rozmach mliečnych automatov na predaj surového kravského mlieka, pričom však ale väčšina konzumentov nerešpektuje jeho špecifické riziká. Medzi potenciálne patogénne, hygienicky a technologicky nežiaduce druhy bežne prítomné v surovom mlieku patria okrem iných aj Staphylococcus aureus a Escherichia coli. Oba sú slabí kompetitítori a ich rast je často obmedzený inými mikroorganizmami, predovšetkým baktériami mliečneho kysnutia (BMK). Dôvody pre slabý rast oboch testovaných mikroorganizmov v prítomnosti BMK sú produkcia organických kyselín (pokles ph), utilizácia kyslíka kompetitívnymi mikroorganizmami (pokles redoxného potenciálu), zníženie nutričných faktorov a produkcia špecifických antimikrobiálnych faktorov 1,2. Asperger a Zangerl 3 udávajú, že v prípade infikovaného vemena, je S. aureus exkrétovaný do mlieka, kde jeho počty varírujú od KTJ/ml, zvyčajne však v počtoch 10 4 KTJ/ml. Podľa Valíka a kol. 4 sa v dobre nadojenom mlieku môže vyskytovať v počtoch medzi 100 až 200 KTJ/ml. Hoci väčšina kmeňov neprodukuje enterotoxíny, sú aj také, ktoré ich produkujú a vyvolávajú stafylokokové enterotoxikózy. Preto je nevyhnutné zabrániť spracovávaniu surovín kontaminovaných S. aureus, nakoľko aj keď jeho bunky môžu byť usmrtené, termostabilné enterotoxíny prekonávajú pasterizačné ošetrenia. V ostatnom čase boli Európskou úniou 5 definované kritériá hygieny procesu pre jeho počty, v syroch vyrábaných zo surového mlieka (n = 5, c = 2, m = 10 4 a M = 10 5 KTJ/g). Tieto štandardy môžu byť splnené, len ak sa dodržujú pravidlá správnej výrobnej praxe na farmách a mlieko na výrobu syrov sa okamžite schladí alebo ihneď spracováva 1,2,3. V potravinárskej praxi je E. coli kontaminantom, ktorý znehodnocuje viaceré potravinárske produkty. Pri výrobe syrov s nízko-dohrievanou syrovinou (pri 36 až 40 C) fermentáciou zbytkovej laktózy vyvoláva ich skoré nadúvanie. Niektoré toxinogénne kmene E. coli sa dokážu prichytiť na nerezových povrchoch technologických zariadení. Krížovou kontamináciou počas výroby alebo manipulácie s potravinami vstupujú napríklad shiga-toxín produkujúce kmene do 139

140 potravinového reťazca 9,10,11. Pasterizačné a sterilizačné teploty E. coli devitalizujú, naopak chladenie rast E. coli iba spomalí. Technológie používané pri spracovaní mlieka, napríklad zrecie procesy, počet E. coli čiastočne znižujú. Podľa Burdovej a Laukovej 9, zníženie aktívnej kyslosti ph pod 5,0, rast a rozmnožovanie E. coli obmedzuje až zastavuje. V súvislosti so spracovaním surového mlieka bolo cieľom našej práce kvantitatívne a kvalitatívne popísať rast a prežívanie potenciálne patogénnych mikroorganizmov, Staphylococcus aureus a Escherichia coli počas výroby a skladovania ovčích hrudkových syrov (pri teplote 18 C), sudovaných ovčích syrov (pri teplote 12 C), ale aj syrov vyrobených zo surového kravského mlieka (pri teplote 15 C) z automatov na jeho predaj. Analýza vplyvu prídavku zákysovej kultúry baktérií mliečneho kysnutia na dynamiku rastu S. aureus a E. coli v syroch vyrábaných zo surového ovčieho mlieka V dobre vykysnutom ovčom hrudkovom syre je rozmnožovanie a prípadná tvorba stafylokokových enterotoxínov potlačená fermentačným metabolizmom BMK. Na zabezpečenie správneho kysnutia nemá, podľa Görnera a Valíka 10 a Heriana 11, počas zrenia hrudkového syra po zasyrení mlieka klesnúť priemerná vnútorná teplota syreniny pod 18 C. Syry sme vyrobili v laboratórnych podmienkach bez alebo s prídavkom rôznych zákysových kultúr baktérií mliečneho kysnutia a následná fermentácia prebiehala pri teplote 18 C. Obr. 1. Dynamika rastu baktérií pri 18 C v syroch vyrobených zo surového ovčieho mlieka s bez prídavku (1a) a s prídavkom zákysovej kultúry baktérií mliečneho kysnutia (1b) V syroch vyrobených bez prídavku zákysových kultúr (obr. 1a) sa počiatočné predpokladané počty mliečnych kokov (Pr LC; stanovené na M17 agare) a paličiek (Pr LB; stanovené na MRS agare) pohybovali na úrovni nižšej ako 5 log poriadkov (tab. 1). Napriek tomu, že sa začali množiť bez lag fázy ich metabolizmus, vyjadrený poklesom hodnoty ph, bol menej výrazný a hodnota ph začala klesať až po približne 1 dni fermentácie. Takého podmienky predstavovali priaznivé prostredie pre rast nežiaducich kontaminantov, ktoré v v stacionárnej fáze dosiahli počty vyššie 10 6 KTJ/g, čo v prípade S. aureus môže predstavovať potenciálne riziko produkcie stafylokokových enterotoxínov zodpovedných za vyvolanie alimentárnych intoxikácií. Na druhej strane, prídavkom aktívnej zákysovej kultúry (obr. 1b) sa počty BMK po výrobe syre pohybovali na hodnotách vyšších ako 5 log poriadkov. Navyše, hodnota ph začala klesať po 1,5 h a už po 24 h dosiahla hodnoty nižšie ako ph 5,0. A hoci rastová rýchlosť S. aureus a E. coli bola v syroch s prídavkom BMK vyššia (tab. 1), oba mikrobiálne druhy boli schopné rásť, len kým hodnota ph nedosiahla kritickú hodnotu ph 5,0. To v konečnom dôsledku viedlo aj k nižším konečným počtom nežiaducich mikroorganizmov v stacionárnej fáze, kde v oboch prípadoch bola 140

141 ich koncentrácia nižšia ako 4 log poriadky, ktoré sú požadované legislatívnymi hygienickými smernicami, tak európskymi, ako aj slovenskými. Možno teda konštatovať, že dostatočný prídavok aktívnej kultúry BMK vedie k inhibícii rastu nežiaducich mikroorganizmov počas výroby ovčích hrudkových syrov zo surového mlieka. Rýchly pokles aktívnej kyslosti na hodnoty nižšie ako ph 5,0 zohral významnú úlohu v parciálnej inhibícii rastu S. aureus a E. coli v mlieku, pričom ich konečné denzity dosahovali počty rovné alebo nižšie ako 10 4 KTJ/g. Tabuľka I Rastové parametre baktérií v syroch uchovávaných pri 18 C vyrobených zo surového ovčieho mlieka s prídavkom zákysovej kultúry BMK (n = 4) a bez prídavku kultúry (n = 2) Gr (log KTJ.ml -1.h -1 ) lag (h) N 0 (logktj/g) N max (logktj/g) STA 0,051 ±0, ,49 ±1,60 4,33 ±1,58 EC 0,205 ±0, ,31 ±1,27 4,99 ±1,69 Pr LC 0,406 ±0, ,85 ±0,33 8,17 ±0,81 Pr LB 0,340 ±0, ,22 ±0,66 7,43 ±0,35 ph -0,081 ±0,128 24,7 ±22,7 6,49 ±0,06 5,18 ±0,08 STA + BMK 0,078 ±0, ,00 ±1,18 3,83 ±0,90 EC + BMK 0,213 ±0, ,36 ±1,29 3,96 ±1,53 Pr LC + BMK 0,208 ±0, ,40 ±1,24 7,50 ±0,31 Pr LB + BMK 0,219 ±0, ,34 ±1,30 7,65 ±0,86 ph+ BMK -0,119 ±0,069 1,5 ±2,9 6,43 ±0,21 5,04 ±0,18 Prežívanie S. aureus a E. coli v sudovanom ovčom hrudkovom syre S cieľom zistiť osud potenciálne patogénnych druhov S. aureus a E. coli v sudovaných ovčích hrudkových syroch, sme zámerne sudovaný syr naočkovali týmito mikrobiálnymi druhmi na koncentrácie vyššie ako 5 log poriadkov, ktoré by mohli byť dosiahnuté v prípade pomalej a nedostatočnej acidifikácie syra počas prvých hodín fermentácie. Ako je na obr. 2 zrejmé, oba mikrobiálne druhy v sledovanej matrici začali ihneď odumierať, rýchlosťou uvedenou v tab. 2, pričom sudovka I pozostáva z ovčích hrudkových syrov len z jedného salaša a sudovka II je zmesou syrov z troch rôznych salašov. Obr. 2. Dynamika odumierania S. aureus 2064 (2a) a E. coli BR (2b) v sudovaných ovčích syroch pri 12 C 141

142 Dynamika odumierania S. aureus sudovke I prebiehala rýchlosťou -0,00126 KTJ. g -1.h -1, pričom ešte aj po takmer 85 dňoch bol S. aureus prítomný v množstve 2,2 log poriadku. Na druhej strane, v sudovke II bol pozorovaný až 4-násobne intenzívnejšie odumieranie študovaného izolátu 2064, čo spôsobilo výraznejší pokles počtov životaschopných buniek a už po približne 28 dňoch od začatia pokusu sa množstvo S. aureus 2064 znížilo na 2,3 log poriadku a o 48 h neskôr už neboli zaznamenané žiadne vyrastené kolónie na selektívnom Baird-Parkerovom agare. Pri analýze sledovania dynamiky poklesu izolátu E. coli v sudovke II sa z počiatočných počtov N 0 = 1, KTJ/g po približne 54 dňoch inkubácie dosiahlo zníženie počtu živých buniek o 4 log poriadky. Na rozdiel od sudovaného syra I bol priebeh odumierania približne 2-násobne rýchlejší, pričom hodnota rastovej rýchlosti nadobudla v tejto vzorke za daných podmienok kultivácie hodnotu G R,EC = -0,00247 KTJ.h -1.g -1. V sudovke I sa počty E. coli z počiatočných počtov N 0 = 2, KTJ/g znížili o 3 logaritmické poriadky približne za 94 dní. Na základe získaných výsledkov možno konštatovať, že aj pri zámernej inokulácii hygienicky a zdravotne nežiaducich kontaminantov, akými sú E. coli a S. aureus je prostredie sudovaného syra natoľko nepriaznivé, že sa tieto mikroorganizmy nedokážu tomuto prostrediu prispôsobiť a začnú v ňom odumierať aj bez predchádzajúcej lag fázy. Navyše, heterogénnejšie zastúpenie BMK a tým aj pravdepodobne širšia škála antimikrobiálnych produktov ich metabolizmu výraznejšie prispeli k inhibícii sledovaných mikroorganizmov v sudovanom syre II, ktorý pochádzal z troch rôznych fariem. Tabuľka II Rastové parametre S. aureus 2064 a E. coli BR v sudovaných ovčích syroch pri 12 C Gr (log KTJ.g -1.h -1 ) lag (h) N 0 (log KTJ/g) STA sudovaný syr I -0, ,1 5,08 STA sudovaný syr II -0, ,9 5,10 EC sudovaný syr I -0, ,1 5,94 EC sudovaný syr II -0, ,9 5,88 Analýza vplyvu ročného obdobia na mikrobiologickú kvalitu syrov vyrábaných zo surového kravského mlieka z mliečnych automatov Pri analýze syrov vyrobených zo surového kravského mlieka z mliečnych automatov (a bez prídavku akejkoľvek zákysovej kultúry BMK) v závislosti od ročného obdobia sa ukázalo, že počiatočné počty natívne prítomných mliečnych kokov (Pr LC) a paličiek (Pr LB) neboli determinované ročným obodobím a dosahovali približno rovnaké počiatočné denzity. Na druhej strane však bol ich metabolizmus aktívnejší v letnom období, čo dokumentuje rýchlejší pokles hodnoty ph a navyše boli schopné pomnožiť sa na vyššie maximálne počty (tab. III). Avšak ich kyselinotvorná aktivita nebola natoľko výrazná, aby hodnota ph poklesla počas prvých najkritickejších 6 h fermentácie na úroveň ph 5,0. Naopak, lag fáza ph trvala približne 1 deň, bez ohľadu na ročné obodobie, a potrebná kyslosť zabezpečujúca inhibíciu nežiaducich druhov bola dosiahnutá v letných mesiacoch až po približne 2 dňoch a v zimných mesiacoch dokonca až po 4 dňoch fermentácie syrov pri teplote 15 C. Táto teplota bola zvolená na základe verejne dostupných odporúčaní 12 pre spracovanie surového mlieka z mlienčych automatov. Možno ale predpokladať, že pri teplote 18 C, ktorá je odporúčaná ako minimálna teplota počas kysnutia syrov 10,11 by rast BMK bol intenzívnejší a hodnota ph by kritické hodnoty dosiahla skôr. Práve z uvedených dôvodov sa S. aurues a rovnako tak aj E. coli dokázali pomnožiť až na koncentrácie vyššie ako 4 log poriadky, ktoré sú požadované pre S. aureus podľa Nariadenia EÚ a pre E. coli podľa Potravinového kódexu SR. Napriek tomu, že počty S. aureus v surovom mlieku legislatívne limity ešte neporušili (dáta nie su prezentované), počas výroby a prvých hodín kysnutia sa jeho počty zvýšili až tak, že S. aureus prekročil v syroch vyrobených v zimných mesiacoch (obr. 3a) hranicu 10 4 KTJ/g už po 12 h kysnutia a v syroch vyrobených v lete po 36 h. Z počiatočných 142

143 počtov E. coli na obr. 3a a 3b je tiež zrejmé, že ani v jej prípade surové mlieko nebolo považované za hygienicky neakceptovateľné, avšak kvôli pomalému rastu BMK a ich slabej acidifikačnej schopnsti mohla E. coli prekročiť legislatívnu hranicu v letných syroch ešte rýchlejšie ako S. aureus, po 12 h a po rovnakej dobe aj v syroch vyrobených v zime. Obr. 3. Dynamika rastu baktérií pri 15 C v syroch vyrobených z letného (3a) a zimného (3b) surového kravského mlieka z automatov Tabuľka III Rastové parametre baktérií v syroch uchovávaných pri 15 C vyrobených z letného (n = 4) a zimného (n = 4) surového kravského mlieka z automatov Gr (log KTJ.g -1.h -1 ) lag (h) N 0 (log KTJ/g) N max (log KTJ/g) STA - zima 0,046 ±0, ,34 ±0,74 4,40 ±0,78 EC zima 0,100 ±0, ,75 ±1,36 7,02 ±0,54 Pr LC zima 0,073 ±0, ,01 ±0,35 7,98 ±0,55 Pr LB zima 0,064 ±0, ,66 ±0,14 7,68 ±1,05 ph- zima -0,029 ±0,008 26,8 ±7,8 6,68 ±0,14 5,31 ±0,08 STA - leto 0,035 ±0, ,68 ±0,22 5,22 ±0,41 EC leto 0,291 ±0, ,53 ±1,04 6,61 ±0,88 Pr LC leto 0,107 ±0, ,52 ±0,67 8,73 ±0,14 Pr LB leto 0,132 ±0, ,63 ±0,55 8,31 ±0,30 ph- leto -0,066 ±0,031 22,3 ±1,4 6,62 ±0,01 5,09 ±0,12 Získané výsledky poukázali na skutočnosť, že surové mlieko z mliečnych automatov je do 48 h vhodné na ďalšie spracovanie, avšak jeho nevyhnutnou súčasťou musí byť teplotné opracovanie. Táto podmienka je doložená výsledkami mikrobiologickej analýzy dynamiky rastu S. aureus a E. coli v syroch vyrobených zo surového mlieka, v ktorých boli počty S. aureus vyššie ako limit definovaný nariadením EÚ č. 1441/2007 (10 4 KTJ/g) v 88 % syrov a počty E. coli boli nad limitom stanoveným Potravinovým kódexom SR (10 4 KTJ/g) vo všetkých vzorkách syrov. 143

144 Záver V závislosti od ročného obdobia bola popísaná dynamika rastu hygienicky a zdravotne nežiaducich Staphylococcus aureus a Escherichia coli vzhľadom na rastové a metabolické vlastnosti natívne prítomných alebo zámerne inokulovaných baktérií mliečneho kysnutia počas výroby a 7 dňového kysnutia syrov vyrobených zo surového mlieka skladovaných pri rôznych teplotách fermentácie. Na základe získaných výsledkov sme definovali podmienky rastu patogénnych mikroorganizmov a definovali sme podmienky, za ktorých je možné minimalizovať riziko produkcie zdravotne nežiaducich metabolitov a zabrániť tak vzniku alimentárnych ochorení z konzumácie tradičných slovenských mliečnych výrobkov. Na základe prezentovaných výsledkov možno tiež konštatovať, že hygienicky a zdravotne bezpečné syry vyrobené zo surového mlieka musia byť vyrobené nielen z kvalitných surovín, ale počas ich výroby sa musia dodržiavať zásady správnej výrobnej a hygienickej praxe. Navyše prídavkom dostatočného množstva aktívnej kultúry baktérií mliečneho kysnutia sa podporí rast a metabolická aktivita natívne prítomných BMK, čím sa zabezpečí dostatočný inhibičný potenciál voči nežiaducim mikroorganizmom bežne sa vyskytujúcim v surovom mlieku. Poďakovanie: Práca bola podporená Agentúrou pre vedu a výskum APVV a grantom MŠ SR VEGA č. 1/0495/13. Použitá literatura: 1. JAY, J.M. Staphylococcal Gastroenteritis. In JAY, J.M. Modern Food Microbiology. 6th ed., Gaithersburg: Aspen Publisher, Inc., 2000, vol. 23. ISBN X, p BAIRD-PARKER, T.C. Staphylococcus aureus. In LUND, B.M. - BAIRD-PARKER, T.C. - GOULD, G.W.: The Microbiological Safety and Quality of Food. Gaithersburg: Aspen Publishers, Inc., 2000, vol. 1, p ASPERGER, H. - ZANGERL, P. Staphylococcus aureus. In ROGINSKI, H., FUQUAY, J.W., FOX, P.F.: Encyclopedia of Dairy Science. San Diego: Academic Press, 2002, vol. 4, p VALÍK, Ľ., GÖRNER, F., SONNEVELD, K., POLKA, P. Faktory ovplyvňujúce fermentáciu ovčieho hrudkového syra na salaši. In ŠTĚTINA, J., ČURDA, L.: Celostátní přehlídky sýrů, 2004: Výsledky přehlídek a sborník přednášek semináře Mléko a sýry Praha: Česká společnost chemická, 2004, s ISBN Nariadenie komisie (ES) č. 1441/2007 o mikrobiologických kritériách pre potraviny. 6. GÖRNER, F., VALÍK, Ľ. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé Centrum, ISBN RIVAS, L., FEGAN, N., DYKES, G.A. Attachment of Shoga toxigenic Escheriachia coli to stainless steel. In International Journal of Food Microbiology, vol. 115, 2007, no. 3, p LIM, S.K., LEE, H.S., NAM, H.M. et al. Antimicrobial resistence observed in Escherichia coli strains isolated from fecal samples of cattle and pigs in Korea during In International Journal of Food Microbiology, vol. 115, 2007, p BURDOVÁ, O., LAUKOVÁ, A. Zdravotná neškodnosť mlieka a mliečnych výrobkov. In Mliekarstvo, roč. 32, 2001, č. 1, s GÖRNER, F., VALÍK, Ľ. Mikrobiologické a technologické otázky výroby ovčieho hrudkového syr a bryndze. In Mliekarstvo, roč. 33, 2002, č. 4, s HERIAN, K. Zásady správnej výroby ovčích hrudkových syrov. In Mliekarstvo, roč. 33, 2002, č. 1, s Kontaktní adresa: Ing. Alžbeta Medveďová, PhD., Odd. výživy a hodnotenia potravín, FCHPT STU v Bratislave, Radlinského 9, Bratislava, Slovenská Republika 144

145 TECHNOLOGICKY RIZIKOVÉ MIKROORGANISMY V BÍLÝCH SÝRECH A SOLNÝCH NÁLEVECH Šviráková Eva 1, Chramostová Jana 3, Mühlhansová Andrea 1, Purkrtová Sabina 2, Jebavá Iva 1, Němečková Irena 3 1 Ústav mléka, tuků a kosmetiky, 2 Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT v Praze 3 Výzkumný ústav mlékárenský, s.r.o. Technologically risky microorganisms in white cheeses and salt brines Summary The most common microbial contaminants of white cheese and salt brines present mainly halotolerant bacteria, yeast and fungi causing frequent changes of pure milk cheese flavour and turbidity and odour of salt brines. This work was focused on the detection of technologically risky microorganisms originated from white cheeses and salt brines by use of conventional polymerase chain reaction and plate method. The presence of predicted enterococci, bacilli or spores of Clostridium tyrobutyricum, using the polymerase chain reaction, was not demonstrated in tested samples, although plate method confirmed the presence of Clostridium sp. The contamination of tested samples was caused by other technologically risky microorganisms; apparently by psychrotrophic bacteria, yeasts or moulds with proteolytic and lipolytic activities, due to the present specific odour and the results of microbiological analyses. The future identification will be explored with the help of extending genera and species spectrums of microorganisms detectable by polymerase chain reaction. The results of this work may be applicable in practice closely linked to improving the quality of dairy products and raw materials, including maintaining the level of production standard, using appropriate identification methods of microbial agent defects. Úvod V technologii výroby bílých sýrů 1 je možné setkat se s nejrůznějšími problémy, které mohou mít za následek snížení jakosti sýrů, včetně solných nálevů. Mezi nejčastější mikrobiální kontaminanty bílých sýrů patří především halotolerantní bakterie, dále také plísně a kvasinky, způsobující často změnu čistě mléčné chuti a u solných nálevů se podílející na vzniku zákalu a zápachu. V těchto mikrobiálně heterogenních ekosystémech může být obtížné identifikovat přítomné mikroorganismy kultivačními metodami, z důvodů existence tzv. nekultivovatelných mikroorganismů, kterých je obecně většina. Alternativním řešením je použití moderních molekulárně-biologických metod umožňující eliminaci kultivačních kroků klasické mikrobiologické plotnové metody. Cílem této práce bylo pomocí konvenční metody polymerázové řetězové reakce (PCR) detekovat a identifikovat vybrané technologicky rizikové mikroorganismy, vyskytující se v bílých sýrech a v solných nálevech, ve vazbě na případné mikrobiální vady. Metoda PCR byla vybrána z důvodu snadné proveditelnosti a nízkých finančních nákladů a byla doplněna o kultivační plotnovou metodu. Materiál a metody Vyšetřované vzorky Pro experimenty bylo vybráno 6 bílých sýrů (SZ), tři solné nálevy standardní (ND), 6 solných nálevů nestandardních (NZ); vše: vzorky z mlékárenského provozu. Detailní výčet vzorků je uveden v Tab. I. Kultivační podmínky mikroorganismů izolovaných ze vzorků Kultivační podmínky testovaných mikroorganismů izolovaných z nestandardních solných nálevů bílých sýrů jsou specifikovány v Tab. II. 145

146 Tabulka I Vyšetřované vzorky standardních a nestandardních solných nálevů bílých sýrů Označení vzorku nálevu Stav vzorku nálevu Charakteristika nálevu ND 1.2 Dobrý Solný nálev nevykazující ND 2.2 Dobrý mikrobiální/ senzorické změny ND 3.2 Dobrý NZ 1.2 Zkažený Solný nálev vykazující NZ 2.2 Zkažený mikrobiální/ senzorické změny NZ 3.2 Zkažený NZ 4.2 NZ 5.2 NZ 6.2 Zkažený Zkažený Zkažený Tabulka II Kultivační podmínky mikroorganismů izolovaných z nestandardních solných nálevů bílých sýrů Mikroorganismus Kultivační podmínky Literatura CPM s rozlišením acidogenních MO a alkaligenních MO Agar GTK AB 30 o C, 72 h, aerobně ČSN EN ISO 4833 (2003) 2 MILCOM a.s. (2014) 3 MO z čeledi Enterobacteriaceae Agar VČŽG 37 o C, 24 h, aerobně ČSN ISO (2006) 4 Halotolerantní MO Agar MSA 37 o C, h, aerobně Marshall (1993) 5 Sporulující anaerobní MO Agar RCM 37 o C, 72 h, anaerobně MILCOM a.s. (2013) 6 Kvasinky a plísně Agar GKCH 25 o C, 3 5 dnů, aerobně ČSN ISO 6611 (2009) 7 MO mikroorganismus, CPM celkový počet aerobních a fakultativně anaerobních mikroorganismů Mikrobiologický skríning mikroorganismů izolovaných ze vzorků Pro mikrobiologický skríning mikroorganismů izolovaných z vyšetřovaných vzorků byla použita plotnová metoda (ČSN EN ISO 7218, 2008) 8. Izoláty byly uloženy ve Sbírce bakterií, kvasinek a plísní (Zkušební laboratoř Ústavu biochemie a mikrobiologie při Ústavu biochemie a mikrobiologie FPBT, VŠCHT Praha). 146

147 Izolace DNA z testovaných vzorků Pro izolaci DNA z testovaných vzorků nyl použit laboratorní test DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, SRN). U solných nálevů (10 ml) byla DNA izolována jednak z pelet buněk po enzymatické lyzi (40 mg.ml -1 lysozymu; 20mM Tris-HCl; ph 8,0; 0,2 mm EDTA; 1,2 % Triton X-100), jednak přímo ze supernatantů. Obě frakce byly získány po odstředění (9000 ot.min -1, 15 min, 4 o C). Kvantifikace DNA izolované z testovaných vzorků Koncentrace DNA, izolovaná z testovaných frakcí z pelet buněk a ze supernatantů, byla stanovena na spektofotometru Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc., USA). Detekce mikroorganismů konvenční metodou PCR Pro detekci vybraných mikroorganismů byly použity specifické primery. V mixu PCR byly použity specifické primery společně se směsí HOT FIREPol EvaGreen qpcr Mix (SolisBiodyne, Estonsko). Amplifikace byla uskutečněna za pomocí real-time PCR cycleru CFX96 (Bio-Rad). Výsledky V Tab. III jsou uvedeny výsledky z mikrobiologických rozborů nestandardních solných nálevů (NZ) a bílých sýrů (SZ). Výsledky představují průměr ze dvou uskutečněných měření. V Tab. IV jsou uvedeny výsledky kvantifikace DNA izolované z různých frakcí vybraných nestandardních solných nálevů (10 ml) bílých sýrů. Výsledky představují průměr ze třech uskutečněných měření. V Tab. V jsou uvedeny specifické primery pro detekci mikroorganismů v nestandardních solných nálevech bílých sýrů. 147

148 Tabulka III Skríning mikroorganismů (MO) vyskytujících se v nestandardních solných nálevech (NZ) a bílých sýrech (SZ) Označení Počet mikroorganismů (MO) [KTJ ml -1 nálevu/ KTJ g -1 sýru] Acidogenní Alkaligenní MO z čeledi Halotolerantní Vzorku MO MO Enterobacteriaceae MO NZ 1.2 < 4, < 1,0 x 10 2 < 1,0 x , ** 1, * NZ 2.2 8, < 1, < 1, < 1, ** NZ 3.2 < 1, < 1, < 1, < 4, ** NZ 4.2 < 1, < 1, < 1, < 4, ** 7, * NZ 5.2 < 1, < 1, < 1, , * NZ 6.2 2, < 1, < 1, < 4, ** 8, * SZ 1.1 8, < 4, < 1, < 4, ** SZ 2.1 1, < 1, < 1, < 1, ** SZ 3.1 < 4, < 1, < 1, , ** 9, * SZ 4.1 < 4, < 1, < 1, < 4, ** 3, * SZ 5.1 5, < 1, < 1, < 4, ** 2, * SZ 6.1 1, < 1, < 1, < 4, ** * růžové kolonie (bez fermentace manitolu), ** žluté kolonie (fermentace manitolu)... růžové kolonie (Lactobacillus sp., Streptococcus sp.),... žluté kolonie (Clostridium sp.) Klostridie Kvasinky Plísně 3, < 1, < 1, , < 1, < 1, , < 1, < 1, , < 1, < 1, , < 1, < 1, , < 1, < 1, < 4, , < 4, , < 4, , < 4, , < 4, , < 4, , < 1, < 1, < 1, < 1, < 1, < 1, < 1, < 1, < 1, < 1, < 1, < 1,0 10 1

149 Tabulka IV Kvantifikace DNA izolované z různých frakcí vybraných nestandardních solných nálevů (10 ml) bílých sýrů Vzorky NZ 1.2 NZ 2.2 NZ 4.2 NZ 6.2 c DNA [ng.μl -1 ] Buňky - pelet 32,2 27,9 13,4 11,4 Supernatant 125,5 103,8 149,0 167,8 Tabulka V Specifické primery pro detekci mikroorganismů v nestandardních solných nálevech bílých sýrů Mikroorganismus Primery Sekvence 5-3 Literatura Enterococcus sp. Enterococcus faecalis Enterococcus faecium ENT1 ENT2 FL1 FL2 FM1 FM2 TACTGACAAACCATTCATGATG AACTTCGTCACCAACGCGAAC ACTTATGTGACTAACTTAACC AATGGTGAATCTTGGTTTGG GAAAAAACAATAGAAGAATTAT TGCTTTTTTGAATTCTTCTTTA Jackson et al. (2004) 9 BAC-F* GCTGGTTAGAGCGCACGCCTGATA Němečková Bacillus sp. BAC-R* CATCCACCGTGCGCCCTTTCTAAC et al. (2011) 10 Clostridium CT1F AACTGAAACAGCATGACT Herman et al. tyrobutyricum (1995) 11 (spory) CT1R GCTTGACCTTTATCTACA * Navrh primerů: Solichová K. & Šviráková E. (Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT Praha), Vohánka J. (Roche s.r.o., Praha) Závěr Ve vyšetřovaných vzorcích nestandardních solných nálevů a bílých sýrů nebyla metodou PCR prokázána přítomnost predikovaných enterokoků, bacilů ani spor Clostriduim tyrobutyricum, přestože plotnová metoda přítomnost Clostridium sp. potvrdila. Na kontaminaci sýrů a nálevů se podílely jiné, technologicky rizikové, mikroorganismy - zřejmě psychrotrofní bakterie, kvasinky nebo plísně s proteolytickou lipolytickou aktivitou, a to vzhledem k přítomnému specifickému zápachu a k výsledkům mikrobiologických rozborů. Identifikace technologicky rizikových mikroorganismů budou předmětem dalšího zkoumání s rozšířením rodového a druhového spektra mikroorganismů detekovatelných metodou PCR. Výsledky této práce mohou být aplikovatelné v praxi v úzké vazbě na zvyšování jakosti mlékárenských výrobků a surovin, včetně zajišťování úrovně výrobního standardu, za pomoci vhodných identifikačních metod mikrobiálních původců vad. Poděkování Tato práce vznikla za finanční podpory Národní agentury pro zemědělský výzkum (NAZV), Komplexní udržitelné systémy v zemědělství , projektu QJ Systémy jištění kvality a bezpečnosti mlékárenských výrobků vhodnými metodami aplikovatelnými v praxi. 149

150 Použitá literatura 1. CODEX ALIMENTARIUS: Codex group standard for cheeses in brine - Codex Stan , Milk and milk products, 3.vydání, s , ČSN EN ISO 4833 (560083): Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda pro stanovení celkového počtu mikroorganismů - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 C. ČNI, Praha MILCOM a.s.: Živné půdy k mikrobiologickým rozborům (polotuhé), staženo ČSN ISO (560096): Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metody pro průkaz a stanovení počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae - Část 2: Technika počítání kolonií. ČNI, Praha Marshall R.T.: Standard Methods for the Microbiological Examination of Dairy Products (Marshall, R.T., ed.), 16.edice. American Public Health Association, Washington MILCOM a.s.: Technický list: Živná půda RCM. MILCOM a.s., závod Tábor, aktuální vydání ČSN ISO 6611 ČSN ISO 6611: Mléko a mléčné výrobky - Stanovení počtu jednotek vytvářejících kolonie kvasinek a/nebo plísní - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 25 C. ČNI, Praha ČSN EN ISO 7218 ( ): Mikrobiologie potravin a krmiv. Všeobecné požadavky a doporučení pro mikrobiologické zkoušení. ČNI, Praha JACKSON C.R., FEDORKA-CRAY P.J., BARRETT J.B.: Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. Journal of Clinical Microbiology 42, (2004). 10. NĚMEČKOVÁ I., SOLICHOVÁ K., ROUBAL P., UHROVÁ B., ŠVIRÁKOVÁ E.: Methods for detection of Bacillus sp., B. cereus, and B. licheniformis in raw milk. Czech Journal of Food Sciences 29, Special Issue, S55 - S60 (2011). 11. HERMAN L., DE BLOCK J., WAES G.M.: A direct PCR detection method for Clostridium tyrobutyricum spores in up to 100 millilitres of raw milk. Applied and Environmental Microbiology 61, (1995). Kontaktní adresa Ing. Eva Šviráková, Ph.D., Ústav mléka, tuků a kosmetiky, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6, , eva.svirakova@vscht.cz 150

151 ANTIMIKROBIÁLNÍ ÚČINKY LEVANDULOVÉ SILICE NA MIKROORGANISMY OBSAŽENÉ V KOZÍ SYROVÁTCE Dostálová Lenka 1, Detvanová Lenka 1, Teplá Jana 2, Přichystalová Jitka 1, Kalhotka Libor 1, Rožnovská Doubravka 2, Lužová Táňa 2 1 Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin 2 Ústav technologie potravin, Mendelova univerzita v Brně Antimicrobial Activity of Lavandin Essential Oil against Microorganisms Present in Goat Whey Summary: Antimicrobial activity of lavandin 'Grosso' essential oil was tested in this work. Lavandin (Lavandula x intermedia) is crossbreed of Lavandula angustifolia Mill. and Lavandula latifolia. Lavandin is grown to obtain essential oil. The yield of the essential oil can be more than five times higher than yield of oil from L. angustifolia. Antimicrobial activity was tested against microorganisms present in goat whey. Lavandin essential oil was added to goat whey and the whey was stored in refrigerator. Dynamics of count of microorganisms was researched in a four week period. These groups of microorganisms were tested: total plate count, coliform bacteria, enterococci, aerobic and anaerobic thermo-resistant microorganisms and psychrotrophic microorganisms. In the second period, coliform bacteria and enterococci were isolated from Petri dishes. Isolates were identified by biochemical tests. Antimicrobial activity of lavandin essential oil was tested on these bacteria by disc diffusion method. The study revealed that essential oil of lavandin shows provable antimicrobial activity. Enterococci were more sensitive than coliform bacteria; gram negative bacteria are more resistant to the effect of essential oils. Úvod Čeleď hluchavkovitých (Lamiaceae) zahrnuje množství léčivých rostlin s prokázanými terapeutickými účinky, jako je například levandule. Levandule je aromatická rostlina rozšířená především ve Středozemí 1. Jednotlivé druhy levandule se liší svou vytrvalostí, od neopadavého polokeře až po letničku 6. Hodně druhů levandule je vysoce aromatických, a to díky přítomnosti esenciálních olejů přítomných ve žlázkách pokrývajících většinu rostliny 4. Fytochemické studie prokázaly, že druh Lavandula obsahuje esenciální olej, triterpeny, kumariny, hydroxyskořicovou kyselinu a flavonoidy 1. Křížením Lavandula angustifolia, Mill. a Lavandula latifolia vznikl kultivar lavandin (Lavandula x intermedia). Byl vyšlechtěn pro získávání esenciálních olejů, jejichž výtěžek může být až pětkrát vyšší než u L. angustifolia 4. Esenciální olej získaný z L. angustifolia má různá uplatnění, například v sedativech, karminativech, antidepresivech, zatímco esenciální olej L. x intermedia je díky vysokému obsahu kafru používán především při výrobě parfémů a mýdel. Kromě tohoto využití jsou používány jako přírodní aromata v pečivu, alkoholických i nealkoholických nápojích nebo pudincích. Mnoho studií prokázalo, že tyto esenciální oleje mají antimikrobiální a cytotoxické účinky vůči některým druhům bakterií a plísní 3. Těchto účinků by mohlo být úspěšně využito pro prodloužení doby údržnosti syrovátky, která vzniká jako vedlejší produkt při výrobě sýrů. Bez úpravy by rychle podlehla mikrobiálnímu kažení, a to především kvůli vysokému obsahu laktózy, která je vhodným substrátem pro některé mikroorganismy 2. Materiál a metody Pro testování antimikrobiální aktivity silice lavandinu byla použita kozí syrovátka, která byla získána z Farmy dojných a kašmírských koz v Šošůvce. Silice lavandinu 'Grosso' byla zakoupena od firmy Manipura. Pozorování probíhalo po dobu čtyř týdnů. První den byla do syrovátky přidána silice v množství 100 µl / 100 ml. Takto ošetřená syrovátka a kontrolní vzorek bez přídavku silice byly skladovány při chladírenské teplotě 6 C. Druhý a dále každý další 7. den byla provedena jejich mikrobiologická analýza, a to plotnovou metodou zalitím inokula živnou půdou. Přehled stanovovaných mikroorganismů společně s podmínkami kultivace je uveden v Tabulka I. Počty mikroorganismů (MO) byly vyjádřeny v KTJ ml -1 a zlogaritmovány. 151

152 Tabulka I Stanovované skupiny MO a podmínky jejich kultivace MO Živná půda Podmínky kultivace Celkový počet mikroorganismů (CPM) PCA with skimmed milk 30 C, 72 hodin Koliformní bakterie (Koli) VRBL 37 C, 24 hodin Enterokoky (Ent) Termorezistentní MO aerobní (TMRae) a anaerobní (TMRan) Compass Enterococcus Agar PCA with skimmed milk 44 C, 24 hodin Psychrotrofní MO (PS) PCA with skimmed milk 6 C, 10 dní Pozn.: Výrobcem použitých živných půd je Biokar diagnostics, France 30 C, 48 hodin, TMRan za anaerobních podmínek Z Petriho misek s koliformními bakteriemi a enterokoky byly izolovány bakterie, které byly následně identifikovány na úrovni druhu pomocí biochemických testů ENTEROtest 24 a EN-COCCUStest (Erba Lachema, ČR). Na identifikovaných bakteriích byla zkoušena antimikrobiální aktivita silice lavandinu pomocí diskové difúzní metody. Na Petriho misky se zatuhlým živným médiem byl rozetřen 0,1 ml suspenze mikroba o denzitě 1 McF. Sterilní disky o průměru 9 mm byly napuštěny 30 µl silice. Ta byla použita ve třech koncentracích 1 % (koncentrace použitá pro sledování dynamiky vývoje mikrobiálního společenstva v syrovátce), 10 % a 100 %. Pro její zředění byl použit methanol, který sloužil také jako kontrola citlivosti mikroba na rozpouštědlo. Disky napuštěné silicí (methanolem) byly po třech pokladeny na zaočkovanou Petriho misku. Pro každou koncentraci silice byly pro jednoho mikroba použity dvě Petriho misky, tj. celkem bylo použito šest disků se silicí. Pro kultivaci koliformních bakterií byla použita živná půda PCA a teplota 37 C po dobu 24 hodin a pro kultivaci enterokoků byla použita živná půda Compass Enterococcus Agar a teplota 44 C po dobu 24 hodin. Po kultivaci byly odečteny průměry inhibičních zón v mm a vyhodnocena účinnost silice. Výsledky a diskuze Po dobu čtyř týdnů byla pozorována dynamika vývoje mikrobiálního společenstva ve vzorcích syrovátky. Výsledky sledování jsou shrnuty v Tabulce II. Bylo provedeno dvojí opakování a pro každé byla použita jiná syrovátka. To znamená, že kontrolní vzorky syrovátky obsahovaly odlišné výchozí počty mikroorganismů. Aby bylo možné porovnat účinnost inhibice růstu mikroorganismů lavandinem, musí být uvedeny výsledky obou kontrolních vzorků. V obou opakováních došlo ke snížení počtu téměř všech sledovaných skupin mikroorganismů. Lepších inhibičních účinků bylo dosaženo v prvním opakování, kdy došlo k významnému potlačení růstu enterokoků, termorezistentních anaerobních mikroorganismů a celkového počtu mikroorganismů, v případě druhého opakování byl významně snížen pouze počet termorezistentních aerobních mikroorganismů. V průběhu mikrobiologických analýz byly izolovány jednotlivé koliformní bakterie a enterokoky, které byly následně identifikovány biochemickými testy. Přehled identifikovaných bakterií je uveden v Tabulka III. Na identifikovaných mikroorganismech byla testována antimikrobiální účinnost silice lavandinu diskovou difúzní metodou. Testovány byly tři koncentrace silice 1 %, 10 % a 100 %. Citlivost jednotlivých bakterií je znázorněna v Tabulka IV. 152

153 Tabulka II Dynamika vývoje mikrobiálního společenstva Vzorek Kontrolní vzorek syrovátky I Syrovátka I + lavandin Kontrolní vzorek syrovátky II Syrovátka II + lavandin ND = nedetekováno Den pozorování log N [log KTJ ml -1 ] Koli Ent TMRan TMRae CPM PS 2 5,05 1,67 1,34 0,44 6,54 5,11 8 5,80 1,94 1,10 0,66 6,71 5, ,94 1,23 1,88 1,92 6,85 5, ,42 1,21 0,80 0,80 7,71 6,31 2 4,20 1,18 1,25 0,44 5,85 4,84 8 6,12 1,35 0,80 0,70 6,86 5, ,29 0,26 ND 0,61 6,08 6, ,55 ND ND 0,70 6,42 6,19 2 5,03 1,45 2,31 2,63 7,34 4,68 8 4,65 1,13 1,74 0,70 6,78 6, ,04 1,32 0,70 3,03 6,04 3, ,40 1,16 0,70 0,70 5,56 4,13 2 3,26 1,20 0,96 2,60 6,35 2,94 8 5,64 ND 1,18 0,36 11,00 6,52 15 < ,36 1,00 0,74 5,44 1, ,36 0,94 0,50 0,26 < ,20 Tabulka III Přehled identifikovaných mikroorganismů Skupina MO Koliformní bakterie Enterokoky Identifikovaný druh Raoultella terrigena Hafnia alvei Escherichia hermanii Aeromonas hydrophila Enterococcus faecium Enterococcus solitarius Enterococcus sulfureus Tabulka IV Průměry inhibičních zón Identifikovaný druh MO Průměr inhibičních zón [mm] Koncentrace silice [%] kontrola Escherichia hermanii 11,00 10,17 10,33 60,00 Hafnia alvei 9,33 10,17 11,17 51,60 Raoultella terrigena 9,33 9,00 9,17 18,00 Aeromonas hydrophila 9,00 9,67 9,83 15,67 Enterococcus faecium 15,50 19,50 19,83 72,50 Enterococcus sulfureus 10,83 13,50 14,00 43,00 Enterococcus salivarius 9,00 16,00 15,00 51,00 153

154 Nejvýrazněji byl silicí lavandinu inhibován E. faecium, který byl citlivý i k působení methanolu. Naopak nejméně byl z enterokoků potlačen E. sulfureus. Koliformní bakterie byly viditelně odolnější vůči antimikrobiálním účinkům lavandinu, a to především v jeho nižších koncentracích. Neředěnou silicí byly výrazně inhibovány E. hermanii a H. alvei, naopak R. terrigena a A. hydrophila byly inhibovány i touto koncentrovanou silicí poměrně slabě. Celkově citlivější k působení silice lavandinu byly enterokokoky, což odpovídá výsledkům předchozích studií, které prokázaly, že gramnegativní bakterie jsou vůči antimikrobiálnímu působení silic odolnější než bakterie grampozitivní 7. Byl zkoumán vliv silice Lavandula x intermedia a L. latifolia spica cineolifera na E. coli, S. typhimurium a S. aureus. Nejcitlivější byl k jejich účinku grampozitivní S. aureus 5. Stejně tak v další studii byl k antimikrobiální aktivitě lavandinu z testovaných mikroorganismů nejcitlivější grampozitivní B. cereus 8. Porovnáním účinnosti Lavandula angustifolia a Lavandula x intermedia proti Shigella flexneri, Staphylococcus aureus a E. coli bylo zjištěno, že obě silice byly proti testovaným bakteriím prokazatelně účinné, přičemž ve všech případech jejich růst lépe inhiboval esenciální olej lavandinu 3. Zkoumána byla také antimikrobiální aktivita různých ethanolických extraktů lavandinu, a to z květů, listů a stonků. Nejefektivnější byl ethanolický extrakt z květů, který vykazoval aktivitu proti širokému spektru bakterií, kvasinek i plísní 1. Závěr V této práci byla prokázána antimikrobiální aktivita silice lavandinu, a to již v koncentraci 1 %, v případě jejího přídavku do syrovátky, kdy byla schopna potlačit růst přítomných mikroorganismů, i v případě jejího testování pomocí diskové difúzní metody. Díky svým antimikrobiálním vlastnostem se tedy lavandin jeví jako vhodný přírodní prostředek pro prodloužení doby údržnosti syrovátky. Je důležité pokračovat v řešení této problematiky, aby mohlo být stanoveno vhodné množství přidávané silice lavandinu, které by potlačilo růst nežádoucích mikroorganismů a zároveň zachovalo přijatelnou senzorickou jakost syrovátky. Poděkování Tento výzkum byl financován za podpory IGA SP Použitá literatura 1. BLAZEKOVIC, Biljana, Gordana STANIC, Stjepan PEPELJNJAK a Sanda VLADIMIR-KNEZEVIC. In Vitro Antibacterial and Antifungal Activity of Lavandula x intermedia Emeric ex Loisel. Budrovka. Molecules. 2011, vol. 16, issue 12, s JELIČIĆ, I., R. BOŽANIĆ a L. TRATNIK. Whey-based beverages- a new generation of diary products. Mljekarstvo. 2008, roč. 58, č. 3, s JIANU, C., G. POP, A.T. GRUIA and F.G. HORHAT, Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils of lavender (Lavandula angustifolia) and lavandin (Lavandula x intermedia) grown in Western Romania. Int. J. Agric. Biol., 15: LIS-BALCHIN, Edited by Maria. Lavender the Genus Lavandula. London: CRC Press, OUSSALAH, Mounia, Stéphane CAILLET, Linda SAUCIER a Monique LACROIX. Inhibitory effects of selected plant essential oils on the growth of four pathogenic bacteria: E. coli O157. Food Control. 2007, vol. 18, issue 5, s PAVELA, Roman. Rostlinné insekticidy: hubíme hmyz bez chemie. Praha: Grada, SMITH-PALMER, A., J. STEWART a L. FYFE. The potential application of plant essential oils as natural food preservatives in soft cheese. Food Microbiology. 2001, vol. 18, issue 4, s VARONA, Salima, Soraya RODRÍGUEZ ROJO, Ángel MARTÍN, María José COCERO, Ana Teresa SERRA, Teresa CRESPO a Catarina M.M. DUARTE. Antimicrobial activity of lavandin essential oil formulations against three pathogenic food-borne bacteria. Industrial Crops and Products. 2013, vol. 42, issue 12, s Kontaktní adresa Ing. Lenka Dostálová, Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, , Brno-Černá Pole; Lenka.Dostalova@mendelu.cz 154

155 STANOVENÍ LACTOBACILLUS HELVETICUS A STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS V TRADIČNÍCH KAZAŠSKÝCH SÝRECH VYROBENÝCH ZE SMĚSI KRAVSKÉHO A KOZÍHO MLÉKA POMOCÍ qpcr Zhexenbay Nurshash 2, Mühlhansová Andrea 1, Jebavá Iva 1, Alimardanova Mariam 2, Kulazhanov Talgat 2, Kozybaev Asilbek 2, Plocková Milada 1 1 Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT Praha 2 Almaty Technological University, Kazachstán Determination of Lactobacillus helveticus and Streptococcus thermophilus in traditional Kazachstani cheese made from blend of cow and goat milk using qpcr Summary: Currently used methods based on polymerase chain reaction (PCR), especially quantitative PCR (qpcr), seems to be very useful for detection, identification and quantification of both pathogens and technologically important microorganisms in food matrix containing mix of starter cultures. The aim of the study was to quantify Lactobacillus helveticus and Streptococcus thermophilus in six samples of artisanal cheese produced in Kazakhstan. Determination of Lb. helveticus and S. thermophilus using qpcr was performed in three cheeses made from cow's milk and three cheeses made from a mixture of cow s and goat s milk. Specific primers for Lb. helveticus (2) and S. thermophilus (4) were used to monitore presence of genes encoding for peptidoglycan hydrolases and 16S rrna, respectively. Lb. helveticus and S. thermophilus were also quantified on the MRS ph 5,4 or M17, respectively, using agar plate method. Combination of physical and enzymatic lysis was proposed for DNA extraction. Quantity of S. thermophilus cells was higher using qpcr than using the plate method. This may be caused by the presence of dead cells and their subsequent detection by qpcr. Quantification of Lb. helveticus based on qpcr ranged between to CFU ml -1 according to type of the cheese. Because of the presence of Lb. casei which is closely related to Lb. helveticus, it was complicated to determine selectively Lb. helveticus using plate method based on MRS agar. Lb. casei appeared next to Lb. helveticus on the agar plates and increased total counts. Moreover, we even observed the presence of Lb. helveticus colonies on selective MRS/CP/CL agar plates. Úvod: V současné době jsou metody založené na polymerázové řetězové reakci (PCR), konkrétně kvantitativní PCR (qpcr), přednostně používány k detekci, identifikaci a kvantifikaci technologicky významných mikroorganismů. Kvantitativní PCR umožňuje sledovat kontinuálně každý krok reakce. Je rychlejší, vysoce citlivá, specifická a umožňuje současně detekci několika odlišných mikroorganismů najednou. V této práci byly použity specifické primery pro Lactobacillus helveticus (2), kterými byla sledována přítomnost genů kódujících peptidoglykan hydrolasy. Pro Streptococcus thermophilus byl vybrán primer z odborné literatury kódující 16S rrna (4). S. thermophilus i Lb. helveticus byly kvantifikovány také plotnovými metodami na půdě M17, resp. MRS. Sýry byly vyrobeny za použití nízké pasterace, což by mohlo znamenat výskyt nestartérových bakterií mléčného kvašení (NSLAB). Proto byla použita půda MRS s přídavkem antibiotik ciprofloxacinu a clindamycinu (MRS/CP/CL) pro zjištění možného výskytu Lb. acidophilus. Metoda byla použita dle platné normy ČSN ISO Cíle práce: kvantifikovat Lb. helveticus a S. thermophilus v sýrech vyrobených v Kazachstánu pomocí klasické kultivační metody a současně pomocí qpcr stanovit výskyt NSLAB konkrétně Lb.acidophilus v sýrech a ověřit selektivitu půdy MRS/CP/CL používanou pro stanovení Lb. acidophilus 155

156 Materiál a metody: Tabulka I Použité vzorky sýrů Sýr Mléko použité k výrobě sýra Doba zrání 1 ze směsi kravského a kozího mléka (1:1) 2 týdny 2 ze směsi kravského a kozího mléka (1:1) 1 týden 3 ze směsi kravského a kozího mléka (1:1) čerstvý 4 z kravského mléka 2 týdny 5 z kravského mléka 1 týden 6 z komerčního kravského mléka - Složení směsné kultury použité při výrobě sýrů - Christian Hansen FD-DVS DCC-260 Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus a Streptococcus thermophilus Plotnové metody Byly stanoveny počty Lb. helveticus na půdě MRS, S. thermophilus na půde M17 a Lb. acidophilus na půdě MRS/CP/CL dle platné normy ČSN ISO Metody a podmínky kultivace jsou uvedeny v tabulce II. Tabulka II Podmínky plotnových metod vybraných mikroorganismů stanovovaných v různých typech sýrů Mikroorganismus Použitá půda Pipetovaný objem, metoda Podmínky kultivace Lb. helveticus MRS 1ml, přelivem 72 h, 37 C, anaerobně Lb. acidophilus MRS/CP/CL 0,1 ml, roztěrem 72h, 37 C, anaerobně S. thermophilus M17 1ml, přelivem 48h, 37 C,aerobně Izolace DNA Izolace DNA ze sýrů probíhala pomocí komerčně dostupného kitu DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) za pomocí protokolu dle literatury (3), který využívá desetinásobné naředění vzorku a následnou enzymaticko-mechanickou lyzy. Polymerázová řetězová reakce Složení PCR Mixu pro stanovení Lb. helveticus bylo následující: (i) 10 μl iq SYBR Green Supermix (BioRad), (ii) 0,5 μl primer Lhv_0190 nebo Lhv_0191 o koncentraci 50 μm (iii) 7 μl - demineralizovaná sterilní voda (iv) 2 μl izolované DNA. Celkový objem reakce byl 20 μl. PCR reakce byla zahájena 5 min při 95 C, po nichž následovalo 40 cyklů: (i) počáteční denaturace 30 s při 95 C, (ii) annealing 30 s při 64 C, (iii) elongace 45 s při 72 C. Složení PCR Mixu pro stanovení S. thermophilus se lišilo a bylo následující (i) 10 μl iq SYBR Green Supermix (BioRad) (ii) 1 μl primer Tabasco o koncentraci (10 μm) (iii) 6 μl demineralizovaná sterilní voda (iv) 2 μl izolované DNA. Celkový objem reakce byl 20 μl. Průběh PCR byl 3 min při 95 C iniciační denaturace, následovalo 40 cyklů: 156

157 (i) počáteční denaturace 30 s při 95 C, (ii) annealing 30 s při 65 C (iii) elongace řetězce 30 s při 72 C. K přípravě kalibračních křivek, nezbytných pro absolutní kvantifikaci pomocí qpcr, byly připraveny PCR produkty vzniklé: (i) amplifikací peptidoglykan hydrolasy (PGHs) Lhv_0190 nebo Lhv_0191 s referenčním kmenem Lb. helveticus DPC 4571, (ii) amplifikací 16S rrna s referenčním kmenem S. thermophilus CNRZ Pro přečištění PCR produktů byl použit kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Koncentrace PCR produktů byla stanovena na přístroji Nanodrop ND-1000 a výpočet počtu přítomných kopií DNA v PCR produktu byl stanoven dle rovnice 1. Sekvence použitých primerů jsou uvedeny v tabulce III a IV. Dále byla provedena tři na sobě nezávislá stanovení, resp. tři na sobě nezávislé PCR reakce. (rovnice 1) Množství DNA Délka PCR produktu ng, bp. Tabulka III Primer pro stanovení S. thermophilus z odborné literatury Název primeru Tabasco Označení genu 16S rrna Tabulka IV Primery pro stanovení Lb. helveticus Název primeru Lhv_0190 Lhv_0191 Označení genu PGH PGH Sekvence 5 3 Fwd:ACGCTGAAGAGAGGAGCTTG Re:GCAATTGCCCCTTTCAAATA Sekvence 5 3 Fwd:ACGCTGAAGAGAGGAGCTTG Re:GCAATTGCCCCTTTCAAATA Fwd:GGGCTGATTACAGTGGCTAAT Re: CTTGCCCTTTTCGGTGTAAA Velikost produktu [bp] Reference 157 (4) Velikost produktu [bp] Reference 542 (2) 747 (2) Elektroforéza Gel (1.0 %) byl připraven z agarosy a TBE pufru s přídavkem 10 μl barviva Sybr Safe. Bylo smícháno 5 μl amplifikátu s 2 μl Gel Loading Buffer (Invitrogen) a pipetováno do příslušných jamek v gelu. Na začátku a na konci jamek bylo pipetováno 3 μl markeru 1 kb DNA Ladder (Invitrogen), migrace probíhala 100 V po dobu 60 min. Identifikace kolonií z půdy MRS/CP/CL Bylo izolováno 5 kolonií narostlých na půdě MRS/CP/CL (selektivní médium pro Lb. acidophilus). Tyto kolonie byly pomnoženy v MRS bujonu a z těchto čistých kultur byla izolována DNA. Na závěr byla provedena identifikace pomocí konvenční PCR s využitím primerů Lhv_190 a Lhv_191 a gelové elektroforézy (3). 157

158 Výsledky a diskuze: Koncentrace izolované DNA ze všech vzorků sýrů jsou uvedeny v Tabulce V. Výsledky ukazují, že pouze čerstvý sýr vyrobený ze směsi kravského a kozího mléka vykazoval vyšší koncentraci DNA než ostatní sýry. Porovnání stanovení Lb. helveticus (MRS agar), Lb. acidophilus (MRS/CP/CL) použitím plotnových metod a kvantitativního stanovení Lb. helveticus pomocí qpcr při použití dvou primerů Lhv_190 a Lhv_191, je uvedeno v Tabulce VI. Z výsledků je patrné, že nelze srovnávat použité plotnové metody, jelikož se v použité kultuře nacházel i Lb. casei, a proto je stanovení pomocí MRS agaru zkresleno. Tyto výsledky poukazují jednak na neselektivitu vybraných kultivačních medií a současně zdůvodňují nutnost použití druhově specifické qpcr pro stanovení a kvantifikaci homofermentativních laktobacilů ve směsích. V tabulce VII je dále uvedeno porovnání stanovení S. thermophilus pomocí plotnových metod na půde M17 a qpcr za použití primeru z literatury. Tento primer kóduje 16S rrna, který se v genomu mikroorganismu nachází vícekrát, což může mít za následek vyšší počty získané pomocí qpcr. Na závěr práce byla provedena identifikace kolonií odebraných z půdy MRS/CP/CL za použití primerů Lhv_0190 a Lhv_0191 z důvodu podezření, že se jedná o Lb. helveticus. Tato úvaha byla potvrzena. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 1. Velikost PCR produktu pro primer Lhv_0190 byla 542 bp. Velikost produktu pro primer Lhv_0191 byla 747 bp. Všech pět izolátů z půdy MRS/CP/CL bylo identifikováno jako Lb. helveticus. Tyto výsledky poukazují na neselektivitu půdy MRS/CP/CL při stanovení blízce příbuzných druhů laktobacilů, proto je nutné navrhovat specifické primery pro jednotlivé druhy a kmeny BMK a vyvíjet a optimalizovat metody pro qpcr. Tabulka V Koncentrace DNA izolovaná ze šesti druhů sýrů z různých typů mlék Vzorek cdna a [ng μl -1 ] Sýr 1 10,7 a cdna-koncentrace DNA Sýr 2 12,6 Sýr 3 212,3 Sýr 4 56,7 Sýr 5 4,7 Sýr 6 24,4 Tabulka VI Porovnání metod kvantifikace Lb. acidophilus (MRS/CP/CL) a Lb. helveticus (MRS) pomocí plotnových metod a qpcr Vzorek Počty [KTJ g -1 ] Plotnová metoda, MRS/CP/CL Počty [KTJ g -1 ] Plotnová metoda, MRS Počty [KTJ g -1 ] qpcr, Lhv_0191 Počty [KTJ g -1 ] qpcr, Lhv_0190 Sýr 1 5, , , ± 6, , ± 4, Sýr 2 9, , , ± 4, , ± 7, Sýr 3 7, , , ± 4, , ± 4, Sýr 4 6, , , ± 5, , ± 3, Sýr 5 1, , , ± 6, , ± 3, Sýr 6 5, , , ± 1, , ± 3,

159 Tabulka VII Porovnání metod kvantifikace S. thermophilus pomocí plotnových metod (M17) a qpcr Vzorek Počty [KTJ g -1 ] Plotnová metoda, M17 Počty [KTJ g -1 ] qpcr, Tabasco Sýr 1 2, , ± 3, Sýr 2 2, , ± 4, Sýr 3 1, , ± 9, Sýr 4 1, , ± 2, Sýr 5 2, , ± 2, Sýr 6 1, , ± 1, Obr. 1 Výsledky elektroforézy odebraných kolonií z plotny MRS/CP/CL. Sloupce: (M) - marker, (1-5) odebrané kolonie z půdy MRS/CP/CL amplifikované s primerem Lhv_0190, (6-10) odebrané kolonie z půdy MRS/CP/CL s primerem Lhv_0191 Závěr: Stanovený počet Lb. helveticus pomocí qpcr se pohyboval v rozmezí 2, až 4, KTJ ml -1 dle vzorku sýra. Protože se v kultuře vedle sebe vyskytovaly jak Lb. helveticus tak Lb. casei, bylo jejich stanovení plotovou metodou na půdě MRS neselektivní. Kvantifikace S. thermophilus pomocí qpcr byla většinou o jeden řád vyšší ve srovnání s počty získanými pomocí plotnových metod. Vyšší počty získané pomocí qpcr mohou být ovlivněny přítomností mrtvých buněk a také navrženým primerem, který kóduje 16S rrna. Úsek tohoto genu se může v genomu mikroorganismu nacházet vícekrát. Lb. helveticus, který byl dle výrobce přítomný v zákysové kultuře a byl stanoven pomocí qpcr rostl na půdě MRS/CP/CL selektivní po Lb. acidophilus. 159

160 Poděkování: Tato práce byla podpořena grantem MZE QI101B090 Nové postupy produkce funkčních cereálních a mléčných potravin a funkčních nápojů s obsahem bioaktivních složek z vybraných rostlinných a živočišných zemědělských surovin s využitím probiotických mikroorganismů a postupy posuzování jejich kvality. Použitá literatura: 1. ČSN ISO Mléčné výrobky Stanovení počtu presumptivního Lactobacillus acidophilus na selektivní živné půdě-technika počítání kolonií vykultivovaných při 37 C. Český normalizační institut, Praha, Česká republika, 20 stran, Jebava I., Chuat V., Lortal Sylvie, Valence Florence: Peptidoglycan hydrolases as species-specific markers to differentiate Lactobacillus helveticus from Lactobacillus gallinarum and other closely related homofermentative lactobacilli. Current Microbiology Curr. Microbiol. 68, (2014). 3. Parayre S., Falentin H., Madec M N., Sivieri K., Le Dizes A., Sohier D., Lortal S.: Easy DNA extraction method and optimization of PCR-Temporal Temperature Gel Electrophoresis to identify the predominant high and low GC-content bacteria from dairy products. J. Microbiol. Methods 69, (2007). 4. Tabasco R., Paarup T., Janer C., Peláez C., Requena T.: Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk. Int. Dairy J. 17, (2007). Kontaktní adresa: Andrea Mühlhansová, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6, Česká republika, andrea@muhlhans.com 160

161 BSH AKTIVITA LAKTOBACILŮ IZOLOVANÝCH Z RŮZNÝCH ZDROJŮ Sedláčková Pavla, Horáčková Šárka, Plocková Milada Ústav mléka, tuků a kosmetiky, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze BSH activity of lactobacilli isolated from various sources Summary: Bile salt hydrolase activity is known as activity of choloylglycin hydrolase (EC ). This enzyme hydrolyses of conjugated bile acid to form glycin or taurin and steroid core. This hydrolyses is one of the indirect mechanisms of reduction of cholesterol level in human blood. Lactobacillus strains were isolated from various sources (15 strains from feacal of fully breast fed infants, 4 strains from cow colostrum, 12 strains from cheeses made from raw cow s milk and 7 strains from raw cow milk). Identifications were done by genotypic and phenotypic methods. All strains, including two commercial probiotic strains and five collection strains, were subsequently tested for their Bile Salt Hydrolase (BSH) activities via two methods Thin Layer Chromatography (TLC) and plate assay. Among all the Lactobacillus strains, 11 strains were shown to be BSH positive. All of 11 strains were BSH positive by TLC and only 5 of these strains by plate assay. Most of the BSH positive strains (7 strains) were of gastrointestinal origin. Differences between BSH activities for bile salts (sodium salts of taurocholic acid and glycocholic acid) were demonstrated. TLC method was shown to be more suitable and more sensitive than plate assay for determination of BSH activity. Úvod Zvýšená hladina cholesterolu v krvi je v dnešní době hojně diskutované téma, díky nárůstu pacientů s vysokým obsahem hladiny cholesterolu v krvi, což má výrazný vliv na vznik kardiovaskulárních onemocnění. Kardiovaskulární onemocnění jsou podle světové zdravotnické organizace WHO jednou z nejčastějších příčin úmrtí. V roce 2008 bylo 30% ze všech úmrtí na světě způsobeno v důsledku právě kardiovaskulárních onemocnění. Podle WHO budou tato onemocnění i v roce 2030 jednou z hlavních příčin úmrtí. 13 Již 1% snížení obsahu celkového cholesterolu v krvi může snížit riziko úmrtí příčinou kardiovaskulárních onemocnění o 2 4 %. 14 Hladinu cholesterolu v těle jde nepřímo snižovat enzymem choloylglycin hydrolasou (EC ), který byl zjištěn u několika rodů mikroorganismů, mezi něž patří právě i rod Lactobacillus. Tento enzym hydrolyzuje amidovou vazbu žlučových solí za vzniku žlučových solí a aminokyselin (glycin nebo taurin). Žlučové kyseliny jsou v porovnání s konjugovanými žlučovými solemi méně vstřebatelné střevní stěnou (až o 80 % menší resorpce) a jsou tedy i více vylučované stolicí. Díky exkreci žlučových kyselin se sníží jejich celkový obsah v těle a ten musí být doplněn syntézou právě z cholesterolu. Tímto způsobem se snižuje hladina cholesterolu v těle. 2 Možný přídavek BSH aktivních kmenů laktobacilů do potravin by působil na snižování hladiny cholesterolu v těle konzumentů těchto probiotických výrobků. Cílem práce bylo izolovat a identifikovat laktobacily z různých zdrojů. U izolovaných a sbírkových kmenů dále stanovit BSH aktivitu metodou plotnovou a TLC. Použité mikroorganismy Kmeny laktobacilů byly izolovány ze sýrů vyrobené ze syrového mléka, syrového kravského mléko, syrového kravského mleziva, stolice plně kojených dětí. Dále byly použity i kmeny sbírkové (L. acidophilus CCDM 151, L. rhamnosus CCDM 150, L. casei CCDM 198, Laktoflora, Milcom, Praha, Česká Republika; L. acidophilus ATCC 4356TM, L. acidophilus ATCC 314 TM, Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK) Rogosa agar (5,5 ph, Merck, Darmstadt, Německo) byl použit pro první izolace kmenů laktobacilů, následné přečištění a kultivace byly prováděny na MRS agaru (ph 5,6, Oxoid) a v MRS bujónu (ph 5,6, Oxoid) při 37 C v atmosféře 5 % obj. CO 2. Izolované bakterie byly identifikovány pomocí fenotypických (morfologie, gramova barvení a přítomnosti katalasy) a genotypických metod (PCR pro identifikaci rodu Lactobacillus12,5) Genová sekvenace byla provedena u kmenů, které prokázaly aktivitu enzymu choloylglycin hydrolasy. 161

162 Použité metody Stanovení dekonjugace žlučových solí metoda plotnová Dekonjugace žlučových solí byla testována podle metod Ahn et al. (2003), Dashkevicz, Feighner (1989). Tyto metody byly modifikovány. Pro toto stanovení byl použit soft MRS agar, který obsahoval MRS bujón (52 g l 1, Oxoid) s bakteriologickým agarem (7,5 g l 1, Oxoid), s přídavkem žlučových solí (0,3 % hm. Ox bile, Himedia) a CaCl 2 (0,37 g l 1, Lachner, Neratovice, ČR). Konečné ph soft MRS agaru bylo upraveno na hodnotu 6,5 po sterilaci. Agar byl před použitím kultivován 48 h při teplotě 37 C v anaerobní atmosféře. Následně byly misky zaočkovány vpichem do agaru (10 μl 18h staré kultury kmenů). Kultivace probíhala při 37 C v anaerobní atmosféře po dobu 72 h. L. acidophilus ATCC 4356TM byl použit jako srovnávací BSH pozitivní kmen 4,7,8 a Escherichia coli CNCTC 6859 jako srovnávací BSH negativní kmen 2,6. Po kultivaci byly měřeny průměry vzniklých zón kolem vpichů Měření bylo opakováno třikrát a z naměřených hodnot byl vypočítán aritmetický průměr. Stanovení dekonjugace žlučových solí metoda tenkovrstvé chromatografie (TLC) Dekonjugace žlučových solí byla dále testována pomocí tenkovrstvé chromatografie podle metody Guo et al. (2011). Kultura kmenů laktobacilů kultivovaná 18 h v MRS bujónu (5 ml, Oxoid) při teplotě 37 C v atmosféře 5 % obj. CO 2 a byla odstředěna (10 min, 9000 min -1, 4 C). Odstředěné buňky byly promyty fyziologickým roztokem (2 ml) a poté byly resuspendovány do fyziologického roztoku (5 ml). Následně byla bakteriální suspenze (1 ml) smíchána s reakční směsi (1 ml). Reakční směs obsahovala MRS bujón (52 g l -1 ), sodnou sůl kyseliny glykocholové (Na-GCA, 0,3 % hm, Sigma-Aldrich.) nebo sodnou sůl kyseliny taurocholové (Na-TCA, 0,3 % hm., Sigma-Aldrich) ve fosfátovém pufru (0,1 M), konečné ph reakční směsi bylo 6,5. Kultivace laktobacilů probíhala 8 h při 37 C v atmosféře 5 % obj. CO 2. Po kultivaci byla směs odpařena na vakuové odparce (40 mbarr, 50 C). Residua byly rozpuštěny v methanolu (1 ml, Lachner) a následně byla tato směs odstředěna (1 min, min -1, 4 C). Supernatant (3 µl) byl nanášen na destičku se silikagelem (10 x 10 cm, TLC silica gel 60 F254, Merck). Na destičku byly nanášeny také standardní roztoky kyseliny cholové v methanolu (CA, 5 mm, Sigma-Aldrich), Na-TCA v methanolu (5 mm, Sigma- Aldrich) a Na-GCA v methanolu (5 mm, Sigma-Aldrich). Poté byla destička vložena do vyvíjecí nádoby s mobilní fází, která byla složena z isoamylacetátu (Merck), propionové kyseliny (Fluka, Buchs, Švýcarsko), n-propanolu (Penta, Praha, ČR) a vody (40:30:20:10). Po cca 30 min byla destička vysušena pod horkým vzduchem. Vysušená destička byla posprejována 5 % hm. roztokem kyseliny fosfomolybdenové v ethanolu a znovu usušena. Vyhodnocení probíhalo srovnáním se standardy. Měření bylo opakováno třikrát. Stejně jako u stanovení dekonjugace žlučových solí pomocí plotnové metody byl i zde použit kmen L. acidophilus ATCC 4356TM jako srovnávací BSH pozitivní kmen 4,7,8 a kmen Escherichia coli CNCTC 6859 jako srovnávací BSH negativní kmen 2,6. Výsledky a diskuze Z různých zdrojů bylo vyizolováno 38 kmenů (15 kmenů ze stolice plně kojených dětí (izolace na ČZU v Praze), 12 kmenů ze sýrů vyrobených ze syrového mléka (izolace na ÚMTK, VŠCHT v Praze), 4 kmeny ze syrového kravského mleziva (izolace na ÚMTK, VŠCHT v Praze), 7 kmenů ze syrového kravského mléka (izolace na ÚMTK, VŠCHT v Praze). Všechny kmeny byly grampozitivní, kataláza negativní s morfologií tyčinek. Po izolaci genomové DNA a genotypové identifikaci rodu Lactobacillus spp. bylo určeno všech 38 izolovaných kmenů bakterií jako rod Lactobacillus spp. Na obrázku 1. je znázorněn příklad gelu identifikace rodu Lactobacillus spp. 162

163 Obr. 1. Příklad agarosového gelu PCR produktů genomové identifikace rodu Lactobacillus sp., M DNAmarker (Top Bios.r.o.), všechny kmeny patří do rodu Lactobacillus sp. Screening BSH aktivity plotnovou metodou a TLC byl proveden u všech kmenů identifikovaných jako rod Lactobacillus spp., dále také u sbírkových (L. acidophilus CCDM 151, L. rhamnosus CCDM 150, L. casei CCDM 198, L. acidophilus ATCC 4356TM, L. acidophilus ATCC 314 TM). L. acidophilus ATCC 4356TM byl použit jako srovnávací BSH pozitivní kmen a Escherichia coli CNCTC 6859 jako srovnávací BSH negativní kmen. Bylo nalezeno 11 BSH pozitivních kmenů (7 izolátů ze stolice plně kojených dětí, 1 kmen ze syrového kravského mléka, 3 kmeny sbírkové). U kmenů laktobacilů izolovaných ze sýrů vyrobených ze syrového mléka a syrového kravského mleziva nebyl nalezen žádný BSH pozitivní kmen. Stanovení BSH aktivity plotnovou metodou bylo nalezeno 5 BSH aktivních kmenů (3 kmeny ze stolice plně kojených dětí, 2 sbírkové kmeny). Touto metodou nebyly nalezeny BSH pozitivní kmeny u izolátů ze sýrů vyrobených ze syrového mléka, izoláty ze syrového kravského mléka a syrového kravského mleziva. Na obrázku 2. je znázorněna petriho miska s BSH pozitivními a BSH negativními kmeny. Jsou zde patrné zóny kolem BSH pozitivních kmenů, které vznikly vysrážením dekonjugovaných solí s CaCl 2. TLC metodou byla prokázána BSH aktivita u všech 11 BSH pozitivních kmenů (7 izolátů ze stolice plně kojených dětí, 1 kmen ze syrového kravského mléka, 3 kmeny sbírkové). Touto metodou bylo stanoveno více BSH aktivních kmenů než metodou plotnovou, proto lze vyvodit, že TLC metoda je více citlivá. Příklad TLC destičky je znázorněn na obrázku 3. Obr. 2. Stanovení BSH aktivity plotnovou metodou. Soft MRS agar s Ox bile (0,3% hm., Himedia) a CaCl 2 (0,37 g l 1, Lachner), E. coli CNCTC 6859 (1), L. casei JN (2), L. brevis S1 (3), L. gasseri VI (4), L. acidophilus ATCC 4356TM (5), L. gasseri Z3 (6), L. rhamnosus AN (7). 163

164 Obr. 3. Stanovení BSH aktivity TLC metodou. (A) BSH aktivita pro Na GCA, (B) BSH aktivita pro Na TCA, Standardy Na TCA, Na GCA a CA v 0,1M fosfátovém pufru (0,3% hm., Sigma Aldrich) (S), L. acidophilus ATCC 4356TM (4356), E. coli CNCTC 6859 (6859), Lactobacillus sp. (JA), L. gasseri VI (VI), Cholová kyselina (CA), sodná sůl kyseliny taurocholové (Na TCA), sodná sůl kyseliny glykocholové (Na GCA). Tabulka I BSH pozitivní kmeny laktobacilů a jejich druhová identifikace pomocí 16S rrna genomové sekvenační analýzy; Plotnová metoda ph 6,5, 0,3% žluč. k. (Ox bile); TLC Na GCA tenkovrstvá chromatografie (TLC) pro sodnou sůl kyseliny glykocholové (Na GCA), ph 6,5, 5 mm Na GCA; TLC Na TCA TLC pro sodnou sůl kyseliny taurocholové (Na TCA), ph 6,5, 5 mm Na TCA; BSH negativní; mm; mm; mm; Y BSH pozitivní; N BSH negativní. Kmen Plotnová metoda TLC Na GCA TLC Na TCA Zdroj Druh JN Y N stolice plně kojených dětí, ČZU Praha L. casei VI +++ Y Y stolice plně kojených dětí, ČZU Praha L. gasseri Z2 +++ Y Y stolice plně kojených dětí, ČZU Praha L. gasseri LBA +++ Y Y stolice plně kojených dětí, ČZU Praha L. gasseri Z3 Y Y stolice plně kojených dětí, ČZU Praha L. gasseri AN N Y stolice plně kojených dětí, ČZU Praha L. rhamnosus Z1 Y Y stolice plně kojených dětí, ČZU Praha L. gasseri S1 Y N syrové kravské mléko, ÚMTK, VŠCHT Praha L. brevis Y Y sbírkový kmen, Oxoid, Britain L. acidophilus Y Y sbírkový kmen, Oxoid, Britain L. acidophilus 151 Y Y sbírkový kmen, Laktoflora, Milcom a.s. L. acidophilus 164

165 Všech 11 BSH pozitivních izolovaných kmenů stanovených plotnovou nebo TLC metodou byly dále druhově identifikovány 16S rrna genomovou sekvenační analýzou. Purifikované PCR produkty po reakci byly analyzovány na středisku skenování MBÚ akademie věd ČR. Výsledky skenování z akademie věd byly následně analyzovány pomocí programu DNA Baser a srovnáním s databází genomů bakterií NCBI byla dokončena identifikace druhů neznámých bakterií. Výsledky identifikace jsou uvedeny v tabulce 1. spolu se zdroji izolací a výsledky TLC a plotnové metody. Podle Tanaky et al. (1999) kmeny laktobacilů izolovaných z gastrointesinálního traktu jsou častěji BSH pozitivní díky přítomnosti žlučovým solím se srovnáním z kmeny izolovanými z prostředí jiného. To bylo demonstrováno i v této práci, kde většina BSH pozitivních kmenů (7 z 11 kmenů) byla izolována ze stolice pně kojených dětí. Avšak nelze jednoznačně říci, že kmeny z jiného než gastrointestinálního traktu nemohou být BSH pozitivními kmeny. I v této práci byly nalezeny kmeny izolované z prostředí bez obsahu žlučových solí, jako je syrové kravské mléko. Ve studiích Moser a Savage (2001) a Ridlon et al. (2006) uvádí, že laktobacily mohou mít odlišnou BSH aktivitu k různým konjugovaným žlučovým solím. Glyko-konjugované žlučové sole jsou více hydrolyzovatelné než tauro-konjugované žlučové sole.2,10 V práci Corzo & Gilliland, (1999) 3 kmeny L. acidophilus více dekonjugovaly glykocholát sodný než taurocholát sodný. I v této práci byla nalezena specifita kmenů k Na-TCA a Na-GCA, např. L. casei JN a L.brevis S1 neprokázaly žádnou BSH aktivitu k Na-TCA a naopak L. rhamnosus AN k Na-GCA. Většina kmenů však hydrolyzovala obě sole. Závěr Z různých zdrojů bylo vyizolováno celkem 38 kmenů. Všechny izoláty byly fenotypicky a genotypicky identifikovány jako rod Lactobacillus sp. Screeningem BSH aktivity bylo nalezeno 11 BSH pozitivních kmenů. Plotnovou metodou bylo BSH aktivita prokázána pouze u 5 kmenů a TLC metodou u všech 11 kmenů. Většina BSH pozitivních kmenů (7 z 11) byla izolována ze stolice plně kojených dětí. Dále byla také nalezena kmenová specifita ke žlučovým solím. Z výsledků lze vyvodit, že TLC metoda je více citlivá a tedy více vhodná ke stanovení BSH aktivity. Poděkování: Poděkování doc. Ing. Evě Vlkové, PhD. z ČZU v Praze za poskytnutí vyizolovaných kmenů ze stolice plně kojených dětí Použitá literatura: 1. Ahn Y.T., Kim G.B., Lim K.S., Baek Y.J., Kim H.U.: Deconjugation of bile salts by Lactobacillus acidophilus isolates. International Dairy Journal 13(4), (2003). 2. Begley M., Hill C., Gahan C.G.M.: Bile salt hydrolase activity in probiotics. Applied and envoromental microbiology 72, (2006). 3. Corzo G., Gilliland S.E.: Bile salt hydrolase activity of three strains of Lactobacillus acidophilus. Journal of Dairy Science 82, (1999). 4. Dashkevicz M.P., Feighner S.D.: Development of a differential medium for bile salt hydrolase active Lactobacillus spp. Applied and environmental microbiology 55, (1989). 5. Godon J.-J., Zumstein E., Dabert P., Habouzit F., Moletta R.: Molecular Microbial Diversity of an Anaerobic Digestor as Determined by Small-Subunit rdna Sequence Analysis. Applied and Environmental Microbiology 63, (1997). 6. Guo C.F., Zhang L.W., Han X., Li J.Y., Du M., Yi H.X., Feng Z., Zhang Y.C., Xu X.R.: Short communication: A sensitive method for qualitative screening of bile salt hydrolase active lactobacilli based on thin layer chromatography. Journal of Dairy Science 94, (2010). 7. Liong M.T., Shah N.P.: Bile salt deconjugation ability, bile salt hydrolase activity and cholesterol coprecipitation ability of lactobacilli strains. International Dairy Journal 15, (2005). 165

166 8. Moser S.A., Savage D.C.: Bile Salt Hydrolase Activity and Resistance to Toxicity of Conjugated Bile Salts are Unrelated Properties in Lactobacilli. Applied and Environmental Microbiology 67, (2001). 9. Ridlon J.M., Kang D.J., Hylemon P.B.: Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. Journal of Lipid Research 47, (2006). 10. Suvarna V.C., Boby V.U.: Probiotics in human health: A current assessment. Current Science 88, (2005). 11. Tanaka H., Doesburg K., Iwasaki T., Mierau I.: Screening of lactic acid bacteria for bile salt hydrolase activity. Journal of Dairy Science 82, (1999). 12. Ventura M., Callegari M.L., Morelli L.: S-layer gene as a molecular marker for identi cation of Lactobacillus helveticus. FEMS Microbiology Letters 189, (2000). 13. WHO: (citováno dne ) 14. WHO: we do/health topics/noncommunicable diseases /cardiovascular diseases/facts and figures) (citováno dne ) Kontaktní adresa: Ing. Pavla Sedláčková Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6 pavlasedlackova@seznam.cz 166

167 DEKARBOXYLÁZOVÁ AKTIVITA VYBRANÝCH ZÁKYSOVÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ V MODELOVÉM PŘÍRODNÍM SÝRU Flasarová Radka 1), Buňka František 1), Pachlová Vendula 1), Menšíková Anna 1), Georgová Nikola 1), Buňková Leona 2) 1) Ústav technologie potravin, FT UTB ve Zlíně 2) Ústav inženýrství ochrany životního prostředí, FT UTB ve Zlíně The decarboxylation activity of selected starter lactic acid bacteria in model Dutch type cheese Summary: The aim of this study was monitoring of tyramine concentration in model Dutch-type cheese inoculated with two tyramin-positive strains of Lactococcus lactis subsp. cremoris (CCDM 824 and CCDM 946; individualy used) during 90-day at 10 ± 1 C. Control samples without tyramine-positive strains were also produced. The increased amount of tyramine was formed with decarboxylase-positive microorganisms in comparison with samples possess starter culture without the latter mentioned strains. The tyramine concentration grew after 30 days of ripening by both monitored strains (tyramine concentrations near to 100 mg.kg -1 were observed). At the end of ripening period the 90 th day, the tyramine concentration was more than two times higher (samples with tyramine-positive strains CCDM 824 and CCDM 946) in comparison with samples possess starter culture (control samples). The higher ability to tyramine production was observed in cheese inoculated with strain Lactococcus lactis subsp. cremoris CCDM 946 where the tyramine amount was up to 350 mg.kg -1. In these samples were also detected the higher number of lactoccus in comparison with control samples and cheese inoculated with Lactococcus lactis subsp. cremoris CCDM 824. Úvod Zákysové kultury jsou nedílnou součástí technologie výroby sýrů a jiných mléčných výrobků. Mezi jednu z nejčastěji využívaných zákysových kultur během výroby sýrů patří smetanový zákys, jehož součástí jsou mimo jiné homofermentativní bakterie mléčného kvašení Lactococcus lactis subsp. lactis a Lactotoccus lactis subsp. cremoris. Aktivitou těchto zákysových kultur dochází k fermentaci laktózy za vzniku kyseliny mléčné. Zákysové bakterie jsou zpočátku dominující mikroflórou, avšak jejich počet se v průběhu zrání sýrů snižuje. Kromě zákysových bakterií se mohou v sýrech vyskytovat i nezákysové bakterie, jejichž přítomnost může být do jisté míry žádoucí, neboť se mohou podílet na tvorbě řady významných senzoricky aktivních látek 1-3. Bakterie mléčného kvašení mohou vykazovat dekarboxylázovou aktivitu, jež může mít za následek tvorbu vyšších koncentrací biogenních aminů (BA) (např. dekarboxylací tyrozinu vzniká tyramin). Na druhou stranu, značnou dekarboxylázovou aktivitu mohou vykazovat i nezákysové bakterie 1-3. BA jsou nízkomolekulární látky, které jsou v nízkých koncentracích pro organizmus nezbytné, kde plní řadu významných funkcí (stabilizace makromolekul, zdroj dusíku pro řadu biochemických reakcí, lokální tkáňové hormony, aj.). Avšak příjem vyšších množství BA v potravinách může vést k řadě zdravotních problémů, jako jsou bolesti hlavy, problémy trávicího ústrojí, ovlivnění krevního tlaku, aj. Podmínky vzniku BA mohou být rozděleny na přímé a nepřímé. Mezi přímé podmínky můžeme zařadit přítomnost dostatečného množství příslušných volných aminokyselin (prekurzor pro produkci BA) a přítomnost mikroorganizmů s pozitivní dekarboxylázovou aktivitou. Nepřímé podmínky ovlivňují růst samotných mikroorganizmů s pozitivní dekarboxylázovou aktivitou, resp. mohou ovlivňovat jejich metabolizmus. Tyto podmínky se mohou významně lišit v závislosti na konkrétním mikroorganizmu. Jedná se např. o teplotu, ph, přítomnost O 2, koncentraci NaCl, aj U některých kmenů Lactococcus lactis subsp. cremoris byla zjištěna významná dekarboxylázová aktivita 5, proto je důležité kmeny určené pro produkci mléčných výrobků testovat na dekarboxylázovou aktivitu z důvodu vyselektování kultur, které biogenní aminy vůbec neprodukují nebo pouze v omezeném rozsahu. V současné době se dekarboxylázová aktivita mikroorganizmů testuje zejména v podmínkách dekarboxylačních bujónů. Schopnost tvorby BA u konkrétních kmenů v reálném systému potraviny může být ovlivněna výše zmíněnými faktory (ph, koncentrace soli) a navíc také přítomností konkurenčních mikroorganizmů, 167

168 které mohou v důsledku tvorby metabolitů vytvářet nevhodné prostředí pro samotný růst dekarboxyláza pozitivních kmenů bakterií mléčného kvašení 1-3,5. Cílem této studie bylo sledovat vývoj obsahu tyraminu v přírodních sýrech zaočkovaných dvěma kmeny Lactotoccus lactis subsp. cremoris (CCDM 824 a CCDM 946; producenti tyraminu; kmeny byly aplikovány individuálně), které byly očkovány do modelových sýrů holandského typu. Změny obsahu tyraminu byly studovány v průběhu 90-denního zrání při teplotě 10 ± 1 C. Materiál a metody Laboratorně byly vyrobeny dvě skupiny přírodních sýrů holandského typu, přičemž každá skupina se skládala ze dvou šarží kontrolní výroba a výroba modelových vzorků inokulovaných sledovaným kmenem Lactotoccus lactis subsp. cremoris. Mléko pro kontrolní výrobu (modelové sýry A) bylo inokulováno 100 ml provozního zákysu smetanové kultury (Laktoflora smetanová, Milcom, a.s.), která obsahuje mikrobiální kmeny Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris a Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetylactis. Provozní zákys pro kontrolní šarži A byl připraven den předem smícháním 100 ml sterilovaného mléka a 0,3 g lyofilizované smetanové kultury, a do druhého dne inkubován k prokysání při teplotě 25 ± 1 C. Mléko pro druhou šarži s přídavkem dekarboxyláza pozitivního kmene bylo inokulováno 50 ml provozního zákysu (Laktoflora smetanová, Milcom, a.s.), který byl připraven obdobným postupem jako zákys pro výrobu A. Dále bylo použito 50 ml zákysu zaočkovaného sledovaným kmenem (modelové sýry obsahující kmen Lactococcus lactis subsp. cremoris CCDM 824 značeny jako B1 a modelové sýry obsahující kmen Lactococcus lactis subsp. cremoris CCDM 946 značeny jako B2), který byl připraven smícháním 50 ml sterilovaného mléka a 5 ml bujónu (zaočkovaný dekarboxyláza pozitivním kmenem) a inkubován do druhého dne při teplotě 25 ± 1 C. Pro jednu výrobu sýrů bylo použito 20 l pasterovaného kravského mléka o tučnosti 2,5 %, ze kterého bylo vyrobeno 24 bloků sýrů o průměrné hmotnosti 90 ± 3 g (obsah sušiny 50 ± 1 % w/w). Sýry byly po prokysání soleny v 20% w/w solné lázni po dobu 30 minut a po oschnutí a ošetření povrchu antimykotikem (Delvocid, DSM Food Specialties, Francie) vakuově baleny do polopropustných zracích obalů (Cryovak). Takto připravené bloky sýra byly uloženy do zracích komor po dobu 90 dnů a teplotě 10 ± 1 C. Modelové vzorky sýrů byly podrobeny základní chemické analýze (obsah sušiny a NaCl, ph), mikrobiálnímu rozboru a detekci tyraminu 1. (před solením), 30., 60. a 90. den. Základní chemická analýza zahrnovala stanovení celkového obsahu sušiny sušením vzorku při teplotě 102 ± 2 C do konstantních úbytků hmotnosti dle normy ISO 5534:2004, měření ph (vpichový ph metr Spear Eutech, Nizozemsko) a stanovení obsahu NaCl dle Mohra 7. Mikrobiologická analýza byla zaměřena na stanovení počtu jednotlivých skupin mikroorganizmů, přičemž byla použita následující kultivační média: PCA neselektivní médium pro stanovení celkového počtu mikroorganizmů (mezofilní aerobní a fakultativně anaerobní mikroorganizmy), M17 agar pro kultivaci a stanovení celkového počtu koků (laktokoků, streptokoků a leukonostoků), MRS agar pro zjištění počtu laktobacilů, SB agar pro monitoring počtů enterokoků a ENDO agar stanovující počet enterobakterií. Izoláty ze sýrů, příprava kultivačních médií a podmínky inkubace byly provedeny podle Buňkové a kol. 6. Pro stanovení koncentrace biogenních aminů byly vzorky nejprve lyofilizovány pomocí ALPHA 1 4 LSC (Christ, Německo) (- 40 C a tlaku ~ 12 Pa) po dobu dvou dnů. Biogenní aminy byly extrahovány pomocí 0,6 mol.l -1 HCl. Následně byly extrakty zderivatizovány dansylchloridem. Derivatizace biogenních aminů byla provedeno podle Dadákové a kol. 8. Biogenní aminy byly stanovovány podle Smělé a kol. 9 pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie (Agilent Technologies, USA) za použití kolony Agilent Eclipse Plus C18 RRHD (Agilent Technologies, USA) o rozměrech 3,0 x 50 mm x 1,8 µm a spektrofotometrické detekce o vlnové délce 254 nm a teplotě kolony 30 C. 168

169 Výsledky a diskuze U všech analyzovaných sýrů byla sušina po celou dobu zrání 51,0 ± 0,2 % w/w bez výrazných rozdílů mezi jednotlivými výrobami či přídavkem dekarboxyláza pozitivního kmene. Hodnoty ph se taktéž výrazně nelišily mezi jednotlivými výrobami. Na počátku zrání (vzorek odebrán v den výroby před solením sýrů) byly hodnoty ph všech sýrů v rozmezí 5,0-5,1 a v průběhu zrání došlo k mírnému snížení ph (zejména během 30 dnů zrání sýrů), poté bylo zpozorováno pozvolné zvyšování ph až na hodnotu 5,4-5,6 (90. den ode dne výroby). K počátečnímu snižování ph u sýrů dochází zejména díky vzniku kyseliny mléčné, která je následně odbourávána zejména na kyselinu octovou, dále vodu a oxid uhličitý. Tento rozklad kyseliny mléčné je důsledkem mírného zvyšování ph u sýrů až do konce zrání. Kromě rozkladu kyseliny mléčné mohou ke zvyšování ph sýra v průběhu zrání přispívat i vznikající alkalické látky, například v důsledku katabolizmu aminokyselin 1-3,10.. Koncentrace NaCl se také v průběhu zrání významně nelišila (2,0 ± 0,2 % w/w) mezi jednotlivými vzorky (a to jak mezi kontrolními, tak i s přidaným sledovaným kmenem). Obr. 1. Počet vybraných skupin mikroorganizmů v průběhu zrání kontrolních sýrů (A), kde: celkový počet mikroorganizmů; laktobacily; mléčné koky; enterokoky; + enterobakterie. B1) B2) Obr. 2. Počet vybraných skupin mikroorganizmů v průběhu zrání sýrů s přídavkem Lactotoccus lactis subsp. cremoris CCDM 824 (B1) a Lactotoccus lactis subsp. cremoris CCDM 946 (B2), kde: celkový počet mikroorganizmů; laktobacily; mléčné koky; enterokoky; + enterobakterie. 169

170 Na Obrázcích 1 a 2 je znázorněn vývoj počtu sledovaných skupin mikroorganizmů v modelových sýrech. Celkový počet mikroorganizmů (CPM; mezofilní aerobní a fakultativně anaerobní mikroorganizmy) u kontrolních vzorků sýrů (A) byl na počátku doby zrání (1,0 ± 0,2) 10 8 KTJ.g -1, přičemž v průběhu zrání docházelo k pozvolnému poklesu CPM na (1,9 ± 0,2) 10 7 KTJ.g -1 v 90. den zrání. U modelových sýrů B1 a B2 měl CPM v průběhu zrání také klesající trend, avšak bylo zjištěno, že tyto hodnoty jsou v porovnání s kontrolními vzorky A nižší ((5,8 6,0) 10 6 KTJ.g - 1 ) (90. den). Počty mléčných koků byly 1. den zrání sýrů v rozmezí (3,9 9,4) 10 8 KTJ.g -1 a v průběhu zrání se jejich hodnoty snižovaly. Tyto hodnoty jsou srovnatelné i se současnou literaturou, kde Fox a kol. 3 uvádí, že počet zákysových bakterií v sýrech může být první den ode dne výroby sýrů až 10 9 KTJ.g -1 a stávají se tak jednou z nejvíce dominující mikroflóry v sýrech. V průběhu zrání sýrů dochází ke snižování její aktivity a až následnému rozkladu buněk v důsledku poklesu ph či difuzí NaCl skrz celou hmotu bloku sýra 3,11. Vývoj počtu laktobacilů, jak u modelových sýrů A tak u sýrů B1 a B2, měl rostoucí trend zejména do 30. dne a poté se jejich počty do konce experimentu výrazně neměnily. Počty enterokoků a enterobakterií se u vzorků B1 výrazně nelišily v porovnání s výrobou A. Avšak u výroby B2 byl zpozorován vyšší počet enterobakterií (4,6 ± 0,2) 10 3 KTJ.g -1. Pokles počtů enterokoků a enterobakterií může být v důsledku vznikající kyseliny mléčné, jež může díky poklesu ph vytvářet nepříznivé podmínky pro jejich vznik a růst 2,3,11. Vývoj obsahu tyraminu v průběhu 90 denního zrání modelových sýrů je znázorněn na Obr. 3. Na počátku zrání, 1. den ode dne výroby, byla koncentrace tyraminu téměř zanedbatelná (2,9 3,1 mg.kg -1 ), a to bez ohledu na použitou zákysovou kulturu. Od 30. dne docházelo u všech modelových sýrů k nárůstu koncentrace tyraminu a ke konci zrání byly hodnoty tyraminu u kontrolních sýrů 100 mg.kg -1. K tvorbě těchto hodnot tyraminu může docházet v důsledku působení nezákysových bakterií, které mohou mít pozitivní dekarboxylázovou aktivitu. Naměřené hodnoty tyraminu v kontrolních vzorcích sýrů jsou srovnatelné s výsledky publikované Buňkovou a kol. 6, kde se konečné koncentrace tyraminu v sýrech holandského typu skladovaných při teplotě 10 ± 2 C pohybovaly taktéž okolo 100 mg.kg -1 po dvou měsících zrání. U sýrů vyrobených s přídavkem kmene (B1 a B2) byl zpozorován významnější nárůst koncentrace tyraminu do 60. dne zrání sýrů, které byly více než trojnásobně vyšší v porovnání s koncentracemi modelových sýrů A a překročily tak hodnoty 250 mg.kg -1. Od 60. dne však byl zaznamenán mírný pokles naměřených hodnot tyraminu u modelových sýrů s přídavkem kmene (B1 a B2). Tento jev může být důsledkem následné reakce vzniklého tyraminu s dalšími látkami. Jednou z možných reakcí je například oxidativní deaminace za vzniku aldehydů a ketonů, reakce s triacylglyceroly za vzniku amidů mastných kyselin, či se může účastnit neenzymového hnědnutí. Jistou deaminační aktivitu mohou vykazovat i nezákysové bakterie Obr. 3. Obsah tyraminu [mg.kg -1 ] v kontrolních sýrech (A) a sýrech s přídavkem dekarboxyláza pozitivního kmene Lactotoccus lactis subsp. cremoris CCDM 824 (B1) a Lactotoccus lactis subsp. cremoris CCDM 946 (B2) v průběhu zrání. 170

171 Vznik vysokých koncentrací tyraminu přesahující hodnoty 250 mg.kg -1 v porovnání s kontrolními sýry může být důsledkem přítomného vyššího množství nejen mléčných koků, ale i nezákysových laktobacilů. Zdrojem nezákysových bakterií mohlo být již mléko určené pro výrobu sýrů 12. Kleter 12 uvedl, že v případě přítomnosti i malého počtu laktobacilů (1 KTJ.ml -1 ) v mléce může dojít k výraznému nárůstu jejich počtů již během několika týdnů (až na hodnoty 10 7 KTJ.ml - 1 ). Buňková a kol. 5 ve své studii pozorovala pozitivní dekarboxylázovou aktivitu vybraných kmenů Lactotoccus lactis subsp. cremoris v kultivačním médiu, přičemž u kmenů CCDM 824 a CCDM 946 byla prokázána schopnost dekarboxylovat tyrozin za vzniku tyraminu. Dekarboxylační aktivitu vybraných kmenů Lactococcus lactis subsp. cremoris taktéž sledoval a potvrdil i Santos a kol. 17. Vyšší koncentrace tyraminu od 60. dne zrání sýrů byly zpozorovány u modelových sýrů s přídavkem kmene Lactotoccus lactis subsp. cremoris CCDM 946. Tento jev však není shodný s publikovanými výsledky Buňkové a kol. 5, kde vyšší dekarboxylační aktivitu v kultivačním médiu vykazoval Lactotoccus lactis subsp. cremoris CCDM 824. Námi detekované rozdíly v konečných koncentracích mezi jednotlivými vzorky s přídavkem kmenů by mohly být způsobeny tím, že u modelových sýrů inokulovaných kmenem CCDM 946 (B2) byly detekovány vyšší počty zejména mléčných koků, a v menší míře i nezákysových laktobacilů. Tyto rozdíly mohou být způsobeny vlivem podmínek reálného systému sýra, který může ovlivňovat růst a vývoj dekarboxyláza pozitivního kmene. Může tak docházet k rozdílné schopnosti dekarboxylovat tyrozin za vzniku tyraminu v porovnání s podmínkami in vitro (v kultivačním médiu). Proto je nutné testovat dekarboxylázovou aktivitu nejen v kultivačních médiích, ale i v reálných systémech potravin. Námi detekované koncentrace tyraminu v sýrech s přídavkem dekarboxyláza pozitivních kmenů jsou vysoké, přičemž více než dvojnásobně překročily hranici označovanou některými autory za toxickou 13. Poděkování: Práce vznikla s finanční podporou Národní agentury pro zemědělský výzkum, projekt QJ programu Komplexní udržitelné systémy v zemědělství a interního grantu UTB ve Zlíně č. IGA/FT/2014/001 financovaného z prostředků specifického vysokoškolského výzkumu. Použitá literatura: 1. NOUT, M.J.R. Fermented foods and food safety. Food Research International. 1994, 27, FOX, P.F. Cheese - chemistry, physics and microbiology, volume 1., 2 nd ed., Springer ISBN FOX, P.F.; McSWEENEY, P.L.H. Dairy chemistry and biochemistry, 1 st edition, Tullamore: Thomson science ISBN ADAMS, M.R.; NOUT, M.J.R. Fermentation and food safety, Gaithersburg: Aspen Publishers ISBN BUŇKOVÁ, L., BUŇKA, F., HLOBILOVÁ, M., VAŇÁTKOVÁ, Z., NOVÁKOVÁ, D., DRÁB, V. Tyramine production of technological important strains of Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus. Europen Food Research and Technology. 2009, 229, BUŇKOVÁ, L., BUŇKA, F., MANTLOVÁ, G., ČABLOVÁ, A., SEDLÁČEK, I., ŠVEC, P., PACHLOVÁ, V., KRÁČMAR, S. The effect of ripening and storage conditions on the distribution of tyramine, putrescine and cadaverine in Edam-cheese. Food Microbiology. 2010, 27, INDRA, Z., MIZERA, J. Chemické kontrolní metody pro obor zpracování mléka. Učebnice pro střední průmyslové školy potravinářské, Praha DADÁKOVÁ, E., KŘÍŽEK, P., PELIKÁNOVÁ, T. Determination of biogenic amines in foods using ultra-performance liquid chromatography (UPLC). Food Chemistry. 2009, 116, SMĚLÁ, D., PECHOVÁ, P., KOMPRDA, T., KLEJDUS, B., KUBÁŇ, V. Chromatographic determination of biogenic amines in dry salami during the fermentation and storage (in Czech). Chemical Papers. 2004, 98, JENNESS, R.; KEENEY, M.; MARTH, E.H. Fundamelntals of dairy chemistry, 3 rd edition Gaithersburg: Aspen publishers ISNB

172 11. FOX, P. F. a kol. Fundamentals of Cheese Science. 1. st ed., Gaithersburg: Aspen Pub-lishers ISBN KLETER, G. The ripening of Gouda cheese made under strictly aseptic conditions. The comparison of activity of different starters and the influence of certain Lactobacillus strains. Netherlands Milk Dairy. 1977, 31, SILLA SANTOS, M.H. Biogenic amines: their importance in foods. International Journal of Food Microbiology. 1996, 29, ROGINSKI, H.; FUQUAY, J.W.; FOX, P.F. Encyclopedia of dairy sciences. London: Academic press ISBN KOMPRDA, T. Obecná hygiena potravin. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita ISBN X. 16. KALAČ, P.; KŘÍŽEK, M. Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich vliv na lidské zdraví. Potravinářská Revue. 2005, 2, SANTOS, W.C., SOUZA, M.R., CERQUEIRA, M.M.O.P., GLÓRIA, M.B.A. Bioactive amines formation in milk by Lactococcus in the presence or not of rennet and NaCl at 20 and 32 C. Food Chemistry. 2003, 81, Kontaktní adresa: Ing. Radka Flasarová, Ústav technologie potravin, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, nám. T. G. Masaryka 5555, Zlín, tel.: , flasarova@ft.utb.cz. 172

173 HODNOTENIE TECHNOLOGICKÝCH VLASTNOSTÍ VYBRANÝCH KMEŇOV LACTOBACILLUS PLANTARUM Bezeková Jana, Čanigová Margita, Lavová Monika, Ducková Viera, Kročko Miroslav Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Evaluation of technological properties selected strains Lactobacillus plantarum Summary: The aim of this study was to determinate technological properties six strains of lactobacilli. All isolates were evaluated for acidifying activity, proteolytic activity and ability to grow in condition of NaCl. The strains of lactobacilli were isolated from raw cow milk. Isolates were identified with commercial biochemical test API 50 CHL and PCR method, as Lb. plantarum. Acidifying activity tested strains reached the value from 7.90 SH to SH in UHT milk at 25 C, 30 C and 37 C. Strain no. 161 showed the highest proteolytic activity in condition of acidity with 5.9 during 48 hours cultivation. The proteolytic activity strains were higher with longer time of cultivation (5 10 days). All tested strains Lb. plantarum grew in conditions with NaCl from 0 to 6 % without their significant decline. Baktérie mliečneho kysnutia patria medzi žiaduce mikroorganizmy tvoriace dominantnú mikroflóru fermentovaných mliečnych výrobkov, ktoré majú významnú úlohu pri vytváraní požadovaných vlastností. Zvláštnu skupinu baktérií mliečneho kysnutia tvoria tzv. NSLAB (neštartovacie baktérie mliečneho kysnutia), ktoré sa napr. do syra dostávajú z iných zdrojov ako sú zákysové kultúry (1). Najväčšie zastúpenie z komplexu NSLAB majú mezofilné laktobacily (2). NSLAB sa vyskytujú prirodzene v mlieku a v prostredí mliekarní (1). Kagkli et al. (3) uvádzajú priemerné počty laktobacilov v surovom kravskom mlieku 1, KTJ.ml -1. NSLAB sú izolované z podlahy, kanalizácie a z povrchov zariadení používaných v mliekarenskom prostredí (4). Prispievajú predovšetkým k rozvoju chuti syrov (5). Podľa Bernardeau et al. (6) pasterizácia ovplyvňuje vznik niektorých prchavých zlúčenín v mlieku, čím nepriamo pôsobí na chuť syrov. Použitie doplnkových kultúr môže zlepšiť chuť syrov vyrobených z pasterizovaného mlieka s porovnateľnými organoleptickými vlastnosťami syrov vyrobených z nepasterizovaného mlieka. Počas zrenia syrov je laktóza z veľkej časti sfermentovaná, ph je medzi 4,9 a 5,3. Teplota v zrecích skladoch je pod 13 C, obsah vody v syre okolo 50 %, koncentrácia soli 4 6 % a k dispozícii je minimálne množstvo kyslíka. Tieto podmienky zrenia vytvárajú neprijateľné prostredie pre väčšinu mikroorganizmov. Naopak baktérie zo skupiny NSLAB majú jedinečnú schopnosť rásť aj v náročných podmienkach (7). Cieľom práce bolo u vybraných kmeňov Lb. plantarum izolovaných zo surového mlieka otestovať vybrané technologické vlastnosti v rôznych rastových podmienkach typických pre výrobu syrov. Materiál a metódy Izolácia laktobacilov z mlieka Prítomnosť NSLAB sa zisťovala vo vzorkách surového kravského mlieka. Na kultiváciu laktobacilov sa použil MRS agar (HiMedia Laboratories, India) a kultivovalo sa pri teplote 37 ± 1 C po dobu 72 hodín za anaeróbnych podmienok (8). Rodová identifikácia laktobacilov Baktérie rodu Lactobacillus vytvárajú na MRS médiu charakteristické kolónie, t.j. biele, šošovkovité až hviezdicovité kolónie o priemere 1 až 3 mm. Vybrané kolónie laktobacilov vyrastené na živnom médiu MRS sa preočkovali čiarovaním na platne MRS agaru. Po kultivácii sa mikroskopicky zistila ich morfológia a príslušnosť podľa Grama. Laktobacily sú grampozitívne paličky samostatné resp. vytvárajúce retiazky a sú katalázanegatívne (9). 173

174 Druhová identifikácia laktobacilov Druhová identifikácia izolátov laktobacilov sa vykonala pomocou komerčnej biochemickej súpravy API 50 CHL (BioMérieux, France). K identifikácii sa použila 24 hodinová kultúra, z ktorej sa pripravila suspenzia s turbiditou rovnou 2. stupňu McFarlandovej zákalovej stupnice na prístroji Densilameter (Lachema, Česká republika). Inkubácia, identifikácia a vyjadrenie výsledkov sa uskutočnilo podľa návodu testu. Izoláty druhovo určené komerčným biochemickým testom sa potvrdil PCR metódou (10). Z vyrastených kolónií mliečnych baktérií na MRS médiu sa vybrané kolónie použili na prípravu 24 hodinovej kultúry a nechali sa pomnožiť v MRS bujóne. Izolácia bakteriálnej DNA sa uskutočnila pomocou komerčného kitu peqgold Bacterial DNA Kit (Peqlab, Germany). Čistota a koncentrácia získanej DNA sa zmerala na prístroji NanoDrop 2000c spectrophotometer (Thermo Scientific, Germany). K 22 µl reakčného mixu, ktorý obsahoval: 100 µl 10 x PCR buffru (Finnzymes, Finland), 20 µl 10 mm deoxynukleozid trifosfát mixu (Carl Roth, Austria), 10 µl 2 U/µl DynaZyme II (DNA polymeráza) (Finnzymes, Finland) a 750 µl sterilnej vody sa pridal 1 µl každého 10 pmol primeru (Fermentas, Germany) a 1 µl testovanej DNA. For GCTGGATCACCTCCTTTC, Rev GAAAGGAGGTGATCCAGC. Amplifikácia sa uskutočnila na prístroji Thermal cycler C1000 (Biorad, USA). Preinkubácia prebiehala pri teplote 94 C počas 2 min. V 30 cykloch sa opakovala denaturácia pri 94 C 30 sekúnd, annealing pri 56 C 40 sekúnd a elongácia pri 72 C 1 min. Záverečný predlžovací krok sa uskutočnil pri teplote 72 C počas 5 min. PCR fragmenty sa získali na 2 % agarózovom géle pri 80 V a 2000 ma po dobu 50 minút, farbili sa pomocou etídium bromidu a vizualizovali pod UV svetlom. Sekvencia špecifických primerov pre Lb. plantarum (220 bp) (10). Stanovenie kysacej aktivity laktobacilov Kysacia aktivita vybraných izolátov laktobacilov sa sledovala v UHT mlieku cez zmenu titračnej kyslosti v SH počas kultivácie pri teplote 25, 30 a 37 ± 1 C v pravidelných časových intervaloch 0, 18, 24, 40 a 48 hodín. Stanovenie proteolytickej aktivity laktobacilov Proteolytická aktivita sa zistila difúznou metódou na mäsopeptónovom agare (HiMedia Laboratories, India) s 10 % tným prídavkom obnoveného sterilného odstredeného mlieka (ph média = 5,9 a 7,4). Kultivácia prebiehala pri teplote 7, 25, 30 a 37 ± 1 C po dobu 10 dní za anaeróbnych podmienok GENbox generators (BioMérieux, France). Vytvorené zóny sa po ukončení kultivácie prelievali 1 %-tným roztokom HCl (11). Pri sledovaní proteolytickej aktivity sa merali zóny vyčírenia agaru v okolí naočkovaného izolátu v mm. K hodnoteniu vyššie uvedených aktivít sa použila 24 hodinová kultúra pomnožená v MRS bujóne s hustotou 0,5 McFarland zákalovej stupnice Densilameter (Lachema, Česká republika). Testovanie rastu laktobacilov v prostredí so soľou Skúška sa vykonala sledovaním rastu laktobacilov na MRS médiu (ph = 5,9) s prídavkom NaCl (koncentrácia 0, 2, 4, 6 %) pri teplote 7, 25, 30, 37 ± 1 C po dobu 72 hodín za anaeróbnych podmienok GENbox generators (BioMérieux, France) (12). Výsledky a diskusia U 6 náhodne vybraných kmeňov laktobacilov sa hodnotila kysacia aktivita, proteolytická aktivita a schopnosť rastu v prostredí s rôznou koncentráciou solí. Izoláty laktobacilov boli podľa výsledkov biochemického testu API 50 CHL identifikované ako Lb. plantarum, čo sa potvrdilo aj následnou PCR identifikáciou. Obrázok 1 vyjadruje priebeh fermentácie laktózy spôsobenej kmeňmi Lb. plantarum v závislosti od teploty po 48 hod. kultivácii. Najvyššiu kysaciu aktivitu z kmeňov druhu Lb. plantarum dosahoval kmeň č. 161 pri teplote 30 C. Kysacia aktivita ostatných izolátov laktobacilov druhu Lb. plantarum nie je výrazná. Za zákysové sa považujú tie baktérie mliečneho kysnutia, ktoré majú schopnosť produkovať v mlieku pri 30 až 37 C za 6 hodín toľko kyseliny 174

175 mliečnej, ktorá zníži kyslosť mlieka z pôvodného ph asi 6,8 na hodnotu ph < 5,3 (13). Schopnosť prekysávať naočkované UHT mlieko sa u všetkých testovaných kmeňov začala prejavovať až po 24 hodinách kultivácie. Obr. 1. Kysacia aktivita v SH kmeňov Lb. plantarum (kmene č. 152, 153, 161, 167, 177, 178) pri teplotách 25, 30 a 37 C po 48 hodinách kultivácie v UHT mlieku Pri testovaní proteolýzy u kmeňov č. 152 a č. 153 nebola zaznamenaná žiadna proteolytická aktivita pri všetkých sledovaných teplotách. Najvyššiu aktivitu dosiahol kmeň č. 177 pri teplote 25 C a 30 C po 10 dňoch kultivácie tabuľka I. Schopnosť proteolýzy sa zvyšovala s dobou kultivácie. Tabuľka I Proteolytická aktivita (veľkosť zón v mm) laktobacilov naočkovaných v UHT mlieku po 48 hod predkultivácii v závislosti od doby, teploty a pri ph 5,9 Izolát 7 C 25 C 30 C 37 C číslo 5 dní 10 dní 5 dní 10 dní 5 dní 10 dní 5 dní 10 dní Skúmaním technologických vlastností druhu Lb. plantarum sa zaoberali aj Nieto-Arribas et al. (14). Kmeň Lb. plantarum PBL207 podľa týchto autorov vykazoval vysokú proteolytickú aktivitu. Zatiaľ čo autori Sánchez et al. (15) uvádzajú výraznú proteolýzu u kmeňov Lb. paracasei subsp. paracasei (QC28 a QC35), u kmeňa Lb. plantarum ju nezistili. Všetky testované kmene Lb. plantarum boli schopné rastu v prostredí s prídavkom 0 až 6 % NaCl pri teplote 30 C. V tomto prostredí dosahovali všetky kmene počty rádovo 6 7 log KTJ.ml -1. Takmer rovnako sa správali testované kmene Lb. plantarum pri teplote 37 C až na kmeň č. 167, u ktorého v prostredí s koncentráciou 6 % NaCl klesli počty o polovicu na úroveň 3 log KTJ.ml -1. Pri koncentrácii soli 6 % a teplote kultivácie 25 C sa zistil u viacerých kmeňov pokles ich počtu. Tabuľka II uvádza počty laktobacilov v MRS médium pri rôznych teplotách a koncentráciách soli. 175

176 Tabuľka II Rast izolátov laktobacilov v MRS médiu s rôznou koncentráciou NaCl v závislosti od teploty Izolát číslo Teplota Koncentrácia NaCl v % Počty laktobacilov (KTJ.ml -1 ) 7 C C 1, , , , C 1, , , , C 2, , , , C C 1, , , , C 1, , , , C 1, , , , C C 6, , , , C 1, , , , C 1, , , , C C 1, , , , C 1, , , , C 7, , , , C C 1, , , , C 1, , , , C 1, , , , C C 1, , , , C 1, , , , C 9, , , , Záver Zo získaných výsledkov možno konštatovať, že kmene z druhu Lb. planturum vykazovali slabú kysaciu aktivitu. Napriek nízkej schopnosti fermentácie laktózy, boli všetky kmene schopné prežívať v prostredí s vyšším prídavkom NaCl. Jeden kmeň vykazoval zaujímavú proteolytickú aktivitu. Pre použitie kmeňov z druhu Lb. plantarum v mliekarenskej praxi je potrebné tieto kmene otestovať na mnoho ďalších vlastností, nielen technologických, ale aj z hľadiska zdravotnej bezpečnosti. Poďakovanie: Príspevok vznikol s finančnou podporou Európskeho spoločenstva v rámci projektu: Vybudovanie výskumného centra AgroBioTech, projekt číslo Práca sa riešila za finančnej podpory grantovej výskumnej úlohy VEGA projektu č. 1/0679/

177 Použitá literatúra: 1. TŮMA, Š. PLOCKOVÁ, M Protektívní kultury pro výrobu polotvrdých syrů. In Mléko a sýry 2007 (sborník přednášek semináře), Praha, 2007, s , ISBN SMIT, G Dairy Procesing Improving Quality. London: Woodhead Publishing, 2003, 545 s., ISBN KAGKLI, D. M. VANCANNEYT, M. HILL, C. VANDAME, P. COGAN, T. M Enterococcus and Lactobacillus contamination of raw milk in a farm dairy environment. In International Journal of Food Microbiology, roč. 114, 2007, s FOX, P. F. McSWEENEY, P. L. H Dairy chemistry and biochemistry. London: Springer Verlag, 2004, 478 s., ISBN THAGE, B. V. BROE, M. L. PETERSEN, M. H. PETERSEN, M. A. BENNEDSEN, M. ARDÖ, Y Aroma development in semi-hard reduced-fat cheese inoculated with Lactobacillus paracasei strains with different aminotransferase profiles. In International Dairy Journal, roč. 15, 2005, s BERNARDEAU, M. VERNOUX, J. P. DUBERNET, S. H. GUÉGUEN, M Safety assessment of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus. In International Journal of Food Microbiology, roč. 126, 2008, s WOUTERS, J. T. M. AYAD, E. H. E. HUGENHOLTZ, J. SMITH, G Microbes from raw milk for fermented dairy products. In International Dairy Journal, roč. 12, 2002, s STN ISO Fermented milk products bacterial starter cultures standard of identity. Bratislava: SÚTN, s. 9. HAVLOVÁ, J. JIČÍNSKA, E. HRABOVÁ, H Mikrobiologické metody v kontrole jakosti mléka a mlékarenskych výrobků. Praha: ÚZP, 1993, 243 s., ISBN BERTHIER, F. BEUVIER, E. DASEN, A. GRAPPIN, R Origin and diversity of mesophilic lactobacilli in Comté cheese, as revealed by PCR with repetitive and species-specific primers. In International Dairy Journal, roč. 11, 2001, s BETINA, V. BARÁTHOVÁ, H. FARGAŠOVÁ, A. FRANK, V. HORÁKOVÁ, K. ŠTURDÍK, E Mikrobiologické laboratórne metódy. Bratislava: Alfa, 1987, 544 s. 12. INTERNATIONAL IDF STANDARD 149A: s. 13. GÖRNER, F. VALÍK, Ľ Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava: Malé centrum, 2004, 528 s., ISBN NIETO-ARRIBAS, P. POVEDA, J. M. SESENA, S. PALOP, L. CABEZAS, L Technological characterization of Lactobacillus isolates from traditional Manchego cheese for potential use as adjunct starter cultures. In Food Control, roč. 20, 2009, s SÁNCHEZ, J. I. SESENA, S. POVEDA, J. M. CABEZAS, L. PALOP, L Phenotypic and genotypic characterization of lactobacilli isolated from Spanish goat cheeses. In International Journal of Food Microbiology, roč. 102, 2005, s Kontaktná adresa: Ing. Jana Bezeková, PhD. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, Nitra, Slovenská republika, j.bezekova@gmail.com 177

178 178

179 VYBRANÉ TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI LAKTOBACILOV IZOLOVANÝCH Z KOZIEHO MLIEKA Klapáčová Lýdia 1, Slottová Anna 2, Bujňáková Dobroslava 3, Greif Gabriel 2, Kmeť Vladimír 3, Drončovský Maroš 2, Greifová Mária 2, Kološta Miroslav 2, Tomáška Martin 2, Dudriková Eva 1 1 Univerzita veterinárského lekárstva a farmácie v Košiciach; Košice, Slovensko 2 Výskumný ústav mliekárenský, a.s.; Žilina, Slovensko 3 Ústav fyziológie hospodárskych zvierat, Slovenská akadémia vied; Košice, Slovensko Certain processing properties of lactobacilli isolated from goat s milk Summary: Our work was focused on testing of certain processing properties of lactobacilli isolated form raw goat s milk, after spontaneous fermentation without thermal treatment and without addition of starters. Presumptive lactobacilli were isolated on MRS medium and they were identified by MALDI-Tof MS method. Strains of L. paracasei 21L10, L. johnsonii KB2-1 and L. paraplantarum/plantarum 25/1L were characterised for several attributes, like: growth on milk, proteolytic activity, influence of NaCl addition and also production of diacetyl, CO 2 and organic acids. According to measured results, the strains can be utilised as starters or starter adjuncts, in production of cheeses from pasteurised goat s milk. Úvod Produkcia kozieho mlieka je rýchlo rastúci priemysel, ktorý má zásadný význam pre živobytie pre stovky miliónov ľudí na celom svete a je dôležitou súčasťou ekonomík mnohých krajín. Aj na Slovensku sa chov kôz teší pomerne veľkej popularite. Oproti ovčiarstvu však nie sú chovatelia kôz tak organizovaní a prevláda využitie a spracovanie mlieka predovšetkým na vlastné účely. Koziemu mlieku sa oprávnene pripisujú viaceré pozitívne zdravotné účinky, predovšetkým nižší alergénny potenciál, celkovo lepšie dietetické vlastnosti a aj určitý ochranný potenciál (1). Na druhej strane treba pri mlieku kozom brať do úvahy zvýšené riziko encefalitídy a preto sa odporúča kozie mlieko konzumovať a spracovať po tepelnom ošetrení (2). Pri výrobe fermentovaných výrobkov z kozieho mlieka, ako sú syry, kyslomliečne nápoje a pod., je samozrejme možné použiť komerčné štartovacie kultúry, čím sa však značne znižuje rozmanitosť tzv. divokých kyslomliečnych baktérií. Cieľom našej práce bolo otestovať vybrané technologické vlastnosti laktobacilov izolovaných zo surového kozieho mlieka za účelom budovania zbierky pre použitie v technológii spracovania kozieho mlieka. Materiál a metódy Prezumptívne laktobacili boli izolované z výrobkov založených na surovom kozom mlieku, vyrobených bez tepelného ošetrenia a bez prídavku štartovacích kultúr. Izolácia bola vykonaná pomocou MRS média (Merck, Darmstadt, Nemecko), po naočkovaní vhodne nariadených vzoriek a po kultivácii pri 37 C počas 24h až 72h. Typické kolónie boli preočkované viac krát a potom boli identifikované pomocou MALDI-Tof MS metódy na zariadení Microflex LT (Bruker Daltonik, Leipzig, Nemecko) (3). Vplyv kultivačnej teploty na rast kmeňov a metabolickú aktivitu sa sledoval v MRS médiu meraním absorbancie (pri 600nm) resp. ph. MRS média boli naočkované nočnou kultúrou príslušného kmeňa (1%) a boli kultivované pri testovanej teplote stanovený čas. Vplyv NaCl na rast a metabolickú aktivitu kmeňov sa sledoval obdobne, ako vplyv teploty. Naočkované MRS média boli kultivované pri teplote 37 C. Špecifická rastová rýchlosť (µ m ) a lag fáza (λ) boli počítané z Gompertzovej funkcie za použitia softvéru TableCurve 2D pre Windows (Jandel Scientific, California, USA) a Origin 8.1 (Microcal Software, Northampton, USA) (4). Na stanovenie produkcie organických kyselín bolo použité surové kravské mlieko sterilizované autoklávovaním. Laktóza v mlieku bola hydrolyzovaná odporúčaným prídavkom komerčného reparátu laktázy Maxilact (DSM, Heerlen, Holandsko). Organické kyseliny boli 179

180 stanovené pomocou metódy HPLC. Na meranie sa použil kvapalinový chromatograf DeltaChrom osadený kolónou Polymer IEX H + (250mm x 8mm) (Watrex, Bratislava, Slovakia). Podmienky HPLC analýzy organických kyselín v odobratých vzorkách boli nasledovné: Dávkovanie vzorky: 20μl, teplota (50,0 C ± 0,1 C), mobilná fáza: 9mM H 2 SO 4, prietok mobilnej fázy: 1cm 3.min -1, detektor UV pri 210nm. Výsledné koncentrácie boli vyhodnocované pomocou kalibračných čiar, pričom sa berie do úvahy riedenie a návažok vzorky. Tvorba CO 2 bola posúdená podľa tvorby plynu v Durhamových skúmavkách počas kultivácie kmeňov v MRS médiu pri 37 C počas 24h. Produkcia diacetylu sa sledovala vizuálne v mlieku, ktoré bolo fermentované testovanými kmeňmi pri 30 C a 37 C počas 24h. 1ml fermentovaného mlieka sa následne zmiešal s 0,5ml 16% KOH (Merck, Darmstadt, Nemecko) a s 0,5ml 1% α-naftolu (Merck, Darmstadt, Nemecko). Zmes bola inkubovaná pri 30 C počas 10min. Potom sa pozorovala farba zmesi ružová indikovala tvorbu diacetylu. Proteolytická aktivita sa hodnotila pomocou veľkosti čírych zón, vytvorených okolo 1,3cm jamiek vytvorených v M17 agare (Merck, Darmstadt, Nemecko) s prídavkom 10% sušeného odtučneného mlieka na Petriho miskách. Do jamiek bolo napipetovaných 100μl koncentrovanej suspenzie testovaného kmeňa. Následne boli Petriho misky kultivované pri 37 C počas 24h. Výsledky a diskusia Kozie mlieko je zaujímavé z viacerých hľadísk. Tým, že je pastva kôz bohatšia, ako u iných zvierat produkujúcich mlieko, je toto bohatšie na viaceré zložky chemického pôvodu, ale aj na sprievodnú mikroflóru. V našich experimentálnych prácach bolo izolovaných niekoľko kmeňov kyslomliečnych baktérií z prostredia spracovania surového kozieho mlieka. Boli to predovšetkým laktokoky, laktobacily a enterokoky. Tu je popísaná selekcia a vybrané technologické vlastnosti troch kmeňov laktobacilov. Ich identifikácia je uvedená v Tab. I. Keďže sa jedná o laktobacily, bola testovaná ich schopnosť rásť pri teplotách 30 C a 37 C, ktoré sú pre tento rod typické a ktoré sa využívajú aj v mliekarenskej technológii. Z Tab. II je zrejmé, že testované kmene rástli lepšie pri teplote 37 C. Hoci táto teplota bola vhodnejšia pre rast, nemusí byť optimálnou aj pre ich metabolickú aktivitu (5). Schopnosti rastu pri teplote 30 C boli výrazne horšie najmä u kmeňa KB2-1. Okrem týchto optimálnych teplôt bol testovaný aj rast pri teplote 15 C a 45 C. Pri teplote 15 C rástol po 24h kultivácii iba kmeň 21L10 a pri teplote 45 C tiež najmä tento kmeň, ostatné menej výrazne. Vo všeobecnosti však platí, že laktobacili rastú skôr pri teplote 15 C, ako pri teplote 45 C (6). Rast v prostredí NaCl je dôležitý, pretože táto látka sa bežne používa pri výrobe syrov. Množstvo NaCl býva variabilné, podľa toho o aký syr sa jedná. V Tab. III je zobrazený pokles ph počas 48.5h kultivácie kmeňov v MRS médiu s prídavkom 0%, 2% resp. 5% NaCl. Z tabuľky je zrejmé, že kmeň KB2-1 bol najviac citlivý na prítomnosť NaCl pri 5% prídavku takmer neprodukoval organické kyseliny a ani nerástol. Naopak zvyšné dva kmene boli inhibované iba minimálne. Podobné štúdie s laktobacilmi uvádza aj Gänzle a kol. (7), kde sa rast laktobacilov úplne zastavil už pri 4% koncentrácii NaCl. Tabuľka I Identifikácia kmeňov laktobacilov izolovaných zo surového kozieho mlieka a identifikovaných pomocou metódy MALDI-Tof MS Kmeň 1. identifikácia 2. identifikácia 21L10 Lactobacillus paracasei Lactobacillus paracasei KB-2/1 Lactobacillus johnsonii Lactobacillus gaserii* 25/1L Lactobacillus paraplantarum Lactobacillus plantarum * Skóre pod 2, čo je nižšia pravdepodobnosť identifikácie 180

181 Tabuľka II Vplyv kultivačnej teploty na rast a metabolickú aktivitu kmeňov laktobacilov na MRS médiu, po 24,5h kultivácii 30 C 37 C Kmeň μ m (h -1 ) λ(h) μ m (h -1 ) λ(h) 21L10 0,203 4,4 0,282 3,5 KB-2/ ,222 3,3 25/1L 0,299 4,3 0,390 3,6 μ m je špecifická rastová rýchlosť a λ je lag fáza Tabuľka III Vplyv prídavku NaCl na metabolickú aktivitu kmeňov laktobacilov kultivovaných na MRS médiu pri 37 C počas 48,5h ph Kmeň 0% NaCl 2% NaCl 5% NaCl 21L10 3,83 3,62 3,74 KB-2/1 3,88 4,26 5,41 25/1L 3,87 3,68 3,75 Kyselina mliečna patrí medzi základné metabolické produkty kyslomliečnych baktérií. Tieto môžu produkovať aj iné organické kyseliny, predsa však uvedená kyselina býva dominujúca. Na Obr. 1 je zobrazená produkcia organických kyselín testovanými kmeňmi po fermentácii na kravskom mlieku pri teplote 37 C. Z obrázka je zrejmé, že bez prídavku laktázy dva kmene (21L10 a 25/1L) kyselinu mliečnu produkovali iba minimálne. Kmeň KB2-1 vyprodukoval po 4,2 g.l -1 kyseliny mliečnej. Prídavok laktázy do mlieka a následná fermentácia za rovnakých podmienok tvorbu kyseliny mliečnej značne stimulovala a kmene 21L10 a 25/1L vyprodukovali v rovnaký čas 8,2 g.l -1 resp. 6,4 g.l -1 kyseliny mliečnej. Je prirodzené, že hydrolýza laktózy pred fermentáciou vo všeobecnosti väčšinou zvýši jej efektívnosť, kvôli dostupnosti ľahšie utilizovateľného zdroja uhlíka - glukózy (8). Produkcia kyseliny octovej bola pod kvantifikačný limit použitej metódy (HPLC) L10 21L10* KB2-1 25/1L 25/1L* 24h 36h 48h Obr. 1. Produkcia kyseliny mliečnej (g.l -1 ) kmeňmi laktobacilov počas fermentácie na kravskom mlieku. (*) sú označené fermentácie s prídavkom laktázy 181

182 Produkcia CO 2 u kyslomliečnych baktérií všeobecne závisí od toho, či sú homo, alebo heterofermentatívne. CO 2 môže mať priaznivý ochranný účinok. Na druhej strane môže spôsobovať u konzumentov nadmiernu flatulenciu. Ani jeden z testovaných kmeňov neprodukoval CO 2 (kultivácia pri 37 C). To je spolu s výlučnou produkciou kyseliny mliečnej indikátorom, že kmene boli homofermentatívne. Tieto kmene laktobacilov sú zvyčajne fakultatívne heterofermentatívne (Lbc. plantarum, Lbc. paraplantarum a Lbc. casei) alebo obligátne homofermentatívne (Lbc. johnsonii) (9). Diacetyl je látka, ktorá sa výrazne podieľa na priaznivom senzorickom profile predovšetkým zakysaných mliečnych výrobkov, ale čiastočne aj syrov. Skríningová produkcia diacetylu pri dvoch testovaných teplotách je prezentovaná v Tab. IV. Z tabuľky vyplýva, že ani jeden z kmeňov nemôže byť považovaný za výrazného producenta diacetylu. Typickým producentom tejto látky je Leuconostoc mesenteroides, ale môžu ho produkovať aj niektoré kmene laktobacilov, napr. Lactobacillus rhamnosus (10). Tabuľka IV Produkcia diacetylu pri 24h fermentácii mlieka kmeňmi laktobacilov Kmeň 30 C 37 C 21L KB-2/ /1L + - Intenzita produkcie diacetylu sa posudzuje podľa sfarbenia výslednej reakcie v rozmedzí od (-) až po (+++) Proteolytická aktivita kyslomliečnych baktérií môže mať pozitívny aj negatívny vplyv na celkové senzorické vlastnosti syrov (11). Je neoddeliteľnou súčasťou zrenia syrov. Avšak môže spôsobovať aj vznik horkých peptidov, ktoré sú problematické. Pri zvolených testovaných podmienkach (M17 agar s prídavkom sušeného mlieka, kultivácia pri 37 C) žiaden z kmeňov nevykazoval výraznú proteolytickú aktivitu. Záver Mlieko je jedným zo substrátov, v ktorom sa bežne vyskytujú baktérie mliečneho kysnutia. V posledných rokoch sa čoraz väčší záujem mliekarenských odborníkov sústreďuje na izoláciu a charakteristiku vlastností nových kmeňov týchto baktérií, okrem iného aj z rodu Lactobacillus. Baktérie mliečneho kysnutia sú antagonistami nežiaducich mikroorganizmov v potravinách. Prostredníctvom nich sa predlžuje trvanlivosť, zvyšuje kvalita a v mnohých prípadoch aj zdravotná neškodnosť potravín. Okrem toho, proces fermentácie priaznivo ovplyvňuje senzorické vlastnosti a akceptovateľnosť niektorých zložiek potravín. Významným inhibične pôsobiacim faktorom pri fermentácii je kyselina mliečna. Testované kmene produkovali výlučne kyselinu mliečnu, pričom produkcia bola ovplyvnená predovšetkým ich schopnosťou utilizovať laktózu. Hoci kmene nepatrili k výrazným producentom kyseliny mliečnej, senzorické vlastnosti koagulátu na mlieku boli veľmi príjemné. Na základe sledovania rastu pri rôznej koncentrácii soli môžeme usúdiť, že 2% prídavok NaCl nepôsobil inhibične na rast testovaných laktobacilov, s výnimkou kmeňa Lbc. johnsonii KB2-1. Pri 5% koncentrácii soli kmeň KB2-1 už nerástol vôbec a pri zvyšných dvoch sledovaných kmeňoch (Lbc. paracasei 21L10 a Lbc. paraplantarum/plantarum 25/1L) 5% koncentrácia NaCl spôsobovala spomalenie ich rastu. Laktobacily mali nízku proteolytickú aktivitu a nízku produkciu diacetylu a žiaden neprodukoval CO 2. Získané výsledky sa využijú pri ďalšom skríningu izolovaných kmeňov a po doplnení o ostatné charakteristiky (produkcia biogénnych amínov, rezistencia na ATB, prežívanie v GITe, antimikrobiálna aktivita, produkcia senzoricky aktívnych látok a pod.), môžu byť kmene využité najmä v štartovacích a doplnkových kultúrach pri výrove syrov z pasterizovaného kozieho mlieka. 182

183 Poďakovanie: Práca vznikla s podporou projektov: Izolácia, identifikácia a charakterizácia kyslomliečnych baktérií pre ich aplikáciu v mliekarenskom priemysle ITMS kód projektu: a Kompetenčné centrum pre biomodulátory a výživové doplnky (Probiotech) ITMS , ktoré boli spolufinancované z Európskeho fondu regionálneho rozvoja, ako aj projektu KEGA č. 011UVLF-4/2012 Použitá literatúra: 1. Silanikove, N., Leitner, G., Merin, U., Posser, C.G Recent advances in exploiting of goats milk: Quality, safety and production aspects. Small Ruminant Research. 89 (1-3), Zavadska, D., Anca, I., André, F., Bakir, M., Chlibek, R., Čižman, M., Ivaskeviciene, I., Mangarov, A., Mészner, Z., Pokorn, M., Prymula, R., Richter, D., Salman, N., Šimurka, P., Tamm, E., Tešović, G., Urbancikova, I., Usonis, V Recommendations for tick-borne encephalitis vaccination from the Central European Vaccination Awareness Group (CEVAG). Hum Vaccin Immunother, 9 (2), Bessede, E., Angla-gre, M., Delagarde, Y., Sep Hieng, S., Ménard, A., & Mégraud F Matrixassisted laser-desorption/ionization BIOTYPER: experience in the routine of a University hospital. Clinical Microbiology and Infection, 17 (4), Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K Modelling of the bacterial growth curve. Applied Environmental Microbiology, 56 (6), Hujanen, M., Linko, Y. -Y Effect of temperature and various nitrogen sources on L(+)-lactic acid production by Lactobacillus casei. Journal of Microbiology and Biotechnology, 45 (3), Kandler, O., and N. Weiss Genus Lactobacillus V, P. H. A. Sneath a kol. (ed.), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2, 9-te vydanie Williams and Wilkins, Baltimore. 7. Gänzle, M. G., Ehmann, M., Hammes, W. P Modeling of growth of Lactobacillus sanfranciscensis and Candida milleri in response to process parameters of sourdough fermentation. Applied Environmental Microbiology, 64 (7), Vandák, D., Tomáška, M., Zigová, J. and Šturdík, E Effect of growth supplements and whey pretreatment on butyric acid Production by Clostridium butyricum. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 11(3), Stiles, M. E., Holzapfel, W. H Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International Journal of Food Microbiology. 36 (1), Jyoti, B.D., Suresh, A.K., Venkatesh, K.V Diacetyl production and growth of Lactobacillus rhamnosus on multiple substrates. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 19(5), Singh, T.K.; Cadwallader, K.R Cheese V, R.C. Chandan a kol. (ed.), Dairy Processing and Quality Assurance. Wiley-Blackwell, New Jersey. Kontaktná adresa: MVDr. Lýdia Klapáčová, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach, Komenského 73, Košice, Slovensko klapacol@gmail.com 183

184 184

185 HODNOTENIE SENZORICKÝCH VLASTNOSTÍ ČERSTVÝCH SYROV S PRÍDAVKOM PROBIOTICKEJ KULTÚRY Čanigová Margita, Flimelová Erika, Kňazovická Vladimíra, Ducková Viera Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Evaluation of sensory properties in fresh cheeses with addition of probiotic culture Summary: The aim of this study was to evaluate the possibility of probiotic culture using in fresh cheeses and to assess the influence of probiotic culture on the sensory properties of the cheeses during 15 days at cooling temperature at 7 ± 1 C. In the first series of experiments, probiotic culture (0.1% w/w) was added to the dressing of fresh cheese. Probiotic culture consisted of Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus and Bifidobacterium sp. Dressing was prepared from sour cream (with fat content of 10% w/w) and salt (in amount of 2% per weight of cheese). In sensory analysis, significant differences (P 0.05) in the control samples (C) were found in the smell between the 1 st and 15 th day of storage and between the 10 th and 15 th day of storage. Experimental samples (P1 - with the addition of probiotic cultures in the dressing) did not show significant differences (P 0.05) in the sensory parameters between the days of storage. In the second series of experiments, probiotic culture (P11; 0.05% (w/w)) was added directly into the milk before coagulation. Results from sensory evaluation of experimental cheese samples (P11) showed that, this technology of fresh cheese with probiotic culture in the milk is not suitable. In term of sensory evaluation, fresh cheese with addition of probiotic cultures into the dressing was assessed as optimal product. V správnej výžive človeka zaujímajú syry významné postavenie vďaka typickým senzorickým vlastnostiam, obsahu bielkovín, tuku, vápnika, fosforečných zlúčenín a v neposlednom rade vitamínov. V súčasnej dobe je snahou výrobcov produkovať široký sortiment syrov ochutených rôznym spôsobom a obohatených o ďalšie zložky. Chuť čerstvých syrov môže byť obohatená o príchuť napr. pažítky, ďalších rôznych byliniek, orientálneho korenia a pod. Tieto ochucujúce látky sú v prevažnej miere aplikované na povrch hotového výrobku. V prípade tvrdých zrejúcich syrov sa väčšinou ochucujúce látky aplikujú ešte v procese výroby samotného syra. Ako prídavné ochucujúce látky alebo aromatické látky sa používajú napr. viacfarebné celé korenie, oriešky, niektoré druhy zeleniny (mrkva, rajčiny, chilli, paprika), aromatické bylinky, hrozienka a iné. Na celom svete je v súčasnosti trendom produkcia čo najväčšieho množstva potravín s priaznivým vplyvom na zdravie človeka. Snahou výrobcov syrov je produkcia syrov obohatených o zdraviu prospešné zložky ako sú napr. probiotické kultúry. Tieto sú pridávané z dôvodu dosiahnutia pozitívneho účinku na ľudský organizmus, prípadne môžu zastávať funkciu štartovacích kultúr (1). Použitie mliečnych baktérií s probiotickými účinkami sa stáva čoraz rozšírenejším, keďže tieto baktérie produkujú zlúčeniny, ktoré pôsobia inhibične na nežiaduce mikroorganizmy (2) a všeobecne sa predpokladá, že majú priaznivý účinok na zdravie spotrebiteľov (3). Syry sú pre probiotické baktérie dobrým nosičom, pretože v porovnaní napr. s jogurtom, majú vyššie ph, pevnejšiu konzistenciu, nižšiu koncentráciu kyslíka a lepšie tlmivé vlastnosti, ktoré chránia probiotické baktérie pred žalúdočnými šťavami (4, 5). Tým sa vytvárajú podmienky na to, aby sa zdraviu prospešné probiotické mikroorganizmy dostali v dostatočných množstvách do tráviaceho traktu človeka. Cieľom práce bolo otestovanie prídavku probiotickej kultúry do čerstvého syra v dvoch rozdielnych výrobných krokoch a zistiť vplyv tejto kultúry na senzorické vlastnosti syra počas jeho skladovania. 185

186 Materiál a metódy K výrobe čerstvých syrov sa použilo pasterizované polotučné mlieko (obsah tuku 1,5 hmot. %) z obchodnej siete. Syriteľnosť mlieka sa upravila prídavkom 40 %-ného nasýteného roztoku CaCl 2. Mlieko sa zahrialo na teplotu 31 C a pridala sa smotanová kultúra (Laktoflora, Česká republika). Po pridaní syridla Reniláza (Christian Hansen, Dánsko) sa mlieko dôkladne premiešalo a nasledovalo zrážanie po dobu 5 hodín. Po vyzrážaní sa syrenina krájala, drobila, stužovala a dohrievala. Po dosušení sa zliala srvátka a syrové zrno sa premývalo studenou vodou. Získané tuhé zrná sa nechali odkvapkať. Následne sa zistila hmotnosť zŕn a pridal sa dessing. Ten sa pripravil z kyslej smotany (obsah tuku 10 hmot. %) a kuchynskej soli (2 % na hmotnosť syra). Dressing sa pridával k vyrobeným syrovým zrnám v pomere 1 diel dressingu a 2 diely syra. V prvej sérii pokusov sa pripravila kontrolná vzorka syra (K) bez prídavku probiotickej kultúry a pokusná vzorka syra (P1) s prídavkom probiotickej kultúry, pričom kultúra sa pridávala do dressingu (0,1 hmot. % kultúry k hmotnosti syra). Ako probiotická kultúra sa použila kultúra zložená zo Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium sp. (Laktoflora, Česká republika). V druhej sérii pokusov sa pri výrobe pokusnej vzorky syra (P11) probiotická kultúra aplikovala do mlieka pred pridaním syridla v množstve 0,05 hmot. %. V každej sérii pokusov sa výroba syrov zopakovala šesťkrát. Syry sa po výrobe rozdelili do plastových uzatvárateľných nádob a skladovali sa v chladničke (7±1 C) po dobu 15 dní. Senzorické vlastnosti syrov sa hodnotili v 1., 6., 10. a 15. deň po výrobe. Hodnotili sa chuť, vôňa, farba, vyrovnanosť syrového zrna a textúra (6). Hodnotenie vykonávala 6-členná skupina laických hodnotiteľov bodovým testom. V prípade najlepšieho hodnotenia bolo pridelených 5 bodov, v prípade najhoršieho hodnotenia 0 bodov. Získané výsledky sa spracovali štatisticko-variačnými metódami programom SAS. Výsledky a diskusia Aj napriek mnohým pozitívnym zmenám, ktoré sa v oblasti mliekarenského priemyslu na Slovensku udiali, je tento priemysel v útlme a spotreba syrov, mlieka a mliečnych výrobkov je v posledných rokoch vo všeobecnosti veľmi nízka (7). Jednou z možností ako zatraktívniť syry a zvýšiť ich spotrebu je rozšíriť výrobu ochutených syrov a syrov obohatených o zložky priaznivo pôsobiace na zdravie človeka napr. prídavok probiotických kultúr. Rozhodujúcim ukazovateľom pre výrobu takýchto typov syrov sú ich senzorické vlastnosti. V tabuľke I sú uvedené výsledky hodnotenia senzorických vlastností vzoriek čerstvých syrov s dressingom bez prídavku probiotickej kultúry (K) a s prídavkom probiotickej kultúry (P1) počas 15 dňového skladovania v chlade. Ako vyplýva z tabuľky I, počas skladovania vzoriek syrov prebiehali najvýraznejšie zmeny vo vôni a chuti. Hodnotitelia uvádzali na 10-ty, resp. na 15-ty deň hodnotenia kontrolných vzoriek syrov horkú chuť syrových zŕn a cudziu kvasničnú vôňu. Štatisticky významné rozdiely (P 0,05) sa zistili u kontrolných vzoriek syrov v prípade zmien vône medzi 1. a 15. dňom a medzi 10. a 15. dňom (P 0,05). Pokusné vzorky (P1) nevykazovali v hodnotách senzorických parametrov štatisticky významné rozdiely medzi dňami (P 0,05). Chyby v chuti a vôni kontrolných vzoriek syrov zrejme súviseli s ich vyššou aktívnou kyslosťou (na 10. a 15. deň) a prítomnosťou kvasiniek. Vo vzorkách syrov s probiotickou kultúrou sa takéto zmeny nezaznamenali. Počty mliečnych baktérií v tomto type syra sa do 10. dňa skladovania udržiavali na úrovni 10 7 KTJ.g -1 a potom mierne klesli. Na základe celkového senzorického hodnotenia sa čerstvý syr s probiotickou kultúrou v dressingu vyhodnotil ako akceptovateľný. Pri použitom spôsobe balenia, by mohla byť vzhľadom na zistené vlastnosti a počty mliečnych baktérií jeho trvanlivosť 10 až 12 dní. Dá sa predpokladať, že pri použití novších metód balenia akou je napr. modifikovaná atmosféra, by bolo možné predĺžiť trvanlivosť aj na viac dní. Balenie čerstvých výrobkov vyrábaných z mlieka v modifikovanej atmosfére pokladajú za vhodné viacerí autori vedeckých štúdií (8, 9). Výsledky senzorického hodnotenia čerstvých syrov s dressingom bez (K) a s prídavkom probiotickej kultúry do mlieka (P11) uvádza tabuľka II. 186

187 Tabuľka I Senzorické hodnotenie vzoriek čerstvých syrov bez (K) a s prídavkom probiotickej kultúry (P1) do dressingu počas 15 dní skladovania pri 7±1 C Parameter Farba Vôňa Chuť Textúra Vyrovnanosť zrna Celkový dojem Vzorky syrov K P1 K P1 K P1 K P1 K P1 K P1 1. deň x±s x 4,95±0,05 4,92±0,08 4,62±0,19 4,45±0,23 4,32±0,58 4,31±0,56 4,90±0,05 4,68±0,04 4,58±0,10 4,56±0,13 4,73±0,17 4,60±0,18 6. deň x±s x 4,78±0,14 4,77±0,07 4,02±0,46 4,23±0,49 3,75±0,82 3,75±0,81 4,48±0,23 4,38±0,24 4,52±0,16 4,51±0,22 4,45±0,33 4,50±0, deň x±s x 4,90±0,06 4,83±0,07 4,35±0,36 4,33±0,32 3,99±0,32 4,02±0,42 4,63±0,14 4,70±0,06 4,72±0,11 4,50±0,14 4,67±0,12 4,48±0, deň x±s x 4,62±0,12 4,67±0,14 2,55±0,48 2,89±0,51 2,77±0,40 2,63±0,59 4,27±0,25 4,32±0,23 4,51±0,09 4,41±0,16 4,17±0,26 4,05±0,26 Tabuľka II Senzorické hodnotenie vzoriek čerstvých syrov s dressingom bez (K) a s prídavkom probiotickej kultúry (P11) do mlieka počas 15 dní skladovania pri 7±1 C Parameter Farba Vôňa Chuť Textúra Vyrovnanosť zrna Celkový dojem Vzorky syrov K P11 K P11 K P11 K P11 K P11 K P11 1. deň x±s x 4,97±0,03 4,87±0,07 4,72±0,65 4,30±0,17 4,53±0,10 3,88±0,15 4,18±0,13 3,82±0,21 4,17±0,03 3,75±0,10 4,20±0,07 3,88±0,14 6. deň x±s x 4,78±0,01 4,75±0,07 4,23±0,22 3,93±0,22 3,58±0,26 3,76±0,16 3,64±0,34 3,48±0,06 3,39±0,19 3,19±0,17 3,62±0,17 3,55±0, deň x±s x 4,27±0,28 4,39±0,30 3,38±0,20 3,65±0,18 3,35±0,30 3,59±0,19 3,13±0,30 3,72±0,20 3,45±0,19 3,62±0,21 3,52±0,28 3,58±0, deň x±s x 4,75±0,02 4,46±0,03 3,41±0,09 3,41±0,26 3,14±0,07 3,14±0,11 3,30±0,05 2,85±0,05 3,55±0,06 2,80±0,06 3,50±0,03 3,33±0,13 Zo získaných výsledkov je zrejmé, že počas 15 dní skladovania prebehli vo vzorkách výrazné zmeny a to najmä v chuti, vôni a tiež vo vyrovnanosti zŕn a textúre. Niektorí hodnotitelia uvádzali už na 10-ty deň hodnotenia kvasničnú vôňu a ostrú chuť v kontrolných vzorkách syrov. Tento postreh možno vysvetliť aj zaznamenaným posunom ph v syroch, čo mohli spôsobiť zistené kvasinky svojim oxidatívnym metabolizmom. Medzi jednotlivými dňami skladovania kontrolných vzoriek syrov sa zistil preukazný rozdiel vo vôni a chuti (P 0,001). Syrové zrná v pokusných syroch na rozdiel od kontrolných vzoriek mali mäkký, tvarohovitý charakter a dosahovali mazľavú až slizovitú konzistenciu. Je to možné vysvetliť intenzívnym rastom pridanej probiotickej kultúry, predovšetkým druhov Lactobacillus acidophilus a Streptococcus thermophilus počas výroby syra a tým výrazným poklesom aktívnej kyslosti 187

188 v syrových zrnách. Potvrdili to aj výsledky stanovenia aktívnej a titračnej kyslosti. Medzi kontrolnými vzorkami syrov a pokusnými syrmi (P11) sa zistili počas celej doby skladovania štatisticky preukazné rozdiely medzi aktívnou a titračnou kyslosťou na úrovni P 0,001. Počas skladovania sa zaznamenal v pokusných vzorkách syrov aj nárast počtu mliečnych baktérií (do 10. dňa skladovania). V pokusných vzorkách syrov sa medzi 1. a 15. dňom skladovania zistili štatisticky významné rozdiely v chuti a vôni na úrovni P 0,05. Na základe celkového senzorického hodnotenia čerstvých syrov s prídavkom probiotickej kultúry do mlieka ešte pred jeho syrením možno konštatovať, že takto vyrobené syry sú po senzorickej stránke neprijateľné. Vyrobené syry mali výraznú kyslú až ostrú chuť a mazľavú, slizovitú konzistenciu. Záver Čerstvé syry s prídavkom probiotickej kultúry vzhľadom k tomu, že syry sú vhodným nosičom mliečnych baktérií predstavujú z hľadiska zdravej výživy zaujímavý produkt. Avšak pri ich výrobe je potrebné zvládnuť také faktory ako je napr. výber vhodnej probiotickej kultúry, jej dávkovanie, technologický krok, v ktorom by sa mali pridávať, spôsob balenia vyrobených syrov a ďalšie. Z výsledkov pokusov výroby čerstvých syrov s probiotickou kultúrou nami odskúšanými technológiami sa ako vhodná javí aplikácia probiotickej kultúry do dressingu k vyrobenému syrovému zrnu. Potvrdili to nielen prezentované výsledky senzorických vlastností, ale aj zistené mikrobiologické a fyzikálno-chemické parametre vyrobených syrov. Poďakovanie Príspevok vznikol s finančnou podporou Európskeho spoločenstva v rámci projektu: Vybudovanie výskumného centra AgroBioTech, projekt číslo Použitá literatúra 1. HØIER, E., JANZEN, T., RATTRAY, F., SØRENSEN, K., BØRSTING, M. W., BROCKMANN, E., JOHANSEN, E. The Production, Application and Action of Lactic Cheese Starter Cultures. In Law, B. A., Tamime, A.Y. Technology of Cheesemaking. 2. ed. United Kingdom : Blackwell, p ONG, L., HENRIKSON, A.., SHAH, N. P. Proteolytic pattern and organic acid profile soft probiotic Cheddar cheese as influenced by probiotic strains of Lactobacillus acidophilus, Lb. paracasei, Lb. casei, or Bifidobacterium sp. International Dairy Journal,17, 2007, p ROY, D. Technological aspects related to the use of bifidobacteria in dairy products. Lait, 85, 2005, p BOYLSTON, T. D., VINDEROLA, C. G., GHODDUSI, H. B., REINHEIMER, J. A. Incorporation of bifidobacteria into cheeses: challenges and rewards. International Dairy Journal, 14, 2004, p KARIMI, R., MORTAZAVIAN, A. M., DA CRUZ, A.G. Viability of probiotic microorganisms in cheese during production and storage: a review. Dairy Science and Technology, 91, 2011, p FIL-IDF Standard 99C. Sensory evaluation of dairy products by scoring reference method, 1997,15 p. 7. HERIAN, K. Zhodnotenie doterajšieho vývoja mliekarstva na Slovensku. Mliekarstvo, 41, 2012, s CONTE, A., GAMMARIELLO, D., DI GIULIO, S., ATTANASIO, M., DEL NOBILE, M. A. Active coating and modified-atmosphere packaging to extend the shelf of Fior di Latte cheese. Journal of Dairy Science, 92, 2009, p DEL NOBILE, M. A., CONTE, A., INCORONATO, A. L., PANZA, O. Modified atmosphere packaging to improve the microbial stability of Ricotta. African Journal of Microbiology Research, 3, 2009, p Kontaktná adresa Doc. Ing. Margita Čanigová, CSc., Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov; Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra, ul. Tr. A. Hlinku č. 2, Nitra, SR margita.canigova@uniag.sk 188

189 SENZORICKÉ HODNOCENÍ POMAZÁNKOVÝCH MÁSEL Ilko Vojtěch, Panovská Zdeňka, Míková Kamila Ústav analýzy potravin a výživy, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Sensory evaluation of cream spread Summary: Sensory evaluation of 4 types of cream spread (typical Czech speciality named pomazankove maslo ) from various producers was done. The evaluation was focused on sensory attributes which are perceived by consumers as significant. Consistency and taste is possible to consider as the most significant attributes. Flavouring ingredients have the important effect. The identical products from various producers were different but the variances were not relevant. Úvod Pomazánkové máslo je česká specialita, jejíž receptura vznikla v sedmdesátých letech minulého století a na trhu je od roku Jedná se o mléčný výrobek, jehož hlavní složkou je smetana, sladká nebo zakysaná, která je doplněna mlékem případně syrovátkou, mlékárenskou bakteriální kulturou a škrobem. Pomazánkové máslo musí obsahovat minimálně 42 % sušiny a 31 % tuku. Tukem může být pouze tuk mléčný, nesmí obsahovat žádné rostlinné tuky a oleje 1. Nízký obsah tuku je z nutričního hlediska pozitivní, ale z hlediska evropského potravinového práva jsou právě kvůli nízkému obsahu tuku výhrady k používání názvu máslo. Přesto, že se jedná o náš tradiční výrobek, nezískal od Evropské unie ochrannou známku pro tradiční speciality a výrobci hledají vhodný alternativní název. Na počátku roku 2013 ministerstvo oznámilo, že v připravované novele vyhlášky se počítá s novým názvem tradiční pomazánkové. Pomazánkové máslo se ihned po uvedení na trh stalo velmi oblíbeným produktem. Je vhodné ke konzumaci za studena jako pomazánka nebo složka jiných lahůdkářských a pekařských výrobků, ale nelze ho používat ke smažení. Jeho předností je snadná roztíratelnost i při nízké teplotě. Původně se vyrábělo pouze v neochucené variantě, postupně se začaly objevovat výrobky s různými příchutěmi. V současné době vyrábí pomazánková másla řada mlékáren podle téměř stejných receptur, přesto jsou mezi nimi rozdíly a to hlavně v oblasti senzorické. Cílem práce bylo provést senzorické hodnocení 4 druhů pomazánkových másel od různých výrobců a sledovat, které smyslové deskriptory jsou pro spotřebitele nejvýznamnější a ve kterých jsou mezi pomazánkovými másly od různých výrobců největší rozdíly. Experimentální část K hodnocení bylo zvoleno neochucené pomazánkové máslo, pomazánkové máslo s pažitkou, pomazánkové máslo s příchutí česneku a pomazánkové máslo s křenem od 4 případně 5 různých výrobců. Postup všech senzorických analýz byl v souladu s mezinárodními ISO normami. Zkušební místnost byla vybavena podle mezinárodní normy ISO Vzorky posuzoval 12 členný senzorický panel neškolených hodnotitelů ve věku 22 až 72 let. Vzorky byly hodnoceny při pokojové teplotě pomocí bodových stupnic. U jednotlivých vzorků byly hodnoceny následující deskriptory: vzhled, vůně, konzistence, chuť a celkový dojem. Z dílčích deskriptorů byly hodnoceny textura a intenzita nebo množství ochucující složky. Výsledky a diskuse Výsledky jsou uvedeny v grafech 1 až 7. Je zřejmé, že ve všech sledovaných deskriptorech byly u výrobků stejného druhu mezi jednotlivými výrobci hodnotiteli vnímány rozdíly, a to zejména ve vzhledu, konzistenci a v chuti, což se projevilo i při hodnocení celkového dojmu. Hodnocení vůně bylo ovlivněno ochucující složkou. 189

190 K hodnocení byla použita 9 bodová stupnice. Rozdíly v bodovém hodnocení byly u jednotlivých výrobců poměrně malé a pohybovaly se v rozmezí 1 až 2 bodů. Žádný z výrobků nedosáhl při hodnocení 9 bodů, nejlépe hodnocené výrobky dosahovaly průměrně 7 bodů, nejhůře hodnocené výrobky byly hodnoceny průměrně 4 body, přičemž stupnice byla orientována od velmi špatného po velmi dobré hodnocení. Na chuť i celkový dojem měla největší vliv použitá ochucující složka. Nejvíce bodů získalo neochucené pomazánkové máslo, nejméně pomazánkové máslo s pažitkou. 9 Hodnocení vzhledu A B C D1 D2 E 1 0 Pomazánkové máslo Pomazánkové máslo s křenem Pomazánkové máslo s příchutí česneku Pomazánkové máslo s pažitkou Obr 1. Senzorické hodnocení vzhledu pomazánkových másel. 8 Hodnocení vůně A B C D1 D2 E 1 0 Pomazánkové máslo Pomazánkové máslo s křenem Pomazánkové máslo s příchutí česneku Pomazánkové máslo s pažitkou Obr 2. Senzorické hodnocení vůně pomazánkových másel. 190

191 8 Hodnocení konzistence A B C D1 D2 E 0 Pomazánkové máslo Pomazánkové máslo s křenem Pomazánkové máslo s příchutí česneku Pomazánkové máslo s pažitkou Obr 3. Senzorické hodnocení konzistence pomazánkových másel. 8 Hodnocení chutě A B C D1 D2 E 0 Pomazánkové máslo Pomazánkové máslo s křenem Pomazánkové máslo s příchutí česneku Pomazánkové máslo s pažitkou Obr 4. Senzorické hodnocení chutě pomazánkových másel. Největší rozdíly mezi jednotlivými výrobky byly v textuře a v intenzitě (případně množství) ochucující složky. Intenzita ochucující složky byla většinou hodnocena jako vyhovující, avšak zde se nejvíce projevily rozdíly mezi vnímáním jednotlivých hodnotitelů, neboť u jednotlivých vzorků byla intenzita ochucující složky vždy vnímána částí hodnotitelů buď jako příliš slabá nebo jako příliš silná (graf č.6-7). 191

192 8 Hodnocení celkového dojmu 7 6 A 5 B C D1 D2 E 0 Pomazánkové máslo Pomazánkové máslo s křenem Pomazánkové máslo s příchutí česneku Pomazánkové máslo s pažitkou Obr 5. Senzorické hodnocení celkového dojmu pomazánkových másel. Intenzita křenové chuti 100% 90% 80% příliš silná 70% spíše silná 60% vyhovující 50% 40% spíše slabá 30% příliš slabá 20% 10% 0% A B C D Obr 6. Senzorické hodnocení intenzity křenové chuti v pomazánkových máslech s křenem. Intenzita česnekové chuti 100% 90% 80% příliš silná 70% 60% spíše silná 50% vyhovující 40% spíše slabá 30% příliš slabá 20% 10% 0% A B C D Obr 7. Senzorické hodnocení intenzity česnekové chuti v pomazánkových máslech s česnekem. 192

193 Závěrem lze konstatovat, že konzumenti u pomazánkových másel pokládají za významné senzorické znaky zejména konzistenci a chuť, která je silně ovlivněna druhem a množstvím ochucující složky. Mezi pomazánkovými másly od různých výrobců byly zjištěny rozdíly v senzorických vlastnostech, ale tyto rozdíly nebyly významné. Největší rozdíly byly ve vnímání intenzity ochucující složky. Použitá literatura: 1. Vyhláška č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje. 2. ČSN ISO 8589/2008. Senzorická analýza Obecné pokyny pro uspořádání senzorického pracoviště. Kontaktní adresa: mikovak@vscht.cz ilkov@vscht.cz 193

194 194

195 POROVNÁNÍ SENZORICKÝCH METOD PRO HODNOCENÍ TAVENÝCH SÝRŮ Panovska Zdeňka., Ilko Vojtěch, Koštejnová Denisa Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha The comparison of sensory methods for evaluation of spread cheeses. Summary: The work is concerned at sensory methodology and two recent published standards: the newly translated Czech technical ČSN ISO 16820:2011 Sensory analysis - Sequential analysis and the newly released international standard ISO 11132:2012 Sensory analysis - General guidelines for monitoring the performance of quantitative sensory panel, which has not been translated into Czech language yet. These are very new standards and the aim of professionals must be the earliest possible utilization of these standards in practice. The usage of these standards was tested on samples of cheeses, which were evaluated also by ranked test, paired test and by profile method. Práce týkající se senzorického hodnocení tavených sýrů publikované v poslední době se většinou zaměřují na hodnocení nově vyvíjených výrobků např. výrobků se změněným obsahem tuku, nebo je sledován vliv zrání, vliv náhrady klasických emulgačních solí vybranými hydrokoloidy, či použití sodných polyfosfátů s rozdílnou délkou řetězce na senzorické vlastnosti 1. Byly publikovány i zajímavé práce, kde se hodnotil např. vliv přídavku zimoleze jedlého (Lonicera caerulea var. edulis) na chutnost a texturu sýrů 2. Zimolez jedlý má vysoký obsah sacharidů, kyselin, vitamínu C, anthokyanů a jsou známy i jeho zdravotní účinky na ochranu zraku a ochranu proti stárnutí. Přídavek zimolezu měl vliv na barvu, chuť, vůni (bylo nalezeno 36 hlavních těkavých látek) a texturu sýra. Výsledky této práce ukázaly, že s jeho vzrůstajícím obsahem se snížilo ph a značně se změnila mikrostruktura sýra. Autoři před vlastním senzorickým hodnocením vytvořili tabulku standardů pro hodnocení barvy, vzhledu, tvrdosti, viskozity, tání, chutě, vůně a celkového vjemu 2. Někteří autoři porovnávají výsledky instrumentálního měření a senzorické analýzy. Byl publikován článek o využití infračervené spektroskopie pro charakteristiku texturních deskriptorů 3. Zajímavá je studie japonských autorů, kteří provedli metabolomickou analýzu, při které využili plynovou chromatografii s hmotnostní detekci GC/TOF-MS (Gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) pro aplikaci na senzorický model 4. Pomocí metody nejmenších čtverců byl navržen regresní model umožňující předpovědět vztah mezi metabolickým profilem a dvěma senzorickými atributy tj. bohatostí chuti a vůně a intenzity kyselé chuť a vůně, které jsou ve vztahu ke stupni zralosti. Byly identifikovány sloučeniny, které hrají nejvýznamnější roli a to 12 aminokyselin a laktosa pro bohatost a γ-aminomáselná kyselina, jantarová kyselina, mléčná kyselina, ornithin, prolin a laktosa pro kyselou chuť. Cíl práce Ohodnotit 5 vzorků tavených sýrů z běžného trhu různými senzorickým metodami a ukázat možnosti využití dvou nových senzorických norem. V roce 2011 vyšla nová česká technická norma ČSN ISO Senzorická analýza - Metodologie - Sekvenční analýza, která je zaměřena na vyhodnocení rozdílových metod a na možnosti sledování výkonu senzorického panelu a v roce 2012 Mezinárodní norma ISO 11132:2012 Sensory analysis - Methodology - Guidelines for monitoring the performance of a quantitative sensory panel, která popisuje možnosti sledování výkonu kvantitativního senzorického panelu. Tato norma nebyla prozatím přeložena do českého jazyka. Materiál a postup 5 druhů tavených sýrů z běžné obchodní sítě od různých výrobců. Tavené sýry se vyrábějí tepelným ošetřením přírodních sýrů za přídavku tavících solí, mléka, másla, nebo smetany, syrovátky. Základní surovina pro jejich výrobu jsou tvrdé sýry a na jejich obsahu a kvalitě závisí výsledná chuť a vůně. Příklad složení uvedeného na etiketě jednoho z testovaných vzorků: Sýr, máslo, pitná voda, tvaroh, laktóza, mléčné bílkoviny tavící soli E450, E452, E339, kukuřičný škrob, 195

196 stabilizátory. E 407, E415, jedlá sůl. U tavených sýrů se obsah bílkovin pohybuje v rozmezí od 4,54% do 20,38 %, obsah vápníku může být různý od 153 až do 745 miligramů 5. Hodnocení probíhalo v laboratoři odpovídající požadavkům normy ČSN ISO 8589, vybavení místnosti, způsob přípravy a předkládání vzorků odpovídalo příslušným ISO normám. Vzorky byly předkládány pod čtyřmístnými kódy na bílých talířcích a v náhodném pořadí. Použité metody: Profilová zkouška - grafické hodnocení a bodové hodnocení, pořadová zkouška, párová zkouška, sekvenční metoda. Panel posuzovatelů byl u profilové zkoušky 12 členný, u pořadové zkoušky 7členný a u porovnání práce panelu 4 členný. Výsledky: Pořadová zkouška Hodnotitelé řadili vzorky podle zvoleného kritéria tj. podle celkové chuti od nejlepšího k nejhoršímu. Výsledky hodnocení ukazuje tab.i. Tabulka I Výsledky pořadové zkoušky Pořadí pro vzorky A-E Hodnotitel A B C D E Součty pořadí Podle nejnižších součtů pořadí posuzovatelé nejlépe hodnotili vzorky 4 a 5. Friedmanův vypočtený koeficientu χ 2 byl 6.5 a porovnáním s jeho hodnotou z tabulek (pro 7 hodnotitelů a 5 vzorků na hladině pravděpodobnosti 99% je χ 2 =13,28), bylo prokázáno, že mezi vzorky nebyl statisticky významný rozdíl. Párová zkouška Párovou zkouškou byly porovnány vzorky A a D. Při 12 hodnocení bylo nutno získat na hladině pravděpodobnosti 95% minimální počet správných odpovědí 10. V našem případě byl tento počet pouze 6, takže párovou zkouškou nebyl prokázán statisticky významný rozdíl mezi vzorky, což odpovídá i výsledkům pořadové zkoušky. Z metodických důvodů byla použita i sekvenční analýza, při které se musí nejprve vybrat druh a citlivost rozdílové zkoušky. Hodnoty α, β, p 0 a p 1 určují citlivost zkoušky. Potom se vypočítají hraniční přímky, kde p 0 je pravděpodobnost náhodně zvolených správných odpovědí, když neexistuje vnímatelný rozdíl a p 1 je pravděpodobnost správných odpovědí, když vnímatelný rozdíl existuje. Hodnota p d je brána jako procento populace, které je schopno vnímatelný rozdíl odlišit. Hraniční přímka pro dolní hranici se vypočte podle následujícího vztahu. log( β) log( 1 α) n log( 1 p1) + n log( 1 p0) d0 = log( p ) log( p ) log( 1 p ) + log( 1+ p )

197 Po výpočtu obou přímek se body vynesou do grafu. Graf 1. je rozdělen na 3 oblasti, oblast A vzorky jsou odlišné B oblast pokračovat ve zkoušení C vzorky jsou podobné, n počet hodnocení s počet správných odpovědí. Jak je vidět z grafu 1 naše hodnocení spadá do oblasti B a pro správné vyhodnocení párové zkoušky byy se mělo pokračovat v hodnocení. Obr. 1. Hraniční přímky pro párovou zkouškuu Metoda senzorického profilu - bodové hodnocení Senzorický profil zahrnoval bodové hodnocení vybraných deskriptorů tj. vzhled, roztíratelnost a chuť. Pro sledování hédonických parametrů byla použita devítibodová stupnice. Výsledky pro některé hodnocené deskriptoryy jsou shrnuty v grafu 2. Jak vyplývá z grafu ani použití bodových stupnic neprokázalo statisticky významné rozdíly mezi vzorky, v i když opět vzorky C a D měly nejvyšší bodový průměr, ale vzhledem ke směrodatné odchylce nejsou rozdíly statisticky významné. Graf.2 Výsledky hodnocení vzorkůů sýrů A - E bodově Metoda senzorického profilu - grafické hodnocení Metoda senzorického profilu patří v senzorické analýze k nejdůležitějším. Pro hodnocení jednotlivých deskriptorů byla použita grafická stupnice. Výsledky jsou shrnuty v tabulce II. Metoda podrobného senzorického profilu prokázala pro některé deskriptory rozdíly mezi vzorky, přestože směrodatná odchylka bylaa 10-15%. Např. vzorek D měl nejhorší roztíratelnost, 197

198 vzorek C nejnižší intenzitu sýrové chuti, u vzorků B a C byla vyšší intenzita kyselé chuti. Cizí, netypická chuť byla zaznamenaná u vzorků B a C. Celková příjemnost chuti byla nejvyšší u vzorků A, D, E. Tabulka II Výsledky senzorického profilu Vzorky hodnoty v % Deskriptory A B C D E Celkový vzhled Intenzita zbarvení Roztíratelnost sýra Typická sýrová Mléčná, smetanová Slaná Nakyslá Nahořklá Nasládlá Palčivá Oříšková Žluklá Máselná Cizí, netypická Celková příjemnost Panel sýry hodnotitel ve třech opakování, aby bylo možno ohodnotit i práci panelu podle mezinárodní normy ISO Pro kontrolu výkonu jednotlivých hodnotitelů i celého panelu je zapotřebí použití statistické metody analýzy rozptylu (ANOVA). V tabulce III je shrnuto hodnocení jednoho posuzovatele pro deskriptor celková příjemnost a v další tabulce IV ukázka výpočtu ANOVY pro jednoho hodnotitele a v tabulce V jsou výsledky pro všechny čtyři hodnotitele. Tabulka III Hodnocení vybraného posuzovatele - 3 opakování Hodnotitel Vzorek Opakování A B C D E Tabulka IV Výsledky ANOVY pro jednoho hodnotitele Zdroj variability SS Stupně volnosti MS F Mezi výběry ,55 Všechny výběry Celkem

199 Tabulka V Výsledky pro panel 4 posuzovatelů Z tabulky V vyplývá, že nejlepší posuzovatelé byli posuzovatel č.1 a 4, zatímco posuzovatelé 2 a 3 neměli konzistentní hodnocení. Závěr: V senzorické analýze jsou pro porovnání vzorků používané různé metody, každá má své výhody a nevýhody a při jejich výběru záleží na cíli práce. Pro posouzení celkové příjemnosti chuti u 5 vzorků tavených sýrů byly použity metody pořadové zkoušky, párové zkoušky a profilové zkoušky s různými stupnicemi. Žádná zkouška neprokázala statisticky významné rozdíly mezi vzorky, i když došlo ke shodě, že vzorky D a E patři k lépe hodnoceným vzorkům. Podrobná profilová metoda s hodnocením na grafické stupnici umožnila určit deskriptory, které hodnocení sýrů nejvíc negativně ovlivňovaly, jako konzistence, vnímané pachuti, nakyslá chuti. Byly ověřeny postupy práce u dvou nově publikovaných ISO norem. Použití sekvenční analýzy umožňuje zjistit, jaké množství vzorků použít pro rozdílové zkoušky a tím přispět ke snížení finančních nákladů. Posouzení práce panelu umožňuje vybrat ty posuzovatele, jejichž hodnocení je konzistentní a mělo by se v senzorických laboratořích více používat. Použitá literatura: 1. Nagyová G., Buňka F., Salek R.N., Černíková M., Mančík P., Grůber T., Kuchař D.: Use of sodium polyphosphates with different linear lengths in the production of spreadable processed cheese. Journal of Dairy Science, 97, 1, str , Zhang X., Yang Y., Zhao D. Effect of Blueberry on Spreadable Processed Cheese Journal of Northeast Agricultural University (English edition), 18, 2, str.73-78, (2011). 3. Fagan C.C., Everard C., O Donnellv, Downey C.P., Sheehan E.M., Delahunty C.M., O Callaghan D.J. Evaluating Mid-infrared Spectroscopy as a New Technique for Predicting Sensory Texture Attributes of Processed Cheese, Journal of Dairy Science, Volume 90, 3, str , (2007). 4. Ochi H., Naito H., Iwatsuki K., Bamba T., Fukusaki E., Metabolomics-based component profiling of hard and semi-hard natural cheeses with gas chromatography/time-of-flight-mass spectrometry, and its application to sensory predictive modeling. Journal of Bioscience and Bioengineering, 113, 6, str , (2012) číslo 3/ Tavené sýry ( ) Kontaktní adresa: zdenka.panovská@vscht.cz 199

200 200

201 HODNOCENÍ SENZORICKÉ KVALITY JOGURTŮ Z KOZÍHO MLÉKA Legarová Veronika, Vítová Kateřina, Kouřimská Lenka Katedra kvality zemědělských produktů, FAPPZ, Česká zemědělská univerzita v Praze Evaluation of Sensory Quality of Goat Milk Yoghurts Summary: Differences between yogurts prepared from the Italian milk with added inulin, almond flour and powdered cow's milk were first evaluated at work. Yogurt with powdered milk and almond flour were evaluated as the best. Then yogurts prepared in the laboratory from Czech milk were evaluated. Dried cow's and goat's milk, inulin, almond flour, strawberry or cherry jams were added to the prepared yogurt. The results showed that yogurts with the addition of dried cow's milk received from assessors better sensory properties than yogurts with added powdered goat milk. Dried cow's milk gave yogurts sweet taste and improved consistency. Yoghurts with dried goat's milk were too sour for assessors. Used flavourings such as almond flour and jam gave yogurts better taste and viscosity. Yogurt with added cherry jam belonged to the best evaluated samples. Úvod Rostoucí zájem a poptávka spotřebitelů po zdravotně nezávadných a dietických potravinách způsobují, že se u nás i ve světě rozvíjí chov koz. Koza je poměrně přizpůsobivé zvíře, které lze chovat i v oblastech, kde se ostatní hospodářská zvířata špatně uplatňují. V poslední době se kozy chovají na smíšené pastvě společně s ovcemi (Fantová a kol., 2000). Po celém světě je koza významným producentem živočišných bílkovin a cenných surovin. Kozí mléko je cenná a zdravá potravina za předpokladu, že i zvířata jsou zdravá a správně ošetřena (Kühnemann, 2011). Složení kozího mléka je značně variabilní a kolísá v širokém rozmezí hodnot. Je ovlivněno mnoha faktory jako je plemeno, věk zvířete, stádium laktace, výživa, způsob chovu, životní prostředí či způsob dojení (Haenlein, 2004). Složení kozího mléka je v průměru 13 % sušiny, 4,1 % tuku, 3,3 % bílkovin, 2,5 % kaseinu a 4,7 % laktózy (Fantová a kol., 2000). Nejdůležitější vlastností kozího mléka je jeho atraktivní chuť a vůně, speciálně popsána jako kozina. Pro neznalé může být ostrá, páchnoucí či slaná (Slačanac et al., 2010). Kozí mléko může být alternativou pro osoby trpící alergií na mléčnou bílkovinu kravského mléka. Pomáhá při kožních problémech a kloubních onemocněních, a při dýchacích a nervových obtížích. Kozí mléko a výrobky z něj jsou stále populárnější. V první řadě se vyrábí kozí sýry a jogurty, ale známé jsou také tvarohy, másla či zmrzlina. Syrovátkové bílkoviny a další prospěšné látky z kozího mléka se používají v kosmetickém průmyslu jako součásti mýdel, šamponů či tělových krémů (Ribeiro et Ribeiro, 2010). Jogurty patří mezi nejčastěji konzumované fermentované mléčné výrobky. Jsou oblíbené nejen pro svou příjemnou a osvěžující chuť, ale také pro své známé terapeutické účinky (Erkaya et Sengül, 2011). Jedním ze základních ukazatelů kvality jogurtů je textura. Jogurt z kozího mléka se oproti jogurtu z mléka kravského vyznačuje řidší konzistencí a menší přilnavostí (Domagała, 2009). Herrero et Requena (2006) ve své práci uvádí, že struktura jogurtu závisí především na bílkovinných kaseinech tvořící sítě micel, a na uskupení tukových kuliček. K dosažení žádoucí textury je zapotřebí zvýšit obsah sušiny. Toho lze dosáhnout například přidáním hydrokoloidů, které váží vodu, zvyšují viskozitu a vylučují syrovátku na povrch. Nejčastěji se využívá želatina, škrob, agar-agar a pektin (Kadlec a kol., 2009). Cílem studie bylo proto zjistit vliv přídavku zahušťovacích a ochucovacích přídatných látek na senzorické vlastnosti laboratorně připravených kozích jogurtů. Materiál a metody Jako materiál pro výrobu jogurtů z kozího mléka bylo použito pasterované bio kozí mléko z kozí farmy Pěnčín, které obsahovalo min. 3,5 % tuku a 3 % bílkovin. Dále byly jogurty vyráběny z italského kozího mléka Latte di capra od firmy Mamabe', na jehož obalu byly deklarovány 4 g tuku a 4 g bílkovin na 100 ml mléka. Pro výrobu jogurtů byla použita jogurtová kultura 201

202 Laktoflora od firmy Milcom a.s., Výzkumný ústav mlékárenský. K zahuštění bylo využito sušené plnotučné kravské mléko od společnosti Samantha a sušené kozí mléko od firmy Olimpex spol. s.r.o. Jako ochucující složky byly použity inulin, mandlová mouka Farina di Mandorla od společnosti Dolcezze di Rumia, jahodový a višňový extra džem od firmy Hamé. Při výrobě jogurtů bylo 300 ml mléka zahřáto na teplotu očkování C. a následně byla přidána jogurtová kultura, případně další aditivní látky. Mandlová mouka byla před přidáním ohřáta v mikrovlnné troubě po dobu 2 minut, aby získala zlatavou barvu, typické mandlové aroma a chuť. Vzorky byly fermentovány při 43 C po dobu 6 hodin. Poté byly přemístěny do chladicí místnosti. Senzorické hedonické posuzování jogurtů školenými hodnotiteli probíhalo pomocí lineární grafické orientované nestrukturované stupnice (ISO 13299, ISO 6658, ISO 6564), jejíž orientace byla 0 % = odporný vzorek a 100 % vynikající. Výsledky V prvním pokusu hodnotitelé posuzovali jogurty z italského kozího mléka s přídavky sušeného kravského mléka, mandlové mouky a inulinu. Výsledky hodnocení celkové příjemnosti chuti jsou uvedeny v tabulce I. Následně byly hodnoceny vzorky z českého kozího mléka s přídavky sušeného kravského nebo kozího mléka, inulinu, mandlové mouky a jahodového či višňového džemu. Výsledky hodnocení celkové příjemnosti chuti jsou uvedeny v tabulce II. Tabulka I Senzorické hedonické hodnocení jogurtů z kozího mléka s přídavky sušeného kravského mléka, mandlové mouky a inulinu. Vzorek Celková příjemnost chuti (%) Jogurt 51 Jogurt + 30 g sušeného kravského mléka 77 Jogurt + 6 g inulinu 51 Jogurt + 9 g mandlové mouky 50 Jogurt + 30 g mandlové mouky 67 Jogurt + 30 g sušeného kravského mléka + 9 g mandlové mouky 86 Tabulka II Senzorické hedonické hodnocení jogurtů z kozího mléka s přídavky sušeného kravského nebo kozího mléka, inulinu, mandlové mouky a jahodového či višňového džemu. Vzorek Celková příjemnost chuti (%) Jogurt 38 Jogurt + 50 g sušeného kravského mléka 74 Jogurt + 50 g sušeného kozího mléka 53 Jogurt + 25 g sušeného kravského mléka + 25 g sušeného kozího mléka 60 Jogurt + 50 g sušeného kozího mléka + 8 g inulinu 53 Jogurt + 50 g sušeného kozího mléka + 50 g mandlové mouky 57 Jogurt + 50 g sušeného kozího mléka + jahodový džem 64 Jogurt + 50 g sušeného kozího mléka + višňový džem

203 Diskuse Při výrobě jogurtů se pro dosažení žádoucí konzistence zvyšuje obsah sušiny, často přídavkem sušeného mléka, syrovátky či syrovátkových bílkovin. Sušená mléka (kravské a kozí) se od sebe liší v barvě, složení i chuti stejně tak, jako mléka normální. Sušené kravské mléko dodávalo připraveným jogurtům žlutou barvu a sladkou chuť. Také docela dobře zamaskovalo kozí vůni a chuť. Jogurty s přídavkem kravského mléka byly nejlépe hodnoceny, znemožňuje to ale jejich podávání konzumentům s alergií na kravské mléko. Jogurty s přídavkem sušeného kozího mléka byly výrazně bělejší s kyselejší příchutí a byly hodnoceny méně příznivě. Kozina zde byla ještě více zvýrazněna, a proto byla do jogurtů přidávána různá další ochucovadla. Přídavek višňového a jahodového džemu se ukázal jako vhodné řešení. Jejich sladká chuť úspěšně maskovala nežádoucí kozí příchuť. Podle hodnotitelů se ke kozímu jogurtu o trochu víc hodil džem višňový. Inulin patří mezi nejznámější prebiotika v mléčných výrobcích. Zabraňuje vytváření krystalů při skladování a zlepšuje jejich krémovitost. Přidáním inulinu do jogurtu se dosáhne lepší využitelnosti vápníku v organismu a sníží se obsah tuku a energie (Paseephol et al., 2008). V celkovém hodnocení dosáhl jogurt s přídavkem inulinu stejného hodnocení jako jogurt bez přídavku inulinu. Mandlová mouka snížila intenzitu barvy, zvýšila sušinu jogurtů a dodala jim příjemnou chuť a vůni. Nejlépe byly hodnoceny vzorky s kombinací mandlové mouky a sušeného kravského mléka. Pražáková a kol. (1999) porovnávali jogurty vyrobené z kravského, ovčího a kozího mléka s přídavkem sušeného kravského mléka. Jogurt z kozího mléka se vyznačoval nejhorší viskozitou a celkovou chutí. Měl krupičkovou a velmi řídkou konzistenci a kyselou chuť. Hodnotitelé zaznamenali výraznou kozinu. Nežádoucí konzistence jogurtu z kozího mléka ale mohla být způsobená i tím, že autoři nechali všechny jogurty zrát v termostatu pouhé 3,5 hod. Borková a kol. (2013) se také snažili zlepšit fermentovaných mléčných výrobků z kozího mléka přídavkem probiotik, prebiotik koncentrátu syrovátkových bílkovin, sušeného kozího mléka, kukuřičného škrobu a ovčího mléka. Zaznamenali zlepšení chemických a mikrobiologických vlastností také při přídavku sušeného kozího mléka či přídavku syrovátkových bílkovin. Závěr Při senzorickém hedonickém hodnocení jogurtů z italského kozího mléka byly nejlépe hodnoceny byly jogurty se sušeným kravským mlékem a mandlovou moukou. Při posuzování jogurtů z českého kozího mléka dopadly nejlépe vzorky se sušeným kozím mlékem a višňovým džemem spolu s jogurty s přídavkem sušeného kravského mléka. Z výsledků vyplývá, že jogurty s přídavkem sušeného kravského mléka mají lepší senzorické vlastnosti než s jogurty s přidaným sušeným kozím mlékem. Sušené kravské mléko dodává jogurtům sladkou chuť a zlepšuje konzistenci. Jogurty se sušeným kozím mlékem byly kyselejší a nedosahovaly optimální konzistence. Použitá ochucovadla jako mandlová mouka či džem zpříjemnily chuť vyrobených jogurtů. Nejlépe hodnocený jogurt byl s přídavkem višňového džemu. Poděkování: Práce byla podpořena finančními prostředky ze specifického výzkumu (MSMT 21/2011) a S grantem. Použitá literatura: 1. BORKOVÁ, M.; LISOVÁ, I.; JANGL, M.; PECHAČOVÁ, M. Fermentovaný mléčný výrobek z kozího mléka s probiotiky, prebiotiky a zvýšeným obsahem sušiny. Mlékařské listy zpravodaj, 2013, č. 141, s. XXXVIII-XLII. 2. DOMAGAŁA, J., SADY, M., GREGA, T., NAJGEBAUER-LEJKO, D. Changes in texture of yoghurt from goat s milk modified by transglutaminase depending on ph of the milk. Biotechnology in Animal Husbandry, 2007, vol. 23, no. 5-6, pp

204 3. ERKAYA, T., SENGÜL, M. Comparison of volatile compounds in yoghurts made from cows, buffaloes, ewes and goats milks. International Journal of Dairy Technology, 2011, vol. 64, no. 2, pp FANTOVÁ, M., KACEROVSKÁ, L., MALÁ, G., MÁTLOVÁ, M., SKŘIVÁNEK, M., ŠLOSÁRKOVÁ, S. Chov koz, 1. vyd., Praha: Brázda, 2000, 200 s., ISBN: HAENLEIN, G.F.W. Goat milk in human nutrition. Small Ruminant Research, 2004, vol. 51, no. 2, pp HERRERO, A.M., REQUENA, T. The effect of supplementing goats milk with whey protein concentrate on textural properties of set-type yoghurt. International Journal of Food Science and Technology, 2006, vol. 41, no. 1, pp ISO Sensory analysis - Methodology General guidance for establishing a sensory profile ISO (IDF 99-1: 2009) Milk and milk products - Sensory analysis - Part 1: General Guidance for the recruitment, selection, training and monitoring of assessors ISO Sensory analysis - General Guidance for the selection, training and monitoring of assessors - Part 1: Selected assessors KADLEC, P., MELZOCH, K., VOLDŘICH, M., A KOL. Co byste měli vědět o výrobě potravin?. 1. vyd. Ostrava: KEY Publishing s.r.o., 2009, 536 s. ISBN: KÜHNEMANN, H. Chováme kozy, 1. vyd., Vimperk: Víkend, 2011, 93 s., ISBN: PASEEPHOL, T., SMALL, D.M., SHERKAT, F. Rheology and texture of set yogurt as affected by inulin addition. Journal of Texture Studies, 2008, vol. 39, no. 6, pp PRAŽÁKOVÁ, J., BURDOVÁ, O., TUREK, P., LACIAKOVÁ, A. Sensorial evaluation of yoghurt produced from cow, sheep and goat milk. Czech Journal of Food Sciences, 1999, vol. 17, no. 1, pp RIBEIRO, A. C., RIBEIRO, S. D. A. Specialty products made from goat milk. Small Ruminant Research, 2010, vol. 89, no. 2, pp SLAČANAC, V., BOŽANIĆ, R., HARDI, J., SZABÓ, J.R., LUČAN, M., KRSTANOVIĆ, V. Nutritional and therapeutic value of fermented caprine milk. International Journal of Dairy Technology, 2010, vol. 63, no. 2, pp Kontaktní adresa: Doc. Ing. Lenka Kouřimská, Ph.D., Katedra kvality zemědělských produktů, FAPPZ, ČZU v Praze, Kamýcká 129, Praha 6 Suchdol, kourimska@af.czu.cz 204

205 VLIV JAKOSTI NA KONKURENCESCHOPNOST MLÉKA A MLÉKÁRENSKÝCH VÝROBKŮ Renata Hrubá 1), Jana Stávková 2) 1) Katedra obchodu a financí, Česká zemědělská univerzita v Praze, 2) Ústav marketingu a obchodu, Mendlova univerzita v Brně Influence of quality on competitivity of milk product Summary: Due to the fact that information behavior affects the competitiveness of dairy products market and consumer perception of every other problem areas related to food, this study focuses on the indirect effect of perception of information through information behavior and use of the model ordered. Results obtained by asking students, suggest that the attitude of the origin of the product is strong, despite the fact that the behavior is inconsistent with the position and education on food properties is unclear. It can be concluded that the indirect effect (indirect effect on consumer attitude towards a product e.g. is the product locally- grown, fresher, environmental issue, safety, etc.) on consumer attitude towards product exists and the available information does not fulfill its function. Based on the results, as behavioural response with the aim of solving global production related problems, 73 % of the young people with uncertainity concerning product information will never or occasionaly buy such food products. This is a clear indication that consumers need clear product information for quality perception. The General Assembly of the United Nation has declared 2014 the year of Family farming. I believe that this is a good opportunity for the future usage of this model as a tool for Agro-marketing to answer questions concerning behavioural change based on awareness of global production related issues Úvod Nařízení Evropského parlamentu a Rady (EU) č. 1151/2012 pojednává obecně o řešené problematice Vlivu jakosti na konkurenceschopnost mléka a mléčných výrobků. V tomto nařízení se uvádí, že producenti mohou nadále vyrábět rozmanitou škálu jakostních potravin a to v případě, že obdrží spravedlivou odměnu za jejich úsilí, které je spojeno s informováním kupujících a spotřebitelů k zajištění spravedlivé hospodářské soutěže pro zemědělce a producenty zemědělských potravin s vlastnostmi a charakteristikami představujícími přidanou hodnotu. Účelem je tak podpořit vnímání kvality potravin u lidí, to znamená, že zlepšení konkurenceschopnosti kvality potravin je možné za předpokladu, že i chování spotřebitele je spojeno se zájmem o specifickou vlastnost. Spočívá-li problém v postoji k informacím a sledování specifických vlastností o potravině, jaké máme k dispozici řešení? Empirické studie nabízí vzdělání o významu znaku (Verbeke a Ward, 2006). Prokazuje se zde evidentní vztah mezi objevenými nejasnostmi u potravin a chováním lidí. Tato skutečnost se prokázala, a proto spotřebitelská znalost problematiky globálních problémů, jeho osobité vidění reality i vyjádření měření konkurenceschopnosti to vše je záležitostí této studie: měření konkurenceschopnosti zdravých potravin u lidí s mimořádným myšlením o globálních problémech ve vztahu k potravinám Přijetí a porozumění informaci, její percepce a interpretace jako konečné komunikace s aspektem dalšího jednání v návaznosti na hodnocení kvality se jeví jako jev podstatný. Setkáváme se logicky s metodologickým problémem, se kterým se ztotožňuje i Carreon (2012): nemůžeme přeci číst myšlenky u lidí. V témže období Denton (2009) zaujímá stanovisko, že informace prolíná myšlenky ve dvou způsobech. Navíc důvodem sledování specifických vlastností u potravin jsou většinou nejasnosti (Olson, 1978; Ericksson a kol., 1984; Han a Terpstra, 1988; Rao a Monroe, 1989; Kirman a Rao, 2000). Proto sledujeme-li recepci cíle měření konkurenceschopnosti kvality potravin u lidí s mimořádným porozuměním o globálních problémech, pak výzkumné otázky zní: má náš vztah k informacím na svědomí, že hodnotíme kvalitu potravin z konkrétního úhlu pohledu? které vlastnosti potravin jsou příznačné u mladých lidí, co uvažují o problémech ve vztahu k potravinám? 205

206 jaká je pravděpodobnost, že si spotřebitel koupí potravinu, když jsou informace nejasné? které důsledky jsou spojovány výhradně s informační nejistotou? jaký je vztah mezi porozuměním kvality životního prostředí a potravin? Metodika Cílem koncepčního modelu je do jisté míry ukázat, myšlení spotřebitele, které ve svém důsledku může vést k zdravé budoucnosti celé komunity. Kromě toho studie zkoumá vztahy konkurenceschopnosti kvality potravin a informační nejistoty. Výzkum postojů zaměstnává odborníky desítky let. Marketingové a vědecké instituce získávají informace o názorech, myšlení čili postojích lidí, k tomu je vede záměrná myšlenka, která říká, že podle postojů lidí lze předvídat chování. První studii prokazující tuto myšlenku napsal LaPiere (1934). Jemu se nepodařilo najít jasné spojení mezi tím, co si lidé myslí čili postoji a chováním (Zanna a Fazio, 1982). Následně badatelé dokonce zpochybňují předpoklad, že postoje předvídají chování, to podnítilo k nové vlně výzkumu. S ohledem na vzniklé nejasnosti je snaha najít způsob, jak změnit a působit na postoje lidí. Podle Ajzena a Fishbeina (1977) zjistíme úzký vztah mezi postoji a chováním pouze tehdy, pokud je měření vzájemně slučitelné. Katona (1960) nalezl úzký vztah mezi charakteristickým rysem osobnosti a relevancí produktu. K analýze odvozující charakteristické vlastnosti lidí s určitým rysem chování k informacím se použila vícenásobná korespondenční analýza, která řeší vliv, jednotlivých kategorií, jejich vzájemnou podobnost či asociaci s kategoriemi ostatními proměnnými. Tyto kategorie (tzv. latentní veličiny) si lze představit jako redukci souřadného systému (neboli korespondenční mapy), ve kterém jsou tyto veličiny zobrazeny ( Kondrádová, 2009). Analýza, která využívá pouze informaci, mimo diagonálních prvků matice se nazývá: spojená korespondenční analýza (Joint Correspondence analysis). Jedná se o iterativní metodu, která používá nejmenších čtverců (Greenacre 1988, 2006). Problematické oblasti či nejasnosti jednotlivců jsou převedeny do proměnné informace (11 informací, je zde surovina informace o produktu a složení informace o procesu) a do proměnné chování (4 způsoby jednání). K simulaci předvídání chování předchází regresní analýza vztahu postoje k informacím a vnímání u nového druhu sýru. Tato statistická metoda (ordered probit, logit) umožňuje predikci pravděpodobnosti, jak mladí lidé budou používat informace v případě, že začnou řešit problematické oblasti ve vztahu k potravině spojené s důsledkem: potenciálního ohrožení kvality potravin, dostupnosti potravin, nutriční výživy, postupu zpracování a charakteristických vlastností typu sýru, rovněž tak odhalují souvislosti mezi informacemi a percepcí jakosti. Výsledky a diskuze, závěr Studie vychází z předpokladu, že hlavním faktorem konkurenceschopnosti kvality potravin je postoj lidí ke globálním otázkám. Tím se vztah lidí k potravinám převratně změní směrem k udržitelnému zemědělství. Převratná změna je nutná k zlepšení pozice rodinných farem, které byly a jsou znakem Evropské unie, a které se ve světle globalizace vytrácí. Přemostění mezi odborným problémem a poznáním jsou výzkumné otázky: 1) Má náš vztah k informacím na svědomí, že hodnotíme kvalitu potravin z konkrétního úhlu pohledu? Které vlastnosti potravin jsou příznačné pro mladé lidi, co uvažují o problémech ve vztahu k potravinám? Studie převzala přístup, který zdůrazňuje, že kognitivní determinanty udržitelného zemědělství u lidí ovlivní jejich jednání. Výsledkem je, že změna chování mladých lidí především není o znalostech, ale o příležitostech jak signifikantně změnit myšlení lidí. 206

207 Ke zkoumání se v prvním bodě použila korespondenční analýza. Perceptuální mapování problematických oblastí ve vztahu k vlastnostem potravin, odvozuje netriviálně skryté a potenciálně užitečné informace, kdy vztah k informacím má na svědomí, že hodnotíme kvalitu potravin z jiného úhlu pohledu. Znamená to, že způsob myšlení o informaci na potravině se stává charakteristickým rysem pro určitou skupinu lidí. Přesvědčili jsme se o třech skupinách problémových lidí, první z nich je skupina lidí, kteří řeší problematické otázky při hodnocení kvality potravin. Druhá z nich je skupina rovněž s charakteristickým rysem: plně se neasociovat s okolnostmi zemědělství a třetí z nich je skupina lidí, kteří jsou zcela subjektivní a od obou skupin se odlišují. Odlišují se tím, že nejsou přesvědčeni o informacích, s kterými by řešili vztah k potravinám a s nimi související nejasné otázky. Již tato prvotní analýza ukazuje, že lidé co nehledají informace, se nezajímají o čerstvou potravinu a její složení. Navíc se ukázalo, že není principiální rozdíl mezi skupinami s velmi relevantním a relevantním postojem a často i nerelevantním postojem k specifickým informacím u potravin ve vztahu k informační nejistotě v zemědělském a potravinovém řetězci viz. Graf 1 2. Existence znaků a osobního hodnocení je v každé komunikaci nesporná. Postoj, názor podle teorie psychologie zcela nepředvídá chování. Individuální charakter jednání je odvislý od složitosti otázky, kterou lidé ve vztahu k potravinám řeší. Princip reakce na myšlení lze identifikovat metodou pro ordinální proměnné. V druhém bodě z hlediska zjištění vlastností u potravin, kde postoj předvídá informační chování, se použila vícerozměrná statistická metoda. Informace lze podle informační teorie a tendence ve vztahu k vnímání kvality potravin rozdělit do tří skupin: 1. Postoj k informacím ovlivní sledování kvality; 2. Informace, pro které není důvod je používat (ohrožení zdraví, apod.); 3. Nejasné informace. Empirický výzkum poskytl důkazy kromě jiného o tom, že (1) lidé především přemýšlí o informacích: výrobci, nutriční hodnotě, složení, původu suroviny kupované potraviny, když se asociují s problémy ve vztahu ke kvalitě potravin a životnímu prostředí (1. skupina); (2) mladí lidé jeví zájem o informace, které se týkají alergií, ale vzhledem k tomu, že nejsou upozorněni o alergických reakcích vzniklých z potravin, tak tyto informace nevyužívají (2. skupina). Výsledky z této části studie naznačují, že na vnímání souhrnné kvality mají především vliv jasné informace. Pravděpodobně nejpřekvapivější aspekt v chování je rozhodování s jistotou či důvěrou k potravinovému systému. Z tohoto odborného problému vychází následující výzkumná otázka. Jaká je pravděpodobnost, že si spotřebitel koupí potravinu, když jsou informace nejasné? Které důsledky jsou spojovány výhradně s informační nejistotou? Jaký je vztah mezi porozuměním kvality životního prostředí a potravin? Konflikt postoje k informacím a jejich subjektivním vnímání vysvětluje, že vnímání důsledků k lhostejnosti ke kvalitě potravin je u řady lidí jedinečné. Logicky je vhodnější se soustředit na nejpravděpodobnější charakteristickou vlastnost, která se výhradně spojuje s informační nejistotou. Výsledky nastiňují, že se jedná o informační nejistotu k původu suroviny a udržení mikrobiální kvality u potravin. Závěrem je, že jistota je přesvědčení spotřebitelů a jen málo koresponduje s postojem k informacím. Výzkum rozhodování za jistoty mikrobiální kvality, potažmo nutriční hodnoty, zdravotní nezávadnosti umožnil odhadnout chování v situaci při nákupu nového druhu potraviny (sýru). Dodatečný výpočet potvrdil poznání reality, že v případě nejasných informací si studenti, kteří neřeší problematické otázky s informacemi o potravině, si ji evidentně s 95 % pravděpodobností (nikdy, někdy, příležitostně) nekoupí. Tvrzení vypovídá o představě věrné vize potravinové jistoty. Vztah k informacím tedy mění vnímání kvality potravin. Jak změnit myšlení lidí směrem k udržitelnému zemědělství a jak u nich dosáhnout porozumění důsledku lhostejnosti k potravinám? 207

208 Graf č. 1: Korespondenční analýza postoj k informacím Legenda: Postoje k informacím jsou vyjádřeny číselně, kde 0 znamená nedůležité, 1 znamená důležité a 2 znamená velmi důležité. V případě otázky: Hledáte požadované informace o výrobku na etiketě? Znamená 3 někdy. Čím jsou si body v mapě blíže, tím více spolu korespondují. Graf č. 2. Korespondenční analýza Legenda: Značení informací je stejné jako v předchozím grafu. V případě otázky 1 znamená příležitostně. 208

209 Změna postoje je klíčem k hlubší a dlouhodobější formě sociálního vlivu, jak je uvedeno v řadě výzkumných zpráv (Ajzen, 2001; Eagly and Chaiken, 1998; Petty a kol., 1997; Wood, 2000). K nejvýznamnějším objektivním zjištěním postoje k potravinové jistotě ve vědecké literatuře je bezmála vztah mezi standardy, vírou spotřebitele, zemědělském vzdělání, transparentnosti potravinového systému. Teoretické experimenty fascinují dobovou změnou postoje k potravinám v severní Americe, hovoří o tom, že lidé, kteří řeší nejasnosti ve vztahu k potravině, se orientují podle výrobce a obávají se používání chemikálií přímo v potravině a současně v jejich okolí, v zemědělství (Tilmanyho, 2008). Méně překvapivé je zjištění, že spotřebitelé používají charakteristické vlastnosti potravin, když informace jsou neplnohodnotné či těžko zjistitelné (Olson, 1978; Ericksson a kol., 1984; Han a Terpstra, 1988; Rao a Monroe; 1989, Kirman a Rao, 2000). Vztah k informacím tedy mění způsob, jímž vnímáme kvalitu. I tady platí, že se musíme vzdělávat sami a spoléhat se sami na sebe. Před skončením věřím, že je důležité se zmínit i o stanovení definice kvality v této studii. Kvalita potravin na globálním trhu vyjadřuje v mysli lidí princip udržitelného zemědělství, stejně tak následuje populární slogan z farmy přímo na vidličku. Udržitelné zemědělství je definováno jako hospodaření s minimálními, negativními důsledky na životní prostředí, nabízející kreativní pracovní příležitosti mladým lidem a obohacující život na venkově. Pro nové generace je myšlenka od farmy na vidličku a směr identity k místu zvláštní změna. Nejedná se o blízkost k místu, ale o poctivost a společenské hodnoty, které se dnes na konkurenčním světě a ve světle Evropy vytrácí. Je to směr, který je více než důležitý pro místní tradice, rodinné farmy v ČR. V roce 1969 Howard a Sheth identifikují, že složitost nejasností je do jisté míry determinantou vnímání kvality. V současnosti se v této studii na základě tohoto přístupu odhaduje příležitost, že 71 % mladých lidí, kteří řeší globální problémy či nejasnosti ve vztahu ke znaku: výrobci, názvu sýru, složení a nutriční hodnotě, sledují informace. Potvrzuje se, že spotřebitel potřebuje jasné informace o kvalitě potravin. Ještě jednou předpokladem k dosažení udržitelného zemědělství (k zlepšení dostupnosti zdravých potravin všude na světě) se jeví přemýšlení mladých lidí o environmentálních globálních závazcích. K tomu je potřeba signifikantní změna na politické úrovni. Environmentální globální otázky pro mnohé z nás znamenají především globální rozšíření nemocí, nedostatek potravin, ekonomické otřesy, ekologické katastrofy, kyselé deště, snižující se dostupnost pitné vody, degradaci půdy, ztrátu rodinných farem, neefektivní a svou realizací nesystematickou formou plýtvání velkého objemu potravin, nejasnosti o výrobě a původu potravin. K tomu v konečném důsledku se staví i vědečtí odborníci s objevem neobvyklé mutace genů u dětí a doktoři s naléhavým upozorněním na zdravotní problémy s cukrovkou, obezitou, alergií u řady lidí. Poděkování: Práce vznikla za částečné finanční podpory výzkumného záměru IGA Posílení konkurenceschopnosti místních mlékárenských výrobků na trhu. Použitá literatura 1 Ajzen, I. (2001): Nature and operation of attitudes. Annual Review of Psychology, 52, Carreón, J. R. (2012): Mind and Soil, Knowledge Aspekt of Sustainable agriculture. ISBN: Denton, D. (2009): Branding agri-food products with credence attributes, Disertační práce. Submitted to Michigan State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosphy, Agricultural Economics. 4 Eagly, A., H., Chaiken, S. (1993): The psychology of attitues. For Worth, TX: Harcourt Brace Jovanovich 5 Ericksson, G., J. Johansson, P. Chao (1984): Image Variables in Multi-Attribute Product Evaluations: Country-of-Origin Effects. Journal of Consumer Research 11 (2), Greenacre, M. J. (1988): Correspondence analysis of multivariate categorical data by weighted leastsquares. Biometrika 75:

210 7 Greenacre, M. J. (2006): From simple to multiple correspondence analysis. In Multiple Correspondence Analysis and Related Methods, ed. M. J. Greenacre and J. Blasius. Boca Raton,!FL: Chapman and Hall. 8 Han, M. & Terpstra, V. 1988, Country-Of-Origin Effects for Uni-National and Bi-National,Journal of International Business Studies 19 (2), p Howard a Scheth, J., N. (1969): The Theory of Buyer Behavior. New York: John Weley an Sons. 10 Kirmani, A., Rao, A.,R. (2000): No pain, No Gain: A Critical Review of the Literature on Signaling Unobservable Product Quality. Journal of Marketing 64, Kondrádová, L (2009): Korespondenční analýza, Diplomová práce, Vysoká škola Ekonomická v Praze. 12 Olson, J. (1978): Inferential Belief Formation in the Cue Utilization Process." Advancesin Consumer Research 5, Petty, R. E., Wegener, D. T., Fabrigar, L., R. (1997): Attitudes and attitude change. Annual Review of Psychology, Rao, A.,R., Monroe, K. B. (1988).: The Moderating Effect of Prior Knowledge on Cue Utilization in Product Evaluations. Journal of Consumer Research 15 (2), Thilmany, D., Bond, C. A., Bond J. K. (2008): Goint local: exploring consumer behavior and motivations for direct food purchases. Amer. J. Agr. Econ. 90 (Number 5, 2008): Copyright 2008 Agricultural and Applied Economics Association.DOI: /j x 16 Wood (2000): Attitude change: Persuasion and social influence. Annual Revieiw of Psychology, 51,

211 VÝSKYT BIOGENNÍCH AMINŮ V SÝRECH Z FARMÁŘSKÉ PRODUKCE A VYBRANÝCH FERMENTOVANÝCH MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH V ČR Buňková Leona 1), Lorencová Eva 2), Velichová Helena 3), Buňka František 2) 1) Ústav inženýrství ochrany životního prostředí, Fakulta technologická UTB ve Zlíně 2) Ústav technologie potravin, Fakulta technologická UTB ve Zlín 3) Ústav analýzy a chemie potravin, Fakulta technologická UTB ve Zlín Monitoring of biogenic amines in cheeses manufactured at small-scale farms and in fermented dairy products in the Czech Republic Summary: The aim of the study was monitoring of six biogenic amines (histamine, tyramine, phenylethylamine, tryptamine, putrescine, and cadaverine) and two polyamines (spermidine and spermine) in 112 samples of dairy products purchased in the Czech Republic, namely in 55 cheeses made at small-scale farms and in 57 fermented dairy products. The products were tested at the end of their shelf-life period. Neither tryptamine nor phenylethylamine was detected in the monitored samples; histamine was found only in four cheese samples containing up to 25 mg/kg. The contents of spermine and spermidine were low and did not exceed the values of 35 mg/kg. Significant amounts of tyramine, putrescine, and cadaverine occurred especially in cheeses produced from ewe s milk or in long-term ripened cheeses. In about 10 % of the tested cheeses, total concentration of all the monitored biogenic amines and polyamines exceeded the level of 200 mg/kg, which can be considered toxicologically significant. In fermented dairy products, the tested biogenic amines occurred in relatively low amounts (generally up to 30 mg/kg) that are regarded safe for consumers health. Úvod Biogenní aminy (BA) jsou nízkomolekulární dusíkaté látky, které mají charakteristické fyziologické účinky v živých organizmech. Některé BA mají funkci hormonální, řada BA je považována za nervové mediátory nebo mohou být prekurzory pro syntézu hormonů, alkaloidů a dalších metabolitů. 1-3 Mezi nejdůležitější a v potravinách nejvíce sledované aminy patří histamin, tyramin, 2-fenyletylamin, tryptamin, putrescin, kadaverin, spermin a spermidin. 1,3 Biogenní aminy vznikají nejčastěji dekarboxylací aminokyselin nebo aminací či transaminací aldehydů a ketonů. Dekarboxylace je katalyzována enzymy dekarboxylázami, které jsou buď přirozenou součástí živočišných a rostlinných organizmů nebo častěji mikrobiálního původu. Mikroorganizmy s dekarboxylázovou aktivitou se mohou do potravin dostat spontánně nebo jsou součástí zákysových kultur, které jsou do potraviny přidávány záměrně. 3 Z tohoto důvodu lze BA považovat za indikátory kvality a mikrobiální kontaminace potravin. 1,4 V současné době jsou dostupné studie charakterizující výrobky od maloproducentů farmářského charakteru z oblasti jižní Evropy (Itálie, Portugalsko, Řecko), avšak v oblasti střední Evropy se takovou studií doposud nikdo nezabýval. V České republice navíc stoupá obliba farmářských trhů, mnozí lidé se svým životním stylem snaží o návrat k přírodě a z toho důvodu preferují i výrobky od maloproducentů farmářského charakteru. Ucelená studie, která by monitorovala výskyt biogenních aminů v takových výrobcích, rovněž nebyla dosud publikována. Cílem této studie bylo stanovit obsah osmi BA (histaminu, tyraminu, 2-fenyletylaminu, tryptaminu, putrescinu, kadaverinu, spermidinu, sperminu) ve vzorcích sýrů od maloproducentů farmářského charakteru a ve vybraných kysaných mléčných výrobcích na konci doby trvanlivosti. Tyto výrobky byly zakoupeny v běžné obchodní síti v ČR. Materiál a metody V průběhu roku 2012 (duben červenec) bylo zakoupeno celkem 55 sýrů od maloproducentů farmářského charakteru z oblasti Střední Evropy (Česká republika a Slovensko). Ve všech případech se jednalo o krajové výrobky, které byly zakoupeny na farmářských trzích, maloprodejnách a nebo přímo v místě výroby na jednotlivých farmách. Sýry byly rozděleny do 5 skupin: (i) brynzy a sýry z nepasterovaného ovčího mléka, (ii) sýry a tvarohy z pasterovaného ovčího mléka, (iii) sýry z kozího mléka (s výjimkou 1 vzorku vyrobeny z pasterovaného mléka), 211

212 (iv) čerstvé sýry a tvarohy vyrobené z pasterovaného z kravského mléka a (v) zrající sýry vyrobené z pasterovaného z kravského mléka (Tabulka 1). Kromě sýrů z farmářské produkce bylo také analyzováno 55 kysaných mléčných výrobků zakoupených v běžné obchodní síti v České a Slovenské republice a 2 kysané mléčné výrobky od maloproducentů farmářského charakteru z východní Moravy. Jednalo se o: (i) 29 jogurtů (z toho jeden smetanový jogurt z farmářské produkce), (ii) 14 zakysaných smetan, (iii) 4 acidofilní mléka, (iv) 4 kefírová mléka, (v) 2 kysaná podmáslí a (vi) 4 kysaná mléka (z toho jedno z farmářské produkce). Všechny výrobky byly bez příchutě (Tabulka 2). Vzorky sýrů i kysaných mléčných výrobků byly uchovávány při chladírenských teplotách 6±2 C a použity k analýze na konci doby trvanlivosti. Všechny odebrané vzorky byly homogenizovány (pokud bylo potřeba) a následně byly lyofilizovány. Lyofilizovaná hmota byla udržována do okamžiku analýzy při 70 C. Trojnásobná extrakce aminů byla provedena roztokem kyseliny chloristé (0.6 mol/l). Obsah 8 aminů byl stanoven metodou kapalinové chromatografie (přístroje LabAlliance a Agilent Technologies) po předchozí derivatizaci dansylchloridem. Derivatizace, chromatografická separace (ZORBAX Eclipse XDB-C18, 150 x 4.6 mm, 3.5 μm, Agilent Technologies) a spektrofotometrická detekce (λ = 254 nm) byly provedeny podle Dadákové et al. 5 Každý vzorek byl extrahován třikrát, každý extrakt dvakrát derivatizován a každá derivatizovaná směs třikrát nanesena na kolonu (n = 18). Meze detekce se pro jednotlivé aminy pohybovaly v rozmezí ( mg/kg). Výsledky byly přepočteny na hmotu před lyofilizací. Výsledky byly podrobeny neparametrické analýze rozptylu s využitím Kruskall-Wallisova a Wilcoxonova testu (Unistat 5.5 software; Unistat, London, UK). Výsledky a diskuze Biogenní aminy anebo polyaminy byly detekovány ve 40 sýrech farmářského původu. V žádném z těchto sýrů nebyl detekován fenyletylamin a tryptamin, pouze v jednom sýru (vyrobeném z pasterovaného kozího mléka) byl detekován spermidin ( 32 mg/kg). Rovněž četnost výskytu histaminu byla nízká, tento BA byl detekován ve 4 sýrech v 1 brynze vyrobené z nepasterovaného mléka a ve 3 zrajících sýrech vyrobených z pasterovaného kravského mléka, a to v rozmezí mg/kg (Tabulka 1). Nejčastěji detekovaným biogenním aminem u analyzovaných sýrů byl tyramin, který se vyskytoval ve 24 vzorcích v množství mg/kg. U 11 sýrů byl zjištěn tyramin v koncentraci do 20 mg/kg, naopak u 6 sýrů bylo jeho množství vyšší než 100 mg/kg. Tyramin byl detekován ve většině sýrů vyrobených z ovčího mléka (pasterovaného i nepasterovaného). Tento BA byl také detekován u sýrů z pasterovaného kravského mléka, avšak v nižších koncentracích než u sýrů z ovčího mléka. Druhým nejčastěji detekovaným aminem u sýrů od maloproducentů byl kadaverin, který byl zjištěn ve 20 výrobcích v koncentraci mg/kg. U necelé poloviny vzorků byl kadaverin zaznamenán v poměrně nízkých koncentracích do 20 mg/kg. Toxikologicky závažnější množství kadaverinu (>100 mg/kg) bylo detekováno ve 2 sýrech. Přítomnost tohoto BA byla zjištěna především v ovčích sýrech s převahou sýrů vyrobených z nepasterovaného mléka (P<0.05). U sýrů vyrobených z kravského mléka byl zjištěn vyšší výskyt kadaverinu u čerstvých sýrů. Podobné účinky jako kadaverin (potenciátor účinku histaminu a tyraminu 2 ) má i putrescin, který byl zjištěn u 17 sýrů v množství mg/kg. U 3 sýrů byl putrescin detekován v koncentraci do 20 mg/kg, naopak u 4 sýrů v koncentracích vyšších než 100 mg/kg. U sýrů vyrobených z ovčího mléka byl putrescin zaznamenán ve více než polovině vzorků (10 vzorků z 18 testovaných), přičemž v 1 sýru zrajícím v solném nálevu byl detekován v množství téměř 230 mg/kg. U sýrů vyrobených z kravského mléka byl putrescin zjištěn ve čtvrtině vzorků s převahou zrajících sýrů (P<0.05). U 19 sýrů byl rovněž zaznamenán spermin. Tento polyamin byl s výjimkou 1 sýru (čerstvý sýr vyrobený z pasterovaného kravského mléka) detekován v množství do 20 mg/kg. U sýrů vyrobených z kravského mléka byl nalezen ve 2/3 ze všech testovaných sýrů. Spermin nebyl detekován u sýrů vyrobených z kozího mléka, jeho výskyt byl nízký rovněž u sýrů vyrobených z ovčího mléka (P<0.05). 212

213 Tabulka 1: Obsah biogenních aminů v mg/kg v testovaných sýrech od maloproducentů farmářského charakteru. Typ sýru Počet vzorků Biogenní aminy (mg/kg)* Suma Tyramin Histamin Putrescin Kadaverin Spermin Nepasterované ovčí mléko Brynza / /24.2±1.1 2/ / /9.7±0.8 Uzený sýr / ND ** 3/ / ND Čerstvý sýr 2 ND ** ND ND 1/20.7±1.3 1/19.6±1.4 ND Pasterované ovčí mléko Čerstvý sýr 3 ND / ND 2/ / ND Sýr z pařeného těsta 2 ND-13.2 ND ND ND ND 1/13.2±1.1 Sýr zrající v solném nálevu / ND 1/229.5±20.0 1/125.6±3.0 1/14.0±1.1 Ochucený sýr 2 ND /114.7±8.0 ND 1/108.8±7.0 ND ND Kozí mléko Zrající sýr z nepasterovaného mléka /207.1±7.5 ND ND 1/149.0±7.3 ND Čerstvý sýr neochucený 3 ND /11.3±1.0 ND ND ND ND Čerstvý sýr ochucený 6 ND /10.7±0.5 ND ND ND ND Sýr z pařeného těsta 3 ND /8.5±0.6 ND 1/41.1±3.3 1/40.3±2.5 ND Čerstvé sýry kravské mléko Čerstvý sýr neochucený 6 ND / ND 1/111.4±8.6 3/8.9±21.7 4/ Čerstvý sýr ochucený / ND ND 2/ / Ostatní sýry kravské mléko Zrající sýr / ND 2/ / / Sýr z pařeného těsta neochucený 5 ND /25.8±1.5 1/19.3±0.6 1/37.3±1.1 ND 2/ Sýr z pařeného těsta ochucený ND ND 2/ ND 3/ Sýr z pařeného těsta uzený ND 2/ ND 1/10.7±0.9 2/ * Jednotlivé biogenní aminy počet pozitivních vzorků/rozmezí detekovaného množství BA ** ND biogenní amin(y) nedetekován(y)

214 Pokud byly v sýrech farmářského původu detekovány biogenní aminy a polyaminy, tak ve většině sýrů byl detekován více než jeden amin. U 20 % testovaných sýrů bylo zjištěno celkové množství biogenních aminů a polyaminů do 20 mg/kg, u 30 % sýrů v rozmezí mg/kg, u 15 % sýrů v rozmezí mg/kg a u 9 % sýrů dokonce v množství vyšším než 200 mg/kg. Nejvyšší množství biogenních aminů (530 mg/kg) bylo zjištěno v sýru zrajícím v solném nálevu vyrobeném z pasterovaného ovčího mléka. V ovčích sýrech (vyrobených z pasterovaného i nepasterovaného mléka) byly BA detekovány obecně ve vyšších množstvích než v sýrech vyrobených z kozího a kravského mléka. Celkem 8 vzorků sýrů vyrobených z ovčího mléka obsahovalo BA v součtu >100 mg/kg, u kozích sýrů bylo toto množství zjištěno pouze v 1 sýru (vyrobeném z nepasterovaného mléka) a u sýrů vyrobených z pasterovaného kravského mléka u 4 sýrů, z nichž 3 sýry byly zrající. Kromě jednoho vzorku byly ve všech testovaných neochucených kysaných mléčných výrobcích detekovány BA v celkovém množství mg/kg (Tabulka 2). Zjištěna byla přítomnost 4 biogenních aminů tyraminu, putrescinu, kadaverinu a sperminu. Spermin byl však detekován pouze u 2 výrobků jogurtů (z toho byl jeden z farmářské produkce) v malém množství do 4 mg/kg. Přítomnost kadaverinu byla zjištěna pouze u jednoho jogurtu se sníženým obsahem tuku v množství 4.3±0.3 mg/kg. Nejčastěji zastoupeným biogenním aminem v kysaných mléčných výrobcích byl tyramin, jehož přítomnost byla zjištěna v 50 testovaných výrobcích. Ve většině případů (34 vzorků) bylo detekované množství tyraminu do 5 mg/kg. Vyšší množství bylo zaznamenáno pouze u zakysaných smetan, kdy u 12 výrobků (ze 14 testovaných) bylo detekováno >5mg/kg tyraminu (Tabulka 2). Tabulka 2: Obsah biogenních aminů ve fermentovaných mléčných výrobcích. Výrobek Počet Biogenní aminy (mg/kg) * vzorků Suma Tyramin Putrescin Kadaverin Jogurt bílý (obsah tuku 3-10%) / / ND ** Jogurt bílý (obsah tuku 10-11%) 4 ND ** / / ND Jogurt bílý (obsah tuku 2-3%) / /1.4±0.2 1/4.3±0.3 Jogurt bílý (obsah tuku 0.1%) / / ND Zakysaná smetana / / ND Acidofilní mléko / /4.1±0.3 ND Kysané mléko / ND ND Kysané podmáslí / ND ND Kefírové mléko / / ND * Jednotlivé biogenní aminy počet pozitivních vzorků/rozmezí detekovaného množství BA ** ND biogenní amin(y) nedetekován(y) Poměrně často byl v kysaných mléčných výrobcích detekován také putrescin, a to celkem ve 20 testovaných vzorcích. Na rozdíl od tyraminu však byla zjištěná množství putrescinu vyšší, u poloviny vzorků pozitivních na putrescin bylo zjištěné množství do 10 mg/kg, u 8 vzorků v rozmezí mg/kg a u 2 vzorků jogurtů dokonce v množství mírně převyšujícím 25 mg/kg. Zjištěné celkové množství BA se u kysaných mléčných výrobků pohybovalo do 30 mg/kg (Tabulka 2), přičemž u více než 75% testovaných vzorků bylo toto množství do 10 mg/kg. U 10 výrobků bylo celkové množství BA v rozmezí mg/kg a pouze u 3 jogurtů >20 mg/kg. U 39 testovaných kysaných mléčných výrobků byla zjištěna přítomnost pouze jednoho biogenního aminu (putrescinu nebo tyraminu), u zbývajících výrobků to byla nejčastěji kombinace dvou biogenních aminů tyraminu a putrescinu. V cca 80 % testovaných mléčných výrobků byla zjištěna přítomnost biogenních aminů. Zjištěné biogenní aminy mohou přecházet do výrobků z použitých surovin, ve kterých mohou být jejich přirozenou součástí. Příkladem mohou být polyaminy spermin a spermidin, které jsou součástí čerstvého mléka. 6,7 BA mohou být rovněž produkovány zákysovými a nezákysovými 214

215 bakteriemi mléčného kvašení, které byly použity při výrobě těchto výrobků nebo které se do nich dostaly během jejich technologického zpracování. Schopnost tvorby biogenních aminů byla popsána u řady zástupců bakterií mléčného kvašení. 6-9 Biogenní aminy mohou rovněž vytvářet i bakterie náležící ke kontaminující mikroflóře, zejména bakterie čeledi Enterobacteriaceae a další gramnegativní bakterie. 10,11 Jestliže srovnáme výskyt biogenních aminů a polyaminů v sýrech čerstvých a sýrech zrajících, tak vyšší obsah BA byl zjištěn u sýrů zrajících. Tento fakt lze přičíst tomu, že přítomná mikroflóra u čerstvých sýrů nemohla vyprodukovat dostatečné množství biogenních aminů. U zrajících sýrů se obvykle koncentrace BA s narůstající dobou zvyšují. 12,13 Na druhou stranu je však nutné podotknout, že u některých sýrů zrajících kratší dobu zakoupených od farmářů se vyskytovalo >200 mg/kg BA. Toto zvýšené množství BA lze pravděpodobně přičíst činnosti nezákysových bakterií mléčného kvašení nebo kontaminující mikroflóře. Sledován byl také výskyt biogenních aminů vyrobených z pasterovaného i nepasterovaného ovčího a kozího mléka. V případě ovčích sýrů nebyly zaznamenány výraznější rozdíly v celkovém obsahu BA mezi sýry vyrobenými ze syrového a pasterovaného mléka. Výraznější rozdíly byly zjištěny u sýrů vyrobených z kozího mléka, kdy sýr vyrobený ze syrového mléka obsahoval výrazně vyšší koncentrace BA (P<0.05). K podobným výsledkům dospěli i Novella-Rodríguez et al. 4, kteří toto zjištění přičítají vyššímu počtu mikroorganizmů v sýrech vyrobených ze syrového mléka. Vzhledem k povaze kysaných mléčných výrobků, jejich složení a způsobu výroby bylo možno očekávat výskyt určitého množství BA, protože zde existují příznivé podmínky pro jejich vznik (přítomnost volných aminokyselin, mikroorganizmů s dekarboxylázovou aktivitou, vhodné ph, teplota, apod.). 1,3,7 Na druhou stranu byl však u kysaných mléčných výrobků očekáván nižší obsah biogenních aminů než např. v sýrech. Fermentované mléčné výrobky nejsou, na rozdíl od sýrů, vhodným prostředím pro rozvoj mnohých bakterií (zejména kontaminujících gramnegativních bakterií), které by mohly přispět k produkci BA. Někteří autoři uvádí, že v kysaných mléčných výrobcích se nachází nízké množství biogenních aminů, obvykle nepřesahujících 15 mg/kg 6,14. Výsledky této práce u cca 15 % vzorků tuto hranici přesahují. Celkové množství BA se pohybovalo až do 29.4 mg/kg. Obdobná množství biogenních aminů byla detekována i v kefíru 15 a ve fermentovaném mléku 16, přičemž podobně jako v naší studii byly detekovány především tyramin a putrescin. Z hlediska možných negativních dopadů na lidské zdraví jsou nejvýznamnější BA v potravinách histamin a tyramin. 2 Histamin nebyl detekován u žádného z 57 vzorků kysaných mléčných výrobků. Přítomnost histaminu byla zjištěna ve 4 sýrech farmářského původu, avšak v poměrně nízkých koncentracích do 25 mg/kg, Podobná množství histaminu detekovali v sýrech vyrobených z ovčího mléka na farmách v Portugalsku 17, v Itálii 18 a v Turecku 19. Naproti tomu Ladero et al. 20 uvádějí výrazněji vyšší množství histaminu (až 1040 mg/kg) v sýrech vyrobených ze syrového i pasterovaného kravského, kozího i ovčího mléka a Andiç et al. 21 v sýrech s přídavkem bylin až 680 mg/kg histaminu. Tyramin byl přítomen v 50 analyzovaných vzorcích kysaných mléčných výrobků v poměrně nízkých koncentracích (do 16 mg/kg) a ve vyšších koncentracích (do 210 mg/kg) ve 24 sýrech farmářského původu. Obdobná množství tyraminu v sýrech detekovali i další autoři. 12,17,18 V případě zrajících sýrů vyrobených z ovčího mléka byly zaznamenány i mnohem vyšší koncentrace tyraminu v sýrech (až cca 1200 mg/kg) 18,21. Shalaby 2 udává jako hranici toxicity pro tyramin 100 mg/kg. Tomuto množství se žádný z testovaných kysaných mléčných výrobků nepřiblížil, avšak v případě sýrů byla tato koncentrace překročena u cca 10 % testovaných sýrů. V případě pacientů léčených inhibitory detoxikačních enzymů je udávána bezpečná hranice 6 mg/kg tyraminu. 2 Přes tuto hranici se dostalo 15 kysaných mléčných výrobků. Vzhledem k tomu, že jsou tyto výrobky obvykle konzumovány v množství maximálně několika set gramů (mililitrů), neměla by tato množství představovat vážné riziko pro zdraví konzumentů. Potenciální nebezpečí by hrozilo pouze v případě současné konzumace jiných na BA bohatých potravin, mezi které však patří i sýry. 6,7 V případě námi testovaných sýrů tuto hranici překročilo všech 24 sýrů (z 55 testovaných), u kterých byla zjištěna přítomnost tyraminu. 215

216 V porovnání s dalšími mléčnými výrobky (například zrajícími sýry), dosahuje množství BA v testovaných kysaných mléčných výrobcích o několik řádů nižších hodnot (prakticky <30 mg/kg). V případě zrajících sýrů se obsah BA může pohybovat i v jednotkách gramů na kilogram. 6,18,22 Tento rozdíl je pravděpodobně způsoben podmínkami při výrobním procesu a zrání/skladování. Kysané mléčné výrobky procházejí procesem fermentace za teplot příznivých pro růst bakterií a tvorbu BA jen po dobu několika málo hodin. Poté jsou zchlazeny a uchovávány při chladírenských teplotách, které nejsou optimální pro růst mikroorganizmů a tudíž ani pro tvorbu BA. Také doba jejich použitelnosti a tím i doba, po kterou mohou ve výrobcích BA vznikat, je relativně krátká a většinou nepřesahuje 3 až 4 týdny. Stanovení toxické hodnoty celkového množství biogenních aminů v potravinách je obtížné, neboť při stanovení sehrává význam velké množství různorodých faktorů. Jednotliví autoři uvádí hodnoty obsahu v širokém rozmezí a to mg biogenních aminů na 1 kg potraviny. 1,3,7 Vezmeme-li dolní hranici tohoto intervalu (200 mg/kg), pak asi 10 % vzorků sýrů od maloproducentů farmářského původu již obsahuje taková množství biogenních aminů, která jsou schopna přivodit zdravotní komplikace i zdravému jedinci. Při posuzování závažnosti obsahu biogenních aminů v potravinách je třeba posuzovat denní příjem komplexněji. Řada dalších sloučenin, například alkohol může snižovat aktivitu enzymů, které se podílejí na odbourávání biogenních aminů v lidském střevním traktu. 2 Přihlédneme-li ke skutečnosti, že sýry se často podávají k alkoholickým nápojům (například pivo nebo víno), pak mohou být i nižší koncentrace BA pro člověka nežádoucí. Situaci navíc zhoršuje i skutečnost, že samotné pivo a víno často obsahují vysoká množství biogenních aminů. 23,24 Výsledky této studie ukazují, že biogenní aminy a polyaminy se v sýrech vyskytují poměrně často, což je třeba vzít v úvahu i z toho důvodu, že se obecně zvyšuje konzumace sýrů a rovněž roste obliba výrobků od maloproducentů. Jelikož není pro obsah biogenních aminů a polyaminů legislativně stanoven limit, nejsou tyto sekundární metabolity pravidelně dozorovými orgány sledovány a vyhodnocovány, což by v případě vyššího obsahu BA mohlo představovat potenciální riziko pro konzumenta. Poděkování: Tato práce vznikla s finanční podporou Národní agentury pro zemědělský výzkum, projekt QJ programu Komplexní udržitelné systémy v zemědělství Použitá literatura: 1. Halász, A., Baráth, Á., Simon-Sarkadi, L. and Holzapfel, W Biogenic amines and their production by microorganisms in food. Trends in Food Science and Technology, 5: Shalaby, A. R Significance of biogenic amines to food safety and human health. Food Research International, 29: Silla Santos, M. H Biogenic amines: their importance in food. International Journal of Food Microbiology, 29: Novella-Rodríguez, S., Veciana-Nogués, M. T., Roig-Sagués, A. X., Trujillo-Mesa, A. J. and Vidal- Carou, M. C Evaluation of biogenic amines and microbial counts throughout the ripening of goat cheeses from pasteurized and raw milk. Journal of Dairy Research, 71: Dadáková, E., Křížek, P. and Pelikánová, T Determination of biogenic amines in foods using ultra-performance liquid chromatography (UPLC). Food Chemistry, 116: Linares, D. M., Martín, M. C., Ladero, V., Alvarez, M. A. and Fernández, M Biogenic amines in dairy products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 51: Spano, G., Russso, P., Lonvaud-Funel, A., Lucas, P., Alexandre, H., Grandvalet, C., Coton, E., Coton, M., Barnavon, L., Bach, B., Rattray, F., Bunte, A., Magni, C., Ladero, V., Alvarez, M., Fernández, M., Lopez, P., De Palencia, P. F., Corbi, A., Trip, H. and Lolkema, J. S Biogenic amines in fermented foods. European Journal of Clinical Nutrition, 64: S95-S Buňková, L., Buňka, F., Hlobilová, M., Vaňátková, Z., Nováková, D. and Dráb, V Tyramine production of technological important strains of Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus. 216

217 European Food Research and Technology, 229: Buňková, L., Buňka, F., Pollaková, E., Podešvová, T. and Dráb, V The effect of lactose, NaCl and an aero/anaerobic environment on the tyrosine decarboxylase activity of Lactococcus lactis subsp. cremoris and Lactococcus lactis subsp. lactis. International Journal of Food Microbiology, 147, Chaves-López, C., De Angelis, M., Martuscelli, M., Serio, A., Paparella, A. and Suzzi, G Characterization of the Enterobacteriaceae isolated from an artisanal Italian ewe's cheese (Pecorino Abruzzese). Journal of Applied Microbiology, 101: Coton, M., Delbés-Paus, C., Irlinger, F., Desmasures, N., Le Fleche, A., Stahl, V., Montel, M.-C. and Coton, E Diversity and assessment of potential risk factors of Gram-negative isolates associated with French cheeses. Food Microbiology, 29: Buňková, L., Buňka, F., Mantlová, G., Čablová, A., Sedláček, I., Švec, P., Pachlová, V. and Kráčmar, S The effect of ripening and storage conditions on the distribution of tyramine, putrescine and cadaverine in Edam-cheese. Food Microbiology, 27: Martuscelli, M., Gardini, F., Torriani, S., Mastrocola, D., Serio, A., Chaves-López, C., Schirone, M. and Suzzi, G Production of biogenic amines during the ripening of Pecorino Abruzzese cheese. International Dairy Journal, 15: Chaves-López, C., Serio, A., Martuscelli, M., Paparella, A., Osorio-Cadavid and Suzzi, G Microbiological characteristics of kumis, a traditional fermented Colombian milk, with particular emphasis on enterococci population. Food Microbiology, 28: Özdestan, Ö and Üren, A Biogenic amine content in kefir: a fermented dairy product. European Food Research and Technology, 231: Magwamba, C., Matsheka, M. I., Mpuchane, S. and Gashe, B. A Detection and quantification of biogenic amines in fermented food products sold in Botswana. Journal of Food Protection, 73: Pintado, A. I. E., Pinho, O., Ferreira, I. M. L. V. O., Pintado, M. M. D., Gomes, A. M. P. and Malcata, F. X Microbiological, biochemical and biogenic amine profiles of Terrincho cheese manufactured in several dairy farms. International Dairy Journal, 18: Schirone, M., Tofalo, R., Mazzone, G., Corsetti, A. and Suzzi, G Biogenic amine content and microbiological profile of Pecorino di Farindola cheese. Food Microbiology, 28: Andiç, S., Tunçtürk, Y. and Gençcelep, H The effect of different packaging methods on the formation of biogenic amines and organic acids in Kashar cheese. Journal of Dairy Science, 94: Ladero, V., Linares, D. M., Fernández, M. and Alvarez, M. A Real time quantitative PCR detection of histamine-producing lactic acid bacteria in cheese: Relation with histamine content. Food Research International, 41: Andiç, S., Gençcelep, H. and Köse, Ş Determination of biogenic amines in herby cheese. International Journal of Food Properties, 13: Novella-Rodríguez, S., Veciana-Nogués, M. T., Izquierdo-Pulido, M. and Vidal-Carou, M. C Distribution of biogenic amines and polyamines in cheese. Journal of Food Science, 68: Ancín-Azpilicueta, C., González-Marco, A. and Jiménez-Moreno, N Current knowledge about the presence of amines in wine. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 48: Kalač, P. and Křížek, M A review of biogenic amines and polyamines in beer. Journal of the Institute of Brewing, 109: Kontaktní adresa: Doc. RNDr. Leona Buňková, Ph.D., Ústav inženýrství ochrany životního prostředí, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, nám. T. G. Masaryka 275, Zlín, tel.: , bunkova@ft.utb.cz. 217

218 218

219 POUŽITÍ NIR SPEKTROSKOPIE K ANALÝZE VYROBENÝCH SYROVÁTKOVÝCH SÝRŮ Teplá Jana, Lužová Táňa, Dvořák Lukáš, Strnková Jana, Šustová Květoslava Ústav technologie potravin, Mendelova univerzita v Brně Use of NIR Spectroscopy for the analysis of made whey cheeses Summary: 29 samples of brown whey cheeses were produced from goat whey. The samples of brown whey cheeses were divided into flavoured and unflavoured. Flavoured ones were also divided by temperature evaporation and cream addition. Samples were measured by FT NIR Antaris device on the interactance and reflectance mode. FT NIR discriminant analyses were able to detect differences between brown whey cheeses, depending on the recipe of their manufacture. The values obtained from reference analyses (dry matter, fat, sodium chloride, water activity) were used for the formation of calibration models that took place simultaneously with the measurement of samples by FT-NIR. Results of calibration models for certain parameters were not reliable, but it has been demonstrated that measurement with using of integration sphere was more reliable than the measurement by probe. Úvod Syrovátkou se podle legislativy rozumí mléčný výrobek vznikající jako vedlejší produkt při výrobě sýrů, včetně tvarohů a kaseinů 1. V roce 1970 se v EU pro lidskou výživu využilo jen 5 % syrovátky, zbylých 95 % sloužilo ke krmným účelům, v roce 2000 však byl tento poměr už 50:50. Ekonomické, ekologické a nutriční důvody vedly k rozvoji nových technologií a také k rozšíření výzkumu ohledně nutričně-fyziologického významu obsažených složek 2. Syrovátku lze mimo jiné zpracovat na hnědé karamelové sýry, které jsou typické a známé především ve skandinávských zemích. Při jejich výrobě karamelizuje laktóza a sráží se bílkovina. Vodní pára je tedy jediným vedlejším produktem, který při jejich přípravě vzniká 3,4. Ke kontrole kvality mléčných výrobků se stále častěji využívá FT-NIR spektrometrie. Blízká infračervená spektroskopie (NIR) je rychlá a nedestruktivní analytická metoda pro ověřování vzorků potravin, vyznačuje se snadným použitím a relativně nízkými finančními náklady 5. Cílem naší práce bylo vypracovat technologii zpracování kozí syrovátky na hnědé sýry a posoudit uplatnění FT-NIR spektrometrie ke kontrole technologických postupů a složení hnědých syrovátkových sýrů. Materiál a metodika Pro vlastní analýzy byly použity vzorky hnědých syrovátkových sýrů, které byly vyrobeny podle navržené receptury v laboratoři Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně. Kozí syrovátka byla dopravena z farmy, zabývající se výrobou čerstvých sýrů, nebyla nijak upravena, pouze v daném množství odpařována do požadované konzistence. Následně byla vzniklá pasta zchlazena na zvolenou teplotu, popř. byly přidány vybrané přísady. Vzorky byly poté uskladněny v plastových kelímcích s víčky v chladničce při teplotě 6 8 C. Celkem bylo analyzováno 29 vzorků syrovátkových sýrů. Vzorky byly rozděleny dle navržené receptury do dvou skupin, a to na vzorky neochucené (12 vzorků) a vzorky ochucené různými přísadami (17 vzorků sýrů). Neochucené vzorky byly navíc rozděleny podle teploty na konci odparu a případného recepturního přídavku smetany. Pro výrobu neochucených hnědých syrovátkových sýrů bylo použito vždy 2,6 l kozí syrovátky, teplota na konci odparu byla zvolena podle vytvořené receptury v rozmezí od 55 do 75 C, k některým z nich bylo přidáno 0,17 l smetany. Při výrobě ochucených syrovátkových sýrů se po odpaření větší části kozí syrovátky přidal, podle zvolené jednotlivých vzorků, vanilkový cukr, skořicový cukr s jablkem, sušené švestky, čokoláda se smetanou, výluh sušené majoránky zahradní, sušené švestky s povidly a mákem, výluh z medvědího česneku, banány se skořicovým cukrem a smetanou, sušené švestky se smetanou, sušené brusinky se smetanou, karamel, čokoláda, Jesenka se smetanou, Laktazan a karamel s čokoládou. 219

220 Vzorky vyrobených sýrů byly podrobeny chemickým a fyzikálním rozborům. U hnědých karamelových syrovátkových sýrů byly stanovovány následující parametry: sušina vážkovou metodou, tuk, acidobutyrometricky, NaCl přímou titrací, aktivita vody pomocí přístroje LabSwiftaw (Novasina, Švýcarsko). Současně probíhaly i analýzy na spektrofotometru FT-NIR Antaris, využívající blízké infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (ThermoNicolet, USA) v režimu interaktance pomocí optické sondy, ve spektrálním rozsahu cm -1, při 80 scanech a rozlišením 4. Poté byly vzorky změřeny také v režimu reflektance na integrační sféře, ve spektrálním rozsahu cm -1, s 80 scany a rozlišením 8. Při využití tohoto režimu byl ze vzorku odříznut pásek, který měl šířku 1cm, byl umístěn na Petriho misku a překryt alobalem. Každý vzorek byl měřen v obou režimech pětkrát a byla vytvořena průměrná spektra, která byla dále upravována a vyhodnocována pomocí programu TQ Analyst metodou PLS (Partial least squares, tzn. metodou nejmenších čtverců) s využitím cross-validace a nástroje PRESS. Výsledky byly dále pomocí programu TQ Analyst zpracovány využitím diskriminační analýzy na hladině pravděpodobnosti α = 0,95, kdy cílem bylo zjistit, zda metoda FT-NIR dokáže oddělit jednotlivé vzorky na základě použité receptury, teplot zpracování a zda je možné mezi sebou srovnávat jednotlivé měřící režimy. Výsledkem diskriminační analýzy byly tzv. diskriminační kříže. Jsou-li přístrojem mezi jednotlivými skupinami detekovány nějaké rozdíly, dojde k diferenciaci klastrů od sebe navzájem. Kvalita modelu se také ověřovala pomocí korelačního koeficientu R, směrodatné odchylky kalibrace (SEC) a validace (SEP). Výsledky Průměrná hodnota obsahu sušiny byla stanovena na 6,64 hmotnostních procent. U ostatních parametrů byly zjištěny tyto hodnoty: průměrný obsah tuku 9,65 %, průměrná hodnota NaCl 3,43 % a průměrná aktivita vody 0,800. V Tabulce I jsou uvedena minima a maxima těchto hodnot, směrodatné odchylky a variační koeficienty. Tabulka I Výsledky chemické analýzy Max Min Sx (%) Vx (%) Sušina hm. % 87,22 61,13 76,64 7,57 9,88 Tuk % 25,00 1,00 9,65 8,29 85,91 NaCl % 4,36 2,54 3,43 0,52 15,16 Aktivita vody 0,880 0,740 0,800 0,050 6,250 Max maximální hodnota, Min minimální hodnota, - průměrná hodnota, Sx = směrodatná odchylka, Vx = variační koeficient. Naměřená data byla zpracována programem TQ Analyst metodou PLS s využitím crossvalidace a nástroje PRESS. Kvalita modelu byla testována pomocí korelačního koeficientu (R), směrodatné odchylky kalibrace (SEC) a validace (SEP). Na Obr. 1. jsou ukázky spekter syrovátkových sýrů s přídavkem čokolády, tedy jaký je rozdíl mezi spektrem měřeným pomocí sondy a na integrační sféře. 220

221 Obr. 1. Infračervená spektra hnědého syrovátkového sýru s přídavkem čokolády měřených sondou a na integrační sféře Diskriminační analýzou byly u syrovátkových sýrů provedeny testy, zda je na základě použité receptury přístroj schopen jednotlivé vzorky od sebe odlišit v rámci použitých přísad a u neochucených vzorků navíc, zda je schopen od sebe odlišit teplotní režimy a případný přídavek smetany. Vzhledem ke skutečnosti, že výsledky si byly ve všech případech velmi podobné, je na Obr. 2. uveden pouze příklad měření na integrační sféře, a to mezi vzorkem s karamelem a švestkami. Obr. 2. Diskriminační kříž detekce rozdílů sondou mezi syrovátkovými sýry s použitím karamelu ( ) či švestek (Δ) Z uvedených výsledků lze usoudit, že jsme prokázali schopnost FT-NIR spektrometrie detekovat rozdíly mezi hnědými syrovátkovými sýry v závislosti na použité surovině při jejich výrobě. Ve všech provedených analýzách došlo k absolutní diferenciaci klastrů, což ukazuje, že mezi jednotlivými skupinami použitých vzorků existují statisticky průkazné rozdíly. Další diskriminační analýzy byly provedeny na základě teploty při výrobě či přídavku konkrétní suroviny. I zde jsou uvedeny jen pro příklad vybraná spektra. Stejně jako tomu bylo u rozpoznání suroviny, byl FT-NIR schopen detekovat rozdíly na základě zvolených parametrů, tedy teploty a případného přídavku smetany, kdy byla odhalena přesvědčivá diferenciace jednotlivých skupin (viz Obr. 3.). 221

222 Obr. 3. Diskriminační kříž syrovátkových sýrů vyrobených při teplotě 55 C bez přídavku smetany ( ) a s přídavkem smetany (Δ) měřených sondou Metoda FT-NIR se jeví jako vhodná metoda k proměřování kvalitativních znaků hnědých syrovátkových sýrů a k rozlišování skupiny vzorků na základě zvolených technologických parametrů. Další částí této práce bylo vytvoření kalibračních modelů pro stanovení obsahů sušiny, tuku a NaCl a vodní aktivity, jak pro měření metodou optické sondy (Tabulka II), tak pro měření integrační sférou (Tabulka III). K tvorbě kalibrací byly použity hodnoty získané pomocí referenčních analýz, které probíhaly současně s měřením vzorků na FT-NIR. Tabulka II Výsledky kalibrace a validace pro stanovení obsahu sušiny, tuku, NaCl a aktivity vody naměřených s využitím sondy Sonda SEC SEP CCV (%) PCV (%) R R v Sušina 4,850 5,920 6,329 7,730 0,767 0,635 Tuk 3,040 4,220 31,493 43,717 0,930 0,862 NaCl 0,433 0,513 12,628 14,961 0,544 0,276 Aktivita vody 0,040 0,050 4,975 6,219 0,591 0,329 SEC směrodatná odchylka kalibrace, SEP směrodatná odchylka predikce, CCV kalibrační variační koeficient, PCV predikční variační koeficient, R korelační koeficient kalibrace,r v korelační koeficient predikce Tabulka III Výsledky kalibrace a validace pro stanovení obsahu sušiny, tuku, NaCl a aktivity vody naměřených na integrační sféře Integrační SEC SEP CCV (%) PCV (%) R R sféra v Sušina 2,990 4,210 3,902 5,494 0,918 0,836 Tuk 2,280 3,690 23,620 38,226 0,962 0,901 NaCl 0,408 0,474 11,899 13,823 0,612 0,435 Aktivita vody 0,033 0,040 4,104 4,975 0,754 0,640 SEC směrodatná odchylka kalibrace, SEP směrodatná odchylka predikce, CCV kalibrační variační koeficient, PCV predikční variační koeficient, R korelační koeficient kalibrace,r v korelační koeficient predikce 222

223 Ukázalo se, že kalibrační model pro stanovení obsahu sušiny naměřené sondou je použitelný (CCV% < 10 %), přičemž korelační koeficient byl poměrně nízký (R = 0,747). Kalibrační model stanovení obsahu sušiny měřením integrační sférou byl charakteristický dobrou kalibrací (CCV < 5 %) a korelační koeficient modelu byl 0,918 (Obr. 4.). Model vytvořený pro obsah sušiny byl tedy při měřením na integrační sféře spolehlivější. Dále bylo zjištěno, že kalibrační modely pro stanovení obsahu soli a tuku se nejeví jako použitelné ani pro jednu z měřících technik (CCV > 10 %, Obr. 5.). Ostatní vytvořené kalibrace byly pro tuto metodu nepoužitelné, z důvodu vysokých směrodatných odchylek či nízkých koeficientů korelace. Modely vytvořené pro stanovení vodní aktivity se vyznačovaly v obou případech dobrou kalibrací (CCV < 5 %), ale koeficienty korelace byly velmi nízké (0,591 a 0,754). Obr. 4. Kalibrace vytvořená pro model stanovení sušiny u vzorků měřených integrační sférou (R = 0,918) Obr. 5. Příklad nefunkční kalibrace vytvořené pro stanovení NaCl u syrovátkových sýrů měřených sondou Závěr FT-NIR spektrometr byl schopen detekovat rozdíly mezi hnědými syrovátkovými sýry v závislosti na rozdílné receptuře při jejich výrobě. Kalibrační modely pro jednotlivé sledované parametry byly vytvořeny pomocí hodnot z laboratorních analýz (sušina, tuk, NaCl, aktivita vody). I přes skutečnost, že některé kalibrační modely nebyly spolehlivé, lze usoudit, že měření pomocí integrační sféry je spolehlivější než měření sondou. 223

224 Poděkování: Tato práce byla podpořena projektem IGA MENDELU AF TP 9/2013. Použitá literatura: 1. Vyhláška č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje. In: Sbírka zákonů. 2003, Suková, I., 2006: Syrovátka v potravinářství. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, 60 s. ISBN Iburg, A., 2004: Lexikon sýrů: výroba, původ, druhy, chuť. 1. vyd. Čestlice: Rebo, 301 s. ISBN Jelen, P., 2011: Whey processing: Utilization and Products. In Fuquay, J. W. Encyclopedia of dairy sciences, second edition. Boston, MA: Elsevier, pp ISBN Reid, L. M., O'Donnell, C. P., Downey, G., 2006: Recent technological advances for the determination of food authenticity. Trends in Food Science and Technology, 17, pp Kontaktní adresa: Ing. Jana Teplá, Ústav technologie potravin, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, , Brno-Černá Pole, Česká republika, xtepla@node.mendelu.cz Ing. Táňa Lužová, Ph.D., Ústav technologie potravin, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, , Brno-Černá Pole, Česká republika, tana.luzova@mendelu.cz 224

225 KOLORIMETRICKÉ MĚŘENÍ SYROVÁTKY BĚHEM SKLADOVÁNÍ Jůzl Miroslav, Sýkora Vladimír, Pytel Roman, Teplá Jana, Lužová Táňa, Dvořák Lukáš, Strnková Jana, Šustová Květoslava Ústav technologie potravin, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně Colorimetric measurements of the whey during storage Summary: Whey is a minor foodstuff in cheese production, but it is highly nutritious commodity and it is necessary to choose a suitable preservation method, if it s not promptly treated. In this work we used fourteen samples of plant extracts. The aim of the experiment was to describe the changes in colour of goat whey for its preservation, depending on the length of leaching. The results showed that the whey is a product which itself can vary in the time, even in colour. Also highly depends on the particular plant material which is used for preservation. Lavender, cinnamon, sage showed a higher colour stability of whey between the measurements, even though the overall colour change and the difference (ΔE* ab = > 3) would be detectable by the human eye. In contrast, rosemary had highly significant difference (P <0.01) on whey colour, the one-hour extract had the most unstable colour (ΔE* ab = after 4 weeks of measurement) oneweek extract had noticeable difference after the first week (ΔE* ab = 7), but then have not significantly changed in the time. Úvod Syrovátka patří mezi vedlejší produkty při výrobě sýrů a je přes svou vysokou nutriční hodnotu komoditou, na kterou je neprávem nahlíženo jako na produkt odpadního charakteru, a proto se k dalšímu zpracování v potravinářském segmentu využívá zřídka. Pro svůj nízký obsah tuku a bohaté zastoupení plnohodnotných bílkovin, vitaminů a dalších významných nutrientů může představovat pro zpracovatele vítanou surovinu. Je však nutné ji náležitě uchovat a zpracovat a nabídnout pro spotřebitele zajímavé produkty. Oblast produkce sýrů a faremních produktů je na vzestupu, jak se zvyšuje produkce sýrů, tak s tím paralelně roste i produkce syrovátky. Proto je důležité vytvoření nového potravinářského výrobku ze syrovátky, který bude mít, pomocí bioaktivních látek, především silic, obsažených v bylinách či koření, prodlouženou dobu údržnosti a bude pozitivně vnímán spotřebitelem. Kromě silic obecně vykazují inhibiční vliv na mikroorganismy i další obsahové složky jako třísloviny, flavonoidy, ale i peptidy a alkaloidy. Antimikrobiální působení silic bylo hodnoceno v řadě studií, v nichž byl sledován vliv na plísně a bakterie [1], výsledky jsou však obtížně srovnatelné, protože jsou značně ovlivněny použitou metodikou a druhem testovaného mikroorganismu [2], Nabízí se velké množství různých rostlin, jejichž silice je možné použít právě k prodloužení doby trvanlivosti a zároveň zachovat senzorické vlastnosti akceptovatelné pro konzumenty. Cílem práce bylo zhodnotit vliv přídavku bylin na vzhled syrovátky v závislosti na délce louhování. Materiál a metodika Pro analýzu byl vybrán bedrník anýz (Pimpinella anisum, L.), česnek medvědí (Allium ursinum, L.), fenykl obecný (Foeniculum vulgare, L.), kmín kořenný (Carum carvi, L.), levandule lékařská (Lavandula angustifolia, L.), majoránka zahradní (Origanum majorana, L.), máta peprná (Mentha piperita, L.), meduňka citronová (Melissa indicum, L.), rozmarýn lékařský (Rosmarinus officinalis, L.), skořice kůra skořicovníku ceylonského (Cinnamomum zeylanicum, L.), šalvěj lékařská (Salvia officinalis, L.), šišák bajkalský (Scutellaria baicalensis, L.), třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum, L.) a tymián obecný (Thymus vulgaris, L.). Antimikrobiální účinky uvedených bylin nebo jejich silic byly testovány na kozí syrovátce, která byla získávána z farmy dojných a kašmírských koz v Šošůvce. Pokus byl opakován v pěti odběrech. 225

226 Pozorování probíhalo po dobu čtyř týdnů. První den byly do syrovátky přidány byliny nebo silice z nich v množstvích od 15 μl.100 ml -1 (např. šalvěj) do 25 mg.100 ml -1 (anýz) syrovátky. Takto ošetřená syrovátka byla skladována při chladírenské teplotě 6 C. Druhý a dále každý další 7. den byla provedena její mikrobiologická analýza, a to plotnovou metodou zalitím inokula živnou půdou a vyhodnoceny CPM a jednotlivé skupiny mikroorganismů, ale tato expertíza není součástí tohoto příspěvku, a dále měření její barvy. Pro přesné měření barvy v závislosti na různých faktorech (čas, složení) byl použit stolní spektrofotometr Konica Minolta CM-3500d, s charakteristikami - geometrie d/8, transmitance po průchodu 10 mm kyvetou. K vyhodnocení výsledků byl použit softwarový program CMs-100w Spectramagic NX a statistického programu UNISTAT 5.1. Změna barvy syrovátky po konzervaci pomocí bylin a výluhů byla vyjádřena pomocí barevné odchylky ΔE* ab (CIE 1976), kde ΔL*, Δa*, Δb* představuje rozdíl parametrů barvy (světlosti L* a barevných souřadnic v kladné, resp. záporné hodnotě u a* od červené po zelenou barvu a b* pro žlutou nebo modrou barvu). Výsledky a diskuze Δ E Δ L * = L* L* 2 2 * = ΔL * +Δa * + Δb vzorku Δ a * = a* a* vzorku Δ b * = b* b* vzorku 226 předlohy předlohy předlohy Ve dvou ze čtyř skladovacích pokusů syrovátka bez přídavku bylin a silic vykázala vyšší stabilitu barvy (ΔE* ab = 1,69, resp. 1,8), ale ve zbývajících dvou pokusech (ΔE* ab = 5,66, resp. 5,74) byl vzhled po 3 týdnech skladování se středně významnou odchylkou, kterou je již pozorovatel schopen vyhodnotit (Třešňák, 1999). To potvrzuje variabilitu kvality syrovátky jako suroviny (Lužová et al, 2013). Odchylky barvy nebo změna vzhledu v čase vyjádřená odchylkou ΔE* ab se u výluhů měnila s tím, že nejvyšší hodnota nutně nemusela být až po 3 týdnech skladování. Levandule, skořice, šalvěj a třezalka vykázaly vyšší stabilitu barvy syrovátky mezi měřeními, i když se barva celkově změnila a rozdíl (ΔE* ab > cca 3) by byl pozorovatelný lidským okem [3]. Zároveň nebyl zjištěn průkazný rozdíl (P>0,05) barvy tohoto produktu, pokud byl použit hodinový nebo týdenní výluh. U těchto vzorků nezáleží v případě barvy na délce louhování. Naopak u rozmarýnu byl vysoce průkazný rozdíl (P<0,01) v barvě, jeho hodinový výluh byl nejvíce barevně nestabilním (ΔE* ab = 20,56 po 4 týdnech měření), u týdenního byl rozdíl markantní po prvním týdnu měření (ΔE* ab = 7). Nejmenší odchylky po 1. týdnu skladování vykázala šalvěj (ΔE* ab = 0,24), máta peprná (ΔE* ab = 0,83) a třezalka (ΔE* ab = 1,56) u hodinového výluhu, a dále anýz (ΔE* ab = 1,51), levandule (ΔE* ab = 1,63) a fenykl i tymián (ΔE* ab = 1,75) u týdenního výluhu. Všechny ostatní byliny a koření po čtyřech týdnech vykázaly změnu barvy s významným pozorovatelným rozdílem. Nejvyšší odchylky barvy byla zjištěna po 2. týdnech skladování u tymiánu, kdy dosahovala hodnoty přes blízké 7 (střední barevný rozdíl). Ve vztahu k výsledkům je zajímavé toto srovnat s mikrobiální jakostí takto konzervované syrovátky. V použitých koncentracích silic dosahoval nejlepších antimikrobiálních účinků tymián obecný. Po jeho přídavku došlo k potlačení růstu koliformních bakterií, enterokoků, termorezistentních aerobních a anaerobních mikroorganismů, bakterií mléčného kysání (BMK) a plísní. U celkového počtu mikroorganismů došlo k jejich mírnému nárůstu, u psychrotrofních mikroorganismů byl pak zaznamenán ve třetím termínu sledování nárůst o více než dva řády [4], Při srovnání měření antioxidační kapacity v prvních dvou sériích (převážně se jednalo o výluhy a silice) v rámci stejného pokusu, ovšem překračujícího rozsah tohoto příspěvku, bylo zjištěno, že antioxidační kapacita ve všech případech byla vždy významně zvýšena až po několika týdnech expozice syrovátky těmto obohacujícím přídavkům. Nejvyšší hodnoty antioxidačních aktivit byly naměřeny pro týdenní výluh majoránky a silici tymiánu [5]. * 2

227 Tab. 1. Barva syrovátky a její změna v čase vyjádřená jako ΔE*ab v závislosti na délce louhování Hodinový výluh Týdenní výluh Měření L* a* b* ΔE* ab L* a* b* ΔE* ab bedrník anýz 1.týden 59,91-4,13 10, ,90-3,83 13, týden 63,43-4,36 12,42 3,86 58,41-3,87 12,48 1,51 3. týden 65,62-4,54 13,05 6,13 61,00-4,15 12,13 2,78 4. týden 64,88-4,33 12,38 5,20 61,58-4,36 14,41 2,78 česnek medvědí 1.týden 75,68-4,29 9, ,28-4,28 7, týden 72,92-3,91 8,09 3,04 55,22-4,33 6,27 6,13 3. týden 77,36-4,69 8,77 1,81 57,42-4,55 7,58 3,89 4. týden 82,05-3,68 9,59 6,41 66,42-4,44 7,89 5,19 fenykl obecný 1.týden 56,56-0,94 21, ,82-2,19 20, týden 53,60 0,30 24,07 3,93 56,33-2,49 19,76 1,75 3. týden 58,64-0,90 22,01 2,09 62,45-4,00 16,20 6,66 4. týden 62,67-1,69 18,91 6,80 63,71-2,63 17,86 6,52 kmín kořenný 1.týden 60,59-2,88 17, ,44-2,68 19, týden 56,06-2,43 15,78 4,81 62,61-2,44 20,09 0,37 3. týden 57,61-1,09 18,59 3,70 63,59-2,29 20,83 1,55 4. týden 59,26-1,24 16,61 2,23 61,31-2,13 19,96 1,26 levandule lékařská 1.týden 59,39-3,50 11, ,20-3,19 13, týden 58,29-3,03 9,53 2,62 57,66-2,66 14,17 1,63 3. týden 63,32-3,72 12,59 4,01 59,71-3,57 14,68 3,67 4. týden 62,64-4,07 13,21 3,57 59,91-4,21 13,51 3,85 majoránka zahradní 1.týden 65,09-4,16 7, ,33 5,55 22, týden 67,77-4,01 7,02 2,71 47,19 4,17 21,32 2,54 3. týden 72,60-4,31 8,65 7,62 46,56 4,67 20,34 2,53 4. týden 72,28-4,10 7,71 7,20 44,99 4,45 20,45 2,24 máta peprná 1.týden 54,45-0,22 25, ,59-2,88 17, týden 54,85-0,88 24,87 0,83 56,06-2,43 15,78 4,81 3. týden 57,69-0,34 24,01 3,44 57,61-1,09 18,59 3,70 4. týden 59,84 1,25 22,38 6,24 59,26-1,24 16,61 2,23 meduňka citronová 1.týden 60,21-5,81 12, ,56-0,94 21, týden 55,32-4,95 8,79 6,07 53,60 0,30 24,07 3,93 3. týden 54,58-5,26 11,12 5,77 58,64-0,90 22,01 2,09 4. týden 60,11-4,77 10,00 2,51 62,67-1,69 18,91 6,80 rozmarýn lékařský 1.týden 49,23 0,97 24, ,36-3,04 15, týden 54,84 1,16 27,83 6,33 57,80-2,83 22,08 7,04 3. týden 60,17 0,10 24,07 11,01 61,88-0,91 25,16 9,99 4. týden 66,41-3,21 14,40 20,56 64,73-1,93 23,07 8,79 skořice 1.týden 62,98-4,15 6, ,45-3,06 10, týden 64,56-4,20 6,43 1,58 58,58-2,93 12,40 2,41 3. týden 65,86-4,41 6,88 2,93 61,09-3,53 11,30 3,81 4. týden 66,45-4,57 7,59 3,69 61,53-3,50 12,52 4,67 šalvěj lékařská 1.týden 65,99-3,76 6, ,38-3,61 11, týden 65,78-3,71 6,41 0,24 62,46-4,01 13,02 3,51 3. týden 65,78-4,02 7,78 1,31 63,83-3,63 13,27 4,83 4. týden 62,64-3,42 5,69 3,47 63,86-4,11 13,35 4,92 šišák bajkalský 1.týden 63,44-4,30 7, ,22 0,02-0, týden 59,67-4,13 6,61 3,83 64,61-2,64 0,82 4,40 3. týden 62,94-4,65 8,54 1,40 63,87-3,87 4,52 6,57 4. týden 66,94-4,15 7,33 3,50 63,87-3,02 3,01 5,07 třezalka tečkovaná 1.týden 58,59-2,88 11, ,15-3,37 8, týden 60,11-2,70 12,22 1,56 61,51-3,41 10,34 3,93 3. týden 63,14-2,84 11,86 4,55 62,64-3,85 9,98 4,82 4. týden 61,89-2,71 13,05 3,51 61,41-3,88 9,31 3,45 tymián obecný 1.týden 65,09-4,16 7, ,82-2,19 20, týden 67,77-4,01 7,02 2,71 56,33-2,49 19,76 1,75 3. týden 72,60-4,31 8,65 7,62 62,45-4,00 16,20 6,66 4. týden 72,28-4,10 7,71 7,20 63,71-2,63 17,86 6,52 227

228 Závěr Z výsledků plyne, že syrovátka je produkt, který se sám o sobě může značně kvalitativně měnit v čase, a to i barevně. Velmi záleží na konkrétním rostlinném materiálu, který je ke konzervaci použit. Levandule, skořice, šalvěj a třezalka vykázaly vyšší stabilitu barvy syrovátky mezi měřeními, naopak syrovátka po použití rozmarýnu ke konzervaci se průkazně nejvíce změnila ve své v barvě, jeho hodinový výluh byl nejvíce barevně nestabilním, u týdenního byl rozdíl markantní již po prvním týdnu. Poděkování Tento výzkum byl financován za podpory IGA MENDELU TP Literatura 1. Nychas, G.J.E., Skandamis, P. N., Tassou, C. C., Koutsoumanis, K. P.: Meat spoilage during distribution. Meat Science, 78, 2008, Bacílková, B., Paulusová, H.: Vliv silic a jejich hlavních účinných látek na mikroorganismy a na archivní materiál. Praha: Národní archiv, 2012, dostupné on-line na: (citováno ). 3. Třešňák, K. (1999): Barvy a barevné modely. Svět tisku, 6, Dostálová, L., Dvořák, L., Teplá, J., Přichystalová, J., Rožnovská, D., Kalhotka, L., Lužová, T. (2013): Vliv přídavku silic na mikrobiologickou kvalitu syrovátky. In STARUCH, L., SEKRETÁR, S. Additives and Contaminants in Foodstuffs vyd. STU v Bratislave: Fakulta chemickej a potravinárskej technológie Slovenskej technickej univerzity v Bratislave, 2013, s ISBN Lužová, T. et al. (2013): Konzervace syrovátky pomocí účinných látek z rostlin za účelem jejího dalšího využití. Závěrečná zpráva o řešení interního grantového projektu AF MENDELU za rok Brno: Mendelova univerzita v Brně, závěrečná zpráva. 34 s. Kontakt Ing. Miroslav Jůzl, Ph.D., Ústav technologie potravin, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, miroslav.juzl@mendelu.cz, tel

229 REJSTŘÍK AUTORŮ Alimardanova Mariam Andrýsek Jiří , 113 Bačová Helena Bezeková Jana Bubník Zdeněk Bujňáková Dobroslava Bunešová Věra Buňka František... 83, 167, 211 Buňková Leona , 211 Čanigová Margita , 185 Černíková Michaela Čurda Ladislav... 13, 37, 97, 101 Detvanová Lenka Diblíková Lenka Dostálová Lenka , 151 Drončovský Maroš Ducková Viera , 185 Dudriková Eva Dvořák Lukáš , 225 Ečer Jiří Falta Daniel , 113 Flasarová Radka Flimelová Erika Foltys Vladimír , 123 Geigerová Martina Georgová Nikola Greif Gabriel... 77, 179 Greifová Mária... 77, 179 Hanuš Oto Henke Svatopluk Hinková Andrea Hofericová Margita Horáčková Šárka... 43, 161 Hrubá Renata Chládek Gustav , 113 Chrachalová Katarína Chramostová Jana Ilko Vojtěch , 195 Jana Stávková Javorová Jana , 113 Jebavá Iva... 55, 145, 155 Jedelská Radoslava Jůzl Miroslav Kaclíková Eva Kadlec Robert Kalhotka Libor , 151 Kinčl Jan... 97, 101 Kirchnerová Katarína , 123 Klapáčová Lýdia Kmeť Vladimír Kňazovická Vladimíra Kološta Miroslav , 179 Koňuchová Martina Koreňová Janka... 67, 73 Koštejnová Denisa Kouřimská Lenka Kováčová Monika Kozybaev Asilbek Kročko Miroslav Kubová Aneta Kuchař Dalibor Kuchta Tomáš... 67, 73 Kulazhanov Talgat Kvapilík Jindřich Lavová Monika Legarová Veronika Lorencová Eva Lužová Táňa , 219, 225 Mančušková Tatiana... 49, 139 Medveďová Alžbeta... 49, 139 Menšíková Anna Míková Kamila Minarovičová Jana Mühlhansová Andrea... 55, 145, 155 Musilová Šárka Mynarčíková Lucie Nagyová Gabriela Němečková Irena Pachlová Vendula Palík Jiří Pangallo Domenico Panovská Zdeňka , 195 Pechar Radko Plocková Milada... 43, 55, 155, 161 Pour Vladimír Přichystalová Jitka , 151 Purkrtová Sabina Pytel Roman Rada Vojtěch Renata Hrubá Rožnovská Doubravka Říha Jan , 123 Salek Richardos Nikolaos Sedláčková Pavla... 43, 161 Sharaf Eldeen Idriss , 123 Skalka Volodimir Slottová Anna Stávková Jana Strnková Jana , 225 Studeničová Adriana Studený Stanislav Sýkora Vladimír Šaková Nikoleta Šípková Anna Štětina Jiří... 13, 101 Šustová Květoslava , 219, 225 Švejstil Roman Šviráková Eva Teplá Jana , 219,

230 Tomáška Martin , 179 Valík Ľubomír... 49, 61, 139 Vašíčková Markéta Večera Milan , 113 Velecká Milena , 113, 133 Velichová Helena Veronika Ferenčíková Vítová Kateřina Vlková Eva Vršková Martina , 123 Zhexenbay Nurshash Židová Petra

231

232

233

234

235

236

237

238

239 MILCOM a.s. Váš partner na cestě ke kvalitě a inovacím. Výzkumný ústav mlékárenský a Laktoflora se sídlem v Praze Závod Tábor Závod servisních služeb Dvůr Králové nad Labem Pro více informací o našich produktech a službách navštivte naše webové stránky: