motnostní spektrometrie (3) Josef Chudoba LC/MS BSA - dávkování vzorku u LC/MS - PLC chromatografie chromatogram, základní pojmy režimy PLC, mobilní fáze, kolony (stacionární fáze) - elektrosprejová ionizace (ESI) - atmosferická chemická ionizace (APCI) - vícenásobná MS CID, produkt ion scan, precursor ion scan, neutrální ztráty - MS spektra měkkých ionizačních technik - interpretace - kvantitativní analýza v hmotnostní spektrometrii - předúprava pro hmotnostní spektrometrii Inducted Coupled Plasma (ICP-MS), Isotope-ratio MS 1
Dávkování vzorku LC/MS 1) Vnos vzorku bez využití separace - roztok vzorku dávkován robotickou stříkačkou (mechanický posun pístu definovaným průtokem 1 100 µl/min) - nástřik vzorku přes nástřikový ventil a dávkovací smyčku do proudu mobilní fáze propojení pomocí PEEK (polyether ether keton) nebo staninless steel kapilár (vnitř. průměr typicky 0,003 a 0,005 inch = 0,127 mm) 2) Vnos vzorku s využitím PLC separace separace vzorku přes kolonu Dávkování vzorku LC/MS Napojení PEEK kapilár na iontový zdroj spektrometru ESI, APCI : napojení do sprejovací sondy Elektrosprejová vyhřívaná sonda Zdroj: Thermo-isher Scientific 2
PLC chromatografie Režimy: normální uspořádání fází mobilní fáze nepolární (n-hexan), stacionární fáze polární (silikagel, alumina) eluční síla mobilní fáze roste s její rostoucí polaritou reverzní uspořádání fází mobilní fáze polární (methanol, acetonitril, voda), stacionární fáze nepolární (modifikovaný silikagel s navázanými skupinami) eluční síla mobilní fáze roste s její klesajicí polaritou voda < methanol < acetonitril < T - nejčastěji používaná u LC/MS Isokratická eluce složení mobilní fáze se během separace nemění Gradientová eluce složení mobilní fáze se mění tak, aby při separaci rostla její eluční síla U RP PLC se zvyšuje obykle obsah organického rozpouštědla PLC chromatogram Intenzita signálu k 1 k 2 k 1 < k 2 retenční čas (t) t R1 t 0 retenční čas nezadržované složky t r retenční čas separované (zadržované složky) k kapacitní faktor (retenční faktor) α selektivita (separační faktor) t R2 3
PLC separace Cíl: symetrické, úzké, vydělené píky v krátkém retenčním čase R s rozlišení dvojice píků Účinnost kolony: N počet teoretických pater PLC kolony retence selektivita selektivita retence Účinnost kolony: PLC separace účinnost počet pater kolony Účinnost kolony: N počet teoretických pater kolony Příklad : PLC kolona: 4,6 mm I.D. x 10 cm, částice 5 µm: N = 5000-8000 N roste: s délkou kolony, s klesajícím průměrem částic 2 x delší kolona = 2 x delší čas analýzy ale pouze 1,41x lepší R 4
PLC separace selektivita (separační faktor α) - souvisí s chemickou povahou látek a jejich interakcí s mobilní a stacionární fází, vyšší α lepší separace - lze ji měnit: Změna mobilní fáze - složení Změna mobilní fáze - p Změna stacionární fáze Změna teploty seprace PLC separace kapacitní faktor (k) Kapacitní (retenční) faktor se změní především složením mobilní fáze RP PLC: vyšší obsah nepolární složky v mob. fázi snížení k - u separace by se k měl pohybovat mezi hodnotami 1-5 u složitých směsí 2 10 Změna mobilní fáze: zpravidla nejrychlejší a nejlevnější řešení optimalizace PLC seprace Pozor, ale na mísitelnost složek mobilní fáze, změnu viskozity při míchání mobilních fází (změna tlak. ztráty kolony) omezení maximálním provozním tlakem PLC pumpy uvolňování tepla (Met+voda), možnost nerozpustnosti složek analyzované směsi při změně mobilní fáze, degradaci stacionární fáze ( rozsah p mobilní fáze) 5
PLC separace specifika při používání MS 1. především RP PLC/MS nutno ověřit kompatibilitu NP PLC s MS detekcí (ESI nelze, APCI lze) 2. s ohledem na doporučené průtoky mobilní fáze při API MS ionizacích volit vhodné PLC kolony a nebo průtok mobilní fáze splitovat - trend u MS uzší PLC kolony (2 mm I.D.), menší velikost částic, kratší kolony ( 5-10 cm) menší průtoky mobilní fáze 3. používat pouze těkavé pufry (kyselina mravenčí, octan amonný atd.) 4. MS je destruktivní technika, v sérii zapojit až za UV detektor 5. Nutnost používání LC/MS grade rozpouštědel (o vyšší čistotě), především Milli Q vody chrana PLC instrumentace a kolon 1. filtrace roztoků vzorků a mob.fází (stříkačkové filtry 0,45 a 0,22 µm, sací frity u rozpouštědel 2. výměna rozpouštědel v pravidelných intervalech, hlavně vody 3. používání předkolon u PLC kolon PLC kolony stacionární fáze Zdroj: Thermo-isher Scientific 6
PLC kolony - specifikace Manufacture Name C18, 1,9 mm, 100 Ǻ, 2,1 mm x 50 mm P/N Typ stacionární fáze Velikost částic Velikost pórů Délka Vnitřní průměr Další parametry: Nominal Surface Area (m 2 /g) Endcapping Partical type Rozsah p ydrofobicita bsah % C Elektrosprejová ionizace (ESI) V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde v elektrickém poli k tvorbě spreje. V kapičkách kapaliny dojde k povrchové lokalizaci náboje a následné tvorbě iontu. Při této ionizaci vznikají často i vícenásobně nabité ionty a adukty např. (M+Na) + - ionizace probíhá za atmosferického tlaku 7
APCI (Chemická ionizace za atmosferického tlaku ) V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde k tvorbě spreje a vypařování látky i mobilní fáze. Na jehlu je vloženo vysoké napětí, výbojem vzniká plazma a v ní ionty 3 + a radikály. Ionty předají náboj analytu. LC/MS: atmosferické ionizační techniky ESI: tvorba násobně nabitých iontů, aduktů a oligomerů APCI: vlivem vyšší teploty může docházet ke štěpení molekuly [M-C [M- 2 ] + 2 ] + [M+] + 18 44 8
LC/MS: atmosferické ionizační techniky Sprejové ionizační techniky poskytují pseudomolekulové ionty resp. adukty molekulového iontu s některými kationty (pozitivní režim) nebo anionty (negativní režim). Často vznikají při ionizaci i oligomery sloučenin nebo v ESI vícenásobně nabité ionty. Pozitivní režim M + 1 (+) ESI+ Možné adukty Negativní režim M - 1 ( - +) ESI- Možné adukty M+18 (N4+) M + 23 (Na+) M + 39 (K+) M + 32 (C3) M + 41 (C3CN) M + 22 (Na+ -) M + 45 (C-) M + 59 (C3C-) LC/MS: ESI Vícenásobně nabité ionty malé molekuly příklad dvounásobně nabitý ion poloviční rozdíl u m/z mezi izotopy CalixMB20_1 #20 RT: 0.54 AV: 1 NL: 1.72E6 T: TMS + p ESI ull ms [500.00-3800.00] 1240.2731 z=2 100 Relative Abundance 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1240.7747 z=2 1239.7716 z=2 1241.2762 z=2 1241.7780 z=2 1240.6763 z=? 1242.2793 z=2 1240.8738 1240.1433 1241.9204 z=? z=? z=? 1239.5 1240.0 1240.5 CalixMB20_1 1241.0 1241.5 #201242.0 RT: 0.54 1242.5 AV: 1 NL: 1.72E6 T: m/z TMS + p ESI ull ms [500.00-3800.00] 1240.2731 z=2 100 995.5652 z=1 90 80 [M+2]2+ z = 2 N N N C 3 C 3 N C 3 N 3C N N C 3 C 3 C 3 C 3 N C 3 CalixMB20_1 #20 RT: 0.54 AV: 1 NL: 4.74E4 T: TMS + p ESI ull ms [500.00-3800.00] 2479.5364 z=1 100 Relative Abundance 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2478.5283 z=1 2479.0459 z=? 2479.8606 z=? 2480.5383 z=1 2480.8804 z=? 2481.5388 z=1 2482.2180 z=? 2482.5435 z=1 2478 2479 2480 2481 2482 2483 m/z C156 204 N8 18 z = 1 2483.5493 z=1 0,5 Da Relative Abundance 70 60 50 40 30 1296.2485 z=2 M = 2477,5292 Da [M+]+ = 2478,5372 Da 1 Da 20 10 0 915.6678 1104.7693 z=1 1463.9445 684.2023 2479.5364 1727.0635 2006.4622 2213.8513 z=? z=2 z=1 z=1 z=2 z=? z=2 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 m/z [M+]+ 9
LC/MS: ESI Vícenásobně nabité ionty Velké molekuly (ESI) série iontů nestejné rozdíly mezi m/z příklad koňský myoglobin (M = 16951 Da) Určení náboje a celkové hmotnosti molekuly: m1 a m2.. m/z dvojice sousedních iontů, n1 a n2 jejich náboj (z), X adukt k molekulovému iontu m1 = [M+n1X]/n1 m2 = [M+n2X]/n2 n2 = (m1-x)/(m2-m1) m1 = 1413, m2 = 1542, odhad X = 1 n2 = 10.94, Mcalc = 16951 Da m1 = 1305, m2 = 1413, odhad X = 1 n2 = 12.07, Mcalc = 16944 Da LC/MS: ESI Tvorba dimeru ESI+ 10
kvalitativní analýza kombinace více ionizačních technik ESI+ S V 2 1 4 1 _ 1 # 3 R T : 0.1 1 A V : 1 N L : 6.7 1 E 4 T : T M S + p E S I u ll m s [4 0 0.0 0-1 5 0 0.0 0 ] 4 6 7.1 0 1 9 z = 1 1 0 0 9 0 Cl 8 0 7 0 Relative Abundance 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 5 4 1.1 2 0 7 z= 1 6 1 5.1 3 9 5 z= 1 6 8 5.4 3 5 5 z = 1 7 7 7.2 2 9 1 z =? 9 5 0.7 3 6 0 z= 1 9 7 8.7 6 7 3 z= 1 9 0 6.7 0 9 7 z= 1 1 2 6 7.3 4 0 0 1 1 1 4.9 2 9 0 z= 1 z = 1 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 m /z [M+Na] + 1 4 4 3.9 5 9 7 z=? kvalitativní analýza kombinace více ionizačních technik SV2141_2 #6 RT: 0.35 AV : 1 NL : 2.64E7 T: TM S + p A P C I c oro na ull m s [42 0.0 0-15 00.00 ] 55 5.1 19 6 10 0 90 80 Cl 70 Relative Abundance 60 50 40 30 20 10 0 52 3.0 93 8 APCI+ 67 5.1 41 2 12 45.3 588 57 7.51 90 71 7.1 07 1 8 37.12 86 9 57.14 98 10 05.31 61 1 12 5.3 37 6 1 27 7.3 85 1 50 0 60 0 70 0 80 0 90 0 10 00 1 10 0 1 20 0 1 30 0 m /z [M+] + 11
kvalitativní analýza kombinace více ionizačních technik EI+ 70 ev Cl LC/MS/MS: - vícenásobná MS Nespecifické štěpení definované rozbití iontů ve AP zdroji nelze vybrat ion, štěpí se vše najednou, lze použít na každém spektrometru Specifické štěpení definované štěpení vybraného iontu (iontů) probíhá v kolizní cele (kvadrupol, iontová past), která je napuštěna kolizním plynem (argon, helium) molekulám fragmetovaného iontu je dodána energie elektrickým polem a následně dochází ke srážkám s kolizním plynem Instrumentace: trojitý kvadrupol, iontová past nebo hybridní spektrometr značení LC/MS/MS experimentu v literatuře CID experiment Collision-induced dissociation (CID) = collisionally activated dissociation Thermo isher Scientific rbitrap CD igh Energy Collision Dissociation nelze provést MS n Molekuly jsou štěpeny při vyšší energii než v případě CID 12
LC/MS/MS: Product ion scan Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC detekce Instrumentace: Tripple Quad, Q-To; Ion Trap (až MS 10 ) s vyšším MS n klesá citlivost! LC/MS/MS: Precursor ion scan Q1:TIC (m/z 1 m/z 2 ) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce Instrumentace: nelze na Ion Trap Pro identifikaci skupiny látek, které poskytují stejný fragment při fragmentaci 13
LC/MS/MS: Constant Neutral Loss Q1:TIC (m/z 1 m/z 2 ) Q2: fragmentace všech iontu Q3: TIC ((m/z 1 - DN) (m/z 2 -DN)) detekce; DN rozdíl hmotností iontů hmotnost odpadající neutrální částice z iontu Instrumentace: nelze na Ion Trap Pro identifikaci skupiny látek, které při fragmentaci odštěpují stejnou část molekuly LC/MS/MS: kvalitativní analýza 1.Separátor výběr iontu -> definované rozbití iontu v kolizní cele -> analýza produktů 2. analyzátorem SV2141_2 #18 RT: 2.77 AV: 1 NL: 5.66E3 : TMS + p APCI corona ull ms2 1245.36@cid25.00 [340.00-1500.00] 523.0939 100 SV2141_2 #19 RT: 2.79 AV: 1 NL: 1.73E7 : TMS + p APCI APCI corona ull ms [420.00-1500.00] pos MS spektrum 100 555.1196 90 80 MS 2 -MS/MS z [M+]+ Relative Abundance 90 80 70 60 50 40 [M+]+ Relative Abundance 70 60 50 40 30 20 957.1501 1245.3583 30 20 10 0 675.1410 479.4822 1245.3583 957.1494 717.1070 837.1282 1213.2241 577.5189 891.4597 1125.3373 989.1754 1277.3846 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 m/z 577.8984 902.5043 10 643.1150 452.3420 726.7733 847.3182 1032.2964 1205.6310 1277.3850 0 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 m/z SV2141_2 #47 RT: 8.42 AV: 1 NL: 4.41E4 : TMS + p APCI corona ull ms3 1245.36@cid25.00 523.09@cid0.00 [140.00-1500.00] 523.0939 100 Cl 90 80 Relative Abundance 70 60 50 40 MS 3 - MS/MS z m/z 523 30 20 289.2163 10 1245.3589 444.7758 643.1158 1479.2357 957.1498 353.1791 719.8121 1065.1304 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 14
LC/MS/MS: kvalitativní analýza Aby se rozdělily jen podle m/z muselo by být R = 740 000 SV2141_2 (0.000) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C1532N56Cl2 448.1730 100 C 15 31 N 5 6 Cl 2 + 450.1730 m/z 448,1730 Scan ES+ 4.68e12 % 449.1730 451.1730 452.1652 0 SV2141_2 (0.185) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C2427N6Na 448.1736 100 % 449.1736 C 24 27 N 6 + Na m/z 448,1736 Scan ES+ 7.50e12 0 450.1814 448 449 450 451 452 453 454 mass Zdroj: Shimadzu LCMS-IT-T brochure LC/MS: pomoc při identifikaci UV-VIS spektrum ESI, APCI detekce pouze polárních sloučenin PLC do série před MS lze zapojit UV-VIS detektor UV-DAD detektor UV-DAD detekce MS detekce ESI+ MS spektrum 15
MS: Kvantitativní analýza CÍL: 1. Potvrzení, že jde skutečně o sledovaný analyt 2. Zjištění jeho koncentrace ve vzorku Ad 1: většinou se jedná o chromatografické analýzy (GC/MS resp. LC/MS) znám retenční čas (RT) EI+ 70 ev: TIC režim (menší citlivost) pro identifikaci k dispozici celé MS spektrum SIM režim (vyšší citlivost) vždy je lépe snímat alespoň dva charakteristické ionty (identifikaci může potvrdit poměr jejich odezev) ESI, APCI: MRM (Multiple Reaction Monitoring) MS/MS technika 1 analyzátor SIM (výběr iontu) 2. analyzátor kolize 3. analyzátor SIM (více iontů, sleduje se poměr odezvy) LC/MS/MS: Kvantitativní analýza Příklad využití MRM Izotopicky označený standard stejné retenční chování, jiná molekulová hmotnost používá se jako vnitřní standard (Internal Standard IS) Kvalitativní informace: retenční čas a přítomnost dceřinného iontu (m/z) popř. poměr ploch píků stop více dceřiných iontů Kvantitativní informace: plocha píků dceřinného popř. dceřiných iontů (m/z) pro analyt a vniřní standard Zdroj: Agilent technologies 5989-9665 App. Note 16
MS: Kvantitativní analýza Kalibrační přímka Vnitřní standard (Plocha Ais) A/Ais Analyt (Plocha A) c.. Koncentrace A/Ais = RR. c/cis c/cis RR.. Relativní odezvový faktor Směrnice přímky je RR Kalibrace s použitím vnitřního standardu Přítomnost vnitřního standardu snižuje vliv kolísání odezvy MS detektoru, u GC chybu při nástřiku atd., jako vnitřní standard lze použít i podobnou sloučeninu ne izotopicky značenou MS: Kvantitativní analýza Kalibrační rozsah Signál (signal) A/Ais split 1:60 1 ul 50 mg/ml 21_V13aro_1 100 5.43 1: Magnet EI+ 134 2.56e3 % Šum (noise) 5.57 0 5.30 5.35 5.40 5.45 5.50 5.55 5.60 5.65 5.70 5.75 Time LD ~ 3 x (Anoise/Ais) / RR c/cis LQ ~ 10 x (Anoise/Ais) / RR Mez detekce (Limit of Detection - LD) Mez stanovitelnosti (LQ - Limit of Quantification) 17
MS: Kvantitativní analýza citlivost MS spektrometrů Specifikace výrobce: pro konkrétní sloučeninu a podmínky udává se poměrem signál/šum pro absolutní detekované množství sloučeniny zpravidla se jedná o množství v řádu pikogramů (pg = 10-12 g) nebo femtogramů (fg = 10-15 g) GC/MS: splitless nástřik: 1 pg oktafluorunaftalenu (N) SIM režim m/z 272 - S/N > X C 10 8 LC/MS/MS: IA: ESI+ 100 fg reserpine MRM: m/z 609 ->m/z 397 a 447 S/N > X C 33 40 N 2 9 Nejmenší absolutní detekované množství : SIM (MRM): řádově fg-pg TIC (ull Scan): řádově pg-ng Maximální abs. detekované množství: dané dynamickým rozsahem cca 3-5 řádů tzn. SIM (MRM) ng ;TIC (ull Scan) mg vždy však záleží na typu sloučeniny odezva MS detektoru není univerzální MS: Kvantitativní analýza citlivost MS spektrometrů Příklad: GC-MS: nastřikované množství cca 1 2 µl roztoku, splitless Specifikace: 10-12 g (pg) ve 1 µl roztoku c = 1 pg/µl = 1 ng/ml = 1 µg/l LC-MS: nastřikované množství cca 10 20 µl roztoku, dávkovací smyčka Specifikace: 10-12 g (pg) ve 10 µl roztoku c = 0,1 pg/µl = 0,1 ng/ml = 0,1 µg/l Specifikace 1 pg 1 fg platí jen pro vybrané analyty, některé látky poskytují však horší odezvu Pro snížení detekčního limitu je pak nutná předúprava vzorku. 18
Předúprava vzorků Cíl: zjednodušení matrice vzorku (odstranění interferujících sloučenin) zakoncentrování analytu ve vzorku změna rozpouštědla např. voda není vhodná pro GC/MS analýzu Způsoby předúpravy: filtrace centrifugace zakoncentrování odpařením extrakce (rozpouštědlová, Soxhlet) SPE (Solid Phase Extraction) SPME (Solid Phase Microextraction) Předúprava vzorků: SPE Solid Phase Extraction Vzorek (analyt s matricí) je nanesen na kondiciovanou vrstvu sorbentu. Matrice je oddělena a zakoncentrovaný analyt je eluován malým objemem vhodného rozpouštědla. Normální uspořádání fází Polární sorbent, nepolární rozpouštědlo Reverzní uspořádání fází Nepolární sorbent, polární rozpouštědlo Iontová výměna pro iontové sloučeniny 19
Předúprava vzorků: SPME (Solid Phase Microextraction) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z plynných matricí nebo těkavých a semitěkavých sloučenin z vody Zdroj: Sigma-Aldrich Vlákno: polymerní sorbent na nosiči: Carboxen 75 µm/ Polydimethylsiloxan (PDMS) 85 µm těkavé látky Mw 30 225 Da PDMS 100 µm PDMS 30 µm Polyakrylát (PA) 85 µm těkavé látky Mw 60 275 Da semitěkavé nepolární semitěkavé polární Kompatibilita s vodnou matricí Praktické aplikace hmotnostní spektrometrie normované metody různé oblasti vodní hospodářství potravinářství Toxikologie testování metabolitů drog v moči, krvi, vlasech atd. Medicinální diagnostika farmakokinetické studie léčiv orenzní analýza požářiště, celníci např.ropné produkty Průmyslové aplikace testování kvality zahraniční normy např. ASTM (American Society for Testing Materials) Výzkum, vývoj 20
Aplikace hmotnostní spektrometrie ČSN normy např. ČSN IS 24293 Jakost vod - Stanovení jednotlivých izomerů nonylfenolu - Metoda extrakce tuhou fází (SPE) a plynové chromatografie/hmotnostní spektrometrie (GC/MS) ČSN EN IS 18856 Jakost vod - Stanovení vybraných ftalátů plynovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií ČSN EN IS 17294-1 Jakost vod - Použití hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) - Část 1: Všeobecné směrnice ČSN EN IS 17294-2 Jakost vod - Použití hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) - Část 2: Stanovení 62 prvků ČSN EN 15662 Potraviny rostlinného původu - Stanovení reziduí pesticidů s použitím GC-MS a/nebo LC-MS/MS po extrakci acetonitrilem/separaci a předčištění pomocí disperzní SPE - Metoda QuEChERS Aplikace hmotnostní spektrometrie toxikologie (1) Marihuana (TC) detekce metabolitů v moči hlavní metabolit 11-nor-9-carboxy- 9-tetrahydrocannabinol ( 9-carboxy-TC) immuno-assay testy když jsou pozitivní potvrzení pomocí GC/MS nebo LC/MS/MS v toxikologické laboratoři 21
Aplikace hmotnostní spektrometrie toxikologie (2) GC/MS SPE + nutná derivatizace úprava vzorku na TriMethylSilyl- těkavější deriváty Zdroj: Restek Aplikace hmotnostní spektrometrie toxikologie (2) LC/MS/MS pouze SPE, kratší časy analýz Zdroj: Restek 22
ICP-MS (Indukčně vázaná plazma hmotnostní spektrometrie) Stopová analýza prvků (kovů) ICP-MS (Indukčně vázaná plazma hmotnostní spektrometrie) Způsob dávkování vzorku: Kapalina: tvorba aerosolu Pevné látky: Laserová ablace Zdroj: Agilent-Technologies 23
ICP-MS (Indukčně vázaná plazma hmotnostní spektrometrie) ICP torch tvorba iontů Zdroj: Agilent-Technologies ICP-MS (Indukčně vázaná plazma hmotnostní spektrometrie) ICP-MS video http://www.youtube.com/watch?v=mqqtv2oic6u ICP video 2012 http://www.youtube.com/watch?v=xtg--dofake Zdroj: Agilent-Technologies 24
Laserová ablace ICP-MS bsah kovů v ostatcích lidských zubů ISTPE RATI MASS SPECTRMETRY Využití v geologii, archeologii, kriminalistice rganická látka je katalyticky spálena na C 2 (Cu/Pt~ 800 C), voda je odstraněna přes NAIN membránu a C 2 je detekován pomocí MS (obvykle dva detektory jeden na 13 C 2 m/z 45 a druhý na 12 C 2 m/z 44) Standartní ref. látka CaC 3 Pee Dee Belemnite (PDB) rozkladem C 2 s poměrem p PDB = 13 C/ 12 C = 0,01123 δ 13 C = 1000 * (p vzorek p PDB )/p PDB C 2 výdech lidi Evropa C 2 výdech lidi USA osilní paliva Methan atmosféra osilní paliva C 2 atmosféra PDB 25
GC/Isotope Ratio-MS Cholesterol izolován z lidských kostí 50 lidí z doby okolo 1000 n.l žíjících na anglickém pobřeží Analyzován přes GC pak katalyticky spálen na C 2 a sledován obsah izotopů 13 C/ 12 C pomocí MS Cholesterol původem z pozemských živočichů Cholesterol původem z mořských živočichů Převzato z Anal.Chem. 1996 (68), 4402 R.Scott, R.P.Evershead 26