PROBLEMATIKA PROGNOSTICKÝCH FAKTORŮ U UROTELIÁLNÍHO KARCINOMU MOČOVÉHO MĚCHÝŘE

UNIVERSITA KARLOVA V PRAZE 1.LÉKAŘSKÁ FAKULTA PROBLEMATIKA PROGNOSTICKÝCH FAKTORŮ U UROTELIÁLNÍHO KARCINOMU MOČOVÉHO MĚCHÝŘE Praha 2007 MUDr. Viktor SOUKUP, FEBU

Postgraduální doktorské studium biomedicíny Při UK a AV ČR v Praze 1. Lékařská fakulta University Karlovy v Praze Obor experimentální chirurgie Předseda oborové rady: Prof. MUDr. Jaroslav Živný, DrSc. Adresa pracoviště: Urologická klinika 1, LF UK a VFN v Praze Přednosta: Prof. MUDr. J. Dvořáček, DrSc. Ke Kadovu 6, Praha 2 Školitel: Doc. MUDr. M. Babjuk, Csc. Urologická klinika 1. LF UK a VFN v Praze 2

Poděkování patří všem za jejichž přispění zde presentované práce vznikly- Doc. J. Duškové, Doc. J. Marešovi a zejména Doc. M. Babjukovi. 3

Obsah: 1. Obecný úvod do problematiky prognostických faktorů uroteliálního karcinomu močového měchýře 1.1 Nádory močového měchýře 1.2.1 Přirozený průběh povrchových uroteliálních karcinomů a klinické prognostické faktory 1.2.1.1 Hloubka nádorové invaze 1.2.1.1.1 Subklasifikace T1 tumorů 1.2.1.2 Stupeň histologické diferenciace nádoru 1.2.1.2.1 Reprodukovatelnost klasifikace uroteliálních nádorů měchýře 1.2.1.3 Prognostický význam četnosti a plošné velikosti nádoru v době diagnózy 1.2.1.4 Počet předchozích recidiv 1.2.1.5 Přirozený průběh tis a prognostické faktory 1.2.1.6 Prognostický význam vyšetření normálně vyhlížejícího urotelu 1.2.1.7 Prognostický význam výsledku první cystoskopické kontroly po 3 měsících 1.2.1.8 Multivariantní analýza jednotlivých prognostických faktorů 1.2.2 Klinické prognostické faktory u invazivního karcinomu močového měchýře 1.2.2.1 Stupeň histologické diferenciace nádoru 1.2.2.2 Hloubka nádorové invaze 1.2.2.3 Prognostický význam metastatického postižení lymfatických uzlin 1.2.2.4 Další prognostické faktory u invazivního karcinomu močového měchýře 1.2.3 Klinické prognostické faktory-závěr 1.3 Molekulární prognostické faktory 1.3.1 Podstata nádorového růstu, kontrola tkáňové proliferace, buněčný cyklus a programovaná smrt buňky 1.3.1.1 Buněčný cyklus a jeho regulace 1.3.1.2 Programovaná smrt buňky. Apoptóza 1.3.1.3 Intracelulární přenos signálu k dělení buňky 1.3.1.4 Nádorové geny 1.3.2.1 a, b, h a další antigeny krevních skupin 13.2.2 S nádorem spojené antigeny 1.3.2.3 Onkogeny 1.3.2.3.1 c-h-ras 1.3.2.3.2 c-myc 1.3.2.3.3 c-erb-b2 1.3.2.3.4 mdm-2 1.3.2.4 Tumor supresorové geny 1.3.2.4.1 Retinoblastoma-tumor supresorový gen (rb) 1.3.2.4.2 p53- tumor supresorový gen (TP53) 1.3.2.4.3 p21 1.3.2.4.4 p27 1.3.2.5 Molekuly buněčné adheze 1.3.2.5.1 Cadheriny 1.3.2.5.2 Integriny 1.3.2.5.3 Rodina imunoglobulinů 1.3.2.6 Proteázy extracelulární matrix a basální membrány 4

1.3.2.6.1 Laminin-p1 1.3.2.6.2 Cathepsind 1.3.2.6.3 Aktivátor plasminogenu urokinásového typu (u-pa) 1.3.2.6.4 Matrixové metaloproteinázy (mmp) 1.3.2.7 Receptory pro růstové faktory 1.3.2.7.1 EGFR 1.3.2.8 Peptidové růstové faktory 1.3.2.8.1 Epidermální růstový faktor (EGF) 1.3.2.8.2 Fibroblastový růstový faktor 1.3.2.8.3 Transformující růstový faktor-p (tgf-p) 1.3.2.8.4 Transformující růstový faktor-a (tgf-a) 1.3.2.8.5 Vaskulární endoteliální růstový faktor 1.3.2.9 Markery apoptózy 1.3.2.10 CD44 1.3.2.11 Antigeny spojené s proiiferací 1.3.2.11.1 Ki-67 1.3.2.11.2 Proliferační jaderný antigen 1.3.2.11.3 Proteiny udržující minichromosomy 1.3.2.12 Angiogeneze a inhibitory nádorové angiogeneze 1.3.2.12.1 Thrombospondin 1.4 Závěr obecné části 2. Cíl projektu 2.1 Konkrétní cíle projektu 3. Hodnocení prognostického významu zkoumaných parametrů 3.1. Prognostický význam imunohistochemické detekce mikrovaskulární denzity ve tkáni Ta T1 nádorů močového měchýře, vztah mikrovaskulární denzity a jaderné akumulace p53 3.1.1 Souhrn 3.1.2 Úvod 3.1.3 Materiál a metodika 3.1.3.1 Výběr a sledování pacientů 3.1.3.2 Metodika imunohistochemické detekce mikrovaskulární density 3.1.3.3 Metodika imunohistochemické detekce jaderné pozitivity p53 3.1.3.4 Statistické hodnocení 3.1.4 Výsledky 3.1.5 Diskuse 3.2 Prognostický význam p53 pozitivity v nenádorové sliznici u pacientů s Ta T1 uroteliálním karcinomem močového měchýře 3.2.1 Souhrn 3.2.2 Úvod 3.2.3 Materiál a metodika 3.2.3.1 Imunohistochemické vyšetření 3.2.3.2 Statistické hodnocení 3.2.4 Výsledky 3.2.4.1 Korelace mezi mírou exprese p53 v nenádorové sliznici a dalším průběhem onemocnění 3.2.5 Diskuse 3.3 Prognostický význam exprese genu PAX5 u nemocných s Ta T1 uroteliálním karcinomem močového měchýře 3.3.1 Souhrn 5

3.3.2 Úvod 3.3.3 Materiál a metodika 3.3.3.1 Výběr a sledování pacientů 3.3.3.2 Izolace RNA a semikvantitativní hodnocení exprese PAX5 prostřednictvím reversní trankriptasa-polymerasové řetězové reakce 3.3.3.3 Statistická analýza 3.3.4 Výsledky 3.3.4.1 Exprese PAX5 a její korelace s ostatními klinickopatologickými charakteristikami tumoru 3.3.4.2 Korelace mezi expresí PAX5 a průběhem onemocnění 3.3.4.3 Multivariantní analýza 3.3.5 Diskuse 3.4 Prognostický význam subklasifikace a exprese fascinu-1 u T1 uroteliálního karcinomu močového měchýře 3.4.1 Souhrn 3.4.2 Úvod 3.4.3 Materiál a metodika 3.4.3.1 Výběr a sledování pacientů 3.4.3.2 Metodika T1 subklasifikace 3.4.3.3 Imunohistochemické vyšetření fascinu-1 3.4.3.4 Statistická analýza 3.4.4 Výsledky 3.4.4.1 Korelace mezi T1 subklasifikací a průběhem onemocnění 3.4.4.2 Korelace mezi T1 subklasifikací a ostatními hodnocenými parametry 3.4.4.3 Korelace mezi T1 subklasifikací a expresí fascinu-1 3.4.4.4 Korelace mezi expresí fascinu-1 a průběhem onemocnění 3.4.4.5 Korelace mezi expresí fascinu-1 a ostatními sledovanými parametry 3.4.4.6 Multivariantní analýza 3.4.5 Diskuse 4. Závěr 5. Summary 6. Seznam zkratek 7. Literatura 8. Seznam prací publikovaných k tématu disertační práce 6

1. OBECNÝ ÚVOD DO PROBLEMATIKY PROGNOSTICKÝCH FAKTORŮ UROTELIÁLNÍHO KARCINOMU MOČOVÉHO MĚCHÝŘE 1.1 NÁDORY MOČOVÉHO MĚCHÝŘE Nádory močového měchýře představují nejčastější malignitu močového traktu a odečteme-li kožní nádory, čtvrtou nejčastější malignitu vůbec. Přestože jejich incidence postupně vzrůstá, nedochází ve vyspělých zemích k vzestupu počtu úmrtí <1). Převážnou většinu nádorů močového měchýře tvoří nádory uroteliální (90 %), méně častou variantou jsou epidermoidní karcinom (6-7 %) a adenokarcinom (1-2 %) <2). Sarkomy, feochromocytomy, maligní lymfomy a jiné druhy malignit představují méně než 2 % (3). Uroteliální nádory močového měchýře představují z hlediska prognózy velmi široké spektrum onemocnění. Rozhodující prognostický význam je přisuzován hloubce infiltrace stěny močového měchýře. Na důležitost tohoto faktoru upozornili již Jewett a Strong v roce 1946 na základě pitevních nálezů, kdy prokázali vztah mezi hloubkou infiltrace a incidencí metastáz (4). Jejich pozorování a závěry se staly podkladem pro tvorbu klasifikačních schémat včetně dnes používané TNM klasifikace. Při posuzování lokálního rozsahu nádoru rozdělujeme z praktických důvodů nádory do dvou velkých skupin - na povrchové (Ta, T1 a tumor in situ- Tis) a infiltrující (T2-T4). Povrchové nádory močového měchýře tvoří v době diagnózy 70-80 % všech uroteliálních nádorů (5). Je možné je odstranit transuretrální resekcí, nemocného však ohrožují vznikem recidiv, které se při dlouhodobém sledování objevují až v 88 % (6>. V případě recidivy se můžeme dokonce setkat s progresí, tedy s přechodem nádoru do formy infiltrující, která je již spojena s bezprostředním rizikem vzniku metastáz. V praxi je tedy zřejmé, že i povrchové uroteliální nádory představují ve skutečnosti onemocnění s velmi heterogenním průběhem. Na jedné straně stojí nádory s minimálním maligním potenciálem a nepatrným rizikem vzniku recidivy či progrese a na druhé straně agresivní povrchové nádory, které přes intenzivní lokální léčbu záhy přecházejí do infiltrující formy. Proces progrese a vzniku metastáz může probíhat tak rychle, že ani radikální operace nemusí znamenat úplné vyléčení. Předpověď budoucího chování již v době diagnózy se tak stává základním a nejčastěji diskutovaným problémem léčby povrchových nádorů močového měchýře. Dokonalá prognóza a odhalení nemocných s budoucí progresí totiž umožní individuálně a včas volenou agresivní léčbu. Téměř 25 % nemocných s nově diagnostikovaným karcinomem močového měchýře má invazivní tumor a ve většině těchto případů jde o tumor s vysokým grade. Většina nemocných (85-92 %) s invazivním karcinomem močového měchýře má tuto úroveň nádorové invaze již v době počáteční diagnózy a téměř 50 % nemocných s invazivním tumorem močového měchýře má v době diagnózy již okultní vzdálené metastázy (7). To je určitým limitem účinnosti lokální léčby invazivních tumorů močového měchýře. U většiny nemocných s okultními metastázami dojde ke vzniku zřejmých vzdálených metastáz v průběhu jednoho roku. Při sledování nemocných je dobré vědět, že může dojít i k pozdním, invazivním recidivám onemocnění po poměrně dlouhém beznádorovém intervalu (např. 5 let) a to i ve skupině nemocných s povrchovými a dobře diferencovanými nádory (8). 7

Jednotlivé prognostické faktory vycházejí z našich znalostí o přirozeném průběhu onemocnění. V praxi dnes využíváme faktory vycházející z klinických a patologických parametrů tumoru, které získáme odběrem anamnézy, endoskopickým vyšetřením a rutinním histologickým vyšetřením odstraněné tkáně. Biologické markery jsou intenzivně studovány, jejich rutinní využití však zatím v širší míře není možné. 1.2.1 PŘIROZENÝ PRŮBĚH POVRCHOVÝCH UROTELIÁLNÍCH KARCINOMŮ A KLINICKÉ PROGNOSTICKÉ FAKTORY Základním kamenem léčby povrchového nádoru je správně provedené endoskopické vyšetření v narkóze a transuretrální resekce. Očekáváme od něj nejen vlastní odstranění nádoru, ale rovněž získání maximálního množství informací o vzhledu, plošném rozsahu a četnosti neoplastických změn. Kvalita získaného vzorku musí patologovi umožnit stanovení patologické diagnózy, posouzení stupně diferenciace a určení hloubky infiltrace do stěny měchýře. Není pochyb o tom, že přirozený průběh nádoru močového měchýře po transuretrální resekci je rozhodující pro osud nemocného. Při hodnocení studií EORTC ( European Organization for Research on the Treatment of Cancer") zabývajících se povrchovými uroteliálními karcinomy se dokonce ukázalo, že agresivita onemocnění má větší vliv na osud pacienta, než zvolený způsob léčby po transuretrální resekci, tedy zda pacienta pouze sledujeme nebo podáme intravezikální léčbu (9). Přirozený průběh je tedy odrazem biologického potenciálu nádorového onemocnění. Tento potenciál lze částečně odhadnout z informací získaných při transuretrální resekci. Předpověď budoucího chování již v době diagnózy se tak stává základním a nejčastěji diskutovaným problémem léčby povrchových nádorů močového měchýře. Dokonalá prognóza a odhalení nemocných s budoucí progresí totiž umožní individuálně a včas volenou agresivní léčbu. 1.2.1.1 HLOUBKA NÁDOROVÉ INVAZE Podle hloubky nádorové invaze rozdělujeme exofytické povrchové nádory močového měchýře do stádií Ta a T1. Zhruba 70-80 % povrchových nádorů tvoří malignity ohraničené na sliznici (Ta a Tis) a 20-30 % se šíří do lamina propria (T1) (10). Nádory Ta a T1 se neliší v riziku recidivy, které je odhadováno na 54 %, respektive 53 %, zásadní rozdíl je však v riziku progrese onemocnění (9). Malignity ohraničené na sliznici (Ta) mají nejlepší prognózu ze všech tumorů močového měchýře a riziko jejich progrese je odhadováno na 4 %. (8). Ty, které skutečně progredují, jsou obvykle špatně diferencované, jež tvoří pouze 1-2 % všech Ta. (8, 11). Naopak nádory, které vykazují invazi do lamina propria (T1) progredují až ve 30 % (8). O invazivním biologickém potenciálu nádorů T1 svědčí i možnost vzniku metastáz v pánevních lymfatických uzlinách, jejichž četnost je odhadována na 2,2 až 6,7 % (12,. Rovněž délka přežití se mezi oběma skupinami výrazně liší. Zhruba 20 % nemocných se zjištěným tumorem T1 umírá do 5 let na nádor močového měchýře (14). V Holmangově studii s nejdelší dobou sledování přežilo 20 let 89 % nemocných s tumory Ta, ale pouze 70 % s nádory T1 (15). 8

1.2.1.1.1 SUBKLASIFIKACE T1 TUMORŮ Vzhledem k určité nejednotnosti chování nádorů T1 doporučují někteří autoři jejich další diferenciaci. Angulo doporučil systém využívající vláken hladké svaloviny, která se u většiny pacientů nacházejí v lamina propria, a která jsou označovaná jako muscularis mucosae. Podle toho, zda nádor proniká pouze k této vrstvě nebo přes ni, rozlišuje podskupinu T1a, respektive T1b ( U nádorů T1b byla prokázána větší agresivita s 50-53% rizikem progrese oproti pouhým 7-31 % u T1a (16 " 18>. Prognostický význam subklasifikace T1 však byl statisticky prokázán jen v některých dalších studiích (19 21). Situaci komplikuje skutečnost, že muscularis mucosae není u všech lidí jednoznačně vytvořena, takže subklasifikace je možná zhruba jen v 60-90 % případů (16,18>. Tato subklasifikace je většinou autorů doporučována jako zdroj další prognostické informace (10), oficiálně však do stávající revize TNM klasifikace zařazena nebyla. Jinou strategii navrhl Cheng, který měřil hloubku invaze do lamina propria pomocí mikrometru, přičemž hloubka invaze nejpřesněji korelovala s výslednou patologickou klasifikací stanovenou na základě vyšetření preparátu po cystektomii (22). 1.2.1.2 STUPEŇ HISTOLOGICKÉ DIFERENCIACE NÁDORU Dalším důležitým faktorem je stupeň histologické diferenciace. Existuje jednoznačná korelace mezi gradem a sklonem k invazivnímu růstu, progresí onemocnění, vznikem metastáz i délkou přežití. Recidivy se objevují u 47-50 % dobře diferencovaných (G1), u 59 % středně diferencovaných (G2) a u 61-80 % špatně diferencovaných (G3) nádorů (8,9). Invaze do lamina propria byla pozorována u 6 % nádorů G1, 52 % G2 a 82 % G3 (10). Riziko progrese je odhadováno na 2-6 % u nádorů G1, 11-17 % u G2 a 30-45 % u G3 (8 ' 9). Riziko progrese u špatně diferencovaných nádorů ještě stoupá s délkou sledování. Po 10 letech zůstává riziko progrese u T1G1 stále nízké, 0-4 %, zatímco u T1G3 stoupá na 50-62 % (23 ' 24). Herr uvádí progresi po 15tiletém sledování u 39 % nádorů TaG3, respektive u 56 % nádorů T1G3 (. Zatímco nádory Ta jsou většinou dobře diferencované a mají velmi dobrou prognózu, má u tumorů T1 přesné posouzení histologické diferenciace zásadní význam. Rúbben uvádí na základě hodnocení nádorového registru vaachenu 18,8% riziko progrese při pětiletém sledování u T1G1-2 oproti 31,4% riziku u T1G3. Rovněž pětileté korigované přežití bylo s 81 % vyšší u T1G1-2, než 64 % u T1G3 (26). Souhrně řečeno, zachytíme-li špatně diferencovaný uroteliální karcinom infiltrující lamina propria /T1G3 - tvoří 30-40 % všech tumorů T1/, máme co do činění s prognosticky velmi nepříznivým nálezem. Všechny doposud citované práce používaly klasifikační systém doporučený WHO v roce 1973. Tato klasifikace má určité nedostatky, mezi které patří hlavně poněkud horší definice středního stupně diferenciace (G2), do kterého jsou zařazovány všechny nádory mezi jasněji vymezenými G1 a G3. Proto byl v roce 1998 navržen WHO a ISUP (International Society of Urological Pathology) nový klasifikační systém, který rozděluje uroteliální malignity na papilární neoplázie o nízkém maligním potenciálu, papilární karcinomy nízkého gradu a papilární karcinomy vysokého gradu (2 ). Následně v roce 1999 upřesnila WHO své doporučení a navrhla poslední skupinu rozčlenit na dvě, takže uroteliální karcinomy by měly být klasifikovány jako papilární neoplázie o nízkém maligním potenciálu a papilární uroteliální karcinomy G1, G2 a G3. 9

Holmang testoval přínos těchto doporučení pro odhad prognózy onemocnění u 363 pacientů s tumory klasifikovanými jako Ta. Riziko recidivy onemocnění bylo 35 % u pacientů s papilární neoplázií o nízkém maligním potenciálu, oproti 71 % u papilárních karcinomů nízkého gradu a 73 % u papilárních karcinomů vysokého gradu. Riziko progrese pro jednotlivé skupiny činilo 0 %, 4 % a 23 %. Prokázal i význam rozdělení poslední skupiny dle doporučení WHO, když se progrese objevila u 20 % nádorů G2 a 45 % G3 Tato pozorování potvrdil i Fuji, když dlouhodobě sledoval 50 pacientů s tumorem klasifikovaným jako papilární neoplázie o nízkém maligním potenciálu. U žádného z pacientů nezaznamenal progresi onemocnění nebo vznik nádoru v horních močových cestách. Po 5 a 10 letech bylo bez recidivy 51 %, respektive 36 % sledovaných (29). 1.2.1.2.1 REPRODUKOVATELNOST KLASIFIKACE UROTELIÁLNÍCH NÁDORŮ MĚCHÝŘE Stanovení hloubky infiltrace a stupně buněčné diferenciace však má svá omezení, která snižují i jejich prognostický význam. Získaný vzorek tkáně malignity často neumožňuje patologovi přesně posoudit hloubku infiltrace (je-li vzorek termálně změněn nebo neobsahuje-li svalovinu) (30). Výsledek je navíc zatížen poměrně velkou chybou danou subjektivitou hodnocení. Projevuje se to velkou diskrepancí při klasifikaci nálezu mezi jednotlivými patology. Rozdíly v hodnocení gradu jsou uváděny v 15-50 % a dokonce závěry jednoho patologa se mohou při časovém odstupu lišit až ve 30 %. Podobně se objevují v 30% diskrepance i v posuzování hloubky infiltrace (31). Van der Meijden zaznamenal souhlas mezi hodnocením lokálního patologa a jeho kolegy provádějícího kontrolu pouze u 57 % nádorů TaG1 a 50 % T1G3, přičemž 10 % bylo z T1G3 překlasifikováno na T2 (32). Podobné popsal Bol souhlas mezi jednotlivými patology v 80 % při určování hloubky infiltrace a pouze v 59 % při určování gradu (33). 1.2.1.3 PROGNOSTICKÝ VÝZNAM ČETNOSTI A PLOŠNÉ VELIKOSTI NÁDORU V DOBĚ DIAGNÓZY Mnohočetný nález v době diagnózy je nepříznivým faktorem hlavně vzhledem k riziku dalších recidiv i k délce beznádorového intervalu. Heney zaznamenal při tříletém sledování vzestup počtu recidiv v případě dvou a více nádorů z 18 % na 43 % u Ta a z 33 % na 46 % u T1 (8). Podobně Holmang zachytil u nádorů nízkého gradu recidivy u 64 % pacientů s původně solitárním nádorem, u 76,7 % s 2-3 nádory a u 87,5 % nemocných, kteří měli 4 nádory a více (34). Významným faktorem, a to vzhledem k recidivám i progresi, je plošná velikost původního nádoru. Parmar zachytil při 2letém sledování recidivy u 29 % pacientů s nádorem do 2,5 cm v průměru, u 49 % s nádorem 2,5-4,9 cm a u 62 % pacientů s tumorem větším než 5 cm (35). Progresi pozoroval Heney u 35 % sledovaných s primárním tumorem větším než 5 cm v největším průměru ve srovnání s 9 % u nádorů menších (8). Stejně tak Kurth zaznamenal progresi u 9 % tumorů do 1,5 cm, u 19 % 1,5-2,9 cm, respektive u 22 % nádorů nad 3 cm v průměru (9). 10

1.2.1.4 POČET PŘEDCHOZÍCH RECIDIV Frekvence předchozích recidiv má velký vliv na riziko recidiv i progrese onemocnění. Kurth definoval jako významný prognostický faktor průměrný počet předchozích recidiv za rok. Byl-li tento poměr méně než 1, pozoroval recidivy u 51 % a progrese u 9 % nemocných, byl-li 1-3 objevily se recidivy u 63 % a progrese u 13 % a u 3 a více předchozích recidiv za rok stoupl počet následných recidiv na 73 % a progresí na 23 % (9). O velké agresivitě opakovaně recidivujících nádorů svědčí i pozorování Holmanga. U 11 z 12 pacientů s nádory TaG1, respektive TaG2, a více než 10 recidivami došlo k progresi onemocnění a 9 z nich během 20tiletého sledování na uroteliální nádor zemřelo (15). 1.2.1.5 PŘIROZENÝ PRŮBĚH TIS A PROGNOSTICKÉ FAKTORY Jako tumor in situ (TIS) je označována intraepiteliální anaplázie uroteliálních buněk, tedy anaplastické změny urotelu bez známek exofytického růstu nebo infiltrace. TIS většinou, zhruba v 90%, doprovází papilární nebo solidní léze, přičemž pravděpodobnost vzniku tumoru infiltrujícího svalovinu je v tomto případě odhadována na 42-83 % (36). Menší část (zhruba 10 %) se vyskytuje jako izolovaný nález. Jeho prognóza je obestřena určitými nejasnostmi. Obecně je TIS považována za prognosticky nepříznivou variantu představující východisko vzniku infiltrujícího tumoru, jsou však známa i pozorování pacientů s dlouholetým neprogredujícím nálezem. Nález abnormality urotelu v okolí primárního nádoru ve smyslu Tis nebo těžké dysplázieje považován za nepříznivý prognostický ukazatel. Dle Heneyho stouplo riziko progrese z 8 na 33 % při nálezu těžkých dysplastických změn v jiném místě urotelu Za velmi nepříznivou variantu je považována kombinace nádoru T1 s Tis. Riziko progrese je 43-49 %, oproti 20 % u samotného Tis, 10 % u samotného nádoru T1, respektive 18 % u kombinace Ta a Tis (37). 1.2.1.6 PROGNOSTICKÝ VÝZNAM VYŠETŘENÍ NORMÁLNĚ VYHLÍŽEJÍCÍHO UROTELU Jakákoliv abnormalita v urotelu vzdáleném od primárního nádoru představuje nepříznivý prognostický ukazatel a zvyšuje riziko vzniku recidivy. Rovněž pravděpodobnost budoucí progrese při nálezu dysplastických změn v jiném místě urotelu stoupá. Není pochyb o tom, že je nutno odebrat studené biopsie ze všech suspektně vyhlížejících míst sliznice močového měchýře. Otázkou zůstává, zda je třeba rutinně provádět biopsie z normálně vyhlížející sliznice. Kiemeney srovnal riziko recidivy a progrese u 1044 pacientů s provedenými biopsiemi (a kde tedy informace o stavu urotelu byla k dispozici) s těmito riziky u 701 nemocného, kde biopsie odebrány nebyly. Recidiva se objevila u 52 % v první a u 54 % ve druhé skupině, četnost progrese byla v obou skupinách shodná, 11 %. Pozitivní nálezy obvykle doprovázely špatně diferencované tumory, u kterých je intravezikální terapie indikována nezávisle na výsledku biopsií. Na základě těchto výsledků Kiemeney nedoporučuje rutinní odběry z normálně vyhlížející sliznice u pacientů s povrchovými nádory močového měchýře (38). 11

1.2.1.7 PROGNOSTICKÝ VÝZNAM VÝSLEDKU PRVNÍ CYSTOSKOPICKÉ KONTROLY PO 3 MĚSÍCÍCH Významným prognostickým ukazatelem pro předpověď následných recidiv je nález při první cystoskopické kontrole, kterou provádíme obvykle 3 měsíce po transuretrální resekci. Pozitivní nález zvyšuje riziko dalších recidiv z 21-47 % až na 83-90 % (9,39). Toto pozorování potvrdili i další autoři (35 40). 1.2.1.8 MULTIVARIANTNÍ ANALÝZA JEDNOTLIVÝCH PROGNOSTICKÝCH FAKTORŮ Při hodnocení skutečného významu jednotlivých prognostických faktorů je třeba posoudit jejich význam a nezávislost pro předpověď recidivy tumoru, progrese tumoru a úmrtí na nádorové onemocnění. K získání těchto informací je třeba vycházet z výsledků studií s velkým počtem pacientů a dostatečnou dobou sledování, kde byly jednotlivé prognostické faktory zhodnoceny metodou multivariantní analýzy. Nezávislé prognostické faktory pro předpověď recidivy, progrese, respektive úmrtí na nádorové onemocnění, které byly odvozeny ze 3 největších studií. Je však nutno si uvědomit, že vstupní informace v jednotlivých studiích se poněkud liší. Kiemeney hodnotil 1674 pacientů s primárními nádory močového měchýře, přičemž random biopsie byly provedeny pouze u části z nich. Autor neuvažuje nález při první cystoskopické kontrole a nehodnotí riziko úmrtí na nádorové onemocnění (41). Kurth zařadil 576 pacientů s primárním i recidivujícím nádorem léčených následně intravezikální chemoterapií v rámci 2 studií organizovaných Evropskou organizací pro léčbu a výzkum rakoviny (EORTC). Pacienti neměli rutinně prováděné random biopsie, posuzován však byl i výsledek první cystoskopie (9).Millan-Rodriguez posuzoval 1529 pacientů s primárním nádorem, u kterých byly rutinně prováděny random biopsie. Nebyl však hodnocen výsledek první cystoskopické kontroly <42). Z těchto údajů vychází i oficiální doporučení Evropské urologické společnosti, dle kterého považujeme počet tumorů, jejich plošný rozsah, frekvenci předchozích recidiv, nález při první cystoskopické kontrole a vysoký grade za prognostické faktory předpovídající recidivu povrchového nádoru močového měchýře. Progresi onemocnění lze předpovědět na základě přítomnosti vysokého gradu a rozlišení tumorů Ta a T1 (4á). 12

Tabulka 1 Millan-Rodriguez rozdělil pacienty dle agresivity onemocnění do tří skupin. Vyšel přitom z výsledků již zmiňované multivariantní analýzy prognostických faktorů. Definice jednotlivých skupin i riziko recidivy, progrese a úmrtí v každé z nich je uvedeno v tabulce (44). Recurrence rate Progression rate Mortality rate Low risk Intermediate risk High risk ptag1,pt1g1 single pt1g1 multiple, ptag2, pt1g2 single pt1g2 multiple, ptag3, pt1g3, ptis 37% 0% 0% 45% 1,8% 0,73% 54% 15% 9,5% Tabulka 2 Rozdělení do skupin dle rizika recidivy onemocnění dle Allarda. Pacienti jsou začleněni do jedné ze 4 skupin dle počtu přítomných nepříznivých faktorů (ATC), mezi které řadí nález mnohočetného nádoru, nádor větší než 3 cm v průměru, nález invaze do lamina propria a grade 2, respektive 3 (45). ATC = multiplicity, > 3cm, pt1, G2-3 2-year recurrence-free rate No ATCs (ptag1, solitary, < 3cm) 68,5% 1 ATC 55,4% 2 ATCs 31,7% 3-4 ATCs 19,1% 13

Tabulka 3 Doporučení Evropské urologické společnosti (43). Low-risk tumours Single, Ta, G1, < 3 cm Intermediate risk All other tumours High-risk tumours T1, G3, multifocal or highly recurrent, Tis Převzato z Prognostic Factors and Individual Follow-Up Strategy in Patients with Superficial Bladder Cancer, M. Babjuk, ESU Course, 25 March 2004, Vienna, Austria Pro předpověď rizika recidivy a progrese u určitého pacienta s Ta, T1 uroteliálním karcinom močového měchýře byly recentně vytvořeny EORTC tabulky rizika. Cílem bylo vytvořit jednoduchý nástroj, který umožní vypočítat riziko recidivy a progrese v době jeden a pět let po provedené transuretrální resekci, založený na hodnocení šesti rutinně vyšetřovaných klinických a patologických faktorů, mezi něž patří počet nádorů, velikost nádorů, počet recidiv za rok, hloubka nádorové invaze, míra histologické diferenciace, přítomnost TIS. Podkladem k vytvoření skorovacího systému se stala data od 2596 pacientů nashromážděná v rámci sedmi EORTC studií probíhajících od ledna 1979 do září 1989, v době, kdy nemocní s vysoce rizikovým neinvazivním karcinomem močového měchýře nebyli léčeni udržovací léčbou vakcínou BCG. Výhodou tabulek je jejich jednoduchost a dostupnost pro běžné užívání, v elektronické podobě je možné je najít na adrese http://www.eortc.be/tools/bladdercalculator. <46) 14

SKOROVACÍ SYSTÉM FAKTOR RECIDIVA PROGRESE POČET NÁDORU SOLITARNI 0 0 MNOHOCETNY 4 3 VELIKOST NÁDORU <3 CM 0 0 >3 CM 3 3 POČET RECIDIV / ROK PRIMOZACHYT 0 0 <1/ROK 2 2 >1/ROK 4 2 STAGE A 0 0 1 1 4 CIS NE 0 0 ANO 0 6 GRADE G1 0 0 G2 1 0 G3 2 5 CELKOVE SKORÉ 0-14 0-23 PRAVDĚPODOBNOST RECIDIVY SKORÉ RECIDIVA /1 ROK RECIDIVA / 5 LET 0 16% (11 %, 21 %) 34 % (27 %, 41 %) 1-4 24 % (22 %, 27 %) 49 % (46 %, 53 %) 5-7 34 % (30 %, 38 %) 63 % (58 %, 68 %) 8-11 51 % (47 %, 55 %) 74 % (70 %, 78 %) 12-14 84 % (69 %, 98 %) 15

PRAVDĚPODOBNOST PROGRESE SKORÉ PROGRESE/I ROK PROGRESE/5 LET 0 0.25 % (0 %, 0.7 %) 1 % (0 %, 2 %) 2-6 1 % (0,5 %, 2 %) 7 % (5 %, 9 %) 7-11 5 % (3 %. 7 %) 18% (14%, 21 %) 12-16 10% (6%. 15%) 39 % (30 %. 47 %) 17-23 32% (12%, 51 %) 75 % (53 %. 97 %) 1 2 2 KLINICKÉ PROGNOSTICKÉ FAKTORY U INVAZIVNÍHO KARCINOMU MOČOVÉHO MĚCHÝŘE Stanovení prognostických faktorů u invazivního karcinomu močového měchýře je důležité pro rozdělení nemocných do různých prognostických skupin, což by umožnilo výběr vhodné adjuvantní léčby, stejně i možnost srovnávání léčebných výsledků mezi jednotlivými institucemi. 1.2.2.1 STUPEŇ HISTOLOGICKÉ DIFERENCIACE NÁDORU Míra histologické diferenciace se jako prognostický faktor u invazivního karcinomu ve srovnání s povrchovým karcinomem uplatňuje mnohem menší měrou, neboť většina invazivních karcinomů má vysoký nádorový grade (47). 1.2.2.2 HLOUBKA NÁDOROVÉ INVAZE Hloubka nádorové invaze má velký význam při předpovědi přežití po radikální cystektomii. Ve Steinově souboru 1054 nemocných s uroteliálním karcinomem močového měchýře léčeného cystektomii měli nemocní s extravesikálním šířením tumoru při srovnání s podskupinou s tumorem ohraničeným na močový měchýř signifikantně nižší četnost recidiv a horší celkové přežití. (13). K obdobným výsledkům dospěli i jiní autoři (48 ' 49). Ve studii se 184 nemocnými s invazivním karcinomem močového měchýře byl medián přežití pro nemocné s T2 tumorem 49 měsíců, pro nemocné s T3 tumorem 26 měsíců a pro nemocné s T4 tumorem jen 13 měsíců ' 50). V jiné retrospektivní studii s 384 nemocnými po radikální cystektomii došlo během sledování k recidivě onemocnění u 5 % nemocných s původním tumorem pt1, u 20 % s tumorem pt2 a u 40 % s tumorem pt3 či vyšší hloubkou nádorové invaze (51). To může být teoretickým podkladem pro rozdílný způsob sledování nemocných po radikální cystektomii, se zřetelem k hloubce nádorové invaze (51). 1.2.2.3 PROGNOSTICKÝ VÝZNAM METASTATICKÉHO POSTIŽENÍ LYMFATICKÝCH UZLIN Přítomnost metastického postižení lymfatických uzlin je významným prediktorem možného relapsu choroby, podle některých prací i nezávislým 16

prognostickým faktorem (52 53). V případě metastatického postižení uzlin je přežití nemocných signifikantně nižší (48). Část nemocných nicméně může být vyléčena pouhou operací- ve Steinově souboru bylo při standardním provedení pánevní lymfadenektomie zastiženo postižení lymfatických uzlin ve 23 %. Navzdory metastatickému postižení uzlin téměř 31 % nemocných bylo naživu 5 let a 23 % 10 let po operaci (. V retrospektivní studii s 686 nemocnými po radikální cystektomii a lymfadenektomii nebyl zjištěn statisticky signifikantní rozdíl v přežití pro nemocné s NO a N1, pokud šlo o tumor ohraničený na močový měchýř, nicméně současně byl zaznamenán klesající benefit stran přežití se vzrůstajícím rozsahem metastatického postižení uzlin (od N1 do N3) (47). Rozsah metastatického postižení lymfatických uzlin má význam pro předpověď vzniku budoucích metastáz. Z nemocných s méně než 5 pozitivními uzlinami přežívalo bez známek recidivy onemocnění 10 let po operaci 41 %, zatímco při postižení 5 a více uzlin přežívalo 10 let po výkonu bez známek recidivy jen 24 % nemocných, při použití multivariantní analýzy však rozdíl nebyl statisticky signifikantní <13). Počet postižených lymfatických uzlin, odstraněných při lymfadenektomii je považován za nezávislý prognostický faktor (54). Leissner v retrospektivní studii s 302 nemocnými po radikální cystektomii zjistil signifikantní korelaci mezi počtem odstraněných lymfatických uzlin a pětiletým beznádorovým přežíváním pro tumory pt1, pt2 a pt3. Byl zaznamenán signifikantní rozdíl pro celkové přežití a přežití bez známek onemocnění mezi nemocnými, u kterých bylo odstraněno více než 16 uzlin a těmi, u kterých bylo odstraněno méně než 15 uzlin. U nemocných s pt4 tumorem neměl počet odstraněných uzlin vliv na celkové přežití, ani přežití bez známek choroby (55). Stejně i Stein potvrdil vliv počtu pozitivních uzlin na přežití nemocných, a to jak univariantní, tak multivariantní analýzou, za prognosticky významný počet uzlin byl stanoven počet 8 (56). Ve studii zabývající se vlivem adjuvantní chemoterapie (M-VAC, M-VEC) na přežití nemocných po radikální cystektomii, byla prognóza nemocných rovněž závislá na počtu postižených lymfatických uzlin, v případě postižení 5 a více lymfatických uzlin byla prognóza špatná, a to i přes podanou adjuvantní léčbu (l \ Nicméně faktem zůstává, že doposud nebyla publikována žádná prospektivní studie, která by prokázala výhodu cystektomie s lymfadenektomii nad provedením prosté cystektomie, rovněž nejasné je to, jakého rozsahu by měla být provedená lymfadenektomie (58). 1.2.2.4 DALŠÍ PROGNOSTIKÉ FAKTORY U INVAZIVNÍHO KARCINOMU MOČOVÉHO MĚCHÝŘE Podle různých studií jsou dalšími důležitými klinickými faktory pro předpověď specifického přežití nemocných velikost nádoru, stav chirurgických okrajů a předchozí anamnéza povrchového karcinomu močového měchýře (59 >. V Chengově souboru 218 nemocných s invazivním karcinomem přinášela velikost tumoru a stav chirurgických okrajů signifikantní prognostickou informaci, nezávislou na hloubce nádorové invaze a metastatickém postižení lymfatických uzlin (60). Ve Witjesově práci nemocní s invazivním karcinomem močového měchýře a současně anamnézou povrchového tumoru měli horší prognózu ve srovnání s nemocnými s primárně invazivním karcinomem, kdy pro nemoc specifické přežití bylo ve skupině s primárně invazivním karcinomem téměř dvojnásobné (61). Yi

1.2.3 KLINICKÉ PROGNOSTICKÉ FAKTORY-ZÁVĚR V současné době se při výběru léčebné strategie u nemocných s karcinomem močového měchýře vychází zejména z histopatologického určení míry histologické diferenciace tumoru a hloubky nádorové invaze jako z primárních prognostických faktorů. Přesto, že tyto klasické prognostické faktory poskytují určitou prognostickou stratifikaci, zůstává v jednotlivých podskupinách významná heterogenita. Schopnost přesně a spolehlivě předpovědět skutečný biologický potenciál tumoru by usnadnila přizpůsobit způsob léčby- vybrat určité nemocné, kteří by mohli mít prospěch z adjuvantní léčby a naopak ušetřit některé pacienty potenciálně škodlivého nadbytečného léčení. Molekulární biologické parametry mohou pomoci při takovémto rozhodování o způsobu léčby. 1.3 MOLEKULÁRNÍ PROGNOSTICKÉ FAKTORY Je zřejmé, že na základě výše zmíněných prognostických faktorů lze vyčlenit rizikové skupiny s vysokou pravděpodobností budoucí progrese onemocnění. Přesto je volba správného postupu v konkrétním jednotlivém případě velmi obtížná. I u nádorů s původně příznivými rysy může dojít k vzestupu agresivity onemocnění s následnou progresí. Naopak i u nádorů s nejrizikovější prognózou existují výjimky s příznivým následným průběhem, u kterých by radikální léčba byla zbytečně agresivní a mutilující. Všechny jmenované prognostické ukazatele jsou pouze projevem určitého biologického potenciálu nádoru. Podkladem determinujícím průběh onemocnění jsou změny na subcelulární úrovni. Změna buněčné morfologie (tedy stupeň buněčné diferenciace) a chování malignity (hloubka infiltrace, rozsah tumoru, frekvence recidiv) jsou pouze fenotypovým odrazem odchylek na úrovni genomu. Dostáváme se tak k samotné biologické podstatě nádorového růstu. Podaří-li se identifikovat faktor na subcelulární úrovni, který je zodpovědný za vznik a konkrétní chování malignity, mohou naše terapeutické kroky předcházet projevům na úrovni fenotypu. Cílem je tedy s pomocí molekulárních prognostických faktorů předpovědět chování tumoru u konkrétního nemocného. I přesto, že jsou intenzivně zkoumány nové molekulární prognostické faktory, jen málo z nich přináší další nezávislou prognostickou informaci k té, kterou získáme na základě běžné cystoskopie a patologického vyšetření. Na druhou stranu, tyto markery nám mohou pomoci poznat biologické procesy vedoucí s dimorfní povaze chování uroteliálního karcinomu. 1.3.1 PODSTATA NÁDOROVÉHO RŮSTU, KONTROLA TKÁŇOVÉ PROLIFERACE, BUNĚČNÝ CYKLUS A PROGRAMOVANÁ SMRT BUŇKY K lepšímu pochopení funkce jednotlivých molekulárních prognostických faktorů je vhodné zmínit několik základních informací o regulaci buněčného cyklu, signálech ovlivňujících dělení buňky a naprogramovanou smrt buňky, apoptózu. V normálních tkáních je velmi pečlivě udržována rovnováha mezi četností buněčné replikace a zánikem buněk. Mechanismus, jakým je tato rovnováha udržována, zatím není přesně znám, objeví-li se však její porucha (ať už zvýšením buněčné replikace nebo redukcí buněčných úmrtí), dochází k akumulaci buněk, které tvoří tumor. V celém procesu se uplatňují růstové faktory, molekuly podílející se na 18

intracelulárním přenosu signálu i látky kontrolující průběh buněčného cyklu a apoptózy. 1.3.1.1 BUNĚČNÝ CYKLUS A JEHO REGULACE Schopnost buněk dělit se patří k jejich základním vlastnostem. Většina z nich se nachází ve fázi proliferačního klidu (Go). Teprve po stimulaci, například růstovými faktory nebo hormony, vstupuje buňka do fáze Gi (gap = mezera), ve které probíhají nezbytné kroky před syntézou DNA. Fáze syntézy DNA, kdy buňka přechází z diploidního do tetraploidního stavu, je označována jako fáze S (syntetická). V průběhu následné fáze G 2 (gap 2) se buňka připravuje na vlastní rozdělení ve fázi mitózy (M), během které dělící vřeténko rozdělí dvě sady chromozomů do oddělujících se dceřinných buněk, čímž je buněčný cyklus ukončen. Průchod buňky cyklem je monitorován a kontrolován v několika kontrolních bodech ( checkpoints"), které zastaví pokračování směrem k mitóze v případě buněčného poškození. Existují nejméně dva kontrolní body detekující poškození DNA. První je při přechodu z Gt do S fáze, druhý pak na hranici mezi G 2 a M. Velký význam v mechanismu této kontroly hrají kinázy, enzymy schopné fosforylovat proteiny. V buněčném cyklu se uplatňují kinázy označované jako cycle dependent kinase". Tyto kinázy jsou tvořeny 34 kda proteinem vyskytujícím se v buňce trvale a s poměrně konstantní hladinou. K dosažení jejich aktivace je však nutná ještě vazba se specifickými proteiny (definovanými někdy jako regulační podjednotky CDK) ze skupiny cyklinů. Jak již název napovídá, kolísá koncentrace těchto proteinů v závislosti na průběhu buněčného cyklu. Celá kaskáda tedy probíhá tak, že CDK, která je aktivována vazbou s cyklinem, fosforyluje, a tím inaktivuje supresorový protein, čímž je uvolněna brzda dalšího průběhu buněčného cyklu (62, 63). Regulace buněčného cyklu se tedy děje periodickou produkcí cyklinů a jejich odbouráváním. «p 21 19

V počátku G1 fáze jsou produkovány hlavně cykliny ze skupiny D (D1, D2 a D3) jako reakce na působení růstových faktorů. Tyto vytvářejí komplex s CDK 4 a CDK 6 (64), který je fosforylován a tím aktivován další proteinkinázou, označovanou jako CAK (cdk activating kinase). Aktivitu CDK4/cyklinD a CDK6/cyklinD nacházíme od poloviny Gi fáze s postupným vzestupem až do přechodu Gi/S. Tyto aktivované komplexy s proteinkinázovým účinkem se váží na retinoblastomový protein (prb), fosforylují jej a inhibují tak jeho supresorový účinek. Fosforylací prb dochází k uvolnění transkripčních faktorů ze skupiny E2F, které jsou nutné pro expresi řady genů, jejichž produkty (dihydrofolátreduktáza, tymidinkináza, DNA polymeráza alfa apod.) řídí a uskutečňují replikaci DNA (65). Vzhledem k rychlé degradaci mrna a proteinů, klesá hladina D cyklinů záhy po vymizení růstových faktorů. Cyklin E je v maximální míře produkován v období Gi/S přechodu a aktivuje CDK2. Tento komplex se může spolupodílet na fosforylaci prb, hlavně však fosforyluje prb příbuzné proteiny s obdobnou funkcí - p107 a p130 (6265). Cyklin A je produkován těsně po objevení se cyklinu E a v komplexu s CDK2 rovněž umožňuje buňce fosforylací prb, p107 a p130 přejít přes G^S přechod (65). Pro další průběh buněčného cyklu až do mitózy je nezbytný protein cdc2 (cell-division cycle 2, označovaný někdy jako CDK1 nebo p34 cdc2 ) v komplexu s cyklinem A a cyklinem B (65). Cyklin B se poprvé objevuje během S fáze, v komplexu aktivuje cdc2, čímž umožňuje přechod G2/M a je rychle odbouráván během anafáze (66). Cyklin A vykazuje podobnou periodicitu jako cyklin B, v buňce se však objevuje již v období G1/S přechodu a jak již bylo výše uvedeno, má určitý význam i pro normální průběh G1/S a replikace DNA (66). Další možností regulačního zásahu do průběhu buněčného cyklu je inaktivace CDK vazbou s některým z CDKI (cyclin-dependent kinase inhibitor). Indukce sekrece CDKI vede k zastavení buněčného cyklu, čímž se vytváří kontrolní bod (checkpoint). V závislosti na sekvenční homologii lze rozlišit dvě skupiny CDKI (65). První skupinu příbuzných CDKI tvoří p15, p16, p18 a p19 (65). Bylo prokázáno, že p15 a p16 jsou schopné se vázat na CDK4 a CDK6 bez přítomnosti cyklinu. Rovněž p18 vykazuje silnou interakci s CDK6 a slabší s CDK4. Zvýšená exprese p16 indukuje zástavu buněčného cyklu ve fázi G1 inhibicí fosforylace prb. Zajímavá je skutečnost, že produkce p15 mrna je třicetkrát zvýšená při působení TGF beta (transforming growth factor beta). Tento peptid má výrazný antiproliferační efekt - snižuje expresi cyklinů E a A, zvyšuje asociaci p15 s CDK4 a CDK6 (65). Do druhé skupiny CDKI zařazujeme p2i (WAF1/fclp1 > i p 27 a p57 proteiny. Na rozdíl od první skupiny se neváží s CDK, ale přímo s cykliny D1, D2, D3, E a A a v menší míře s cyklinem B (65). P21 je indukován produktem genu TP53. Je nutno zdůraznit, že existují i p53 nezávislé cesty aktivace p21. P21< WAF1/CIP1 > působí jako univerzální inhibitor cyklin-cdk komplexů. Pozorování, že TGF beta inhibují aktivaci komplexu cykline/cdk2 během G1 fáze vedlo k identifikaci proteinu označovaného jako p27 nebo Kip1, jehož exprese zabraňuje buňce vstoupit do S fáze (65). CDKI p57 (Kip2) působí jako inhibitor komplexů cyklin/cdk v G1 a S fázi. 1.3.1.2 PROGRAMOVANÁ SMRT BUŇKY. APOPTÓZA V průběhu embryonálního i postembryonálního vývoje pravidelně část buněk umírá a je odstraněna fagocytózou. Tato programovaná buněčná smrt je geneticky řízený proces, který je spojený se syntézou, případně aktivací určitých enzymů a je regulován vnějšími i vnitřními faktory (67). Rozhodující měrou se uplatňuje v udržování 20

homeostázy tkání tím, že brání jejich nekoordinovanému růstu a v jistém slova smyslu ji lze považovat i za terminální událost buněčné diferenciace. Apoptóza označuje způsob, jímž je u vyšších organizmů programovaná smrt buňky realizována (67). Jak vlastně dochází k rozhodnutí, které buňku nasměruje k apoptóze? Podnět může přicházet z jádra buňky při poškození DNA. Toto poškození je detekováno neznámými mechanizmy, které vedou k expresi p53 a k zástavě buněčného cyklu. Nepodaří-li se poškozenou DNA opravit, vstupuje buňka do procesu apoptózy. Signály mohou přicházet také ze zevnějšku, například odstraněním buňky z jejího zakotvení v extracelulární matrix. Apoptóza může být indukovaná působením některých faktorů (Fas, TNF, TGF-beta, ale i hormonů nebo růstových faktorů) nebo naopak absencí jiných (EGF, FGF2, androgeny) (63). Velmi důležitá otázka zní, jak je vlastně proces indukce a průběhu apoptózy regulován. Předpokládáme, že dochází k na sebe navazujícím změnám ve vyjádření specifických genů. Kromě již zmíněného genu TP53 uplatňují rovněž geny, které TP53 ovlivňuje a jejichž produkty jsou schopny celý proces zablokovat. Je třeba se zmínit zvláště o protoonkogenu bcl-2, který kóduje 26-kd intracelulární membránový protein, a který hraje významnou roli v inhibici apoptózy. Ukázalo se, že tento protein vytváří heterodiméry s produktem genu bax, přičemž rovnováha mezi těmito proteiny rozhoduje o rozsahu blokády apoptózy (6268). Vedle těchto genů se uplatňuje i řada dalších, například protoonkogen c-myc, jehož funkce je ambivalentní. Dle přítomnosti různých regulačních faktorů může jeho proteinový produkt stimulovat jak buněčnou replikaci, tak i apoptózu (67>. Počátek apoptózy je charakterizován dvěma souběžnými kroky vedoucími k aktivaci nukleolytického aparátu. Jedná se o spuštění proteolytické kaskády a poškození mitochondrií. Nejprve dochází k indukci proteáz ICE (interleukinconverting enzyme) aktivující následně řadu dějů, kdy jsou aktivovány některé geny (např. pro DNA nukleázu I a II). Důsledkem poškození mitochondrií je ztráta koordinace energetických pochodů a produkce reaktivního kyslíku vyvolávajícího oxidativní změny v bílkovinách a v DNA. Z poškozených mitochondrií se uvolňují jonty vápníku, které aktivují Ca 2+ a Mg 2+ dependentní endonukleázy (6768). Objeví-li se fragmentace DNA a kondenzace chromatinu, začíná poslední fáze apoptózy a celý proces se stává ireverzibilním. 1.3.1.3 INTRACELULÁRNÍ PŘENOS SIGNÁLU K DĚLENÍ BUŇKY Dělení buňky, ale i apoptóza jsou ovlivňovány z vnějšího prostředí působením řady faktorů, které působí interakcí se specifickými transmembránovými receptory na povrchu buňky. Jejich ligandy mohou být růstové faktory, cytokiny, TNF, extracelulární matrix apod. Po vazbě na receptor dochází ke spuštění řady na sebe navazujících intracelulárních pochodů, jejichž výsledkem je exprese CDK, cyklinů nebo CDKI. Prvním krokem bývá aktivace receptorových kinás v cytoplasmatické části receptoru, případně aktivace kinás nereceptorových. Výsledkem je kaskáda fosforylací přenášejících signál směrem k jádru. Jakmile dosáhne signál jádra, aktivují se transkripční faktory k transkripci na promotoru nebo zesilovači transkripce a indukují tak expresi specifických genů směrujících buňku k dělení nebo ke smrti. 21

Na přenosu signálu se tedy uplatňují tyto skupiny faktorů: 1. Růstové faktory, cytokiny, které se naváží na specifický receptor 2. Specifické receptory 3. Intracelulární přenašeči signálu (proteinkinázy, G-proteiny apod.) 4. Transkripční faktory 5. Produkty genů aktivovaných transkripčními faktory, které navozují chování buňky (dělení, diferenciace, apoptóza). 1.3.1.4 NÁDOROVÉ GENY Naše znalosti týkající se regulace a průběhu buněčného cyklu zatím samozřejmě nejsou dokonalé. Umožnily však definici několika genů a genových produktů, které se na regulaci podílejí, a které se při poruše funkce mohou uplatnit také v procesu vzniku a progrese nádorového onemocnění. Tyto geny dělíme do několika skupin: 1. Protoonkogeny jsou fyziologicky se vyskytující strukturní geny, které se podílejí svými translačními produkty na regulaci buněčného cyklu a jejich diferenciaci. Přítomnost protoonkogenu v buňce je jednou z hlavních podmínek jejího normálního růstu, dělení a diferenciace (69). Onkogen vzniká abnormální aktivací protoonkogenu, ke které může dojít mutací, amplifikací nebo translokací a jejímž výsledkem je patologické zvýšení funkce vedoucí k nekontrolované buněčné ( proliferaci. Mezi onkogeny patří například geny kódující růstové faktory, receptory růstových faktorů, nereceptorové proteinkinázy nebo transkripční faktory ' 69>. Jedná se většinou o proteiny, které byly zmíněny v souvislosti s přenosem signálu do nitra buňky. 2. Tumor supresorové geny (TSG), které za normální situace negativně ovlivňují buněčný cyklus. Jejich porucha umožní buňce nekontrolované dělení a proliferaci typickou pro nádorový růst. Přesto, že TSG bylo zatím popsáno podstatně méně než protoonkogenů, je jim přisuzována zásadní role v procesu kancerogeneze. Nejčastěji je diskutován TP53, Rb nebo p15 a p16 (63). 3. DNA reparační geny, které se podílejí na opravě poškozené DNA - patří sem například MSH2, MLH1 nebo PMS1 (63). 4. DNA ochranné geny, jejichž proteinové produkty chrání DNA před oxidativním poškozením (63). 5. Virové geny implantované do lidského genomu - například velký T antigen, E1, E6 nebo virové onkogeny (63). 6. Metylace genu, kdy například hypermetylace v promotorových oblastech může ovlivnit expresi strukturních genů ( ). 1.3.2.1 A, B, H A DALŠÍ ANTIGENY KREVNÍCH SKUPIN Antigeny krevních skupin A, B, a O se nacházejí na krevních a epitelových buňkách. Alterace glykosilace může ovlivňovat celou řadu buněčných povrchových molekul (jako například receptory pro růstové faktory), což může změnit signalizační povrchové buněčné molekuly, interakci s extracelulární matrix a proteázami. Bylo zjištěno, že maligní transformací dochází na buňkách karcinomu měchýře ke ztrátě exprese antigenů krevních skupin A, B, H. Byla zjištěna rovněž korelace mezi ztrátou 22

antigenu a zvýšenou četností recidiv a vznikem invazivního tumoru (71). V souboru 322 nemocných s povrchovým tumorem močového měchýře, který progredoval do invazního formy, byla u 88 % zjištěna ztráta exprese ABH. Nicméně není stále jasné, zda zjišťování přítomnosti A,B, a H antigenu přináší nezávislou prognostickou informaci. Slibný výsledek nebyl pozdějšími studiemi potvrzen <72). Významnou nevýhodou ABH antigenů je chybějící exprese u non-sekretorů, ztráta exprese u těchto jedinců proto nemůže být posuzována. Všeobecně platí, že maligní transformace bývá spojena se zvýšenou expresí krevního antigenu Lewis* Jde o potenciálně užitečný diagnostický test, ačkoliv exprese není závislá na míře histologické diferenciace a hloubce nádorové invaze a její prognostický význam je malý. 1.3.2.2 S NÁDOREM SPOJENÉ ANTIGENY Existuje celá řada antigenů spojených s uroteliálním karcinomem, které jsou detekovatelné pomocí monoklonárních protilátek. Některé z těchto protilátek či jim odpovídajících antigenů slouží jako diagnostické markery. Prakticky pouze T138- antigen má kromě diagnostického i určitý prognostický význam. T-138 je glykoproteinový antigen buněčného povrchu a bývá exprimován u 15 % povrchových a 60 % invazivních tumorů. V případě přítomné exprese T-138 u nemocných s Ta či T1 tumory dochází k progresi onemocnění až v 80 % případů (73). Zvýšená exprese T-138 je spojena s rizikem vzniku metastáz (74), pro vznik metastáz přináší T-138 nezávislou prognostickou informaci. 1.3.2.3 ONKOGENY Onkogen, jak již bylo uvedeno výše, vzniká abnormální aktivací protoonkogenu, který je normální součástí genomu buňky. Inzulty vedoucí k abnormální aktivaci protoonkogenu mohou být bodové, inserční či deleční mutace, translokace a ztráta alel, které vedou ke vzniku maligního fenotypu, ať už zvýšením exprese normálního produktu genu nebo expresí proteinového produktu s poškozenou funkcí (75 '. Zvýšení exprese může být způsobeno amplifikací genu nebo chromozomální translokací genu do místa genomu pod vlivem silného promotoru. Exprese mutovaného proteinového produktu genu může rovněž vést k deregulaci kontrolních mechanismů buněčného růstu. 23

. tarattff* tm thammr ancpr 1.3.2.3.1 c-h-ras O mutaci H-ras se předpokládalo, že se účastní při vzniku progrese karcinomu močového měchýře. Poškození kodonu 12 a 61 ras onkogenu se vyskytuje až u 20 % karcinomů močového měchýře (76). Rovněž byla zjištěna statisticky významná souvislost mezi zvýšenou expresí c-h-ras a časnou recidivou povrchového karcinomu močového měchýře (77). Nicméně tento prognostický vliv nebyl potvrzen následujícími studiemi (78 79). 1.3.2.3.2 c-myc Rodina genů c-myc kóduje jaderné fosfoproteiny se schopností vazby na DNA, která je důležitá pro regulaci buněčné proliferace (80). Regulace aktivity c-myc probíhá prostřednictvím komplexu heterodimerických interakcí s dalšími proteiny jako Mad a Max (81). Prognostická hodnota genu c-myc u karcinomu močového měchýře zůstává kontroversní. Imunohistochemicky zjišťovaná zvýšená exprese produktu genu c-myc korelovala s mírou histologické diferenciace tumoru. Rovněž byla zjištěna souvislost mezi zvýšenou expresí produktu c-myc a Ki-67 (82). Nicméně nezávislá prognostická hodnota zjištěna nebyla (83). K určení skutečné prognostické hodnoty exprese genu c-myc u karcinomu močového měchýře bude třeba provést další studie. 24

1.3.2.3.3 c-erb-b2 Ve dvou studiích byla zjištěna korelace mezi imunohistochemicky zjišťovanou zvýšenou expresí produktu c-erb-b2 a vzrůstajícím nádorovým grade, nádorově specifickým přežitím a vznikem metastáz. Podle mutlivariantní analýzy vyšetření produktu c-erb-b2 přineslo nezávislou prognostickou informaci ve vztahu k nádorově specifickému přežití (84). Podle jiných studií toto vyšetření nepřináší při srovnání s mírou histologické diferenciace a hloubkou nádorové invaze žádnou další prognostickou informaci (85 86). 1.3.2.3.4 mdm-2 Imunohistochemicky zjišťovaná zvýšená exprese mdm-2 proteinu bývá přítomna u 20-30 % karcinomů močového měchýře. Podle dřívějších studií nebyl zjištěn u nemocných léčených cystektomií prognostický význam mdm-2. Nicméně při současném hodnocením mdm-2 a p53 multivariantní analýzou byla exprese mdm-2 nezávislým prognostickým faktorem pro progresi a přežití (8 \ 1.3.2.4 TUMOR SUPRESOROVÉ GENY Tumor supresorové geny za normální situace negativně ovlivňují buněčný cyklus. Jejich porucha umožní buňce nekontrolované dělení a proliferaci typickou pro nádorový růst. Využití technik jako analýza ztráty heterozigozity (LOH) a komparativní genomická hybridizace umožnilo u karcinomu močového měchýře identifikaci několika potenciálních tumor supresorových genů, které pokud jsou inaktivovány vedou k expresi maligního fenotypu. U invazivního karcinomu močového měchýře s vysokým nádorovým grade byla nalezena delece krátkého raménka chromosomu 3 a 8 (88). Podle jiné studie delece 8p byla patrná u více než 50 % invazivních karcinomů močového měchýře, zatímco u povrchových karcinomů nalezena nebyla. Delece na chromosomu 9 je nejčastější chromosomální aberací u karcinomu močového měchýře (89). Delece na chromosomu 9 jsou patrné u povrchových i invazivních karcinomů, proto se uvažuje o tom, že tato porucha je časnou událostí v molekulární patogenezi uroteliálního karcinomu (89). Většina delecí postihuje lokus 9p21, který kóduje tři různé proteiny p16, p14 a p15. Každý z těchto proteinů funguje jako negativní regulátor buněčného cyklu, proto jsou považovány za tumor supresorové geny V současné době probíhají studie hodnotící proteiny p14, p15 a p16 jako markery maligního potenciálu. Ztráta heterozygosity v lokusu 13q14 je spojena s absencí exprese RB proteinu (91). Genetické defekty v lokusu 17p13 souvisí s expresí proteinu p53 (92). O p53 a RB genu bude pojednáno níže. 25

G1 arrest Cyclin D1 i \ CDK4I- Oncogenic ras Pceitive growth stimuli F INK4A/ARF ^ pí6 ona lccua->two pí4 I MDM2 proteins E2F1 Progression to S 1.3.2.4.1 RETINOBLASTOMA-TUMOR SUPRESOROVÝ GEN (Rb) Rb gen byl vůbec prvním objeveným tumor supresorovým genem. Ve své fyziologické aktivní formě Rb gen kóduje fosfoprotein (prb), který zastavuje buněčný cyklus v kontrolním bodě mezi G1 a S fází buněčného cyklu, tím že se váže na řadu buněčných proteinů včetně transkripčního faktoru E2F. Inaktivace Rb byla popsána jako důležitý krok v karcinogenezi a progresi mnoha tumorů (88). Bylo zjištěno, že ztráta heterozygosity (LOH) v Rb lokusu významně korelovala se ztrátou exprese Rb (91). Několika studiemi bylo prokázáno, že porucha funkce je spojena s vyšší hloubkou nádorové invaze a nižší mírou histologické diferenciace (vyšším nádorovým grade) (93). V souboru 38 nemocných s invazivním uroteliálním karcinomem bylo patrné signifikatní snížení pětiletého přežití v případě poškození Rb proteinu (94). Srovnatelné výsledky publikoval Logothetis na souboru 43 nemocných s invazivním karcinomem močového měchýře (95). Při imunohistochemickém vyšetření 45 T1 tumorů močového měchýře bylo překvapivě zjištěno, že jak ztráta Rb, tak i zvýšená exprese proteinu byla spojena se zhoršením přežívání bez progrese onemocnění. Proto oba výsledky barvení byly považovány za abnormální (96). U nemocných s abnornální expresí buď Rb či p53 nebo obou byl zaznamenán signifikantní vzestup procenta progresí onemocnění. Doporučení autorů bylo, že nemocní s normální proteinovou expresí obou genů mohou být léčeni konzervativně, zatímco nemocní s poškozením jednoho či zejména obou genů, vyžadují agresivnější způsob léčby. 1.3.2.4.2 p53-tumor SUPRESOROVÝ GEN Jednou z hlavních funkcí genu p53 je regulace průběhu buněčného cyklu. Abnormální funkce TP53 nejen že vede k pokračování buněčného cyklu, ale zabraňuje rovněž buňkám s abnormální DNA v naprogramované buněčné smrti, apoptóze. Důsledkem toho je pak progresivní genomová nestabilita, proto je abnormální funkce p53 patrná často v souvislosti s tumory s nízkou úrovní histologické diferenciace (vysokým grade), u kterých dochází k dalším genetickým a epigenetickým změnám usnadňujícím proces nádorové invaze a metastazování. TP53 mutace patří mezi nejčastější genetické změny u lidských nádorů, vyskytuje se zhruba u poloviny všech lidských malignit (97). Bodové mutace TP53 mají obvykle charakter mutací měnících smysl kodonu a vedou k substituci aminokyseliny ve 26

výsledném proteinu. Následkem takové mutace je změna konformace a zvýšení stability proteinu p53, což se projeví významným prodloužením jeho poločasu. Zatímco poločas fyziologického p53 se pohybuje kolem 20 minut, dochází u jeho patologické formy až k dvacetinásobnému prodloužení poločasu. Výsledkem je vyšší hladina jaderného p53 a možnost jeho detekce imunohistochemicky pomocí protilátek. V současné době se většinou přítomnost více než 10 % jader se zvýšenou expresí p53 je považováno za abnormální nález (92). Díky snadnému provedení se imunohistochemické vyšetření stalo nejčastěji používanou metodou detekující patologii p53. Je třeba si uvědomit, že normální imunohistochemický nález neprokáže každou poruchu TP53. U mutací, kdy je produkován zkrácený nebo nestabilní protein, nebo v případech nepřítomnosti obou alel, kdy není produkován žádný p53 protein, je imunohistochemický nález negativní. Tyto situace však představují jen méně než 15 % mutací TP53 (98). Podle studií srovnávajících imunohistochemické stanovení p53 s přímým průkazem mutací sekvencováním DNA byla prokázáno, že jaderná akumulace p53 proteinu koreluje s množstvím mutovaného p53 genu {92). Tím byla současně prokázána i vysoká spolehlivost imunohistochemického vyšetření (99) Stanovení změn TP53 tak může být nepříznivým prognostickým ukazatelem. U karcinomu močového měchýře jsou mutace TP53 spojeny s vyšším stupněm histologické diferenciace tumoru s pokročilejší hloubkou nádorové invaze, u povrchového nádoru s rizikem progrese do infiltrující formy. Navíc zvýšená jaderná exprese p53 se jeví nezávislým prediktorem nádorové progrese a zkráceného přežívání po radikální cystektomii (100). Významná část aneuploidních tumorů v provedených studiích byla p53 pozitivních, zatímco většina povrchových tumorů vykazovala menší p53 pozitivitu. Nádory s přítomností patologického p53 měly rovněž větší růstovou frakci než nádory s normálním proteinem Posuzováním rizika recidivy a progrese povrchových nádorů močového měchýře ve vztahu k TP53 se zabývala řada prací. Jejich výsledky však rozhodně nejsou jednoznačné. Ztráta aktivity TP53 u tumorů Ta, T1 a Tis je v tomto případě spojována s předpokladem jejich budoucího agresivního chování (102). Obecně platí, že u povrchových karcinomů je mutace TP53 ve srovnání s invazivními karcinomy mnohem méně častá. Doposud bylo publikováno pouze málo prací hodnotící prognostický význam p53 u karcinomů Ta. Šlo většinou o retrospektivní studie s malým počtem pacientů, proto zůstává i nadále nejasné, zda je vůbec vhodné expresi p53 u Ta karcinomů vyšetřovat (28,103). Ve srovnání s Ta karcinomy, je studií hodnotících prognostický význam jaderné akumulace u T1 karcinomů nepoměrně více. Pacienti s T1 karcinomem a zvýšenou expresí p53 mají vyšší riziko progrese tumoru (104). U nemocných po radikální cystektomii pro pt1 karcinom byla zjištěna souvislost mezi p53 jadernou akumulací a snížením přežití (105). Při provedení subklasifikace T1 karcinomů bylo zjištěno, že míra exprese p53 s hloubkou nádorové invaze vzrůstá (u T1a tumorů je nižší). Ve vztahu k přežití byla exprese p53 prognostickým faktorem jen podle univariantní analýzy, podle multivariantní analýzy byla nezávislým prognostickým faktorem pouze hloubka nádorové invaze do lamina propria (106). Nicméně existují i studie, podle kterých vyšetření exprese p53 u T1 karcinomů nepřináší prognostickou informaci (107). U nemocných s TIS je p53 mutace a zvýšená exprese p53 při imunohistochemickém vyšetření přítomna častěji. Zvýšená exprese p53 u nemocných stis byla jediným nezávislým predikátorem progrese a byla spojena se zkrácením pro nemoc specifickým přežitím (108). 27

U nemocných s invazivním karcinomem je p53 mutace a zvýšená exprese ve srovnání s povrchovými karcinomy častější. Mnoha studiemi bylo zjištěno, že zvýšená exprese p53 byla spojena se špatnou prognózou, korelovala s vyšší hloubkou nádorové invaze a mírou histologické diferenciace, vznikem metastáz a zkrácením přežití (105). Existuje nejednoznačný názor na to, zda p53 pozitivita je nezávislým prognostickým faktorem. V rozsáhlé retrospektivní studii u nemocných s invazivním tumorem byla jaderná akumulace p53 (větší než 10 %) nezávislým prognostickým faktorem pro progresi onemocnění, kdy pomocí multivariantní analýzy byl hodnocen význam p53 exprese, hloubky nádorové invaze a míry histologické diferenciace nádoru (1. Lipponen zjistil, že zvýšená jaderná akumulace p53 v souboru 212 nemocných s invazivním karcinomem močového měchýře, přinášela podle univariantní analýzy nezávislou prognostickou informaci ve vztahu k progresi onemocnění, nikoliv však podle multivariatní analýzy. Stein potvrdil Esringovy výsledky, kdy na souboru 243 nemocných s invazivním karcinomem močového měchýře, kteří byli léčeni uniformně radikální cystektomií, byla p53 exprese jediným nezávislým prognostickým faktorem pro progresi onemocnění při použití multivariantní analýzy. Hodnocen byl p53 stav, nádorový grade a hloubka nádorové invaze (105). Jinými studiemi však při použití multivariatní analýzy hodnotící p53 stav, míru histologické diferenciace tumoru a hloubku nádorové invaze nebylo prokázáno, (87, 101, že by jaderná akumulace p53 přinášela další prognostickou informaci 109). Výsledky studií zabývajících se schopností předpovědět recidivu onemocnění po cystektomii, případně předpovědět délku přežití jsou tedy opět nejednoznačné. Vzhledem k blokádě apoptózy při inaktivaci TP53 lze předpokládat i horší odpověď na některé druhy léčby, zvláště chemoterapii nebo radioterapii. Logicky se proto nabízí úvaha, že poškození TP53 s následnou blokádou apoptózy je možnou příčinou rezistence na příslušný druh léčby. Záchyt mutace nebo patologického proteinu p53 tedy teoreticky může předpovědět nedostatečný účinek té které terapeutické metody. Provedené studie však opět nedospěly k jednoznačným výsledkům (110 ' 111). Pozornost byla věnována rovněž schopnosti imunohistochemického stanovení p53 předpovědět efektivitu intravezikální imunoterapie BCG vakcínou. Ze závěrů je zřejmé, že výsledek vyšetření p53 před zahájením léčby nedokáže předpovědět její účinnost (112 113). Přínosnější je toto vyšetření u pacientů s perzistujícím tumorem po šesti aplikacích, kde je považováno přetrvávání p53 imunopozitivity za prognosticky velmi nepříznivý faktor (114). P53 stav by mohl pomoci vyselektovat nemocné vhodné k opakovaní intravesikální léčby BCG či naopak k indikaci časné cystektomie. Navzdory velkému počtu publikací přesná hodnota p53 jako prognostického markeru, stále nebyla jednoznačně určena. Při hodnocení všech dostupných publikací o p53 jaderné akumulaci a jejího vztahu k prognóze nemocných s karcinomem močového měchýře byly konstatovány značné rozdíly mezi jednotlivými pracemi, zejména technického rázu jako například výběr protilátky, použití různých hraničních hodnot při hodnocení p53 akumulace, selekce nemocných a struktura prací (115). Na hodnocení p53 je patrné, více než na hodnocení jakéhokoliv jiného markeru, že provedení dalších retrospektivních studií nevyřeší problém, a že je třeba jednak standardizace metodiky zjišťování p53 jaderné akumulace, stejně jako provedení multicentrické prospektivní studie, která do současné chvíle realizována nebyla (100). Dle některých studií se zdá, že by detekce mutací genu TP53 mohla dosahovat lepších výsledků, než imunohistochemické stanovení jeho proteinového produktu (116). Ani zde však názory nejsou úplně jednoznačné, limitující je navíc cena, nutnost špičkového laboratorního zázemí i délka trvání vyšetření. 28

1.3.2.4.3 p21 Inhibitory cyklin dependentních kináz (ICK) brání fosforylaci kritických substrátů jako Rb proteinu a tím vlastně blokují kaskádu dějů vedoucí k proliferaci buňky. Ze skupiny ICK byly jako prognostické markery pro karcinom močového měchýře vyšetřovány p21 a p27. Na rozdíl od p53 či Rb, mutace p21/waf1 stejně jako p27/kip1 jsou u karcinomu měchýře poměrně vzácné. Jak již bylo zmíněno, imunohistochemicky zjištěná jaderná akumulace p53 může u nemocných s uroteliálním karcinomem močového měchýře sloužit jako významný marker nádorové progrese a přežití. Nicméně ne všechny karcinomy měchýře s alterací p53 recidivují či progredují (97). Působení p53 na regulaci buněčného cyklu je zčásti zprostředkováno pomocí aktivace p21/waf1. p21 se následně váže a tím inhibuje CDK2, protein, který je nezbytný pro přechod do další fáze buněčného cyklu. Porucha funkce p53 má za následek ztrátu exprese p21, což vede k deregulovanému buněčnému dělení. Nicméně bylo prokázáno, že exprese p21 může být regulována i jinými, na p53 nezávislými způsoby, které mohou udržovat expresi p21 navzdory porušené funkci p53. Tak teoreticky p21 může přinášet pomocnou prognostikou informaci k samotné p53 pozitivitě. Klinická data týkající se p21 jsou velmi protichůdná a očividně komplexnější, než se původně myslelo. Stein imunohistochemicky určil expresi p21 a p53 u 242 nemocných s karcinomem měchýře léčených cystektomií. Při použití multivariantní analýzy byl p21 nezávislým prediktorem recidivy onemocnění a přežití. Nemocní s alterovaným p53/p21 negativním tumorem měli vyšší procento recidiv a horší přežití při srovnání s nemocnými s nádorem p53 alterovaným/p21 pozitivním (1 \ Rovněž u 96 nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem měl p21 při použití multivariantní analýzy nezávislou předpovědní hodnotu pro snížení celkového přežití (118). V těchto studiích zvýšená p21 exprese rušila nepříznivý vliv alterace p53 na progresi karcinomu močového měchýře. Na rozdíl od těchto studií Lipponen popsal lepší prognózu pro Ta/T1 tumory s nízkou mírou p21 pozitivity, i když tento vztah nedosahoval statistické významnosti (119). V pozdější studii stejných autorů je uvedeno, že imunohistochemické stanovení p21 nepřináší žádnou další prognostickou informaci ve srovnání sjiž zavedenými prognostickými faktory pro předpověď vzniku progrese onemocnění. Navíc zvýšená exprese p21 (>10%) byla spojena s kratším intervalem bez recidivy u 47 nemocných s povrchovým karcinomem močového měchýře, léčeného šesti-týdenní kúrou instilací BCG (120). Ač je p21 biologicky zajímavý, zatím není jeho úloha v léčbě nemocných s karcinomem močového měchýře zcela jasná. 1.3.2.4.4 p27 V souboru 120 nemocných s uroteliálním karcinomem močového měchýře byla hodnota p27 signifikantně vyšší u povrchových, papilárních, pomalu rostoucích tumorů s nízkým grade (121). Nižší exprese p27 souvisela s mírou histologické diferenciace, hloubkou nádorové invaze, s horším celkovým přežitím a přežitím po recidivě onemocnění (122). Navíc podle multivariantní analýzy měl u invazivních tumorů močového měchýře stav Ki-67/p27 vliv na přežití. U nemocných 29

s povrchovým karcinomem močového měchýře ztráta p27 exprese s četností recidiv i progresí tumoru (123). korelovala 1.3.2.5 MOLEKULY BUNĚČNÉ ADHEZE Buňky udržují svůj vztah navzájem prostřednictvím řady buněčných adhezivních struktur, které pojí buňky navzájem a současně i k extracelulární matrix. Důležitou součástí tohoto vzájemného působení jsou cadheriny, integriny, selektiny, buněčné adhezivní molekuly podobné imunoglobulínům, dále desmosomy a hemidesmosomy. Tyto molekuly jsou zahrnuty do mnoha buněčných funkcí mezi něž patří transdukce signálů, buněčná komunikace a rozpoznávání, embryogeneze, zánětlivá a imunitní odpověď, a apoptóza (124). Molekuly buněčné adheze se u mnoha lidských tumorů podílejí na nádorové invazi a procesu metastazování. U nádorů močového měchýře byly podrobně studovány cadheriny a integriny, struktura a funkce desmosomů a hemidesmosomů je odhadována stále podle výsledků in vitro studií (125). 1.3.2.5.1 CADHERINY Cadheriny patří do rodiny transmembránových glykoproteinů, které jsou zásadní pro vytvoření a udržování mezibuněčných vazeb. Geny pro cadheriny mohou fungovat jako tumor supresorové geny (126). Molekuly cadherinů byly původně identifikovány jako systém kalcium dependentních intercelulárních molekul, které se vzájemně váží homodimerizací (127). Cadheriny se dělí do různých podtříd, nicméně pro všechny je společná základní struktura, které se skládá z části extracelulární, transmembránové a intracelulární. Nitrobuněčná část cadherinů je ve vazbě na cytoskelet prostřednictvím proteinů známých jako cateninový komplex (128). Jsou známy 4 podtřídy charakterizované jako L-CAM (liver cell adhesion molecule), cadherin P (placentral), N (neural) a E (epithelial). Ztráta cadherinem zprostředkované adhese je důležitým krokem v progresi mnoha karcinomů a tato ztráta je nepříznivým prognostickým znamením (129 T Bylo prokázáno, že snížení imunohistochemicky zjišťované exprese E-cadherinu koreluje s pokročilostí nádorové invaze do svaloviny a přítomností vzdálených metastáz (30), stejně s vyšším nádorovým grade a obecně hloubkou nádorové invaze (131). Dalšími studiemi bylo zjištěno, že exprese E-cadherinu korelovala s celkovým přežitím a přežitím bez návratu choroby (129). U nemocných s tumorem in situ močového měchýře exprese E- cadherinu korelovala s recidivou a progresí onemocnění a s přežitím specifickým pro nádor. Exprese E-cadherinu by tak mohla pomoci určit nemocné s TIS, kteří by mohli mít prospěch z časné cystektomie (132). Podle multivariantní analýzy při současném hodnocení míry histologické diferenciace a hloubky nádorové invaze však vyšetření exprese E-cadherinu nepřinášelo nezávislou prognostickou informaci ve vztahu k přežití nemocných (131, 133). S cadheriny spojené molekuly, a a p-catenin mají obdobnou prognostickou hodnotu (134). Ztráta exprese y-cateninu byla v souboru 68 nemocných spojena se špatnou prognózou (133). Vyšetření hladiny sérového cadherinů u 40 nemocných s karcinomem močového měchýře korelovalo s nízkou mírou histologické diferenciace, počtem povrchových tumorů v době diagnózy a v případě časné recidivy. Nebyla zaznamenána korelace mezi vysokou hladinou sérového cadherinů a nálezem abnormální exprese E-cadherinu v primárním tumoru. 30

Solubilní E-cadherin byl detekován rovněž v moči zdravých jedinců a nemocných s tumorem močového měchýře. Ačkoliv byla koncentrace signifikantně větší ve skupině nemocných s tumorem, vyšetření E-cadherinu nemá větší hodnotu než vyšetření celkového močového proteinu (135). Navzdory slibným výsledkům, hodnota E-cadherinu jako nezávislého prognostického faktoru nebyla multivariantní analýzou doposud prokázána. 1.3.2.5.2 INTEGRINY Integriny jsou rodinou transmembránových heterodimerických receptorů pro proteiny extracelulární matrix jako je laminin, kolagen a fibronektin. Předpokládá se, že integriny zprostředkují adherenci buněk k těmto substrátům extracelulární matrix (124). Každý integrin je složen z ap-heterodimeru. Bylo popsáno 15 různých a a 9 různých p řetězců, které reagují se specifickými komponenty extracelulární matrix. Podle provedených studií se uvažuje o tom, že porucha integrinů se může podílet na ztrátě mezibuněčné adherence a vzniku agresivního a invazivního tumoru. Nicméně úloha integrinů jako prognostického faktoru pro karcinom močového měchýře musí být teprve stanovena. 1.3.2.5.3 RODINA IMUNOGLOBULINŮ Jde o buněčné adhezivní molekuly důležité pro mezibuněčné interakce či interakce mezi buňkami a extracelulární matrix.. V literatuře je pouze minimum informací o možném prognostickém významu těchto molekul u karcinomu močového měchýře. Ve tkáni karcinomu močového měchýře byla zjištěna snížená exprese C- CAM-1 (cell-cell adhesion molecules) (136). Nicméně ve studii s 53 nemocnými s karcinomem močového měchýře nebyla nalezena žádná korelace mezi imunohistochemickým vyšetřením ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule-1) a klinickými proměnnými (137>. 1.3.2.6 PROTEÁZY EXTRACELULÁRNÍ MATRIX A BASÁLNÍ MEMBRÁNY 1.3.2.6.1 LAMININ-P1 Laminin-P1 je proteolytický fragment laminimu, základního proteinu basální membrány. Degradace basální membrány může vést ke zvýšené sérové hodnotě lamininu-p1. V souboru 38 nemocných s uroteliálním karcinomem močového měchýře sérová hladina lamininu-p1 korelovala s velikostí a počtem nádorů, nikoliv však s mírou histologické diferenciace. Nemocní s vyšší sérovou hladinou lamininu- P1 měli vyšší incidenci recidivy tumoru po 3 měsících od původní operace (138). 31

1.3.2.6.2 CATHEPSIND Při nádorové invazi a procesu metastazování dochází k degradaci extracelulární matrix prostřednictvím proteáz, jako je například cathepsin D. V souboru 177 nemocných s tumorem močového měchýře korelovala imunohistochemicky zjišťovaná exprese cathepsinu D s expresí epidermálního růstového faktoru a frakcí buněk v S-fázi (139). Nicméně exprese cathepsinu D v nádorových buňkách při srovnání s mírou histologické diferenciace a hloubkou nádorové invaze nepřinesla nezávislou prognostickou informaci stran recidivy onemocnění a přežití. Při srovnání několika molekulárních parametrů v souboru 20 nemocných st1g3 nádory měchýře nebyla zjištěna žádná statisticky významná prognostická hodnota imunoreaktivity cathepsinu D (140). Ve studii se 105 nemocnými s karcinomem močového měchýře při hodnocení exprese cathepsinu D univariantní analýzou pro beznádorové a celkové přežití bylo zjištěno, že negativní exprese cathepsinu D byla spojena s horší prognózou. Nicméně pomocí multivariantní analýzy pro celkové přežití zůstala statisticky významná pouze hloubka nádorové invaze 1.3.2.6.3 AKTIVÁTOR PLASMINOGENU UROKINÁSOVÉHO TYPU (u-pa) Aktivátor plasminogenu urokinásového typu je proteáza, která aktivuje plasmin, protein degradující jiné proteázy (142). Exprese u-pa u 52 nemocných s povrchovým karcinomem močového měchýře byla při použití multivariantní analýzy nejdůležitejším rizikovým faktorem pro nádorovou invazi a vznik metastáz, hodnocena byla rovněž hloubka nádorové invaze, míra histologické diferenciace, velikost nádoru a nádorová multiplicita. Navzdory těmto slibným výsledkům, další práce hodnotící u-pa jako prognostický faktor u karcinomu močového měchýře nebyly doposud publikovány. 1.3.2.6.4 MATRIXOVÉ METALOPROTEINÁZY (MMP) Matrixové metaloproteinázy jsou rodinou enzymů, které degradují extracelulární martix či bazální membránu. Mají zásadní roli při nádorovém růstu a procesu metastazování díky tomu, že umožňují migraci a invazivní růst nádorových buněk. Matrixové metaloproteinázy jsou regulovány tkáňovými inhibitory metaloproteináz (TIMP) a aktivujícími matrixovými metaloproteinázami membránového typu (MT-MMP). MMP mohou být detekovány imunohistochemicky ve tkáni, rovněž i ve vzorcích moči. Exprese MMP-2, MMP-9 a TIMP-2 byla zjišťována u 43 nemocných s invazivními tumory měchýře s vysokým nádorovým grade. Většina nádorových buněk byla pozitivní pro MMP-2 a MMP-9, nicméně jejich exprese nekorelovala s klinickým průběhem. Silné zbarvení na TIMP-2 ve stromatu však bylo spojeno s nálezem ztráty bazální membrány a špatnou prognózou (143). Při hodnocení exprese MMP-2, TIMP-2, MT1-MMP pomocí RT-PCR analýzy u 41 nemocných s karcinomem močového měchýře bylo zjištěno, že vysoké hodnoty MMP-2 a TIMP-2 stejně i MT-1-MMP exprese byly významně spojeny s poklesem přežití (144). Při hodnocení sérového poměru MMP-2/TIMP-2 u 97 nemocných s karcinomem měchýře pomocí univariantní a multivariantní analýzy byl tento poměr nezávislým indikátorem pokročilého uroteliálního karcinomu (145). Poměr mezi 32

produkcí a aktivací MMP a jejich inhibicí působenou TIMP je zásadním aspektem nádorové invaze a metastazování. Kombinace různých parametrů tohoto komplexu může v budoucnosti přinést zásadní informace, které pomohou klinickému rozhodování. 1.3.2.7 RECEPTORY PRO RŮSTOVÉ FAKTORY 1.3.2.7.1 EGFR Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) je transmembránový glykoprotein, který je aktivován vazbou epidermálního růstového faktoru (EGF) a transformujícího růstového faktoru (TGF) na svou vnější doménu. Po této aktivaci jsou fosforylovány intracelulární tyrosinové kinázy, což vede k buněčné proliferaci, transformaci a dělení. Receptory pro EGF jsou za normálních okolností rozmístěné pouze podél basální membrány urotelu, zatímco v případě uroteliálního karcinomu jsou rozmístěny ve všech vrstvách <146). EGF wr TŮř-n Itpaid bdroiavlvmaii] I^HWIMIMNUI ÍNH : Tyrrclmi >Jym'm nááwm U karcinomu močového měchýře může být imunohistochemické vyšetření přítomnosti EGFR prognostickým markerem. V souboru 41 nemocných s karcinomem močového měchýře exprese EGFR korelovala s mírou histologické diferenciace tumoru, hloubkou nádorové invaze a ploiditou (147). U 48 nemocných s tumorem měchýře zvýšená exprese EGFR korelovala s četností recidiv, signifikantně kratší dobou do recidivy onemocnění a četností progresí (148). V prospektivní studii s 212 nemocnými s primozáchytem tumoru močového měchýře bylo zjištěno, že EGFR je nezávislým prognostickým faktorem pro přežití a progresi 33

hloubky nádorové invaze. Nicméně v dřívějších studiích vyšetření EGFR nekorelovalo s nádorovou progresí ani přežitím nemocných po cystektomii 1.3.2.8 PEPTIDOVÉ RŮSTOVÉ FAKTORY Růstové faktory se podílejí na buněčné proliferaci a diferenciaci, dále na regulaci angiogeneze a buněčné smrti. Navíc se předpokládá, že růstové faktory podporují nádorový růst a progresi. 1.3.2.8.1 EPIDERMÁLNÍ RŮSTOVÝ FAKTOR (EGF) O prognostickém významu EGF u karcinomu močového měchýře bylo publikováno pouze málo prací. Model for growth factor receptors (EGF, ERB-B-2...) activation Imunohistochemická exprese EGF v souboru 43 nemocných s invazivním karcinomem močového měchýře léčených cystektomii byla přítomna u 45 % nádorů a nekorelovala s přežitím nemocných ' 149). Hladinu EGF je možno vyšetřit metodou RIA i v moči. U 54 nemocných s tumorem močového měchýře byla hladina EGF v moči nižší ve srovnání s hladinou u zdravých kontrol. Důvodem může být zvýšení vazby močového EGF na vysoce exprimovaný EGFR při růstu tumoru. Nicméně nebyla zjištěna korelace mezi hladinou EGF v moči a hloubkou nádorové invaze ani mírou histologické diferenciace (151). 1.3.2.8.2 FIBROBLASTOVÝ RŮSTOVÝ FAKTOR Basický fibroblastový růstový faktor je silný mitogen pro řadu buněčných typů. Podle posledních studií se zdá, že basický FGF ovlivňuje maligní potenciál i karcinomu močového měchýře. U 32 nemocných s pokročilým karcinomem močového měchýře korelovala exprese basického FGF s expresí BCL-2 a s vznikem lokálního recidivy (152). V jiné studii s 69 nemocnými však nebyla zaznamenána žádná korelace mezi expresí bazického FGF a přežitím nemocných (153). Imunohistochemické vyšetření kyselého FGF ve tkáni 50 tumorů močového měchýře ukázalo desetinásobně vyšší míru exprese ve srovnání s nenádorovou tkání. Navíc 34

exprese FGF korelovala s hloubkou nádorové invaze (154). Basický FGF je detekovatelný i v moči. Byla popsána signifikantně vyšší hladina v moči nemocných s tumorem močového měchýře ve srovnání s kontrolami, navíc byla patrná i korelace s hloubkou nádorové invaze (155). 1.3.2.8.3 TRANSFORMUJÍCÍ RŮSTOVÝ FAKTOR-p (TGF-p) TGF-p podporuje růst buněk jako osteoblasty či fibroblasty, na druhou stranu potlačuje epiteliální či endoteliální proliferaci. Rodina proteinů Transforming Growth Factor-beta zahrnuje TGF(31-5, inhibin, aktivin. Jde o inhibitory buněčné proliferace, působí prostřednictvím stimulace nukleárních proteinů p27 a p15, které brání fosforylaci prb prostřednictvím různých cyklin-dependentních kinas. V nádorové tkáni uroteliálního karcinomu byla popsána zvýšená exprese TGF-p, nicméně korelace s mírou histologické diferenciace nebyla patrná ( 6>. V případě karcinomu močového měchýře byla rovněž zjištěna vyšší hladina TGF-p v moči, nicméně korelace s hloubkou nádorové invaze a mírou histologické diferenciace nebyla patrná. Hodnota TGF-p jako prognostického markeru pro uroteliální karcinom močového měchýře nebyla doposud prokázána. Účinek TGF je zprostředkován membránovými receptory pro TGF. Podle imunohistochemického vyšetření exprese receptorů pro TGF-p (TpR-1 a 2) na souboru 59 nemocných s karcinomem měchýře korelovala ztráta exprese TpR-1 a TpR-2 s mírou histologické diferenciace. Nicméně pouze ztráta exprese TBR-1 byla spojena s větší pravděpodobností nádorové progrese a zkrácením přežití ( 7). Podle těchto výsledků by TpR-1 mohl být prognostickým faktorem pro karcinom močového měchýře. 1.3.2.8.4 TRANSFORMUJÍCÍ RŮSTOVÝ FAKTOR-a (TGF-a) Exprese TGF-a ve tkáni karcinomu močového měchýře byla signifikantně vyšší ve srovnání s normální sliznicí. Zvýšená exprese byla patrná u 60 % ze 43 tumorů močového měchýře a byla zjištěna významná korelace mezi TGF-a expresí a přežitím (149). Na jiném souboru 54 nemocných byla popsána korelace mezi TGF-a a expresí EGFR, korelace s přežitím nemocných nebyla patrná (158). 1.3.2.8.5 VASKULÁRNÍ ENDOTELIÁLNÍ RŮSTOVÝ FAKTOR VEGF patří mezi základní promotory nádorové angiogeneze. Dvěma studiemi s 261 a 40 pacienty s tumorem měchýře byla prokázána vysoká hladina VEGF v moči a korelace s mírou histologické diferenciace a četností recidiv (159 ' 160). Korelace mezi expresí VEGF a přežitím nebyla zaznamenána (153). 35

1.3.2.9 MARKERY APOPTÓZY Apoptóza je regulována rodinou proteinů, včetně pro- a anti- apoptotických systémů bcl-2 a bax. Onkogen kódující protein bcl-2 negativně ovlivňuje apoptózu, zatímco homologní protein bax usnadňuje buněčnou smrt tím, že antagonizuje působení bcl-2. Bax-bax-homodimery působí pro-apoptoticky, zatímco bcl-2baxheterodimery působí anti-apoptoticky ( 61). Growth factor withurjwal MslaboMc of coil cycle al>nonmalttle«dna Oanngt Signaling molecules eg ps3bp2, Raf-V calclrwurin Forming channels inmcatutar 11» rn«:smrm IH 0tk»»" m ' i i KDO V souboru 32 nemocných byla při použití semikvantitativní RT-PCR nalezena významná korelace mezi vysokým poměrem bcl-2/bax a relapsem tumoru nezávislá na hloubce nádorové invaze a míře histologické diferenciace. Při hodnocení významu exprese bcl-2 v souboru nemocných s invazivním karcinomem močového měchýře byla exprese bcl-2 a p53 nezávislým prognostickým faktorem pro přežití nemocných (162). Ve studii se 75 nemocnými s tumory T1G2/3 a invazivními tumory nebyl bcl-2 signifikantním prognostickým faktorem pro přežití nemocných (163). Dalším systémem regulujícím apoptózu je Fas/Fas ligandový komplex. Jde o transmembránové proteiny. Působením aktivovaných cytotoxických T-lymfocytů a NK buněk dochází k aktivaci Fas ligandu na buněčném povrchu a následně k indukci apoptózy buněk, které exprimují Fas (164). Zvýšená exprese Fas byla imunohistochemicky detekována u 92 % z 37 nádorů močového měchýře. V jiném souboru se 43 nemocnými s tumorem močového měchýře byla nalezena u 28 % tumorů mutace Fas. (165). Podle těchto výsledků může porucha funkce genu Fas vést ke ztrátě apoptotické funkce buňky. Novým potenciálním markerem apoptózy je její inhibitor survivin. Survivin je exprimován řadou tumorů, nikoliv však zdravou tkání (166). Vyšetřením exprese survivinu ve tkáni 36 tumorů močového měchýře byla zjištěna korelace s mírou histologické diferenciace a četností recidiv, zatímco korelace s expresí p53 a bcl-2 nebyla patrná (167). 36

1.3.2.10 CD44 CD44 je transmembránový glykoprotein bohatě exprimovaný na buněčném povrchu, který se spolupodílí na interakcích mezi buňkami navzájem a mezi buňkami a extracelulární matrix, stejně jako na přenosu signálu přes ras jako odpověď na hyaluronovou kyselinu (168). V nádorové tkáni různých nádorů se běžně nachází několik isoform CD44 (169). Míra exprese varianty CD44v6 klesala se vzrůstající hloubkou nádorové invaze a podle multivariantní analýzy byla nezávislým prognostickým faktorem pro povrchový karcinom močového měchýře. Stejně i nezávisle korelovala s prodloužením přežití u nemocných s invazivním karcinomem močového měchýře (170 >. Ač přesná funkce CD44 zatím stále není známa, zdá se, že CD44 může být důležitým prognostickým faktorem pro karcinom močového měchýře. 1.3.2.11 ANTIGENY SPOJENÉ S PROLIFERACÍ Již dávno bylo pozorováno, že větší procento proliferujících buněk koreluje s agresivitou nádoru. Právě počítání mitóz v zorném poli mikroskopu bylo standardním způsobem určování nádorové agresivity téměř u všech typů nádorů. To zahrnuje i určování nediploidní frakce při průtokové cytometrické analýze, určování zvýšeného množství DNA, syntetizované v S fázi při průtokové cytometrii v exfoliovaných či formalinem fixovaných buňkách, dále i imunohistochemickou detekci antigenů, které jsou exprimovány jen v určité fázi buněčného cyklu, např. proliferating cell nuclear antigen (PCNA) a antigen detekovatelný protilátkou MIB-1, analog Ki-67. 1.3.2.11.1 Ki-67 Ki-67 je antigen přítomný v jádrech proliferujících buněk, nikoliv však v jádrech nedělících se buněk. Antigen se hromadí od G1 fáze do mitosy, kdy jej nalézáme v největší koncentraci (171). Antigen Ki-67 je možno detekovat imunohistochemicky pomocí různých protilátek, nejčastěji pomocí monoklonálních protilátek Ki-67 a MIB-1 (172). Exprese Ki-67 koreluje s vyšší četností recidiv, progresí a kratším intervalem bez recidivy onemocnění. (173). V poslední době přibývá studií, podle kterých je při hodnocení pomocí multivariatní analýzy Ki-67 nezávislý prognostický faktor pro recidivu a progresi onemocnění. Ve studii se 114 nemocnými s uroteliálním karcinomem močového měchýře bylo pomocí multivariantní analýzy identifikováno, že hloubka nádorové invaze, p53 a Ki-67 exprese přináší nezávislou prognostickou informaci ve vztahu k intervalu bez progrese a pro nemoc specifickému přežití. (174). V prospektivní, randomizované studii s 207 nemocnými s povrchovým karcinomem močového měchýře byla srovnávána prognostická hodnota míry histologické diferenciace tumoru, hloubky nádorové invaze, exprese Ki-67, p53 a EGFR. Pomocí multivariantní analýzy mělo pouze MIB-1 skóre a papilární uspořádání nezávislou předpovědní hodnotu pro progresi a pro nemoc specifické přežití. Míra histologické diferenciace měla jako jediná nezávislou předpovědní hodnotu pro recidivu onemocnění (175>. Vjiné studii s214 nemocnými s povrchovým uroteliálním karcinomem byl zkoumán vztah mezi expresí Ki-67 a p53. Podle multivariatní analýzy pouze Ki-67 a multifokalita tumoru přinášely nezávislou prognostickou informaci ve vztahu k recidivě onemocnění. Naproti tomu exprese p53, i navzdory poměrně dobré korelaci s tradičními prognostickými faktory, nepředpovídala recidivu onemocnění 37

(176) Ve stucjjj s 93 nemocnými s povrchovým karcinomem močového měchýře s nízkým grade bylo podle univariantní i multivariantní analýzy Ki-67 jediným významným prognostickým indikátorem pro recidivu onemocnění, hodnocena byla ještě exprese bcl-2 a p53 (177). 1.3.2.11.2 PROLIFERČNÍ JADERNÝ ANTIGEN Proliferační jaderný antigen (PCNA) je protein o němž se uvažuje, že působí jako kofaktor DNA polymerázy-8. PCNA není ideálním proliferačním markerem, a to pro svůj poměrně dlouhý poločas. Po dokončení mitózy je PCNA ještě detekovatelný, ačkoliv se buňka již nedělí (178). Navíc PCNA je nezbytný nejen pro replikaci DNA, ale i pro její reparaci. Tak mohou být buňky PCNA pozitivní, aniž by se právě dělily. U karcinomu močového měchýře byla zaznamenána významná korelace imunohistochemického vyšetření na PCNA a hloubkou nádorové invaze a mírou histologické diferenciace na souboru 26 nemocných (179). Ve studii se 48 nemocnými s povrchovým karcinomem močového měchýře barvení na PCNA korelovalo s recidivou onemocnění a možným vznikem invazivního tumoru (180). 1.3.2.11.3 PROTEINY UDRŽUJÍCÍ MINICHROMOSOMY Proteiny udržující minichromosomy (MCM) jsou komponenty prereplikačního komplexu a zásadní pro buněčné dělení. Při imunohistochemickém vyšetření byla zjištěna nižší exprese u nedělících se či diferencovaných buněk (181). V souboru 68 nemocných s tumorem močového měchýře byla patrná exprese MCM5 v celé vrstvě tumoru, zatímco v normálním urotelu byl MCM5 exprimován pouze ve vrstvě proliferujících bazálních buněk. Exprese antigenu korelovala s mírou histologické diferenciace (182). 1.3.2.12 ANGIOGENEZE A INHIBITORY NÁDOROVÉ ANGIOGENEZE Angiogeneze obecně je proces vzniku nové kapilární sítě z pre-existujících cév, fyziologicky se vyskytuje v embryogenezi či při hojení ran < 183). Nádorová angiogeneze je důležitá nejen pro progresivní nádorový růst, ale rovněž usnadňuje proces metastazování (184 ' 186 >. Doposud bylo identifikováno několik angiogenních růstových faktorů (endoteliální růstový faktor, basický fibroblastový růstový faktor, thymidin fosforylása, transformující růstový faktor a a P), které jsou exprimovány maligními buňkami a působí vznik nové kapilární sítě z kapilár přítomných v přilehlém hostitelském stromatu. K této novotvořené síti kapilár se připojují nádorové buňky, po proteolýze bazální membrány, migraci a intravasaci dochází ke vzniku metastáz (1^7). Z toho vyplývá, že by měl existovat lineární vztah mezi počtem vznikajících metastáz a počtem nádorových buněk, které se dostanou do oběhu, jež je závislý právě na nádorové vaskulární denzitě (188>. Prognostická hodnota angiogeneze je u různých typů nádorů zkoumána od doby, kdy Weidner popsal, že vysoké vaskulární skóre je spojeno se vznikem vzdálených metastáz ( Metodou, která kvantifikuje nádorovou angiogenezi uvnitř nádoru, je stanovení tzv. mikrovaskulární denzity (MVD). Principem je identifikace míst v nádoru s vysokou hustotou cév pod mikroskopem (tzv hot spots) a stanovení 38

maximální mikrovaskulární denzity. Tento způsob je výhodnější než vyšetřování mikrovaskulární denzity v náhodně vybraných místech tumoru, neboť rozsah neovaskularizace uvnitř nádoru bývá rozdílný, přičemž místa s největší angiogenezí se nacházejí typicky v růstových zónách nádoru, zatímco nízká mikrovaskulární denzita bývá v centrálních, nekrotických oblastech nádoru < 189 " 190). Kvantitativní vztah mezi nádorovou angiogenezí a prognózou byl zjištěn u řady lidských nádorů (191194). Obecně platí, že fenotyp nádoru s větší vaskulární densitou je spojen s méně příznivou prognózou ( Řadou recentních studií bylo prokázáno, že zvýšená mikrovaskulární denzita ve tkáni invazivního uroteliálního karcinomu je nezávislým prognostickým faktorem pro progresi karcinomu, nádorově specifické přežití a koreluje s vyšší incidencí lymfatických metastáz ( 196-198). Zvýšená mikrovaskulární denzita může pomoci identifikovat nemocné s invazivním uroteliálním karcinomem, kteří by byli vhodnými kandidáty k adjuvantní chemoterapii (196,197 199). Prognostická hodnota mikrovaskulární denzity u nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře je nejasná. Určení míst s maximální mikrovaskulární denzitou je pro papilární morfologii povrchového uroteliálního karcinomu obtížné (200). 1 Doposud bylo provedeno pouze několik studií zabývajících se prognostickým významem stanovení mikrovaskulární denzity u nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře a v žádné nebyla zaznamenána signifikantní korelace mezi recidivou a progresí nádoru a mikrovaskulární denzitou (199,200). 1.3.2.12.1 THROMBOSPONDIN Thrombospondin-1 je jediným inhibitorem angiogeneze, který byl vyšetřován u karcinomu močového měchýře. Imunohistochemická detekce exprese thrombospondinu-1 v souboru 163 nemocných léčených cystektomií signifikantně korelovala s progresí tumoru a celkovým přežitím nemocných. U nemocných s nízkou expresí thrombospondinu-1 bylo při srovnání se skupinami nemocných s mírnou a vysokou expresí patrné vyšší procento recidiv a snížení celkového přežití. V souboru 63 nemocných léčených cystektomií byl thrombospindin-1 nezávislým prognostickým faktorem pro recidivu onemocnění a celkové přežití (201). Informace o nádorové vaskularizaci jsou doposud poněkud heterogenní, nicméně jistě zajímavé a do budoucna slibné. 1.4 ZÁVĚR Pro skupinu nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře platí, že prognostické faktory mají na osud pacienta větší vliv než způsob zvolené léčby. Zdá se rovněž, že ne všichni nemocní s tímto onemocněním vyžadují stejný způsob sledování a léčby. Nemocní s nízce rizikovými tumory (primární, solitární malý ptag1 tumor) mají excelentní prognózu ve vztahu k progresi a přežití. Naopak nemocní s vysoce rizikovým tumorem (pta,1, Glll, ptis) mají vysoké riziko nádorové progrese a následné smrti v souvislosti s karcinomem močového měchýře. Všechny běžně používané prognostické faktory lze získat prostřednictvím anamnézy, cystoskopie, transuretrální resekce a následného patologického vyšetření. 39

Molekulární prognostické faktory jsou bohužel stále používány jen v rámci různých studií. Ideální nádorový marker by měl být objektivní, měl by vypovídat nezávisle a měl by přinášet prognostickou informaci srovnatelnou s tou, kterou přináší histopatologické vyšetření či zobrazovací vyšetření. Navíc by měl předpovídat přirozený vývoj jak léčených, tak neléčených nádorů, stejně i úspěch léčby. Vyšetřování nádorových markerů je možné provést několika různými technikami. Imunohistochemická detekce je nejrozšířenější, je relativně levná a kvantifikace je proveditelná poměrně jednoduchým způsobem. Nicméně výsledky studií různých autorů je třeba hodnotit opatrně, neboť imunohistochemické vyšetření je mnohastupňový proces. Může být použita řada různých protilátek v různých koncentracích, dále různá doba inkubace. Pro správnou a shodnou aplikaci imunohistochemické detekce je nutná standardizace metod. Počítačové zpracování obrazu může zlepšit reprodukovatelnost jednotlivých vyšetření. Navzdory velkému pokroku v základním výzkumu zatím nebyl nalezen molekulární prognostický marker, který by přinášel jednoznačně lepší prognostickou informaci než histopatologická klasifikace. Přesný význam většiny v současné době dostupných markerů musí být určen pomocí velkých prospektivních srovnávacích studií. Exprese Ki-67 se zdá být nejslibnějším molekurálním prognostickým faktorem pro předpověď recidivy a stejně i progrese karcinomu měchýře. Vyšetření exprese p53 je podle mnoha studií velmi slibné, nicméně výsledky prací jsou stále velmi heterogenní. Schopnost nádoru růst a invadovat závisí na množství interakcí, které jsou na molekulární úrovni v současné době pozvolna objasňovány. Je nepravděpodobné, že by jediný molekulární marker mohl poskytnout dostatečnou informaci o biologickém potenciálu tumoru. Hodnocení by tedy spíše mělo zahrnovat vyšetření řady molekulárních markerů přístupem jakési baterie testů. Tato strategie může poskytnout přesnější určení nádorového fenotypu, včetně odhadu odpovědi na uvažované způsoby léčby. Na obdobném principu funguje stanovení molekulárního profilu pomocí tumor-specifické DNA micro-array, které zjišťují naráz míru exprese tisíců genů. Takto by měl být stanoven genetický profil, který může odrážet molekulární heterogenitu tumoru. Tento koncept by měl umožnit individualizaci protinádorové léčby. 40

2 CÍL PROJEKTU Cílem projektu je zhodnotit prognostický význam několika různých histopatologických a molekulárních prognostických faktorů, které by pomohly vyčlenit nemocné s agresivní formou povrchového karcinomu močového měchýře, s cílem pro určitého pacienta zvolit co nejvhodnější způsob léčby, stejně jako způsob sledování vedoucí k co nejčasnější detekci případné recidivy či progrese tumoru. 2.1 KONKRÉTNÍ CÍLE PROJEKTU 1. Posoudit prognostický vliv mikrovaskulární density ve tkáni povrchových uroteliálních karcinomů močového měchýře. Zatímco u invazivních karcinomů močového měchýře byl prognostický význam mikrovaskulární density stanoven, u neinvazivních karcinomů bylo o tomto parametru publikováno doposud minimum prací z důvodu obtížnějšího hodnocení mikrovaskulární denzity při papilárním uspořádání neinvazivních karcinomů. Zásadním prostředkem v hodnocení mikrovaskulrání denzity je námi použité počítačové zpracování obrazu umožňující odečtení mikrovaskulární denzity i ve tkáni povrchového uroteliálního karcinomu. 2. Posoudit prognostický význam míry exprese p53 ve vzorcích nenádorové sliznice u nemocných s prokázaným povrchovým karcinomem močového měchýře. Prognostický význam tohoto parametru doposud nebyl zkoumán. 3. Posoudit prognostický vliv exprese genu PAX-5, rovněž ve tkáni povrchových karcinomů močového měchýře. 4. Na souboru pacientů s T1 uroteliálním karcinomem posoudit prognostický význam subklasifikace tumorů a míry exprese fascinu-1. Prognostický význam fascinu-1 u T1 karcinomů močového měchýře nebyl doposud zkoumán. Problematika hodnocených faktorů, stejně i metodika prováděných vyšetření, se v jednotlivých částech projektu liší, proto každá z výše uvedených části projektu je rozepsána zvlášť, s krátkým úvodem do problematiky, popisem metodiky, výsledky a diskusí ke zjištěným výsledkům. 41

3 1 PROGNOSTICKÝ VÝZNAM IMUNOHISTOCHEMICKÉ DETEKCE MIKROVASKULÁRNÍ DENZITY VE TKÁNI TA T1 NÁDORŮ MOČOVÉHO MĚCHÝŘE, VZTAH MIKROVASKULÁRNÍ DENZITY A JADERNÉ AKUMULACE P53 3.1.1 SOUHRN Cíl studie: Posoudit prognostický význam mikrovaskulární denzity ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře a zhodnotit vztah mezi mikrovaskulární denzitou a jadernou akumulací p53. Materiál a metodika: V rámci prospektivní studie byly vyšetřeny vzorky tkáně povrchových uroteliálních karcinomů močového měchýře od 61 pacientů. Imunohistochemický byl prokazován CD34, při jeho pozitivním průkazu v endoteliích se zobrazil obvod cév. Takto barvené preparáty byly vyhodnocovány v obrazově analytickém systému LUCIA. Sledovanými znaky byla průměrná relativní plocha cév na 1/12mm 2 a maximální relativní plocha cév na 1/12mm 2. P53 protein byl detekován pomocí monoklonální protilátky BP53-12-1. K interpretaci nálezů byla použita semikvantitativní metoda McCartyho, intenzita p53 pozitivity byla vyčíslena jako tzv. HSCORE. Všichni pacienti byli následně sledováni a léčeni dle obvyklých schémat, délka sledování byla 18-48 měsíců. Výsledky byly hodnoceny pomocí statistického systému SAS (Cary, USA). Výsledky: V průběhu sledování byla zaznamenána recidiva onemocnění u 39 sledovaných. U 9 z nich došlo k progresi malignity do formy invazivního tumoru. Souvislost mezi mikrovaskulární denzitou, maximální mikrovaskulární denzitou a recidivou tumoru nebyla prokázána. Byla zjištěna souvislost mezi zvýšenou mikrovaskulární denzitou a rizikem progrese onemocnění, která však nebyla statisticky významná. Statisticky významná se v našem souboru ukázala korelace intenzita p53 pozitivity vyjádřená prostřednictvím HSCORE s CD34 mikrovaskulární denzitou (p-0.0493). Závěr: Kvantita imunohistochemického vyšetření mikrovaskulární denzity může být pomocným prognostickým faktorem u nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře. Podle našich výsledků lze předpokládat určitou roli p53 v regulaci angiogenese povrchových uroteliálních karcinomů. KLÍČOVÁ SLOVA: uroteliální karcinom močového měchýře, mikrovaskulární densita, protein p53 3.1.2 ÚVOD Jak bylo uvedeno v obecném úvodu práce je stanovení míst s maximální mikrovaskulární denzitou u povrchového karcinomu močového měchýře pro jeho papilární morfologii obtížné (200). Doposud bylo provedeno pouze několik studií zabývajících se prognostickým významem stanovení mikrovaskulární denzity u nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře a v žádné nebyla zaznamenána signifikantní korelace mezi recidivou a progresí nádoru a mikrovaskulární denzitou < 199 200). 42

Přestože bylo navrženo několik mechanismů, jakými jsou nádorové endoteliální buňky regulovány, přesný mechanismus není stále znám. Předpokládá se vliv tumor superosorových genů (202, 203). TP53 tumor supresorový gen může například regulovat stupeň nádorové angiogeneze díky své schopnosti kontrolovat produkci trombospondinu-1, účinného inhibitoru růstu endoteliálních buněk. Bylo zjištěno, že p53 zvyšuje tvorbu trombospondinu-1 ve fibroblastech. Ztráta divokého typu genu p53 je spojena se vznikem angiogenního fenotypu tumoru a následném (2 nárůstem agresivního chování, což svědčí pro možný vliv p53 na angiogenezi 1). Vztah mezi mikrovaskulární denzitou a jadernou p53 akumulací byl prokázán u invazivního karcinomu močového měchýře (196198). U povrchového karcinomu se tímto vztahem zabývalo pouze minimum prací a souvislost mezi mikrovaskulární denzitou a p53 byla nevýznamná (204). Cílem této studie bylo posoudit četnost mikrovaskulární denzity pomocí imunohistochemického průkazu CD34 ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře, respektive uvážit prognostický význam tohoto ukazatele a dále posoudit vztah mikrovaskulární denzity a mutace genu p53 zjišťované nepřímo imunohistochemicky průkazem proteinu p53 u stejného souboru nemocných. 3.1.3 MATERIÁL A METODIKA 3.1.3.1 VÝBĚR A SLEDOVÁNÍ PACIENTŮ V rámci prospektivní studie byly od ledna 2000 do října 2002 vyšetřeny vzorky tkáně povrchových nádorů močového měchýře od 61 pacientů. Charakteristika souboru je uvedena v tabulce 1. Všichni pacienti byli následně sledováni dle obvyklých schémat zahrnujících pravidelné cystoskopické a cytologické kontroly. Intravezikální chemoterapie nebo imunoterapie byly indikovány dle obvyklých kritérií. Délka sledování byla 18-48 měsíců. 3.1.3.2 METODIKA IMUNOHISTOCHEMICKÉ DETEKCE MIKROVASKULÁRNÍ DENSITY Všichni pacienti měli předoperačně sterilní moč. Pro hodnocení mikrovaskulární denzity byl použit formol-parafinový materiál uroteliálních karcinomů. V histologických řezech z parafinových bloků o tloušťce 4 n byly imunohistochemicky prokázány endotelie pomocí monoklonální protilátky proti CD34 fy Immunotech (obr. 1). Na preparátech byla následně vyhledána (ve zvětšení 40x) místa s nejvyšší vaskulární denzitou (tzv. hot spots). Dvanáct zorných polí ve zvětšení 200x z každého vyšetřovaného preparátu bylo uloženo jako obrazová databáze v systému LUCIA (Laboratory Universal Computer Image Analysis) - Laboratory imaging, Praha. Použit byl mikroskop Microphot FXA, PlanApo 20x1, 9V a RGB kamera JVC TK 1070E. Plocha jednoho obrazu ve zvětšení 20x10 = 103 586 mikrometrů čtverečních. Použitý rozsah měření na dvanácti obrazech znamenal vyšetření přibližně 1 mm 2 nádorové plochy (s výjimkou interpapilárních úseků, které byly vyloučeny pomocí binární masky užité v měření). Pomocí uživatelského programu v systému LUCIA byla vyhodnocena mikrovaskulární denzita (obr. 2-4). 43

Sledovanými znaky byly celková plocha nádoru, průměrná relativní plocha cév na 1/12 mm, maximální relativní cévní plocha na 1/12 mm 2. Hraniční hodnota byla stanovena na CD34 16, na CD34-max 32. 3.1.3.3 METODIKA IMUNOHISTOCHEMICKÉ DETEKCE JADERNÉ POZITIVITY P53 K detekci proteinu p53 byla použita protilátka BP53-12-1. Za pozitivní zbarvení byla použita pouze jaderná imunoreaktivita. Hodnoceno bylo vždy minimálně 200 nádorových jader v několika reprezentativních polích. K interpretaci nálezů byla použita metoda McCartyho v modifikaci dle Bacusové. Tento postup usiluje o vyšší stupeň objektivity využitím počítačové techniky. Jde o semikvantitativní metodu, která bere v úvahu nejen procento pozitivních nádorových buněk, ale rovněž intenzitu pozitivity kvantifikovanou do 4 stupňů (0- negativní, 1- slabě pozitivní, 2- pozitivní distinktně, 3- pozitivní silně). Vyčísluje se tzv. HSCORE, přičemž HSCORE = IPi (i + 1), kde i je některý ze 4 výše uvedených stupňů a Pi kolísá od 0 do 100 %. Výsledkem je číselný údaj dosahující hodnot od 100 do 400. Zcela negativní nález má hodnotu HS 100, nejvyšší možnou hodnotou je pak HS 400. Zpracované preparáty byly zobrazeny v obrazově analytickém systému LUCIA na obrazovce a pomocí programu bylo zařazeno do příslušné skupiny minimálně 200 nádorových jader v několika reprezentativních polích. Hraniční hodnota byla stanovena na HS 200. 3.1.3.4 STATISTICKÉ HODNOCENÍ Veškerá statistická analýza byla vypracována pomocí systému SAS (Statistical Analysis System, SAS version 8.2, SAS Inc., Cary, NC, USA). Funkce přežití bez návratu choroby a časy do progrese byly porovnány pomocí Log-Rank testu a Wilcoxonova zobecněného testu. Metoda dle Kaplana-Meiera (zvaná též product limit method) byla užita pro odhad funkcí přežití. Porovnání středních poloh dvou distribucí bylo provedeno pomocí ANOVA testu nebo dle Wilcoxonova nepárového testu. Souvislost mezi nominálními parametry byla testována x-kvadrát testem. Všechny testované hypotézy byly oboustranné a předem byla zvolena hladina významnosti a = 0,05. Všechny testované hypotézy H 0 vs. Hi byly formulovány před sběrem dat a nebyla užita žádná z metod adjustace pro mnohonásobná porovnávání. Pro statistické účely hloubka nádorové invaze byla definována jako Ta a T1, míra histologické diferenciace jako G1, G2 a G3, multiplicita jako mnohočetný a solitární. Recidiva byla definována jako histologický průkaz uroteliálního karcinomu v močovém měchýři. Progrese byla definována jako vznik nádoru s invazí do svaloviny detrusoru. 3.1.4 VÝSLEDKY V průběhu sledování byla zaznamenána recidiva onemocnění u 39 sledovaných. U 9 z nich došlo k progresi malignity do formy invazivního tumoru. Průměrné hodnoty HSCORE a mikrovaskularní denzity zjišťované pomocí CD34 a jejich vztah k dalšímu průběhu onemocnění ukazuje tabulka 2. 44

Souvislost mezi mikrovaskulární denzitou, maximální mikrovaskulární denzitou a vznikem recidivy tumoru nebyla prokázána. Souvislost mezi mikrovaskulární denzitou a progresí nebyla zjištěna. Zaznamenali jsme určitou souvislost mezi maximální mikrovaskulární denzitou a progresí tumoru, viz. tabulka 2. Ačkoliv nedosahovala statistické významnosti (p-0,0630), na větším souboru by mohla být statisticky významná. Míra jaderné akumulace p53, vyjádřená prostřednictvím HSCORE, v našem souboru korelovala s rizikem recidivy (p-0,0156) i rizikem progrese tumoru (p- 0,0075). Statisticky významná se v našem souboru ukázala korelace HSCORE s CD34 mikrovaskulární denzitou (p-0.0493), což může svědčit pro určitou roli p53 v regulaci angiogenese povrchových uroteliálních karcinomů. Vztah mezi mikrovaskulární denzitou, maximální mikrovaskulární denzitou a přežíváním bez recidivy a progrese tumoru nebyla zjištěna, jak je patrno z Kaplan- Meierových křivek, viz. obr. 5-8 Podle analýzy multivariantním Coxovým modelem proporcionálních rizik, kdy byly jako proměnné použity mikrovaskulární denzita, maximální mikrovaskulární denzita, míra histologické diferenciace a multiplicita tumoru při hodnocení předpovědi rizika recidivy tumoru žádný z analyzovaných parametrů nedosahoval statistické významnosti. Podle provedené analýzy pouze míra histologické diferenciace tumoru byla nezávislým prediktorem nádorové progrese. Signifikantní vliv na riziko progresí nebyl zjištěn ani pro CD34, ani pro CD34-max, nicméně CD34-max vede k p-value 0.0977, což by mohlo být na větším souboru významné, viz. tabulka 3 3.1.5 DISKUSE Řadou recentních studií bylo prokázáno, že zvýšená mikrovaskulární denzita ve tkáni invazivního uroteliálního karcinomu je nezávislým prognostickým faktorem pro progresi karcinomu a nádorově specifické přežití (19é - 198). Nicméně prognostická hodnota stanovení mikrovaskulární denzity u nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře zůstává stále nejasná. Jedním z důvodů je fakt, že metodika stanovení mikrovaskulární denzity nebyla doposud standardizována, což znesnadňuje srovnávání jednotlivých studií a určení jejich důvěryhodnosti (204). U povrchových, papilárních karcinomů močového měchýře je navíc přesné hodnocení vaskularity obtížné, protože každá papilární struktura obsahuje svoje vlastní fibrovaskulární jádro a je těžké určit která část tumoru má být hodnocena <196). Námi použité počítačové zpracování obrazu nám však umožnilo hodnotit mikrovaskulární denzitu i v preparátech z povrchových karcinomů močového měchýře. Neovaskularizace se zřejmě v tumorigenezi karcinomu močového měchýře uplatňuje poměrně časně, pro což svědčí nález při použití flurescenčních angiografie, kdy se u papilárních karcinomů močového měchýře a rovněž u tumoru in situ zobrazuje zvýšená vaskularita (205). Obecně platí, že porozumění regulaci nádorové angiogeneze má zásadní důležitost, neboť identifikace specifických enviromentálních a genetických faktorů zodpovědných za regulaci neovaskularizace u jakékoli dané malignity usnadní vývoj nových léčebných strategií, které budou ovlivňovat vaskularitu nádoru. V případě povrchového karcinomu močového měchýře by měly vést ke snížení četnosti recidiv a progresí. Na fibrosarkomovém modelu bylo prokázáno, že inaktivace tumor supresorového genu p53 vede k zvýšené produkci induktorů a snížené produkci inhibitorů, jejímž výsledkem je nastavení rovnováhy ve prospěch neovaskularizace (206). Grossfeld prokázal asociaci mutace p53 a zvýšené 45

mikrovaskulární denzity u nemocných s invazivním karcinomem močového měchýře (20D v literatuře je opět pouze minimum prací zabývajících se souvislostí mezi p53 a mikrovaskulární denzitou u nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem. Reiherem byla popsána nevýznamná korelace mezi mikrovaskulární denzitou určenou imunohistochemicky pomocí průkazu CD31 a CD34 a p53, z čehož bylo usuzováno, že p53 není primárním regulátorem angiogeneze v této populaci nemocných, a že způsob regulace je na rozdíl od invazivních karcinomů měchýře odlišný (204). Podle našich dat se zdá, že i u povrchového karcinomu močového měchýře je p53 jedním z možných faktorů, které regulují angiogenezi. Práce byla podpořena granty IGA MZ NC 8095-3/2004 a VZ MSM 111100005. 46

Tabulka 1. Charakteristika souboru. distribuce pohlaví 14 žen, 47 mužů věk 36-90 let (průměrný 67,7 roku) ^délkašled ování 18-48 měsíců (průměrné 28,4 měsíce) předchozí anamnéza 31 primozáchyt nádoru, 30 recidiva r TNM klasifikace 40 Ta, 21 T1 Tíistologická diferenciace 21 G1, 35 G2, 5G3 Tabulka 2. Průměrné hodnoty HSCORE a mikrovaskulami denzity zjišťované pomocí CD34 a jejich vztah k dalšímu průběhu onemocnění. recidiva progrese ano ne P ano ne P HS 224,56 194,51 0,0156 242,85 201,87 0,0075 CD34 10.656 9.88 0.5311 12.42 10.033 0.1356 CD34max 23.035 23.142 0.9673 28.268 22.115 0.0630 Tabulka 3. Multivariantní Coxův model proporcionálních rizik předpovídající riziko recidivy a progrese recidiva progrese hazards ratio P hazards ratio CD-34 1.044 0.2326 1.087 0.1689 CD-34 max 1.008 0.6374 1.050 0.0977 míra histologické diferenciace 1.438 0.1760 9.960 0.0007 nádorová multiplicita 0.987 0.8288 1.029 0.7808 47

Obr. 1: Imunohistochemické zobrazení endotelií pomocí monoklonální protilátky proti CD34. Image dit Jransform Ptepiocess Binary Measure Reference Macro View Help Classifier K^-r w vih - O r - Contiatt(85.0.224); ri syv. -.?«1130 x 830 um [506.58] rgb:232,231.236 48

Obr. 2: Vyhodnocení mikrovaskulární denzity pomocí uživatelského programu v systému LUCIA. Odstranění interpapilárních úseků JutstatUy Reclangle.7.BG Hr.lt-.ifv;. I 1 i 1,'.0*M.A.B.1 9.R.Sti.,.-. I.U.C.t t n: Image dit Jiansfotm Piepiocess Binary Measure Reference Macro View Help Classifier Tools Undo ImageEditO [408.234] rgb:211.217.225 49

Obr. 3: Vyhodnocení mikrovaskulární denzity pomocí uživatelského programu v systému LUCIA. Zobrazení obvodu cév fcf Status: Rectangle.7.BG Hotkeys: F1F12+Q+MM.B.I9.R.Spané T II r I Image Edrt Iransfoim Preprocess fiinaiy Measure Reference Macro View Help Classifier. - u m m ImageEditf) > t I 376 k 277 um [690,374] tgb:213.212.219

Obr. 2: Vyhodnocení mikrovaskulární denzity pomocí uživatelského programu v systému LUCIA. Odstranění interpapilárních úseků Image Edt Irareform Preprocess Bmary Measure Reference Macro yiew Help Classifier r - í i o w nov ijiassiner \t ImageEdilf) 376 x 277 Mm [751.271 ] rgb 21 G.221.234 B Exec- 51

Obr. 5: Kaplan-Meierovy křivky ukazující procento pacientů bez recidivy tumoru (logrank test, p = 0,5969.) zelená - pacienti CD34 < 16 červená - pacienti s CD34 > 16 C034_group-high CD34_group"low» OOO Censored C034_group»high O O O Censored C034_group"lo»» Obr. 6: Kaplan-Meierovy křivky ukazující procento pacientů bez recidivy tumoru (logrank test, p = 0.4843) zelená - pacienti CD34-max < 32 červená - pacienti s CD34-max > 32 1.00 L h '" i 0.50 0.26 ' 1, 'o 0 O * O O O O e-o C034Max_group-high C034nax_flroup"l(m O O C Censored C034*ax_group»high OOO censored C034«ax jjroup-low 52

Obr. 7: Kaplan-Meierovy křivky ukazující procento pacientů bez progrese tumoru (log-rank test, p = 0.9611) zelená - pacienti CD34 < 16 červená - pacienti s CD34 > 16 V) Oi o o o o o e-e e-e- -1-40 -r 50 CD34_group»high C034_group-low O O O censored C034_group»high 0 0 0 Censored C034_group-low Obr.8: Kaplan-Meierovy křivky ukazující procento pacientů bez progrese tumoru (logrank test, p = 0,5334) zelená - pacienti CD34-max < 32 červená - pacienti s CD34-max > 32 B - O Q Oi Oj oco % qqooo e-e - o a e o 40 C034«ax_group-high C034«ax_group"low OOO censored C034«ax_group»hígh 0 0 0 Censored C034nax_group»low> 53

3.2 PROGNOSTICKÝ VÝZNAM P53 POZITIVITY V NENÁDOROVÉ SLIZNICI U PACIENTŮ S TAT1 UROTELIÁLNÍM KARCINOMEM MOČOVÉHO MĚCHÝŘE 3.2.1 SOUHRN Cíl studie: Posoudit míru p53 pozitivity ve vzorcích z nenádorové sliznice u nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře, respektive uvážit prognostický význam tohoto ukazatele. Materiál a metodika: V rámci prospektivní studie byly u 45 pacientů odebrány studené biopsie z nenádorové sliznice v jedné době s TUR povrchového uroteliálního karcinomu. K detekci proteinu p53 byla použita monoklonální protilátka BP53-12-1, vyšetřeno bylo vždy minimálně 200 jader v několika reprezentativních polích. Takto barvené preparáty byly vyhodnocovány v obrazově analytickém systému LUCIA. K interpretaci nálezů byla použita semikvantitativní metoda McCartyho v modifikaci dle Bacusové, intenzita p53 pozitivity byla vyčíslena jako tzv. HSCORE, přičemž platí, že HSCORE = IPi (i + 1), kde i je jeden ze 4 stupňů pozitivity, Pi je procento pozitivních jader. Všichni pacienti byli následně sledováni a léčeni dle obvyklých schémat, délka sledování byla 23-50 měsíců. Výsledky byly hodnoceny pomocí statistického systému SAS (Cary, USA). Výsledky: Recidiva tumoru byla zaznamenána u 30 pacientů, z toho u 7 došlo v průběhu dalšího sledování k progresi onemocnění. Průměrná hodnota HSCORE u nemocných bez recidivy byla 130,2, ve skupině s recidivou 162,5, v podskupině nemocných s následnou progresí 169,2, přičemž hodnota HCORE statisticky signifikantně souvisela s rizikem recidivy onemocnění. Závěr: Míra p53 pozitivity v nenádorové sliznici u nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem může přinášet určitou pomocnou informaci stran předpovědi rizika recidivy onemocnění. Definitivní hodnocení bude možné po provedení rozsáhlejších studií. KLÍČOVÁ SLOVA: uroteliální karcinom močového měchýře, protein p53, nenádorová sliznice, multifokalita. 3.2.2 ÚVOD Mezi vůbec nejčastěji vyšetřované molekulární prognostické faktory patří gen TP53. U karcinomu močového měchýře jsou mutace TP53 spojeny s nižším stupněm histologické diferenciace tumoru (vyšším grade), s pokročilejší hloubkou nádorové invaze, u povrchového nádoru s rizikem progrese do infiltrující formy 000). Navzdory velkému počtu publikací přesná hodnota p53 jako prognostického markeru, nebyla stále jednoznačně určena. (115) Prognostický význam stanovení imunohistochemické exprese p53 ve vzorcích nenádorové sliznice doposud nebyl v literatuře publikován. 54

Jednou z nejvýznamnějších charakteristik karcinomu močového měchýře je četný výskyt synchronní a metachronní multifokality. Bylo již prokázáno, že nemocní (8100) smnohočetným tumorem mají vyšší riziko recidivy. Mechanismus vzniku synchronní a metachronní mutifokality uroteliálního KMM zůstává nejasný. V literatuře byly publikovány dvě základní hypotézy. Podle první je příčinou multifokality migrace nádorových buněk z primárního tumoru do nenádorového urotelu. Tuto teorii podporuje analýza multifokálních a recidivujících tumorů, podle které tyto tumory mají identický klonální původ. < 208-210 > Druhá základní teorie je teorie plošného defektu, která je založena na předpokladu, že do vytváření tumorů je zavzata sliznice jako celek a karcinom močového měchýře může být považován za slizniční onemocnění. Podle této teorie dochází působením karcinogení události k tvorbě mnoha částečně transformovaných buněčných klonů, přičemž pokud v těchto buňkách dojde k dalšímu genetickému poškození, vznikne oligoklonární tumor. < 211-214 > Názor na příčinu multifokality KMM není tedy doposud jednoznačný a měl by být předmětem dalšího zkoumání. Cílem této studie bylo zhodnotit prognostický význam zvýšené exprese p53 v nenádorové sliznici a uvážit, zda může mít určitý vliv při stanovení mechanismu vzniku synchronní a metachronní mutifokality uroteliálního KMM. 3.2.3 MATERIÁL A METODIKA V rámci prospektivní studie byly od ledna 2000 do května 2002 u 45 pacientů s povrchovým uroteliálním KMM vyšetřeny vzorky tkáně nenádorové sliznice. Studená biopsie z nenádorové sliznice byla provedena ve stejné době jako transuretrální resekce (TUR) povrchového KMM. Vzorek z nenádorové sliznice byl odebrán z místa alespoň 3 cm vzdáleného od tumoru močového měchýře. Transuretrální resekce tumoru močového měchýře byla prováděna standardní technikou, vždy byla nejprve resekována exofytická část tumoru, vzorky ze spodiny tumory byly odesílány k histologickému vyšetření separované. Do studie byli zařazeni pouze nemocní s Ta, T1 karcinomem močového měchýře. Nemocní, u kterých histologické vyšetření nepotvrdilo vzorek z nenádorové sliznice a povrchový tumor, byli vyřazeni. Charakteristika souboru je uvedena v tabulce č. 1: Adjuvantní intravesikální léčba byla indikována podle současných doporučení. Intravesikální léčba vakcínou BCG byla podána u nemocných s vysoce rizikovým karcinomem močového měchýře (tumory G3), intravesikální chemoterapie mitomycinem u nemocných se středním rizikem (recidivující G1, G2 tumory), celkem byla léčba vakcínou BCG podána u 13 nemocných, MMC u 2 nemocných. Všichni pacienti byli následně sledováni dle obvyklých schémat zahrnujících pravidelné cystoskopické a cytologické kontroly. Délka sledování byla 23-50 měsíců. 3.2.3.1 IMUNOHISTOCHEMICKÉ VYŠETŘENÍ Metodika imunohistochemické detekce p53 jaderné pozitivity, včetně způsobu semikvantitativního hodnocení, byla popsána v části hodnotící prognostický vliv mikrovaskulární denzity. Hraniční hodnota byla stanovena na HSCORE 160. Viz. obr 1 a 2. 55

3.2.3.2 STATISTICKÉ HODNOCENÍ Veškerá statistická analýza byla vypracována pomocí systému SAS (Statistical Analysis System, SAS version 8.2, SAS Inc., Cary, NC, USA). Funkce přežití bez návratu choroby a časy do progrese byly porovnány pomocí Log-Rank testu a Wilcoxonova zobecněného testu. Metoda dle Kaplana-Meiera (zvaná též Product Limit Method) byla užita pro odhad funkcí přežití. Porovnání středních poloh dvou distribucí bylo provedeno pomocí ANOVA testu nebo dle Wilcoxonova nepárového testu. Souvislost mezi nominálními parametry byla testována x-kvadrát testem. Všechny testované hypotézy byly oboustranné a předem byla zvolena hladina významnosti a = 0,05. Všechny testované hypotézy H 0 vs. Hi byly formulovány před sběrem dat a nebyla užita žádná z metod adjustace pro mnohonásobná porovnávání. Pro statistické účely hloubka nádorové invaze byla definována jako Ta a T1, míra histologické diferenciace jako G1, G2 a G3, multiplicita jako mnohočetný a solitární. Recidiva byla definována jako histologický průkaz uroteliálního karcinomu v močovém měchýři. Progrese byla definována jako vznik nádoru s invazí do svaloviny detrusoru či vzdálených metastáz. 3.2.4 VÝSLEDKY U 35 nemocných (77,7 %) byla ve vzorcích z nenádorové sliznice zjištěna určitá míra exprese p53. U 23 nemocných (51,1 %) byla zjištěna míra exprese vyčíslená pomocí HSCORE rovna nebo vyšší než 160. Tato hodnota byla použita jako hraniční, protože 160 je medián HSCORE zaokrouhlený na desítky. Souvislost mezi mírou exprese p53 v nenádorové sliznici a klinickopatologickými charakteristikami primárního tumoru jako míra histologické diferenciace (p = 0,697) a hloubka nádorové invaze (p = 0,844) nebyla zaznamenána. 3.2.4.1 Korelace mezi mírou exprese p53 v nenádorové sliznici a dalším průběhem onemocnění V průběhu sledování byla zaznamenána recidiva onemocnění u 30 sledovaných. U 7 z nich došlo k progresi malignity do formy invazivního tumoru. Průměrné hodnoty HSCORE a jejich závislost na dalším průběhu onemocnění ukazuje tabulka č. 2: V našem souboru byla zaznamenána statisticky významná souvislost mezi mírou exprese p53 ve vzorcích z nenádorové sliznici a rizikem vzniku recidivy onemocnění při hodnocení (p-value 0,0146). Souvislost mezi rizikem progrese onemocnění a mírou exprese p53 v nenádorové sliznice nedosahovala statistické významnosti (p-value 0,1519), nicméně k progresi onemocnění došlo v průběhu sledování v našem souboru jen u 7 nemocných. Přežití bez recidivy a přežití bez progrese hodnocené metodou podle Kaplan-Meiera ukazuje obrázek 3 a 4. 56

3.2.5 DISKUSE O samotném prognostickém významu stanovení imunohistochemické exprese p53 ve vzorcích nenádorové sliznice u nemocných s povrchovým uroteliálním KMM nebyla doposud publikována žádná práce. Právě zvýšená exprese p53 bývá obecně považována za jednu z nepřímých známek genetické nestability. Zvýšená exprese p53 v nenádorových buňkách pak může být přítomná v onkogenezi KMM ve shodě s danou vícestupňovou genetickou změnou. Takovéto změny na cytogenetické úrovni předcházejí změny patrné při histologickém vyšetření, proto jejich vyšetření může přinést určitou další informaci při odhadování budoucího chování povrchového KMM. Podle našich výsledků je nález zvýšené exprese p53 ve vzorcích z nenádorové sliznice spojen s vyšším rizikem recidivy povrchového uroteliálního karcinomu močového měchýře. K definitivnímu určení jejího významu bude třeba provést rozsáhlejší studie. Doposud nebylo jednoznačně stanoveno, zda je uroteliální karcinom močového měchýře onemocněním celého urotelu nebo zda příčinou multifokality a recidiv KMM je intraepiteliální migrace nádorových buněk a vznik intraepiteliálních implantačních metastáz. Nález genetických změn v nádorových a současně i nenádorových buňkách urotelu v době diagnózy uroteliálního karcinomu podporuje teorii plošného genetického defektu. Srovnávání míry imunohistochemické exprese p53 v tumoru a ve vzorcích z nenádorové sliznice nebylo předmětem naší studie. Toto srovnání provedl A. Pychá, který detekoval zvýšenou expresi p53 jak ve vzorcích z tumoru, tak i ve vzorcích z nenádorové sliznice, přičemž míra exprese v karcinomu byla 3,5x vyšší než ve vzorcích z nenádorové sliznice. (215) Významný byl nález zvýšené exprese i v nenádorové sliznici, který nebyl v dříve publikovaných pracích zjištěn, ač jeho prognostická hodnota nebyla v této práci hodnocena. (216_218) Podle našich výsledků by nález zvýšené exprese p53 ve vzorcích z normální sliznice u skupiny nemocných s časnou recidivou onemocnění spíše svědčil pro to, že příčinou multifokality KMM bude obecná genetická nestabilita přítomná v celém přechodním epitelu již v době diagnózy tumoru. Vzhledem k faktu, že vzorky z nenádorové sliznice byly odebírány ze vzdálených míst od primárního tumoru, je migrace nádorových buněk jako příčina multifokality KMM méně pravděpodobná. Práce byla podpořena granty IGA MZ NR 8934-3 a VZ MSM 0021620808. 57

Tabulka 1 Charakteristika souboru distribuce pohlaví 8 zen, 37 mužů vek 4/ r ~ let (průměrný 68,5 roku) déíka sledování.23^50 měsíců (pmměrné 36 3 měsíce) TNM klasifikace I29T^36J1 histologická diferenciace multifokalita m nohočetný 26, solitární 19 Tabulka 2 Průměrné hodnoty HSCORE a jejich závislost na dalším průběhu počet HSCORE p-value bez recidivy 15 130,2 recidiva 30 162,5 0,0146 progrese 7 169,2 0,1519

Obr 1. Obraz nenádorové sliznice ve světelném mikroskopu, imunohistochemické vyšetření jaderné akumulace p53 59

Obr. 2 Hodnocení preparátů v obrazově analytickém systému LUCIA. Obraz po počítačovém zpracování, semikvantitativní hodnocení jaderné p53 pozitivity. Macro Execution Finished. 752 x 548 pixels (383.143frgb:217.223,228 B 60

Obr. 3 Přežití bez recidivy metodou Kaplan-Meiera. (p-value pro Log-Rank test 0.0135, pro Wilcoxonův test 0.0052). červená - pacienti HSCORE < 160 zelená - pacienti s HSCORE > 160 D ID 11 JD 40 5D ID t ine SIIIHI: imhsciit. I!ip--<15D <=> ^ o Ceisirtd n* I iihs ci IC_ f r a a p=<1 í 0 iiiikscir(.jrnp:)=1i( 000 Cnsíftii nirnhscart_ raap=>=lsd

Obr. 4 přežití bez progrese metodou Kaplan-Meiera. (p-value pro Log-Rank test 0.2236, pro Wilcoxonův test 0.2389, výsledek při použití obou testů není statisticky signifikantní). červená - pacienti HSCORE < 160 zelená - pacienti s HSCORE > 160 D.7S i D.25, SFRfcfA,: narahsccre_ iaup = <1EE> OOO Ceisnied natiih5care_ rbup=<1íd norahscare_ Foup=>=t&D 00 Cnsoitil inihscii(. iiip : > : lit I int 62

3.3 PROGNOSTICKÝ VÝZNAM EXPRESE GENU PAX5 U NEMOCNÝCH S TA T1 UROTELIÁLNÍM KARCINOMEM MOČOVÉHO MĚCHÝŘE 3.3.1 SOUHRN Cíl studie: Posoudit četnost a intenzitu exprese mrna genu PAX5 ve tkáni Ta T1 uroteliálního karcinomu močového měchýře a posouzení vztahu k ostatním klinickopatologickým parametrům a průběhu onemocnění. Materiál a metodika: U 75 nemocných s Ta T1 uroteliálním karcinomem močového měchýře léčených transuretrální resekci (TUR) byla hodnocena míra RNA exprese genu PAX5 pomocí RT-PCR. Všichni pacienti byli zařazeni do sledovacího programu. Byla hodnocena souvislost mezi mírou exprese genu PAX5 a klinickopatologickými charakteristikami tumoru, stejně jako dalším vývojem onemocnění. Kontrolní skupina byla tvořena 8 pacienty operovaných pro benigní hyperplasii prostaty, od kterých byl během operace získán vzorek nenádorové sliznice. Výsledky: Určitá míra exprese genu PAX5 byla zjištěna u 62 nemocných (82,7 %) s karcinomem močového měchýře, naproti tomu v kontrolní skupině exprese PAX5 nebyla zaznamenána. Vysoká míra exprese (větší než 0,2) byla u 19 nemocných (25,3 %). Nebyla zjištěna žádná souvislost mezi mírou exprese a klinickopatologickými charakteristikami tumoru. Tříleté přežití bez recidivy a bez progrese onemocnění u nemocných s vysoce pozitivní expresí bylo 13,2 % a 71,6 % ve srovnání s 40,6 % a 92,8 % u nemocných s nízkou nebo žádnou expresí PAX5 (log-rank test, p= 0,0075, p= 0,022). Podle multivariantního Coxova modelu proporcionálních rizik pouze exprese PAX5 byla nezávislým prediktorem nádorové recidivy. Závěr: Exprese genu PAX5 je častým nálezem ve tkáni povrchového karcinomu močového měchýře. Vysoká míra exprese PAX5 je spojena s horším přežitím bez recidivy a progrese tumoru. Navíc exprese genu PAX5 byla podle multivariantní analýzy nezávislým prognostickým faktorem ve vztahu k riziku recidivy tumoru. KLÍČOVÁ SLOVA: Gen PAX5, uroteliální karcinom močového měchýře, exprese RNA 3.3.2 ÚVOD V současné době je diskutován význam onkogenní aktivity PAX genů. PAX geny kódují rodinu developmentálních transkripčních faktorů, pro které je charakteristické vysoce konzervativní uspořádání 128 aminokyselin, které váže DNA a nazývá se párová doména. Jeden z těchto genů, PAX5, se svou funkcí účastní na vývoji středního mozku a bývá exprimován v časných fázích vzniku B-lymfocytů, kdy dojde k jeho down-regulaci těsně před dokončením vývoje. < 219 ' 22tf) Patologická exprese genu PAX5 byla popsána u maligních onemocnění výše uvedených systémů jako například u astrocytomu, meduloblastomu, neuroblastomu, non-hodgkinova lymfomu a leukémií, jeho exprese byla rovněž potvrzena u uroteliálního karcinomu. (221-225) 63

Cílem této práce bylo zhodnotit výskyt a intenzitu exprese mrna PAX5 ve tkáni Ta T1 uroteliálního karcinomu močového měchýře, korelace s klinickopatologickými charakteristikami tumoru a průběhem onemocnění. 3.3.3 MATERIÁL A METODIKA 3.3.3.1 VÝBĚR A SLEDOVÁNÍ PACIENTŮ Do studie bylo zařazeno celkem 75 pacientů s Ta T1 uroteliálním karcinomem močového měchýře, léčených transuretrální resekcí od ledna 2000 do května 2002. Kontrolní skupinu tvořilo 8 mužů (průměrný věk 70.1, v rozmezí 56-78 let), u kterých byl vzorek nenádorové sliznice močového měchýře získán během transuretrální resekce prostaty prováděnou pro benigní hyperplasii prostaty. U všech těchto 8 pacientů byl nemaligní charakter odebraných vzorků potvrzen standardním histologickým vyšetřením a u všech nebyla prokázána ani žádná jiná malignita. Transuretrální resekce močového měchýře byla prováděna standardní technikou s odstraněním všech viditelných tumorů. Vždy byla provedena biopsie z bazální části tumoru. Výkon byl vždy ukončen přehlednou cystoskopií s použitím 70 optiky, při které již nebyl patrný žádný viditelný tumor. Část nádorové tkáně byla bezprostředně po odebrání zmražena v tekutém dusíku a následně skladována při - 70 C až do doby extrakce RNA. Zbytek nádorové tkáně byl fixován ve formolu a odeslán k běžnému histologickému vyšetření. Hloubka nádorové invaze byla hodnocena pomocí systému TNM. (226) Míra histologické diferenciace podle sytému World Health Organization (tabulka 1). Adjuvantní intravesikální léčba byla podávána podle současných zvyklostí. Intravesikální léčba vakcínou BCG byla určena pro nemocné s vysoce rizikovým tumorem, skupina nemocných se středně rizikovým tumorem byla léčena intravesikální chemoterapií mitomycinem C (MMC). (43) Celkem byla léčba vakcínou BCG provedena u 11 pacientů a léčba MMC u 5 pacientů. Všichni pacienti s tumorem močového měchýře byli zařazeni do sledovacího programu, který zahrnoval pravidelné cytologické vyšetření moče a cystoskopické kontroly. První kontrola byla vždy 3 měsíce od operace, další pak podle hloubky nádorové invaze a míry histologické diferenciace původního nádoru. Jakýkoliv podezřelý nález při ambulantní cystoskopii byl indikován k biopsii a histologickému vyšetření. Recidiva a progrese do invazivní formy tumoru byly vždy histologicky ověřeny. 3.3.3.2 IZOLACE RNA A SEMIKVANTITATIVNí HODNOCENÍ EXPRESE PAX5 PROSTŘEDNICTVÍM REVERSNÍ TRANKRIPTASA-POLYMERASOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE (RT-PCR) Izolace mrna byla prováděna prostřednictvím kitu Oligotex Direct mrna Midi kit (Qiagen) podle doporučeného postupu výrobcem. U všech nádorových vzorků byl proveden stejný postup, bez RT kroku, k vytvoření RT negativních kontrol. K ověření, zda vyšetřované vzorky obsahují ekvivalentní množství RNA, byly všechny testovány na přítomnost genu glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenasy (GAPDH). 64

Protokol RT-PCR genů PAX5 a GAPDH se skládal z reversní transkripce (30 minut při 50 C), inicální aktivace PCR (15 minut při 95 C), 35 cyklů (denaturace 1 minutu při 94 C, zchlazení 1 minutu při 65 C a extenze 1 minutu při 72 C), a finální extenze (10 minut při 72 C). Byly použity následující primery: PAX5 (500 bp) upstream 5 -CCCTGGAGGAAGAGAGGAAG-3' a downstream 5'- GACGACATGAAGGCCAATCT-3', GAPDH (300 bp) upstream 5'- TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3' a downstream 5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA- 3'. Produkty PCR byly separovány elektroforeticky na 2% agarosovém gelu. Gel byl barven ethidium bromidem a množství PCR produktů bylo kvantifikováno prostřednictvím Kodak Digital Science ID. 3.3.3.3 STATISTICKÁ ANALÝZA K statistickému hodnocení dat byl použit S.A.S. software release 8.2 (SAS Inc., Cary, NC, USA). Souvislost mezi mírou exprese PAX5 a klinickopatologickými charakteristikami tumoru (hloubka nádorové invaze, míra histologické diferenciace a multiplicitou) byla zkoumána prostřednictvím X" sc l uare testu nebo Fischerova exaktního testu. Kaplan-Meierova metoda byla použita k výpočtu charakteristik přežití a rozdíly hodnoceny pomocí log-rank testu. Multivariantní analýza přežití byla provedena prostřednictvím Coxova regresního modelu proporcionálních rizik.. Všechny testované hypotézy byly oboustranné a předem byla zvolena hladina významnosti a = 0,05. Všechny testované hypotézy H 0 vs. Hi byly formulovány před sběrem dat a nebyla užita žádná z metod adjustace pro mnohonásobná porovnávání. Pro statistické účely hloubka nádorové invaze byla definována jako Ta a T1, míra histologické diferenciace jako G1, G2 a G3, multiplicita jako mnohočetný a solitární. Recidiva byla definována jako histologický průkaz uroteliálního karcinomu v močovém měchýři. Progrese byla definována jako vznik nádoru s invazí do svaloviny detrusoru. 3.3.4 VÝSLEDKY 3.3.4.1 Exprese PAX5 a její korelace s ostatními klinickopatologickými charakteristikami tumoru Ve vzorcích z nenádorové sliznice získaných od 8 pacientů s hyperplasií prostaty nebyla zjištěna žádná exprese PAX5. Ze 75 nádorových vzorků byla exprese PAX5 přítomna v 62 případech (82,7 %). U 19 pacientů byla zjištěna míra exprese PAX5 rovna nebo vyšší než 0,2. Tato hodnota exprese PAX5 byla použita jako hraniční pro stanovení PAX5 pozitivity a při hodnocení jejího prognostického významu. Nebyl zjištěn žádný signifikantní vztah mezi mírou exprese PAX5 a ostatními klinickopatologickými charakteristikami tumoru jako hloubkou nádorové invaze (p=0.668), mírou histologické diferenciace (p=0.973) a multiplicitou (p=0.690). 65

3.3.4.2 Korelace mezi expresí PAX5 a průběhem onemocnění Během sledování došlo k recidivě tumoru u 50 pacientů (66.7%). Ve skupině 19 pacientů s vysokou PAX5 pozitivitou (PAX5 > 0.2, skupina PAX5 pozitivní) se recidiva tumoru objevila u 16 pacientů (84.2%), naproti tomu ve skupině 56 pacientů s nízkou nebo žádnou mírou exprese PAX5 (PAX5 < 0.2, skupina PAX5 negativní) byla recidiva tumoru zaznamenána jen u 34 pacientů (60.7%). Křivky přežití bez recidivy tumoru u pacientů kategorizovaných podle míry exprese PAX5 ukazuje obrázek 1. Přežití bez recidivy tumoru u vysoce pozitivních pacientů bylo 19.7% a 13.2% po 2 a 3 letech sledování, na rozdíl od 48.0% a 40.6% patientů se slabou či žádnou mírou exprese. Medián doby do recidivy onemocnění byl 7.98 měsíců u pozitivní a 22.05 měsíců u negativní skupiny pacientů (log-rank test, p = 0.0075). Progrese tumoru do invazivní formy byla zjištěna u 9 pacientů (12%). Z toho byla detekována u 5 pacientů z 19 s vysokou mírou exprese PAX5 (26.3%), zatímco jen u 4 z 56 (7.14%) pacientů s nízkou či žádnou expresí (obrázek 2). Dvouleté a tříleté přežití bez progrese onemocnění bylo 83,5 % a 71,6 % v pozitivní skupině a 94,6 % a 92,8 % negativní skupině (p=0.022). 3.3.4.3 Multivariantní analýza Podle analýzy multivariantním Coxovým modelem proporcionálních rizik, kdy byly jako proměnné použity exprese PAX5, klinická hloubka nádorové invaze, míra histologické diferenciace a multiplicita tumoru byly pouze exprese PAX5 a nádorová multiplicita nezávislými prediktory recidivy tumoru. Při předpovědi rizika progrese tumoru pouze míra histologické diferenciace dosahovala statistické významnosti (tabulka 2). 3.3.5 DISKUSE Podle současného konceptu je vznik nádorového růstu mnohastupňový proces, ve kterém hraje podstatnou roli ztráta funkce genů kontrolujících průběh buněčného cyklu. Developmentální regulační geny, mezi něž patří i PAX geny, ovlivňují průběh buněčného cyklu v určitých fázích embryonálního vývoje. Lidské PAX geny jsou tvořeny 9 rodinami genů, které kódují jaderné transkripční faktory a jsou exprimovány v některých specifických tkáních během normální organogeneze. Exprese PAX genů je přítomna v rychle se dělících, nediferencovaných buňkách, proto jsou považovány za možné proto-onkogeny a jejich onkogenní potenciál byl již ověřen v pokusech na myších. (228) Doposud není přesně známo jakým způsobem se PAX5 podílí na vzniku tumoru, nicméně se předpokládá, že má schopnost zvyšovat míru proliferace stejně jako bránit apoptóze. Mechanismus účinku PAX5 může zahrnovat ovlivnění funkce tumor supresorového proteinu p53 nebo anti-apoptotického proteinu bcl-2, nicméně se zdá, že vliv PAX5 zahrnuje celou řadu dalších genů a jejich produktů. (229 ' 230 > Ve vztahu ke karcinomu močového měchýře je zájem o gen PAX5 opodstatněný i protože je lokus pro PAX5 gen lokalizován na devátém chromosomu (9p13), který patří mezi místa s nejčastějším výskytem genetických abnormalit popsaných ve vztahu s touto malignitou. Ztráta heterozygosity na chromosomu 9 je přítomná u více než 70 % uroteliálních karcinomů močového měchýře a objevuje se 66

U všech tumoru, bez zřetele k hloubce nádorové invaze a míře histologické diferenciace.' Přítomnost exprese RNA genu PAX5 byla zjištěna in vitro ve třech buněčných liniích uroteliálního karcinomu (MGH-U1, HT-1376 a RT 11 Z) a rovněž ve tkáni 79 % vzorků uroteliálního karcinomu močového měchýře. (225) Naše výsledky jsou ve shodě s těmito pozorováními - mrna exprese PAX5 byla nalezena u 83 % povrchových uroteliálních karcinomů močového měchýře. Ve vzorcích z normální sliznice, naproti tomu žádná exprese nebyla zaznamenána. Přímá signifikantní závislost exprese PAX5 na vzrůstající míře histologické dediferenciace (nádorovém grade) nádoru byla popsána u astrocytoma meduloblastomu a neuroblastomu a podobný vztah byl dříve (221 222 zjištěn i u karcinomu močového měchýře, i když nebyl tak zřetelně vyjádřen. 2 3. 2 5) v našem souboru nebyl zaznamenán negativní nález exprese ve skupině nemocných s G3 tumorem a rovněž byl patrný vzestup kvantity exprese se vzrůstajícím nádorovým gradem, i když tento vzestup nebyl statisticky signifikantní. Naše výsledky poukazují na možný prognostický význam exprese PAX5. Vysoká míra exprese byla spojena s kratším přežitím bez recidivy a bez progrese tumoru. Navíc podle analýzy multivariantním Coxovým modelem proporcionálních rizik byl vliv exprese PAX5 na přežití bez recidivy tumoru nezávislý na ostatních vyšetřovaných parametrech. Nedostatkem této studie je fakt, že k isolaci nádorových buněk nebyla použita mikrodisekce. Nicméně všechny vyšetřované vzorky byly kontrolovány zkušeným patologem a ve všech byl potvrzen alespoň 50% obsah nádorových buněk. Data o expresi PAX5 přinášejí zajímavou a novou informaci, která podporuje hypotézu, že PAX5 gen se podílí na vzniku uroteliálního karcinomu močového měchýře. Definitivní diagnostický a prognostický význam tohoto prognostického faktoru musí být teprve určen. Práce byla podpořena granty IGA MZ NC 5961-3 a MŠMT J 13/98111100005. 67

Tabulka 1 Soubor pacientů ženy/muži 17/58 1 věk (roky) průměr 69.96 ±11.95 let (rozmezí 35-94) primární/recidivující tumor 47/28 solitární/mnohočetný 34/41 Ta/T1 46/29 G1/G2/G3 23/45/7 průměrná doba sledování (měsíce) 43.81 ± 10.36 Tabulka 2 Multivariantní Coxův model proporcionálních rizik předpovídající riziko recidivy a progrese kvantita exprese PAX5 hloubka nádorové invaze míra histologické diferenciace nádorová multiplicita recidiva progrese hazards P 95% Cl hazards P 95% Cl ratio ratio 12.998 0.0173 1.574-3.769 0.5788 0.035-107.324 408.277 1.477 0.228 0.784-0.734 0.7395 0.119-2.784 4.540 1.090 0.7411 0.655-5.504 0.0510 0.993-1.814 30.519 2.007 0.0217 1.107-1.557 0.6188 0.272-3.639 8.909 68

Obrázek 1 Kaplan-Meierovy křivky ukazující procento pacientů bez recidivy tumoru (log-rank test, p = 0.0075) červená - pacienti s expresí PAX5 < 0.2 (56 pacientů) zelená - pacienti s expresí PAX5 > 0.2 (19 pacientů) STRATA: PAXgron p=<d.2 PAXgroa p=>=d.2 t i ne O o O CensoredPAX gros > = <D 2 oo o Censored PAK gronp=>=d.2 69

Obrázek 1 Kaplan-Meierovy křivky ukazující procento pacientů bez progrese tumoru (log-i test, p=0.022) červená - pacienti s expresí PAX5 < 0.2 (56 pacientů) zelená - pacienti s expresí PAX5 > 0.2 (19 pacientů) o o o moo o oooooooooo oo oo o o oo oo o e > STRATA: i ID T 2D PAXqrDB p=<d.2 PAKgroip=>=D.2 3D r~ -r~ 4D 5D BD t i ne O o o Censored PAXgroup=<D.2 oooc&nsored PAX gr DO P=> = D. 2 -r 7D 70

3.4 PROGNOSTICKÝ VÝZNAM SUBKLASIFIKACE A EXPRESE FASCINU-1 U T1 UROTELIÁLNÍHO KARCINOMU MOČOVÉHO MĚCHÝŘE 3.4.1 SOUHRN Cíl: Zhodnotit prognostický význam T1 subklasifikace a exprese fascinu-1 ve tkáni T1 uroteliálního karcinomu močového měchýře. Materiál a metodika: V prospektivní studii bylo rozděleno 105 po sobě jdoucích pacientů s uroteliálním karcinomem močového měchýře do podskupin podle hloubky nádorové invaze. Jako hranice pro rozdělení tumorů byla použita tunica muscularis mucosae. Míra exprese fascinu-1 byla zjišťována pomocí myší monoklonální protilátky a hodnocena semikvantitativně jak pro intenzitu tak pro distribuci. Průměrná doba sledování pacientů byla 27.3 ± 13.7 měsíců. Výsledky: Subklasifikací T1 tumorů bylo možno provést u 99 pacientů (94%). T1a tumor byl zjištěn u 77 pacientů (73%), T1b tumor u 22 pacientů (21%). Během restagingové TUR byl invasivní tumor nalezen u 5 pacientů (4.8%). Riziko understagingu u pacientů s T1b tumorem bylo 18%. V době do recidivy tumoru nebyl mezi skupinami nemocných s T1a a T1b tumorem zaznamenán signifikantní rozdíl. Naproti tomu přežití do progrese bylo mezi oběma skupinami signifikantně rozdílné (p = 0,0034). Korelace mezi hloubkou nádorové invaze a mírou exprese fascinu-1 nebyla zaznamenána. Pozitivita fascinu-1 nekorelovala s dobou do recidivy ani s dobou do progrese tumoru. Podle multivariantní analýzy byla hloubka nádorové invaze jediným nezávislým prediktorem progrese tumoru. Pozitivita fascinu-1 neposkytovala nezávislou prognostickou informaci ve vztahu k recidivě a progresi tumoru. Závěr: Nález T1b tumoru je spojen se signifikantně vyšším rizikem progrese tumoru a understagingu. Exprese fascinu-1 nekoreluje s hloubkou nádorové invaze ani s rizikem recidivy či progrese tumoru. KLÍČOVÁ SLOVA- T1 subklasifikace, fascin-1, uroteliální karcinom močového měchýře 3.4.2 ÚVOD Průběh onemocnění u pacientů s T1 uroteliálním karcinomem močového měchýře je často nepředvídatelný. Přibližně u 30% těchto nemocných, kteří jsou léčeni transuretrální resekcí tumoru močového měchýře dojde k progresi tumoru do (8 invazivní formy. 41 231 ' Klasické prognostické faktory často nevedou k přesné předpovědi průběhu onemocnění a tudíž i k volbě a načasování nevhodnějšího způsobu léčby. (232) Tento fakt je důvodem pro vytvoření systému subklasifikace T1 tumorů, který identifikuje nemocné s vyšším rizikem progrese tumoru. Několika studiemi bylo prokázáno, že stanovení hloubky nádorové invaze do podslizničního vaziva u T1 uroteliálního karcinomu močového měchýře, podmíněného identifikací muscularis mucosae či vaskulárního plexu, je schopno rozdělit nemocné do skupin s různým průběhem onemocnění. (18, 33) Lamina propria (234) močového měchýře obsahuje tenkou vrstvu hladké svaloviny. Tato tunica 71

muscularis mucosae se liší ve svém vyjádření a může být přítomná jako souvislá či přerušovaná vrstva, či obsahuje pouze tenké svazky hladkých svalových vláken, což je vůbec nejčastější nález. (235 > Bývá rozpoznatelná přibližně mezi jednou třetinou až jednou polovinou vzdálenosti mezi epitelem a svalovinou detrusoru, ve stejné lokalitě se nachází I arteriální plexus. (236) T1 tumory je možné rozdělit na ty, u kterých nádorová invaze zasahuje nad úroveň tunica muscularis mucosae (T1a) a na ty, u kterých nádorová invaze dosahuje úrovně tunica muscularis mucosae či hlouběji ( T1b). (17) Současný pokrok v molekulárně-genetickém přístupu k biologii nádorového růstu, jako je hodnocení významu exprese fascinu-1, může umožnit přesnější odhad prognózy onemocnění ještě ve chvílích, kdy se nádor nachází v časném klinickém stadiu. Fascin byl poprvé popsán v roce 1970 jako 55kDa protein se schopností vazby na aktin. Byl pojmenován jako fascin právě pro tvorbu pevných a stabilních vazeb s F-aktinem. ' 237) Doposud byly popsány 3 vysoce příbuzné skupiny fascinových proteinů. Fascin-1 patří mezi nejčastější a je možné jej nalézt ve většině tkání lidského organismu. (238) Další dva typy fascin-2 a fascin-3 se nacházejí výlučně v retině a varleti. (239,240) Gen pro lidský fascin-1 je lokalizován na chromosomu 7q22. (241) Fascin se spoluúčastní na uspořádání struktur na bázi aktinu, které působí při buněčné adhezi a migraci. (242) Množství proteinu fascinu-1 je proto signifikantně vyšší v transformovaných epitelových buňkách některých běžných karcinomů, mezi něž patří karcinom plic, prsu, pankreatu, žlučových cest, ovaria, kůže a kolorektálního karcinomu. Zvýšená exprese fascinu-1 u těchto karcinomů koreluje s mírou histologické dediferenciace, hloubkou nádorové invaze, vznikem vzdálených (243 247) metastáz a špatnou prognózou. u uroteliálního karcinomu močového měchýře byl popsán progresivní nárůst exprese fascinu-1 s hloubkou nádorové invaze, od povrchových k invazivním karcinomům, proto se fascin-1 zdá být vhodným prognostickým faktorem pro určení nemocných s vyšším rizikem vzniku progrese tumoru. (248) Cílem této prospektivně randomisované studie je zhodnotit proveditelnost a prognostický význam subklasifikace u T1 uroteliálního karcinomu močového měchýře, posoudit její vztah k míře exprese fascinu-1, posoudit prognostický význam exprese fascinu-1. 3.4.3 MATERIÁL A METODIKA 3.4.3.1 SOUBOR NEMOCNÝCH A ZPŮSOB SLEDOVÁNÍ Do studie bylo zařazeno celkem 105 následujících pacientů s T1 uroteliálním karcinomem močového měchýře, léčených transuretrální resekcí močového měchýře od června 2001 do července 2005. Transuretrální resekce byla prováděna standardním způsobem s odstraněním všech exofytických tumorů močového měchýře a separovaným odběrem vzorků z basální části tumoru. Random biopsie z normálně vyhlížející sliznice nebyly prováděny, studená biopsie bioptickými kleštěmi byla odebírána pouze ze suspektních míst. Operace byla vždy ukončena přehlednou cystoskopií 70 optikou bez nálezu residuálního tumoru. Míra histologické diferenciace (nádorový grade) byl hodnocen podle sytému World Health Organization (tabulka 1). U všech pacientů byla provedena re-stagingová transuretrální resekce za 4-6 týdnů od původní operace. Deset pacientů, u kterých 72

byl při restagingové transuretrální resekci nalezen invazivní tumor anebo u nich nebylo možno provést subtypizaci, bylo vyřazeno z definitivního hodnocení. Intravesikální bacillus Calmette-Guerin (BCG) imunoterapie byla podána u 31 pacientů a 5-ti týdenní chemoterapie intravesikálním mitomycinem C (MMC) u 42 pacientů, u 22 pacientů byla podána jediná instilace MMC bezprostředně po transuretrální resekci. Do sledovacího programu bylo zahrnuto celkem 95 analyzovaných pacientů. Součástí sledování byly cystoskopické kontroly a cytologická vyšetření moče v pravidelných intervalech. Jakýkoliv podezřelý nález při cystoskopii byl ověřen následnou biopsii a histologickým vyšetřením preparátu. Recidiva či progrese tumoru byly vždy histologicky potvrzeny. 3.4.3.2 METODIKA T1 SUBKLASIFIKACE U všech nádorových vzorků byly v subepiteliálním pojivu identifikovány tunica muscularis mucosae nebo vaskulární plexus (pokud byly vyjádřeny). T1 tumory byly podle hloubky nádorové invaze po té rozděleny do dvou skupin. U T1a tumorů dosahovala nádorové invaze nad úroveň tunica muscularis mucosae. U T1b tumorů hloubka nádorové invaze dosahovala do či pod úroveň muscularis mucosae. 3.4.3.3 IMUNOHISTOCHEMICKÉ VYŠETŘENÍ Celkem bylo vyšetřeno 95 nádorových vzorků od nemocných s uroteliálním karcinomem močového měchýře. K určení exprese fascinu-1 byla použita monoklonální protilátka proti fascinu-1 (DAKO, klon 55K-2, kód Č.M3567) v ředění 1:100, inkubace 70 min. Reakce byla visualizována metodou DAKO Cytomation LSAB - HRP - DAB. Jádra byla dobarvena Harrisovým haematoxylinem (obrázek 1). Positivita endotelií a myofibroblast byla použita jako vnitřní pozitivní kontrola. Reakce urotelu byla hodnocena semikvantitativně pro intenzitu a distribuci, podle následujících pravidel: hodnoceny byly pouze dobře zachované uroteliální struktury, bez mechanických a termických artefaktů, které jsou v tomto druhu materiálu časté z dobře zachovaných míst byla odečtena maximální pozitivita hodnocená místa byla vyšetřována při zvětšení 20x intenzita fascinu-1 byla obodována jako 0 pokud byla negativní, jako 1 pokud byla slabá a jako 2 pokud byla střední až vysoká rozsah pozitivity fascinu-1 byl obodován jako 1 pokud byl menší než polovina tloušťky urotelu, jako 2 pokud byl větší než polovina tloušťky urotelu a dispersní, jako 3 pokud byl větší než polovina tloušťky urotelu a difusní 3.4.3.4 STATISTICKÁ ANALÝZA Všechny statistické analýzy byly provedeny prostřednictvím programu S.A.S. software release 8.2 (SAS Inc., Cary, NC, USA). Souvislost mezi mírou exprese fascinu-1 a klinickopatologickými proměnnými (hloubka nádorové invaze, míra histologické diferenciace, velikost tumoru, multiplicita a přítomnost tumoru in situ) byla zkoumána prostřednictvím x-square testu nebo Fischerova exaktního testu. Kaplan-Meierova metoda byla použita k výpočtu charakteristik přežití a rozdíly 73

hodnoceny pomocí log-rank testu. Multivariantní analýza přežití byla provedena prostřednictvím Coxova regresního modelu proporcionálních rizik. Všechny testované hypotézy byly oboustranné a předem byla zvolena hladina významnosti a = 0,05. Všechny testované hypotézy H 0 vs. Hi byly formulovány před sběrem dat a nebyla užita žádná z metod adjustace pro mnohonásobná porovnávání. Pro statistické účely byla hloubka nádorové invaze kategorizována jako T1a a T1b, míra histologické diferenciace jako G1, G2 a G3, multiplicita jako solitérní a mnohočetný tumor, přítomnost tumoru in situ jako přítomný a nepřítomný, velikost tumoru a míra exprese fascinu jako číslo (viz. výše). Recidiva tumoru byla definována jako nový, histologicky prokázaný tumor po alespoň 3 měsících od původní operace. Progrese tumoru byla definována jako vznik tumoru s nádorovou invazí do svaloviny detrusoru či vznik vzdálených metastáz. 3.4.4 VÝSLEDKY Hluboká nádorová invaze v lamina propria (T1b tumor) byla zjištěna u 22 pacientů (20.95%), povrchová nádorová invaze (T1a tumor) u 77 pacientů (73.33%). Hloubku nádorové invaze nebylo možno určit u 6 pacientů (5.71%). Při re-stagingové transuretrální resekci byl zjištěn invasivní tumor (T2 a větší) u 5 pacientů (4.76%). U jednoho z těchto 5 pacientů nebylo iniciálně možno provést T1 subklasifikaci, ostatní 4 pacienti měli původně T1b tumor. Riziko understagingu u nemocných s T1b tumorem bylo 18.18%. Pacienti, u nichž byl při re-stagingové transuretrální resekci zastižen invazivní tumor, a u kterých nebylo možno provést T1 subklasifikaci, byli vyřazeni z dalšího hodnocení. Z celkového množství 95 hodnocených pacientů bylo 68 mužů, a 27 žen, průměrný věk byl 68 let (38-87). Recidiva tumoru byla prokázána u 48 pacientů (50.53%), progrese u 15 pacientů (15.79%). Čtyři pacienti (4.21 %) zemřeli v důsledku generalizace tumoru, 3 pacienti (3.16%) zemřeli během sledování z jiných příčin. Tumor in situ byl diagnostikován u 10 pacientů (10.53%). Mezi větvemi s různým druhem intravesikální léčby (sledování, MMC, BCG) nebyl zjištěn statisticky signifikantní rozdíl ve vztahu k případné recidivě či progresi tumoru. Pacienti byli sledováni 27.3 ± 13.7 měsíce. 3.4.4.1 Korelace mezi T1 subklasifikaci a průběhem onemocnění Recidiva tumoru se objevila u 41 ze 77 (53.2%) pacienů s T1a tumorem a 7 z 18 (38.9%) pacientů s T1b tumorem. Mezi skupinami pacientů s T1a a T1b tumorem nebyl signifikantní rozdíl v době do recidivy tumoru. Nádorová progrese byla zjištěna u 9 ze 77 (11.7 %) pacientů s T1a tumorem a u 6 z 18 (33.3 %) pacientů s T1b tumorem. Přežití bez progrese bylo mezi oběma skupinami signifikantně odlišné (p= 0.0034), obrázek 3. 3.4.4.2 Korelace mezi T1 subklasifikaci a ostatními hodnocenými parametry Velikost nádoru, multiplicita a přítomnost tumoru in situ byla v obou skupinách s různou hloubkou nádorové invaze srovnatelná. Nicméně ve skupině s T1b tumorem byl signifikantně častější nález tumoru s vyšší mírou histologické dediferenciace (s vyšším nádorovým grade) (p = 0.0002). 3.4.4.3 Korelace mezi T1 subklasifikaci a expresí fascinu-1 Pozitivita fascinu-1 nekorelovala s hloubkou nádorové invaze. Korelace nebyla zjištěna ani při separovaném hodnocení pro intenzitu a rozsah pozitivity fascinu-1. 74

3.4.4.4 Korelace mezi expresí fascinu-1 a průběhem onemocnění Pozitivita fascinu-1 nekorelovala s přežitím bez recidivy tumoru ani s přežitím bez progrese tumoru. Korelace nebyla nalezena ani při separovaném hodnocení pro intenzitu a rozsah pozitivity fascinu-1. 3.4.4.5 Korelace mezi expresí fascinu-1 a ostatními sledovanými parametry Nebyla zjištěna žádná korelace mezi pozitivitou fascinu-1 a mírou histologické diferenciace, velikostí nádoru, přítomností tumoru in situ a nádorovou multiplicitou. Při separovaném hodnocení pro intenzitu a rozsah pozitivity fascinu-1 nebyla rovněž potvrzena žádná souvislost. 3.4.4.6 Multivariantní analýza Při hodnocení prostřednictvím Coxova regresního modelu proporcionálních rizik byly jako proměnné použity intensita positivity fascinu-1, rozsah positivity fascinu-1, celková míra pozitivity fascinu-1, subklasifikace T1, míra histologické diferenciace tumoru, nádorová multiplicita, velikost tumoru, a přítomnost tumoru in situ. Podle provedené analýzy pouze T1 subklasifikace tumoru byla nezávislým prediktorem nádorové progrese. Při hodnocení předpovědi rizika recidivy tumoru žádný z analyzovaných parametrů nedosahovat statistické významnosti, viz tabulka 2. Pozitivita fascinu-1 nebyla ve srovnání s ostatními parametry nezávislým prognostickým faktorem ve vztahu k riziku recidivy a progrese onemocnění. 3.4.5 DISKUSE Míra histologické diferenciace a hloubka nádorové progrese patří v současné době u karcinomu močového měchýře mezi dva nejvýznamnější prognostické faktory. Nicméně i přes to a to zejména u T1 karcinomů močového měchýře existuje výrazná heterogenita v průběhu onemocnění, což svědčí pro to, že předpovědní hodnota klasických prognostických faktorů je omezená. (8, 4 ' Ve snaze identifikovat nemocné s vyšším rizikem progrese tumoru byla vytvořena subklasifikace T1 tumorů, nicméně někteří autoři pochybují o její užitečnosti pro obtížnost separace mikrostádií. (249) Problémem může být neschopnost identifikovat muscularis mucosae, protože tato je ve většině případů nesouvislá. V této studii jsme potvrdili schopnost kvantifikovat hloubku nádorové invaze do lamina propria, neboť muscularis mucosae byla identifikovatelná u 94% případů. Podle našich výsledků je ve vzorcích nádorové tkáně uroteliálního karcinomu získaných řádně provedenou transuretrální resekcí, fixovaných v parafinu a barvených hematoxilinem-eosinem možné určit hloubku nádorové invaze a provést subklasifikaci T1 tumorů. Zásadní je v tomto ohledu spolupráce urologa s patologem a snaha provést stratifikaci, kdykoliv je to možné. Doposud nebyl stanoven jednoznačný konsensus, zda mají být pacienti s T1a tumorem léčeni jiným způsobem, než pacienti s tumorem T1b. Nicméně podle našich výsledků je zřejmé, že pacienti s T1b tumorem mají signifikantně vyšší riziko nádorové progrese a understagingu tumoru. Navíc podle multivariantní analýzy Coxovým regresním modelem je hloubka nádorové invaze do lamina propria nezávislým prognostickým faktorem na ostatních ve vztahu k přežití bez progrese tumoru. 75

Navzdory tomu, že nádorový grade signifikantně koreloval s hloubkou nádorové invaze, nepotvrdili jsme v našem souboru nádorový grade jako rizikový faktor ve vztahu k progresi tumoru. Předpokládáme, že to je důsledkem omezeného počtu pacientů a délky sledování. Doposud bylo publikováno minimum prací zabývajících se významem exprese fascinu-1 u uroteliálního karcinomu močového měchýře. V Tongově práci nebyla ve vzorcích z nenádorového urotelu zjištěna žádná míra exprese fascinu-1. Naproti tomu 42% Ta tumorů bylo pozitivních pro fascin-1 a míra exprese fascinu byla vyšší v mikroivazivních fokusech v lamina propria T1 tumorů. Všechny části tumoru s invazí do muscularis propria byly silně pozitivní pro fascin-1. Výše uvedené výsledky prokázaly progresivní nárůst míry exprese fascinu-1 s hloubkou nádorové invaze, od (248) povrchových k invazivním uroteliálním karcinomům močového měchýře. Uspořádání naší studie bylo odlišné v tom, že zkoumáni byli pouze pacienti s T1 tumory. Na rozdíl od výsledků Tonga, v naší studii míra exprese fascinu nekorelovala s hloubkou nádorové invaze. Důvodem může být to, že rozsah nádorové invaze hodnocený v naší studii byl jednoznačně menší, a to pouze v rámci tumorů T1, zatímco ve výše uvedené práci byli pacienti s tumory Ta, T1 a rovněž i s invazivními karcinomy močového měchýře. Dalším rozdílem oproti zmiňované Tongově práci, kde v nenádorovém urotelu nebyla zjištěna žádná míra exprese fascinu-1, v našem souboru jsme v několika případech nalezli určitou míru pozitivity fascinu-1 i v nenádorovém urotelu v blízkosti uroteliálního karcinomu (v rámci vyšetřovaných vzorků). Tento nález nebyl hodnocen, nicméně podrobněji zkoumán v rámci dalších studií, viz. obrázek 3. Podle našich poznatků je toto první studie hodnotící prognostický význam exprese fascinu-1 u T1 uroteliálních karcinomů močového měchýře. V našem souboru pacientů jsme neprokázali vztah mezi mírou exprese fascinu-1 a rizikem recidivy či progrese tumoru. Na rozdíl od stanovení T1 subklasifikace, míra exprese fascinu-1 nám neumožní vybrat nemocné s T1 karcinomem močového měchýře vhodné k agresivnějším způsobům léčby. Nicméně skutečný význam exprese facinu- 1 a subklasifikace T1 v klinické praxi musí být stanoven prostřednictvím rozsáhlejších studií. Práce byla podpořena grantem IGA NR 8934-3. 76

Tabulka 1- Soubor pacientů ženy/muži 27/68 věk (roky) průměr 68.43 ± 10.94 (rozmezí 38-87) solitární/mnohočetný 25/70 T1a/T1b 77/18 G1/G2/G3 25/43/27 délka sledování (měsíce) 23.31 ± 13.66 Tabulka 2- Multivariantní Coxův regresní model proporcionálních rizik predikce recidivy a progrese tumoru intenzita fascinu-1 pozitivity recidiva Progrese hazards P 95% Cl hazards P 95% Cl ratio value ratio value 1.625 0.2007 0.773-1.131 0.8574 0.295-3.418 4.331 rozsah fascinu-1 pozitivity 0.837 0.5198 0.488-1.438 1.171 0.7419 0.458-2.993 celková míra pozitivity fascinu-1 1.660 0.1616 0.816-3.373 0.554 0.4050 0.138-2.224 T1 subklasifikace 1.741 0.2529 0.673-4.505 nádorový grade 0.952 0.8598 0.553-1.640 velikost nádoru 1.103 0.2479 0.934-1.301 nádorová multiplicita 1.984 0.0637 0.962-4.095 přítomnost TIS 0.268 0.2208 0.032-2.208 7.580 0.0071 1.736-33.103 0.754 0.6404 0.231-2.461 0.779 0.6040 0.779-1.536 0.560 0.2061 0.560-14.644 0.425 0.2783 0.425-19.541 77

Obrázek 1 Muž 87, LG uroteliální karcinom. Silná cytoplasmatická pozitivita fascinu-1 ve dvou třetinách tloušťky urotelu. 200x. 78

Obrázek 1 Kaplan-Meierovy křivky procenta pacientů bez progrese (log-rank test, p=0.034) červená - pacienti s T1a tumorem (77 pacientů) zelená - pacienti s T1b (18 pacientů) tiae o O O censored T1 -o T1 -b 0 0 0 Censored TI -B 79

Obrázek 1 Muž 73, pozitivita fascinu-1 (střední intenzita, basální polovina sliznice) v nenádorovém urotelu poblíž uroteliálního karcinomu G1. 200x. 80

4. ZÁVĚR: Kvantita imunohistochemického vyšetření mikrovaskulární denzity u nemocných s povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře může přinášet pomocnou prognostickou informaci. Souvislost mezi maximální mikrovaskulární denzitou (CD34-max) a intervalem bez progrese tumoru se blížila statistické významnosti a na větším souboru by mohla být statisticky významná. K definitivnímu určení významu mikrovaskulární denzity jako prognostického faktoru pro povrchový karcinom močového měchýře bude třeba provést rozsáhlejší studie. Statisticky významná souvislost mezi mikrovaskulární denzitou a jadernou akumulací p53 svědčí pro to, že p53 má určitou úlohu v regulaci nádorové vaskularizace u povrchového karcinomu močového měchýře. Míra exprese p53 ve vzorcích z nenádorové sliznice u s nemocných povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře souvisí s vyšším rizikem recidivy tumoru. Podle našich výsledků je příčinou multifokality KMM spíše obecná genetická nestabilita přítomná v celém přechodním epitelu v době diagnózy tumoru. Exprese genu PAX5 je ve tkáni uroteliálního karcinomu močového měchýře častým nálezem. Z prognostického hlediska je nález zvýšené exprese genu PAX5 spojen s vyšším rizikem recidivy a progrese tumoru. Rozsah nádorové invaze do lamina propria se zdá být klinicky významný prognostický faktor ve vztahu ke stanovení rizika progrese T1 uroteliálního karcinomu močového měchýře. Nález T1b tumoru je spojen s významným rizikem understagingu. Míra exprese fascinu-1 nekoreluje s hloubkou nádorové invaze, ani s rizikem recidivy či progrese onemocnění a nezdá se proto vhodným prognostickým faktorem. 81

5. SUMMARY: Immunohistochemical examination of microvascular density can be an additional prognostic factor in patients with superficial urinary bladder carcinoma, nevertheless, more extensive studies need to be carried out. Maximal microvascular density correlated with a recurrence free interval and in a case of bigger group of patients could be statistically significant. The statistical correlation between MVD and a nuclear p53 accumulation is that significant that we assume the p53 importance in the angiogenesis regulation of superficial urinary bladder carcinoma. The p53 positivity in non-tumor mucosa of urinary bladder in patients with superficial bladder cancer correlates with higher risk of tumor recurrence. According to our results the reason of urinary bladder carcinoma multifocality is genetic instability present in the whole urothelium at the time of tumor diagnosis. The PAX5 gene expression is a frequent finding in superficial transitional cell carcinoma of the bladder. From the prognostic point of view, high levels of PAX5 expression seem to be connected with higher recurrence and progression rates. The extent of lamina propria invasion seems to be a clinically relevant prognostic factor for progression of T1 bladder transitional cell carcinoma. Finding T1b tumor is connected with the risk of understaging. The fascin-1 expression does not correlate with the depth of tumor invasion nor with the tumor recurrence or progression. 82

6. SEZNAM ZKRATEK: BCG- bacillus Calmette-Guerin CDK- cyklin dependents kinása EGF- epidermální růstový faktor (EGF) EORTC- European Organization for Research on the Treatment of Cancer ESU European School of Urology FGF- fibroblastový růstový faktor GAPDH- glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase HCORE- číslo, způsob vyčíslení jaderné akumulace p53, viz. metodika. ICE interleukin-converting enzyme ISUP- International Society of urological Pathology KMM- karcinom močového měchýře LOH- ztráty heterozigozity LUCIA- Laboratory Universal Computer Image Analysis MMC- mitomycin C MMP- matrixové metalloproteinázy MVD- mikrovaskulární denzita PCNA- Proliferační jaderný antigen RT- PCR- reversní trankriptasa-polymerasové řetězové reakce TGF- transformujícího růstového faktoru TIS- tumor in situ TUR- transuretrální resekce močového měchýře u-pa- aktivátor plasminogenu urokinásového typu VEGF- vaskulární endoteliální růstový faktor WHO- World Health Organisation

7. LITERATURA: 1. Parker, S.L., Tong, T Bolden, S Wingo, P.A.: Cancer statistics, 1996, CA Cancer J Clin 1996, 46:5. 2. Ro, J.Y., Staerkel, G.A., Ayala, A.G.: Cytologic and histologic features of superficial bladder cancer. Urol Clin North Am, 19, 1992, 3, 435-453. 3. Tumors of the bladder. In: Tanagho, E.A., McAninch, J.W.: Smith's General Urology, 12 th Ed., Lange Medical Publications 1988, ISBN 0-8385-8605-8, 355-360. 4. Jewett, H.J., Strong, G.H.: Infiltrating carcinoma of the bladder: relation of depth of penetration of the bladder wall to incidence of local extension and metastases. J Urol, 55, 1946, 366-372. 5. Lutzeyer, W., Rubben, H., Dahm, H.: Prognostic parameters in superficial bladder cancer: An analysis of 315 cases. J Urol, 127, 1982, 2, 250-252. 6. Lamm, D.L.: Long-term results of intravesical therapy for superficial bladder cancer. Urol Clin North Am, 19, 1992, 3, 573-580. 7. See WA, Fuller JR. Staging of advanced bladder cancer. Urol Clin North Am, 1992, 19, 663-683. 8. Heney, N.M., Ahmed, S., Flanagan, M.J., Frable, W., Corder, M.P. et al.: Superficial bladder cancer: progression and recurrence. J Urol, 130, 1983, 6, 1083-1086. 9. Kurth, K.H., Denis, L., Bouffioux, C. et al. Factors affecting recurrence and progression in superficial bladder tumours. Eur J Cancer, 1995, 31A, 11, 1840-1846. 10.Soloway, M.S., Sofer, M., Vaidya, A. et al. Contemporary management of stage T1 transitional cell carcinoma of the bladder. J Urol, 167, 2002, 1573-1583. H.Jakse, G., Loidl, W., Seeber, G., Hofstadter, F.: Stage T1, grade 3 transitional cell carcinoma of the bladder: an unfavourable tumor? J Urol, 137, 1987, 1, 39-43. 12.Amling, Ch.L., Thrasher, J.B., Frazier, H.A.et al. Radical cystectomy for stages Ta, TIS and T1 transitional cell carcinoma of the bladder. J Urol, 1994, 151, 31-36. 13.Stein, J.P., Lieskovsky, G., Cote, R. et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. J Clin Oncol, 19, 2001, 666-675. 14.Anderstrom, C., Johansson, S., Nilsson, S.: The significance of lamina propria invasion on the prognosis of patients with bladder cancer. J Urol, 124, 1980, 1, 23-26. 15.Holmang, S., Hedelin, H., Anderstróm, C. et al. The relationship among multiple recurrences, progression and prognosis of patients with stages Ta and T1 transitional cell cancer of the bladder followed for at least 20 years. J Urol, 1995, 153, 1823-1827. 16.Angulo, J.C., Lopez, J.I., Grignon, D.J. et al. Muscularis mucosa differentiates 2 populations with different prognosis in stage T1 bladder cancer. Urology, 1995, 45, 47-53. 17.Hasui, Y., Osada, Y., Kitada, S. et al. Significance of invasion to the muscularis mucosa on the progression of superficial bladder cancer. Urology, 1994, 43, 782-786. 18.Holmang, S., Hedelin, H., Anderstróm, C. et al. The importance of the depth of invasion in stage T1 bladder carcinoma: a prospective cohort study. J Urol, 1997, 157, 800-804. 84

19.Kondylis, F.I., Demirci, S.. Ladaga, L. et al. Outcomes after intravesical bacillus Calmette-Guerin are not affected by substaging of high grade T1 transitional cell carcinoma. J Urol, 2000, 163, 1120-1123. 20.Shariat, S.F., Weizer, A.Z., Green, A. et al. Prognostic value of p53 nuclear accumulation and histopathologic features in T1 transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Urology, 2000, 56, 735-740. 21. Bernardini, S., Billerey, C., Martin, M. et al. The predictive value of muscularis mucosae invasion and p53 over expression on progression of stage T1 bladder carcinoma. J Urol, 2001, 165, 42-46. 22. Cheng, L Weaver, A.L., Neumann, R.M. et al. Substaging of T1 bladder carcinoma based on the depth of invasion as measured by micrometer. A new proposal. Cancer, 1999, 86, 1035-1043. 23.Kaubisch, S Lum, B.L., Reese, J. et al. Stage T1 bladder cancer: grade is the primary determinant for risk of muscle invasion. J Urol, 1991, 146, 28-31. 24. Jordan, A.M., Weingarten, J., Murphy, W.M.: Transitional cell neoplasms of the urinary bladder: can biological potential be predicted from histological grading? Cancer, 1987, 60, 2766-2774. 25.Herr, H.W. Tumor progression and survival of patients with high grade, noninvasive papillary (TaG3) bladder tumors: 15-year outcome. J Urol, 2000, 163, p. 60-62. 26.Rubben, H., Jocham, D.: Therapie des oberflachlichen Blasenkarzinoms. Urologe A, 1991, 30, 2-9. 27. Epstein, J.I., Amin, M.B., Reuter, V.E. et al. The World Health Organization/International Society of Urological Pathology consensus classification of urothelial (transitional cell) neoplasms of the urinary bladder. Am J Surg Pathol, 1998, 22, 1435-1448. 28. Holmang, S., Andius, P., Hedelin, H. et al. Stage progression in Ta papillary urothelial tumors: relationship to grade, immunohistochemical expression of tumor markers, mitotic frequency and DNA ploidy. J Urol, 2001, 165, 1124-1130. 29.Fujii, Y., Kawakami, S., Koga, F. et al. Long-term outcome of bladder papillary urothelial neoplasms of low malignant potential. Br J Urol Int, 2003, 92, 559-562. 30.Maruniak, N.A., Takezawa, K., Murphy, W.M. Accurate pathological staging of urothelial neoplasms requires better cystoscopic sampling. J Urol, 2002, 167, 2404-2407. 31.Witjes, J.A., Kiemeney, L.A.L.M., Schaafsma, H.E., Debruyne, F.M.: The influence of overview pathology on study outcome of a randomised multicenter superficial bladder cancer trial. Br J Urol, 73, 1994, 2, 172-176. 32.van der Meijden, A., Sylvester, R., Collette, L. et al. The role and impact of pathology review on stage and grade assessment of stages Ta and T1 bladder tumors: a combined analysis of 5 European Organization for Research and Treatment of Cancer trials. J Urol, 2000, 164, 1533-1537. 33. Bol, M.G.W., Baak, J.P.A., Buhr-Wildhagen, S. et al. Reproducibility and prognostic variability of grade and lamina propria invasion in stages Ta, T1 urothelial carcinoma of the bladder. J Urol, 2003, 169, 1291-1294. 34. Holmang, S., Hedelin, H., Anderstróm, C. et al. Recurrence and progression in low grade papillary urothelial tumors. J Urol, 1999, 162, 702-707. 35.Parmar, M.K.B., Freedman, L.S., Hargreave, T.B. et al. Prognostic factors for recurrence and followup policies in the treatment of superficial bladder cancer: report from the British medical research council subgroup on superficial bladder cancer (Urological cancer working party). J Urol, 1989, 142, 284-288. 85

36. Hudson, M.A., Herr, H.W.: Carcinoma in situ of the bladder. J Urol, 153, 1995, 3, 564-572. 37. Griffiths, T.R.L., Charlton, M., Neal, D.E. et al. Treatment of carcinoma in situ with intravesical bacillus Calmette - Guerin without maintenance. J Urol, 2002, 167, 2408-2412. 38.Kiemeney, L.A.L.M., Witjes, J.A., Heijbroek, R.P. et al. Should random urothelial biopsies be taken from patients with primary superficial bladder cancer? A decision analysis. Br J Urol, 1994, 73, 164-171. 39. Fitzpatrick, J.M., West, A.B., Butler, M.R. et al. Superficial bladder tumors (stage pta, grades 1 and 2): the importance of recurrence pattern following initial resection. J Urol, 1986, 135, 920-922. 40.Holmang. S., Johansson, S.L. Stage Ta-T1 bladder cancer: the relationship between findings at first followup cystoscopy and subsequent recurrence and progression. J Urol, 2002, 167, 1634-1637. 41. Kiemeney, L.A.L.M., Witjes, J.A., Heijbroek, R.P. et al. Predictability of recurrent and progressive disease in individual patients with primary superficial bladder cancer. J Urol, 1993, 150, 60-64. 42. Millan-Rodriguez, F., Chechile-Toniolo, G., Salvador-Bayarri, J. et al. Multivariate analysis of the prognostic factors of primary superficial bladder cancer. J Urol, 2000, 163, p. 73-78. 43.0osterlinck, W., Lobel, B., Jakse, G. et al. Guidelines on bladder cancer. Eur Urol, 2002,41, 105-112. 44.Millan-Rodriguez, F., Chechile-Toniolo, G., Salvador-Bayarri, J. et al. Primary superficial bladder cancer risk groups according to progression, mortality and recurrence. J Urol, 2000, 164, 680-684. 45.Allard, P., Bernard, P., Fradet, Y. et al. The early clinical course of primary Ta and T1 bladder cancer: a proposed prognostic index. Br J Urol, 1998, 81, 692-698. 46. Sylvester, J., van der Meijden, A., Oosterling, W., Witjes, J.A., Bouffioux, C., Denis, L., Newling, D., Kutrh, K., Predicting recurrence and progression in individual patients with stage TaT1 bladder cancer using EORTC risk tables: A combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials. Eur Urol, 2006, 49, 466-477. 47. Jimenez RE., Gheiler E., Oskanian P et al. Grading the invasive component of urothelial carcinoma of the bladder and its relationship with progression-free interval. Am J Surg Pathol 2000, 24, 980-987. 48. Vieweg J., Gschwend JE., Herr H et al. The Impact of primary stage on survival in patients with lymf node positive bladder cancer. J Urol, 1999, 161, p. 72-76. 49.Dalbagni G., Genega E., Hashibe M. et al. Cystectomy for bladder cancer: A contemporary series. J Urol, 2001, 165, 1111-1116. 50.Scrimger RA., Murtha AD., Parliament MB. et al. Muscle-invasive transitional cell carcinoma of the urinary bladder: A population-based study of patterns of care and prognostic factors. Int J Radiation Oncology Biol Phys, 2001, 51, 23-30. 51.Slaton JW., Swanson DA., Grossman HB. et al. A stage specific approach to tumor surveillance after radical cystectomy for transitional cell carcinoma of the bladder. J Urol, 1999, 162, 710-714. 52.Pagano F, Bassi P, Galeti TP et al. Results of contemporary radical cystectomy for invasive bladder cancer: a clinicopathological study with an emphasis on the inadequacy of the tumour, nodes and metastasis classification. J Urol, 1991, 145, 45-50. 86

53. Frazier HA, Robertson JE, Doge RK et al. The value of pathologic factors in predicting cancer-specific survival among patients with radiaci cystectomy for transitional cell carcinoma of the bladder and prostate. Cancer, 1993, 71, 3993-4001. 54. Wish now Kl, Johnson DE, Ro JY et al. Incidence, extent and location of unsuspected pelvic lymf node metastasis in patients undergoing radical cystectomy for the bladder cancer. J Urol, 1987, 137, 408-410. 55. Leissner J, Hohenfellner R, Thuroff JW et al. Lymfadenectomy in patients with transitional cell carcinoma of the urinary bladder, significance for staging and prognosis. BJU Int, 2000, 85, 817-823. 56. Stein JP, Cai J, Groshen S et al. Risk factors for patients with pelvic lymph node metastases following radical cystectomy with en block pelvic lymphadenectomy: the concept of lymph node density. J Urol, 2003, 170, 35-41. 57.Stockle M, Wellek S, Meyenburg W et al. Radical cystectomy with or without adjuvant polychemotherapy for non-organ-confined transitional cell carcinoma of the urinary bladder: Prognostic impact of lymph node involment. Urol, 1996, 48, 868-875. 58.Ghoneim MA, Abol-Enein H. Lymphadenectomy with cystectomy: Is it necessary and what is its extent? Eur Urol, 2004, 46, 457-461. 59. Syed S, Weiss GR. Management of locally advanced bladder cancer: early vs deferred chemotherapy. World J Urol, 2002, 20, 175-182. 60. Cheng L, Weaver AL, Leibovich BC et al. Predicting the survival of bladder carcinoma patients treated with radiaci cystectomy. Cancer, 2000, 88, 2326-2332. 61.Schrier BP, Hollander MP, van Rhijn BW et al. Prognosis of muscle-invasive bladder cancer: Difference between primary and progressive tumours and implication for therapy. Eur Urol, 2004, 45, 292-296. 62. Klener, P.: Protinádorová chemoterapie. 1. Vydání, Praha, 1996, Galén, 614s. ISBN 80-85824-36-1 63.Garcia-Schurman, J.M., Partin, A.W., Coffey, D.S.: The molecular and cellular biology of urologie cancers. In: Oesterling, J.E., Richie, J.P.: Urologie oncology, 1.Ed Philadelphia, 1997, W.B. Saunders Company, 822s ISBN 0-7216-6347-8. 64. Bates, S Bonetta, L MacAllan, D Parry, D Holder, A. et al.: CDK6 (PLSTIRE) and CDK4 (PSK-J3) are a distinct subset of the cyclin-dependent kinases that associate with cyclin D1. Oncogene, 9, 1994, 1, 71-79. 65.McGarvey, T.W., Malkowicz, S.B.: The role of the cell cycle in genitourinary carcinoma. World J Urol, 14, 1996, 5, 310-317. 66. Sherr, Ch.J.: Mammalian Gi cyclins. Cell, 73, 1993, 6, 1059-1065. 67. Chaloupka, J.: Programovaná smrt buňky. Biologické listy, 61, 1996, 3-4, 249-271. 68. Stewart, B.W.: Mechanisms of apoptosis: integration of genetic, biochemical, and cellular indicators. J Natl Cancer Inst, 86, 1994, 17, 1286-1296. 69. Rosypal, S., Úvod do molekulární biologie. Druhý díl, Brno, 2. vydání, 1997, 996 s. 70.Cordon-Cardo, C., Sheinfeld, J.: Molecular and immunopathology studies of oncogenes and tumor-suppressor genes in bladder cancer. World J Urol, 15, 1997, 2, 112-119. 71. Lloyd KO. Philips Levine award lecture. Blood group antigens as markers for normal differentiation and malignant change in human tissues. Am J Clin Pathol, 1987, 87, 129-139 87

72.Cordon-Cardo C, Reuter VE, Lloyd KO et al. Blood group-related antigens in human urothelium: enhanced expression of precursors, LeX and LeY determinants in urothelial carcinoma. Cancer Res, 1988, 48, 4113-4120. 73. Bretton P, Cordon-Cardo C, Wartinger D et al. Proc Am Assn Cancer Res 1990, 31, s.186 (abstract 1105) 74. Fradet Y, Tardif M, Bourget L et al. Clinical cancer progression in urinary bladder tumours evaluated by multiparameter flow cytometry with monoclonal antibodies. Laval University Urology Group. Cancer Res, 1990, 50, 432-437. 75.Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell, 2000, 100, p. 57-70 76. Moriyama N, Umeda T, Akaza H et al. Expression of ras p21 oncogene product on human bladder tumours. Urol Int, 1989, 44, 260-263. 77. Fontana D, Bellina M, Scoffone C et al. Evaluation of c-ras oncogene product (p21) in superficial blader cancer. Eur Urol, 1996, 29, 470-476. 78. Bittard H, Descotes F, Billerey C et al. A genotype study of the c-ha-ras-1 locus in human bladder tumours. J Urol, 1996, 155,1083-1088. 79.0lderoy G, Daehlin L, Ogreid D et al. Low-frequency mutation of Ha-ras and Kiras oncogenes in transitional cell carcinoma of the bladder. Anticancer Res, 1998, 18, 2675-2678. 80. Kospikinen PJ, Alitano K Role of myc amplification and overexpression in cell growth, differentiation and death. Semin Cancer Biol, 1993, 4, 3-12. 81.Vasrik I, Makela TP, Koskinen PJ. Determination of sequences responsible for the differential regulation of Myc function by delta Max and Max. Oncogene, 1995, 11, 553-560 82.Kotake T, Saiki S, Kinouchi T et al. Detection of the c-myc gene product in urinary bladder cancer. Jpn J Cancer Res 1990, 81,1198-1201. 83.Lipponen PK. Expression of c-myc protein is related to cell proliferation and expression of growth factor receptors in transitional cell bladder cancer. J Pathol, 1995, 175, 203-210. 84. Sato K, Moriyama M, Mori S et al. An immunohistologic evaluation of c-erb-b2 gene product in patients with urinary bladder carcinoma. Cancer, 1992, 70, 2493-2498. 85.Lipponen P, Eskelinen M. Expression of epidermal growth factor receptor in bladder cancer as related to established prognostic factors, oncoprotein (c-erbb- 2, p53) expression and long-term prognosis. Br J Cancer, 1994, 69, 1120-1125. 86. Mellon JK, Lunec J, Wright C et al. C-erbB-2 in bladder cancer: molecular biology, correlation with epidermal growth factor receptors and prognostic value. J Urol, 1996, 155, 321-326. 87.Shiiha H, Igawa M, Nagami H et al. Immunohistochemical analysis of proliferating cell nuclear antigen, p53 protein and nm23 protein and nuclear DNA content in transitional cell carcinoma of the bladder. Cancer, 1996, 78, 1762-1774. 88.Knowles MA, Elder PA, Williamson M et al. Allelotype of human bladder cancer. Cancer Res, 1994, 54, 531-538. 89. Cairns P, Shaw ME, Knowles MA. Initiation of bladder cancer may involve deletion of a tumour-supressor gene on chromosome 9. Oncogene 1993, 8, 1083-1085 90. Knowles MA. The genetics of transitional cell carcinoma: progress and potential clinical application. BJU Int, 1999, 84, 412-427. 91.Xu HJ, Cairns P, Hu SX et al. Loss of RB protein expression in primary bladder cancer correlates with loss of heterozygosity at the RB locus and tumour progression. Int J Cancer, 1993, 53, 781-784. 88

92.Cordon-Cardo C, Dalbagni G, Saez GT et al. p53 mutations in human bladder cancer: genotypic versus phenotypic patterns. Int J Cancer, 1994, 56, 347-353 93. Ishikawa J, Xu HJ, Hu SX et al. Inactivation of the retinoblastoma gene in human bladder and renal carcinomas. Cancer Res 1991, 51, 5736-5743. 94. Cordon-Cardo C, Wartinger D, Petrylak D et al. Altered expression of the retinoblastoma gene product:prognostic indicator in baldder cancer. J Natl Cancer Inst, 1992, 84, 1251-1256. 95.Logothesis CJ, Xu HJ, Ro JY et al. Altered expression of retinoblastoma prothein and known prognostic variables in locally advanced bladder cancer. J Natl Cancer Inst, 1992, 84, 1256-1261. 96. Grossman HB, Liebert M, Antelo M et al. p53 and RB expression predict progression in T1 bladder cancer. Clin Cancer Res, 1998, 4, 829-834. 97.Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B et al. p53 mutations in human cancers. Science, 1991, 253, 49-53. 98. Hollstein, M., Soussi, T., Thomas, G., von Brevern, M.-C., Bartsch, H.: P53 gene alterations in human tumors: perspectives for cancer control. In: Muller-Hermelink, H.K., Neumann, H.G., Dekant, W.: Risk and progresson factors in carcinogenesis. Berlin, Heidelberg, 1997, Springer-Verlag, 394 s. 99. Esring D, Spruck CH, Nichols PW et al. p53 nuclear protein accumulation correlates with mutations in the p53 gene, tumor grade and stage in bladder cancer. Am J Pathol, 1993, 143, 1389-1397 100. Smith ND, Rubenstein JN, Eggener SE et al The p53 tumor suppressor gene and nuclear protein: basic science rewiew and relevance in the management of bladder cancer. J Urol, 2003, 169, 1219-1228. 101. Pfiser C, Buzelin F, Casse C et al. Comparative analysis of MiB1 and p53 expression in human bladder tumor and their correlation with cancer progression. Eur Urol, 1998, 33, 278-284. 102. Spruck, III Ch.H., Ohneseit, P.F., Gonzalez-Zulueta, M. et al.: Two molecular pathways to transitional cell carcinoma of the bladder. Cancer Res, 1994, 54, 784-788. 103. Casetta G, Gontero P, Russo et al. p53 expression compared with other prognostic factors in OMS grade-l stage-ta transitional cell carcinoma of the bladder. Eur Urol, 1997, 32, 229-234. 104. Sarkis AS, Dalbagni G, Cordon-Cardo C et al. Nuclear overexpression of p53 protein in transitional cell bladder carcinoma: a marker for disease progression. J Natl Cancer Inst, 1993, 85, 53-60 105. Esring D, Elmajian D, Groshen S et al. Accumulation of nuclear p53 and tumor progression in bladder cancer. N Engl J Med, 1994, 331, 1259-1264. 106. Hermann GC, Horn T, Steven K. The influence of the level of lamina propria invasion and the prevalence of p53 nuclear accumulation on survival in stage T1 transitional cell bladder cancer. J Urol, 1998,159, 91-98. 107. Vaňte V, Maartmann-Moe H, Hoestmark J. The prognostic value of p53 in superficially infiltrating transitional cell carcinoma. Scand J Urol Nephrol, 1995, 29, 491-497. 108. Sarkis AS, Dalbagni G, Cordon-Cardo C et al. Association of p53 nuclear overexpression and tumor progression in carcinoma in situ of the bladder. J Urol, 1994, 152, 388-393. 109. Sarkis A, Bajorin DF, Reuter VE et al. Prognostic value of p53 nuclear everexpression in patients with invasive bladder cancer treated with neoadjuvant MVAC. J Clin Oncol, 1995, 13, 1384-1390. 89

110. Wu C, Pollack A, Czerniak B et al. Prognostic value of p53 in muscle-invasive bladder cancer treated with preoperative radiotherapy. Urology, 1996, 47, p. 305-111. Ogura K, Habuchi T, Yamada H et al. Immunohistochemical analysisi of p53 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in bladder cancer: positive immunostaining and radiosensitivity. Int J Urol, 1995, 2, 302-309. 112. Peyromaure, M., Weibing, S., Sebe, P. et al. Prognostic value of p53 overexpression in T1G3 bladder tumors treated with bacillus Calmette-Guérin therapy. Urology, 2002, 59, 409-413. 113. Saint, F., Salomon, [_., Quintela, R. et al. Do prognostic parameters of remission versus relapse after bacillus Calmette-Guérin (BCG) immunotherapy exist? Analysis of a quarter century of literature. Eur Urol, 2003, 43, 351-361. 114. Ovesen, H., Horn, T., Steven, K. Long-term efficacy of intravesical bacillus Calmette-Guerin for carcinoma in situ: relationship of progression to histological response and p53 nuclear accumulation. J Urol, 1997, 157, 1655-1659. 115. Schmitz-Drager BJ, Goebell PJ, Ebert T et al. p53 immunohistochemistry as a prognostic marker in bladder cancer, playground for urology scientists? Eur Urol, 2000, 38, 691-700. 116. Lorenzo-Romero, J.G., Salinas-Sánchez, A.S., Giménez-Bachs, J.M. et al. Prognostic implications of p53 gene mutations in bladder tumors. J Urol, 2003, 169, p. 492-499. 117. Stein JP, Ginsberg DA, Grossfeld GD et al. Effect of p21waf1/cip1 expression on tumor progression in bladder cancer. J Natl Cancer Inst, 1998, 90, 1072-1079. 118. Migaldi M, Sgambato A, Garagnani L et al. Loss of p21waf1 expression is a strong predictor of reduced survival in primary superficial bladder cancers. Clin Cancer Res, 2000, 6, 3131-3138. 119. Lipponen P, Aaltomaa S, Eskelinen M et al. Expression of p21 (waf1/cip1) protein in transitional cell bladder tumours and its prognostic value. Eur Urol 1998, 34, p. 237-243. 120. Liukkonen T, Lipponen P, Raitanen M et al. Evaluation of p21waf1/cip1 and cyclin D1 expression in the progression of superficial bladder cancer. Finbladder Group Urol Res 2000, 28, 285-292. 121. Korkolopoulou P, Christodoulou P, Konstantinidou AE et al. Cell cycle regulators in bladder cancer: a multivariate survival study with emphasis on p27kio1. Hum Pathol 2000, 31, 751-760. 122. Tsihlias J, Kapusta L, Slingerland J et al. The prognostic significance of altered cyclin-dependent kinase inhibitors in human cancer. Annu Rev Med, 1999, 50, 401-423. 123. Burton PB, Anderson CJ, Corbishly CM et al. Cascade 3 and p27 as predictors of invasive bladder cancer. N Eng J Med 2000, 343, 1418-1420. 124. Cohen MB, Griebling TL, Ahaghotu CA et al. Cellular adhesion molecules in urologie malignancies. Am J Clin Pathol, 1997, 107, 56-63. 125. Liebert M, Gebhardt D, Wood C et al. Urothelial differentiation and bladder cancer. Adv Exp Med Biol, 1999, 462, 437-448. 126. Birchmeier W. E-cadherin as a tumour (invasion) suppressor gene. Bioessays, 1995, 17, 97-99. 127. Takeichi M. Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Science, 1991, 251, 1451-1455. 90

128. Ozawa M, Kemler R. Molecular organization of the uvomorulin-catenin complex. J Cell Biol, 1992, 116, 989-996. 129. Bringuier PP, Umbas R, Schaafsma HE et al. Decreased E-cadherin immunoreactivity correlates with poor survival in patients with bladder tumours. Cancer Res, 1993, 53, 3241-3245. 130. Fujisawa M, Miyazaki J, Takechi Y et al. The significance of E-cadherin in transitional cell carcinoma of the human urinary bladder. World J Urol, 1996, 14, 12-15. 131. Otto T, Birchmeier W, Schmidt U et al. Inverse relation of E-cadherin and autocrine motility factor receptor expression as a prognostic factor in patients with bladder carcinomas. Cancer Res, 1994, 54, 3120-3123. 132. Shariat SF, Pahlavan S, Baseman AG et al. E-cadherin expression predicts clinical outcome in carcinoma in situ of the urinary bladder. Urology, 2001, 57, p. 60-65. 133. Syrigos KN, Harrington K, Waxman J et al. Altered gamma-catenin expression correlates with poor survival in patients with bladder cancer. J Urol, 1998, 160, 1889-1893. 134. Shimazui T, Schalken JA, Giroldi LA et al. Prognostic value of cadherinassociated molecules (alpha-, beta- and gamma catenins and p120cas) in bladder tumors. Cancer Res, 1996, 56, 4154-4158. 135. Protheroe AS, Banks RE, Mzimba M et al. Urinary concentrations of soluble adhesion molecule E-cadherin and total protein in patients with bladder cancer. Br J Cancer, 1999, 80, 273-278. 136. Campbell SC, Tanabe K, Alexander JP et al. Intercellular adhesion molecule-1 expression by bladder cancer cells: functional effects. J Urol, 1994, 151, 1385-1390. 137. Chow NH, Cheng CJ, Chi YC et al. Potential value of urinary intercellular adhesion molecule-1 determination in patients with bladder cancer. Urology, 1998, 52, 1015-1019. 138. Mungan U, Kirkali G, Celebi I et al. Significance of serum laminin P1 values in patients with transitional cell carcinoma of the bladder. Urology, 1996, 48, 496-500. 139. Lipponen PK. Expression of cathepsin D in transitional cell bladder tumours. J Pathol, 1996, 178, 59-64. 140. Ozer E, Mungan MU, Tuna B. et al. Prognostic significance of angiogenesis and immunoreactivity of cathepsin D and type IV collagen in high-grade stage T1 primary bladder cancer. Urology, 1999, 54, 50-55. 141. lizumi T, liyama T, Tanaka W et al. Immunohistochemical studies of proliferating cell nuclear antigen and cathepsin D in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Urol Int, 1997, 59, 81-87. 142. Hasui Y, Marutsuka K, Osada Y. Prognostic value of urokinase-type plasminogen activator in patients with superficial bladder cancer. Urology, 1996, 47, 34-37. 143. Grignon DJ, Sakr W, Toth M, Ravery V, Angulo J et al. High level of tissue inhibitor of metalloproteinase -2 (TIMT2) expression are associated with poor outcome in invasive bladder cancer. Cancer Res, 1996, 56, 1654-1659. 144. Kanayama H, Yokota K, Kurokawa Y, Murakami Y et al. Prognostic values of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in bladder cancer. Cancer, 1998, 82, 1359-1366. 91

145. Gohji K, Fujimoto N, Ohkawa W, Fujii A et al. Imbalance between serum matrix metalloproteinase-2 and its inhibitor as a predictor of recurrence of urothelial cancer. Br J Cancer, 1998, 77, 650-655. 146. Sauter G, Haley J, Chew K, Kerschmann R. Epidermal groth-factor-receptor expression is associated with rapid tumor proliferation in bladder cancer. Int J Cancer, 1994, 15, 508-514. 147. Messing EM. Clinical implication of the expression of epidermal growth factor receptor in human transitional cell carcinoma. Cancer Res, 1990, 50, 2530-2537. 148. Neal DE, Marsh C, Bennett MK, Abel PD et al. Epidermal growth factor receptors in human bladder cancer: comparison of invasive and superficial tumours. Lancet, 1985, 1, 366-368. 149. Ravery V, Grignon D, Angulo J Pontes E, Montie J et al. Evaluation of epidermal growth factor receptor, transforming growth factor alfa, epidermal growth factor and c-erb B2 in progression of invasive bladder cancer. Urol Res, 1997, 25, 9-17. 150. Sriplakich S, Jahnson S, Kalsson MG. Epidermal growth factor receptor expression: predictive value for the outcome after cystectomy for bladder cancer? BJU int, 1999, 83, 498-503. 151. Messing EM, Murphy-Brooks N. Recovery of epidermal growth factor in voided urine of patients with bladder cancer. Urology, 1994, 44, 502-505. 152. Gazzaniga P, Gandini O, Gradilone A, Silvestři I et al. Detection of basic fibroblast growth factor mrna in urinary bladder cancer: correlation with local relapses. Int J Oncol, 1999, 14, 1123-1127. 153. Edgren M, Lennernas B, Larsson A, Nilsson S. Serum concentration of VEGF and b-fgf in renal cell, prostate and urinary bladder carcinomas, prostate and urinary bladder carcinomas. Anticancer Res, 1999, 19, 869-873. 154. Chopin DK, Caruelle JP, Colombel M, Palcy S et al. Increased immunodetection of acidic fibroblast growth factor in bladder cancer, detecable in urine. J Urol, 1993, 150, 1126-1130. 155. O'Brian TS, Smith K, Cranston D, Fuggle S et al. Urinary basic fibroblast growth factor in patients with bladder cancer and benign prostatic hypertrophy. Br J Urol, 1995, 76, 311-314. 156. Izadifar V, deboer Wl, Muscatelli-Groux B, Maille P et al. Expression of transforming growth factor beta 1 and its receptors in normal human urothelium and human transitional cell carcinomas. Hum Pathol, 1999, 30, 372-377. 157. Tokunaga H, Lee DH, Kim IY, Wheeler TM et al. Decreased expression of transforming growth factor beta receptor type I is associated with poor prognosis in bladder transitional cell carcinoma patients. Clin Cancer Res, 1999, 5, 2520-2525. 158. Thogersen VB, Jorgensen PE, Sorensen BS, Bross P et al. Expression of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor in human bladder cancer. Scand J Clin Lab Invest, 1999, 59, 267-277. 159. Crew JP, O'Brian T, Bicknell R, Fuggle S et al. Urinary vascular endothelial growth factor and its correlation with bladder cancer recurrence rates. J Urol, 1999, 161, 799-804. 160. Ogura Y, Sato K, Kato T, Saito K et al. Immunohistochemical analysis of expression of angiogenic factors and tumor angiogenesis in superficial bladder cancer. Nippon Hinyokika Gakkai Zassi, 1998, 89, 529-537. 161. Basu A, Haldar S. The relationship between Bcl2, Bax and p53:consensus for cell cycle progression and cell death. Mol Hum Reprod, 1998, 4, 1099-1109. 92

162. Kong G, Shin KY, Oh YH et al. Bcl-2 and p53 expression in invasive bladder cancers. Acta Oncol, 1998, 37, 715-720. 163. Plastiras D, Moutzouris G, Barbatis C, Presvelos V et al. Can p53 nuclear over-expression, Bcl-2 accumulation and PCNA status be of prognostic significance in high-risk superficial and invasive tumours? Eur J Surg Oncol, 1999, 25, 61-65. 164. Ju ST, Matsui K, Ozdemirli M. Molecular and cellular mechanism regulating T and B cell apoptosis through Fas/FasL interaction. Int Rev Immunol, 1999, 18, 485-513. 165. Lee SH, Shin MS, Park WS, Kim SY et al. Alteration of Fas (APO-1/CD95) gene in transitional cell carcinomas of urinary bladder. Cancer Res, 1999, 59, 3068-3072. 166. Ambrosi G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, surviving, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med, 1997, 3, 917-921. 167. Swana HS, Grossman D, Anthony JN, Weiss RM et al. Tumor content of the antiapoptosis molecule surviving and recurrence of bladder cancer. New Engl J Med, 1999, 9, 452-453. 168. Fitzgerald KA, Bowie AG, Skeffington BS, O'Neil LA. Ras, protein kinase C zeta, and I kappa B kinases 1 and 2 are down-stream effectors of CD44 during the activation of NF-kappa B by hyaluronic acid fragments in T-24 carcinoma cells. J Immunol, 2000, 164, 2053-2063. 169. van der Poel HG. Markers for recurrence of superficial bladder cancer: What is valid? Curr Opin Urol, 1999, 9, 401-406. 170. Lipponen P, Aaltoma S, Kosma VM et al. Expression of CD 44 standard and variant-v6 proteins in transitional cell bladder tumours and their relation to prognosis during a long-term follow-up. J Pathol, 1998, 186, 157-164. 171. Gerdes J, Lemke H, Baisch, H. Cell cycle analysis of a cell proliferationassociated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol, 133, 1984, 1710-1715. 172. Scholzen T, Gerdes J et al. The Ki-67 protein: from the know and the unknown. J Cell Physiol, 182, 2000, 311-322. 173. Cohen M, Waldman F, Carroll P. et al. Comparison of 5 histopatologic methods to assess cellular proliferation in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Hum Pathol, 24, 1993, 772-8. 174. Popov, Z., Hoznak, A., Colombel, M.: The prognosti value of p53 nuclear overexpression and MIB-1 as a proliferative marker in transitional carcinoma of the bladder. Cancer, 80, 1997, 1472-81. 175. Liukkonen T, Rajala P, Raitanen M, Lipponen P et al. Prognostic value of MIB- 1 score, p53, EGFr, mitotic index and papillary status in primary superficial (stage pta/t1) bladder cancer: a prospective comparative study. Eur Urol, 1999, 36, 393-400. 176. Gontero P, Casetta G, Zitella A, Ballario et al. Evaluation of p53 protein overexpression, Ki-67 proliferative activity and mitotic index as markers of tumour recurrence in superficial transitional cell carcinoma of the bladder. Eur Urol, 2000, 38, 287-296. 177. Wu TT, Chen JH, Lee YH, Huang JK. The role of bcl-2, p53 and Ki-67 index in predicting tumour recurrence for low grade superficial transitional bladder cell carcinoma. J Urol, 2000, 163, 758-760. 93

178. Bravo R, Macdonald-Bravo H. Changes in the nuclear distribution of cyclin (PCNA) but not its synthesis depends on DNA replication. EMBO J, 1985, 4, 655-661. 179. Cohen MB, Waldman FM, Carroll PR et al. Comparison of 5 histopathologic methods to assess cellular proliferation in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Hum Pathol, 1993, 24, 772-778. 180. Blasco-Olaetxea E, Belloso L, Garcia-Tamayo J. Superficial bladder cancer: study of the proliferative nuclear fraction as a prognostic factor. Eur J Cancer, 1996, 32, 444-446. 181. Freeman A, Morris LS, Mills AD, Stoeber K et al. Minichromosome maintenance proteins as biological markers of dysplasia and malignancy. Clin Cancer Res, 1999, 5, 2121-2132. 182. Stoeber K, Halsall I, Freeman A, Swinn R et al. Immunoassay for urothelial cancers that detects DNA replication protein Mcm5 in urine. The Lancet, 1999, 354, 1524-1525. 183. Folkman J, Clinical aplication of research of angiogenesis. N Engl J Med 1995, 333, 1757-1763. 184. Folkman J, Tumor angiogenesis: a possible control point in tumor growth. Am Int Med 1971, 82, 96-100. 185. Bouck N, Stellmach V, Hsu S. How tumors become angiogenic. Adv Cancer Res 1996, 69, 135-141. 186. Folkman J. The role of angiogenesis in tumor growth. Cancer Biol 1992, 3, 65-69. 187. Effert P, Gastl G, Strohmeyer T. Current and future strategies to block tumor angiogenesis, invasion, and metastasis. World J Urol 1996, 14,131-140. 188. Liotta L, Kleinerman J, Saidel G. Quantitative relationship of intravascular tumor cells, tumor vessels, and pulmonary metastases following tumor implantation. Cancer Res 1974, 34,997-1004 189. Weidner N, Semple J, Welch W, Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis- correlation in invasive breast carcinoma. N Engl Med 1991, 324, 1-8. 190. Offersen B, Borre M, Overgaard J. Quantification of angiogenesis as a prognostic marker in human carcinomas: a critical evaluation of histopatological methods for estimation of vascular density. Eur J Cancer 2003, 39, 881-890. 191. Weidner N, Carrol P, Flax J, Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastases in invasive prostate carcinoma. Amer J Path 1993, 143, 401-409. 192. Weidner N, Folkman J, Pozza F. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 1992, 84, 1875-1887. 193. Barnhill R, Fandrey K, Levy M. Angiogenesis and tumor progression of melanoma. Quantification of vascularity in melanocytic nevi and cutaneous malignant melanoma. Lab Invest 1992, 67, 331-337. 194. Macchiarini P, Fontanini G, Hardin M. Relation of neovascularization to metastasis of non-small-cell lung cancer. Lancet 1992, 340, 145-146. 195. Wiedner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer. Am J Path 1995, 147, 9-19. 196. Dickinson A, Fox S, Persad R. Quantification of angiogenesis as an independent predictor of prognosis in invasive bladder carcinomas. Br J Urol 1994, 74, 762-766. 94

197. Bochner B, Cote R, Wiedner N et al. Angiogenesis in bladder cancer: relationship between microvessel density and tumor prognosis. J Natl Cancer Inst 1995, 87, 1603-1612. 198. Jeager T, Weidner N, Chew K et al. Tumor angiogenesis correlates with node metastases in invasive bladder cancer. J Urol 1995, 154, 69-74 199. Crew J, O'Brien T, Harris A. Bladder cancer nagiogenesis, its role in recurrence, stage progression and as a therapeutic target. Cancer Metastasis Rev 1996, 15, 221-227. 200. Dinney C, Babkowski R, Antelo M et al. Relationship among cystectomy, microvessel density and prognosis in stage T1 transitional cell carcinoma of the bladder. J Urol 1998, 160, 1285-1290. 201. Grossfelfd GD, Ginsberg DA, Stein JP, Bochner BH et al. Thrombospondin-1 expression in bladder cancer: association with p53 alterations, tumor angiogenesis, and tumor progression. J Natl Cancer Inst, 1997, 89, 219-227. 202. Rastinejad F, Polverini P, Bouck N. Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer supressor gene. Cell 1989, 56: 345-355. 203. Dameron K, Volpert O, Tainsky M et al. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Science 1994, 265: 1582-1584. 204. Reiher F, Ozer O, Pins M et al. p53 and microvessel density in primary resection specimens of superficial bladder cancer. J Urol 2002, 167: 1469-1474. 205. Vermuelen P, Gasparini G, Fox S et al. Quantification of angiogenesis in solid human tumors: an international consensus on the methodology and criteria of evaluation. Eur J Cancer 1996, 32: 2474-2484. 206. Zimmern P, Laub D, Leach G. Flurescein angiography of the bladder: technique and relevance to bladder cancer and interstitial cystitis patients. J Urol 1995, 154: 62-68 207. Volpert O, Dameron K, Bouck N. Sequential development of an angiogenic fenotype by human fibroblasts progressing to tumorigenicity. Oncogene 1997, 14: 1495-1501 208. Sidransky D, Frost P, Von Eschenbach A et al. Clonal origin bladder cancer. N Engl J Med, 1992, 326, 737-740 209. Takahashi T, Habuchi T, Kakehi Y et al. Clonal and chronological genetic analysis of multifocal cancers of the bladder and upper urinary tract. Cancer Res, 1998, 58, 5835-5841. 210. Fadl-Elmula I, Gorunova L, Mandahl N et el. Cytogenetic monoclonality in multifocal uroepithelial carcinomas: evidence of intraluminal tumor seeding. Br J Cancer, 1999, 81, 6-12. 211. Heney NM, Daly J, Prout GR et al. Biopsy of apparently normal urothelium in patients with bladder carcinoma. J Urol, 1978, 120, 559-560. 212. Igawa M, Urakami S, Shirakawa H et al. A mapping of histology and cell proliferation in human bladder cancer: an immunohistochemical study. Hiroshima J Med Sci,1995, 44, 93-97. 213. Koss LG: Mapping of the urinary bladder: its impact on the concepts of bladder cancer. Hum Pathol, 1979, 10, 533-548. 214. Stoehr R., Zietz S., Burger M et al. Deletions of chromosomes 9 and 8p in histologically normal urothelium of patients with bladder cancer. Eur. Urol., 2005, 47,58-63. 215. Pycha A, Mian C, Hofbauer J et al. Multifocality of transitional cell carcinoma results from genetic instability of entire transitional epithelium. Urology, 1999, 53, 92-97 95

216. Spruck CH III, Ohneseit PF, Gonzales-Zulueta M et al. Two molecular pathways to transitional cell carcinoma of the bladder. Cancer Res, 1994, 54, 784-788. 217. Sidransky D, Von Eschenbach A, Tsai YC et al. Identification of p53 gene mutations in bladder cancers and urine samples. Science, 1991, 252, 706-709 218. Dalabaghi G, Presti JC, Reuter VE et al. Molecular genetic alterations of chromosome 17 and p53 nuclear overexpression in human bladder cancer. Diagn Mol Pathol, 1993, 2,4-13. 219. Urbánek P, Wang Z-Q, Fetka I, Wagner EF et al.: Complete block of early B cell differentiation and altered patterning of the posterior midbrain in mice lacking Pax5/BSAP. Cell, 2004, 79, 901-912. 220. Nutt SL, Thevenin C and Busslinger M: Essential functions of Pax-5 (BSAP) in pro-b cell development. Immunobiol, 1997, 198, 227-235. 221. Stuart ET, Kioussi Ch, Aguzzi A et a!.: PAX5 expression correlates with increasing malignancy in human astrocytomas. Clinical Cancer Res, 1995, 1, 207-214. 222. Kozmik Z, Sure U, Ruedi D et al. Deregulated expression of PAX5 in medulloblastoma. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92, 5709-5713. 223. Tiacci E, Pileri S, Orleth A et al.: PAX5 expression in acute leukemias: higher B-lineage specificity than CD79a and selective association with t(8;21)-acute myelogenous leukemia. Cancer Res, 2004, 64, 7399-7404. 224. Baumann Kubetzko FB, Di Paolo C, Maag C et al.: The PAX5 oncogene is expressed in N-type neuroblastoma cells and increases tumorigenicity of a S-type cell line. Carcinogenesis, 2004, 25, 1839-1846. 225. Adshead JM, Ogden CW, Penny MA et al. The expression of PAX5 in human transitional cell carcinoma of the bladder: relationship with de-differentiation. British J Urol International, 1999, 83, 1039-1044. 226. Sobin LH and Wittekind C: UICC TNM classification of malignant tumours, 5 th ed. New York, Wiley Liss, 1997, pp 187-190. 227. Maulbecker CC and Gruss P: The oncogenic potential of Pax genes. EMBO J, 1993, 12, 2361-2397. 228. Scháfer BW: Emerging roles for PAX transcription factors in cancer biology. Gen Physiol Biophys, 1998, 17, 211-224,. 229. Muratovska A, Zhou Ch, He S et al.: Paired-Box genes are frequently expressed in cancer and often required for cancer cell survival. Oncogene, 2003, 22, 7989-7997. 230. Orlow I, Lianes P, Lacombe L et al.: Chromosome 9 allelic losses and microsatellite alterations in human bladder tumors. Cancer Res, 1994, 54, 2848-2851. 231. Fleming ID, Cooper IS, Henson DE, Hutter RVPet al. American Joint Committee on Cancer, cancer staging manual. Philadelphia Raven and Lippincon, 1997 232. Catalona WJ, Dresner SM, Haaff EO: Management of superficial bladder cancer, in Skinner DG, and Lieskovsky G (Eds): Diagnosis and Management of Genitourinary Cancer. New York Alan R. Liss 1988, 284-294. 233. Smits G, Schaafsma E, Kiemeney L, et al: Microstaging of pt1 transitional cell carcinoma of the bladder: identification of subgroups with distinct risk of progression. Urology, 1998, 52, 1009-1014. 234. Dixon JS, Gosling JA: Histology and fine structure of the muscularis mucosae of human urinary bladder. J Anat, 1983, 136, 265-269. 96

235. Keep JC, Piehl M, Miller A, et al: Invasive carcinomas of the urinary bladder. Evaluation of tunica muscularis mucosal involvement. Amer J Clin Pathol, 1989, 91, 575-579. 236. Younes M, Sussman J, True LD, et al: The usefulness of the level of the muscularis mucosae in staging of invasive transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Cancer, 1990, 66, 543-547. 237. Yamashiro S, Matsumura F: Intracellular localization of the 55-kD actin-binding protein in cultured cells: spatial relationships with actin, alpha-actin, tropomyosin and fimbrin. J Cell Biol, 1986, 103, 631-640. 238. Edwards RA, Bryan J: Fascins, a family of actin bundling proteins. Cell Motil Cytoskeleton, 1995, 32, 1-9. 239. Saishin Y, Shimada S, Morimura H, et al: Isolation of a cdna encoding a photoreceptor cell-specific actin-bundling protein: retinal fascin. FEBS Lett, 1997, 414, 381-386. 240. Tubb BE, Bardien-Kruger S, Kashork CD, et al: Characterisation of Human retinal fascin gene (FSCN2) at 17q25: close physical linkage of fascin and cytoplasmic actin genes. Genomic, 2000, 65, 146-156. 241. Duh FM, Latif F, Weng Y, et al: cdna cloning and expression of the human homolog of the sea urchin fascin and Drosophila signed genes which encodes actin-bundling protein. DNA Cell Biol, 1994, 13, 821-827. 242. Pelosi G, Pastorino U, Pasini F, et al: Independent prognostic value of fascin immunoreactivity in stage I non small cell lung cancer, 2003, 88, 537-547. 243. Grothey A, Hashizume R, Sahin AA, et al: Fascin, an actin-bundling protein associated with cell motility, is upregulated in hormone receptor negative breast cancer. Br J Cancer, 2000, 83, 870-873. 244. Maitra A, Adsay NV, Argani P, et al: Multicomponent analysis of the pancreatic adenocarcinoma progression model using a pancreatic intraepithelial neoplasia tissue microarray. Mod Pathol, 2003, 16, 902-912. 245. Jawhari AU, Buda A, Jenkins M, et al: Fascin, an actin bundling protein, modulates colonic epithelial cell invasiveness and differentiation in vitro. Am J Pathol, 2003, 162, 69-80. 246. Hu W, McCrea PD, Deavers M, et al: Increased expression of fascin, motility associated protein, in cell cultures derived from ovarian tumors. Clin Exp Metastasis, 2000, 18, 83-88. 247. Goncharuk VN, Ross JS, Carlson JA, et al: Actin-binding protein fascin expression in skin neoplasia. J Cutan Pathol, 2002, 29, 430-438. 248. Tong GX, Yee H, Chiriboga L, et al: Fascin-1 expression in papillary and invasive urothelial carcinomas of the urinary bladder. Human Pathol, 2005, 36, 741-746. 249. Platz CE, Cohen MB, Jones MP, et al: Is microstaging of early invasive cancer of the urinary bladder possible or useful? Mod Pathol, 1996, 9, 1035-1039. 97

8. SEZNAM PRACÍ PUBLIKOVANÝCH K TÉMATU DISERTAČNÍ PRÁCE: Soukup, Viktor - Pecherová, Stefana - Babjuk, Marko - Smolová, Helena - Marek, Josef - Dvořáček, Jan a Novák, Jaroslav: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Carcinoma in situ močového měchýře. Carcinoma in situ urinary bladder. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2000, 4, 3, s. 20-20. Pracovní konference ČUS. ČR, Liberec, 6.-7.10.2000. Předmětové zatřídění: urologie Babjuk, Marko - Mareš, J. - Soukup, Viktor - Trková, M. - Sedláček, Z. - Dvořáček, Jan - Jarolím, Ladislav a Novák, Jaroslav: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Sledování exprese genu PAX 5 u nádorů močového měchýře. Expression of the PAX 5 gene in urinary bladder tumors. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2001, V, 4, s. 17-17. Výroční konference České urologické společnosti. ČR, Brno, 10.-12.10 2001. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie. Anotace: Urologie, onkologie, ondoskopie. - Urological, oncology. NC5961, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Trková, Marie - Dušková Jaroslava - Sedláček, Z. - Dvořáček, Jan - Jarolím, Ladislav a Novák, Jaroslav: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Hodnocení patologie tumor supresorového genu TP53 u uroteliálních nádorů močového měchýře. Evaluation of pathology of tumor suppressor gene TP53 in urotelial tumors of the urinary bladder. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2001, 5, 4, s. 17-17. Výroční konference České urologické společnosti. ČR, Brno, 10.-12.10.2001. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie - genetika. Anotace: Urologoie - onkologie. - Urological oncology. NC5961, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Mareš, J. - Dušková, Jaroslava - Sedláček, Z. - Trková, M. - Novák, Jaroslav a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Prognostický význam exprese genu PAX5 a patologie genu P53 ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. Significance of the expression PAX5 gene and pathology P53 gene in superficial bladder tumors. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2002, 6, 2, s. 27-27. 14. Kongres České urologické společnosti JEP a Slovenské urologické společnosti s Výroční konferencí Pediatrické sekce. ČR, Hradec Králové 26.-28.9.2002. Předmětové zatřídění: urologie. Anotace: PAX5 gen, P53 gen, povrchový nádor močového měchýře. - PAX5 gene, P53 gene, superficial bladder tumor. MSM 111100005, NC5961, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Mareš, J. - Dušková, Jaroslava - Sedláček, Z. - Trková, M. - Pecen, L. - Dvořáček, Jan - Hanuš, Tomáš - Kočvara, Radim - 98

^ Novák, Jaroslav a Povýšil, Ctibor: (I - původní článek ve vědeckém / odborném časopise - eng) The expression of PAX5, p53 immunohistochemistry and p53 mutation analysis in superficial bladder carcinoma tissue. Correlation with pathological findings and clinical outcome. In: International Urology and Nephrology, Nizozemí, 0301-1623, 2002, 34, 3, s. 495-501. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie. Anotace: HSCORE, PAX5 gene, p53 immunohistochemistry, p53 mutation analysis, Superficial bladder TCC. - MSM 111100005, NC5961, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Mareš, J. - Sedláček Josef - Dušková, Jaroslava et al.: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eng) Expression of the developmental control gene PAX5 in bladder transitional cell carcinoma, its prognostic value and correlation with p53 immunohistochemistry and p53 mutation analysis. In: BJU International (British Journal of Urology International), Velká Británie, 1464-4096, 2002, 90, Suppl. 2, s. 82-82. 26th Congress of the Societě Internationale d 'Urologie (SIU). Švédsko, Stockholm, 8.-12.9.2002. Předmětové zatřídění: urologie. IF = 1.864 (2002) Anotace: Oncogenes p53, bladder tumor. - ND6854, NC5961, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Mareš, Jan - Sedláček, Z. - Dušková, Jaroslava a Dvořáček, Jan: (abstrakt ve sborníku - cze) Prognostický význam exprese genů PAX5 a Shb ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. Prognostic value of the expression of the genes PAX5 and Shb in the tissue of the TCC of the bladder. Jitka Abrahámová (Ed.): In: Vybrané otázky onkologie VI. ČR, Praha, 2002, s. 20-22. 10. Onkologicko-urologické sympozium a 6. Mammologické sympozium. ČR, Praha 28.- 29.11.2002. Galén. 80-7262-196-3 Předmětové zatřídění: urologie - onkologie Anotace: Nádor z přechodního epitelu, genetika, močový měchýř. - TCC, genetics, bladder. MSM 111100005, NC5961, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - Dvořáček, Jan a Povýšil, Ctibor: (abstrakt ve sborníku - cze) Imunohistochemická detekce p53 a mikrovaskulární denzity ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. Immunohistochemical detection of p53 and microvascular density in the tissue of the TCC of the bladder. Jitka Abrahámová (Ed.): In: Vybrané otázky onkologie VI. ČR, Praha, 2002, s. 23-25. 10. onkologicko-urologické sympozium a 6. mammologické sympozium. ČR, Praha, 28.-29.11.2002. Galén. 80-7262-196-3 Předmětové zatřídění: urologie Anotace: Nádor z přechodního epitelu, genetika, močový měchýř. - TCC, genetics, bladder. 99

MSM 111100005, NC5961, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - Novák, Jaroslav - Stolz, Jozef - Votoček, Emil a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Malobuněčný karcinom prostaty a močového měchýře. Oat - cell cancer of the prostate and the bladder. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2002, 6, 2, s. 75-76. 14. Kongres České urologické společnosti JEP a Slovenské urologické společnosti s Výroční konferencí Pediatrické sekce České urologické společnosti. ČR, Hradec Králové, 26.-28.9.2002. Předmětové zatřídění: urologie. Anotace: Karcinom, prostata, močový měchýř. - Cancer, prostate, bladder. MSM 111100005, NC5961, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Mareš, J. - Sedláček, Z. - Dušková, Jaroslava a Dvořáček, Jan: (abstrakt ve sborníku - eng) Expression of the developmental control gene PAX5 in bladder transitional cell carcinoma, its prognostic value and correlation with p53 immunohistochemistry and p53 mutation analysis. In: European School of Urology. Nizozemí, 2002, s. A203-A203. 2nd Central European Meeting. SR, Bratislava, 2002. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie Anotace: TCC of the bladder, genetics. - ND6854, NC 5961-3, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Dušková, Jaroslava - PešI, Michal - Dvořáček, Jan a Povýšil, Ctibor: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Prognostický význam semikvantitativního hodnocení exprese proteinu P53 u povrchových nádorů močového měchýře. Prognostic value of the semiquantitative evaluation of the expression of protein P53 in superficial bladder cancer. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2003, 7, 3, s. 35-35. Výroční konference ČUS ČLS JEP s kursem Evropské školy urologie. ČR. Ostrava, 1.-3.10.2003. Předmětové zatřídění: urologie. Anotace: Povrchové nádory močového měchýře. - Superficial bladder cancer. MSM 111100005, NC5961, ND6854, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Mareš, J. - Dušková, Jaroslava - Sedláček, Z. - Trková, M. - Dvořáček, Jan - Hanuš, Tomáš - Novák, Jaroslav a Povýšil, Ctibor: (I - původní článek ve vědeckém / odborném časopise - cze) Exprese genů PAX 5 a Shb, analýza mutací genu p53 a exprese proteinu p53 ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. PAX 5 and Shb expression, P53 mutation analysis and P53 expression in superficial bladder cancer. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2003, 7, 2, s. 26-30. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie. Anotace: Povrchové nádory močového měchýře, Exprese genu PAX5, Exprese genu Shb. - Superficial urinary bladder cancers, PAX 5 gene expression, Shb gene 100

expression. NC5961, Mareš, J. - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - Sedláček, Z. - Soukup, Viktor - Trková, M. a Goetz, P.: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eng) Expression of PAX5, p53 immunohistochemistry and p53 mutation analysis in superficial bladder carcinoma tissue. In: European Journal of Human Genetics, Velká Británie, 1018-4813, 2003, 11, Suppl. 1, s. 74-74. European Human Genetics Conference 2003. Velká Británie, Birmingham, 3.-6.5.2003. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie. IF = 3.669 (2003) Anotace: Bladder cancer, oncology. - NC5961, PešI, Michael - Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - Dvořáček, Jan a Povýšil Ctibor: (abstrakt příspěvku ve sborníku - eng) Ptlsubclassification as a prognostic factor of superficial urinary bladder tumor. In: Proceedings. Nizozemí, Arnhem, 2003, s. 118-118. ESU 3rd Central European Meeting. Polsko, Krakov, 6.-7.11.2003. European School of Urology. Předmětové zatřídění: urologie Anotace: Urology, oncology. - Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dundr, Pavel - Polák, S. - Hanuš, Tomáš - Zámečník, Libor - Dvořáček, Jan a Povýšil, Ctibor: Dlaždicobuněčný karcinom močového měchýře. Squamous cell carcinoma of the urinary bladder. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2003, 7, 4, s. 25-27. Předmětové zatřídění: urologie. Anotace: Dlaždicobuněčný karcinom, karcinom močového měchýře. - Squamous cell carcinoma, carcinoma of the urinary bladder. MSM 111100005, ND6854, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - Dvořáček, Jan a Povýšil, Ctibor: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eze) Prognostický význam PT1 subtypizace povrchových nádorů močového měchýře. Prognostic evaluatin of the PT1 subtype of the superficial bladder cancer. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2003, 7, 3, s. 36-36. Výroční konference ČUS ČLS JEP s kursem Evropské školy urologie. ČR, Ostrava, 1.-3.10.2003. Předmětové zatřídění: urologie. Anotace: Prognostický význam subtypizace pt1 nádorů močového měchýře. - Prognostic evaluation of the PT1 subtype, superficial bladder cancer. MSM 111100005, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková Jaroslava - Novák, Jaroslav - Votoček, Emil - Dvořáček, Jan a Povýšil, Ctibor: Malobuněčný karcinom močového měchýře. Small cell carcinoma of urinary bladder case report. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2003, 7, 1, s. 21-24. 101

Předmětové zatřídění: urologie - onkologie. Anotace: Malobuněčný karcinom, karcinom močového měchýře. - Small cell carcinoma, Carcinom of the bladder. MSM 111100005, NC5961, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor: (II - přehledový článek ve vědeckém / odborném časopise - cze) Intravezikální léčba povrchových nádorů močového měchýře. Intravesical treatment of superficial bladder tumors. In: Urologie pro praxi, ČR, 1213-1768, 2004, 5, 3, s. 116-120. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie. Anotace: Povrchové nádory močového měchýře, recidiva, progrese, chemoterapie, imunoterapie. - Superficial bladder tumors, recurrence, progression, chemotherapy, immunotherapy. Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Jirsa, Milan - Petřík, Radko a Dvořáček, Jan: (stať ve sborníku - cze) Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Mareš, J. - Trková, M. - Dušková, Jaroslava a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Prognostický význam exprese genu PAX5 ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. Výsledky 4letého sledování u 76 pacientů. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2004, 8, 2, s. 33-33. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP. ČR, Uherské Hradiště, 26.-28.5.2004. Předmětové zatřídění: urologie. MSM 111100005, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Mareš, J. - Trková, M. - Sedláček, Z. - PešI, Michal - Dvořáček, Jan a Dušková, Jaroslava: (stať ve sborníku - cze) Exprese genu PAX5 a patologie genu TP53 ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. Gene PAX5 expression and patology of TP53 in superficial bladder tumor tissue. Abrahámové, Jitka: In: Vybrané otázky onkologie 8. ČR, Praha, 2004, s. 25-26. 12. Onkologicko-urologické sympozium a 8. Mamologické sympozium. ČR, Praha, 24.-26.11.2004. Galén. 80-7262-296-X Předmětové zatřídění: urologie Anotace: urologie -onkologie. - urology-oncology. MSM 111100005, NR8095, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - PešI, Michal - Mareš, J. - Dvořáček, Jan a Hanuš, Tomáš: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eng) Association of developmental control gene PAX5 expression and clinical outcome in patients with superficial transitional cell carcinoma (TCC) of the bladder. In: BJU International (British Journal of Urology International), Velká Británie, 1464-4096, 2004, 94, Suppl. 2, s. 17-17. 27th SIU. USA, Honolulu (HI), 3.- 7.10.2004. Předmětové zatřídění: urologie. IF = 2.089 (2004) MSM 111100005, NR8095, 102

Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Trková, Marie - Sedláček, Zdeněk - Mareš, Jaroslav - Dušková, Jaroslava a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Mutace genu P53 ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. In: Urológia, SR, 1335-3071, 2004, 10, 2, s. 20-20. 15. Kongres Slovenskej urologickej spoločnosti a České urologické společnosti s medzinárodnou účasťou a s kurzom ESU. SR, Bratislava, 8.-10.9.2004. Předmětové zatřídění: urologie. PešI, Michal - Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Sedláček, Z. - Trková, M. - Mareš, J. a Dvořáček, Jan: (abstrakt příspěvku ve sborníku - eng) Prognostic value of p53 mutation analysis in patients with superficial. In: Proceedings. Nizozemí, Arnhem, 2004, s. 150-150. European Association of Urology - 4th Central European Meeting. Rumunsko, Bukurešť, 21.- 22.10.2004. European Association of Urology. Předmětové zatřídění: urologie NR8095, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - PešI, Michal - Dvořáček, Jan a Povýšil, Ctibor: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Imunohistochemická detekce mikrovaskulární denzity ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2004, 8, 2, s. 34-36. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP. ČR, Uherské Hradiště, 26.-28.2004. Předmětové zatřídění: urologie. MSM 111100005, NC5961, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - PešI, Michal - Dvořáček, Jan a Povýšil, Ctibor: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) P53 pozitivita v nenádorové sliznici u pacientů s povrchovým uroteliálním karcinomem močového měchýře. In: Urológia, SR, 1335-3071, 2004, 10, 2, s. 20-20. 15. Kongres Slovenskej urologickej spoločnosti a České urologické společnosti s medzinárodnou účasťou a s kurzom ESU. SR, Bratislava, 8.-10.9.2004. Předmětové zatřídění: urologie. Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - PešI, Michal - Dvořáček, Jan a Povýšil, Ctibor: (stať ve sborníku - cze) Prognostický význam T1 subtypizace ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. Prognostic value of T1 subcategory in the superficial bladder tumor tissue. Jitka Abrahámové (Ed.): In: Vybrané otázky onkologie 8. sborník statí. ČR, Praha, 2004, s. 21-22. 12. Onkologicko-urologické sympozium a 8 mamologické sympozium. ČR, Praha, 24.-26.11.2004. Galén. 80-7262-296-X Předmětové zatřídění: urologie Anotace: Urologie, onkologie. - Urology, oncology. 103

MSM 111100005, NC5961, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - PešI, Michal - Dvořáček, Jan - Dušková, Jaroslava a Dundr, Pavel: (abstrakt příspěvku ve sborníku - eng) Immunohistochemical detection of microvascular density in tissue of superficial urinary bladder carcinoma, relationship between microvascular density and nuclear p53 accumulation. In: Proceedings. Nizozemí, Arnhem, 2004, s. 151-151. European Association of Urology 4th Central European Meeting. Rumunsko, Bukurešť, 21.-22.10.2004. European Association of Urology. Předmětové zatřídění: urologie MSM 111100005, NC8095, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Petřík, Radko - Jirsa, Milan a Dvořáček, Jan: (I - původní článek ve vědeckém / odborném časopise - eng) 5-aminolaevulinic acid-induced fluorescence cystoscopy during transurethral resection reduces the risk of recurrence in stage Ta /T1 bladder cancer. In: BJU International (British Journal of Urology International), Velká Británie, 1464-4096, 2005, 96, 6, s. 798-802. 5-aminolevulová kyselina ve fluorescenční cystoskopii prováděné během transuretrální resekce redukuje riziko recidivy nádorů Ta/T1 Předmětové zatřídění: urologie. IF = 2.171 (2005) Anotace: Urology - oncology. - - urologie - onkologie NR8095, ND6854, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Petřík, Radko - Pavlík, Ivan - Jirsa, Milan - Dvořáček, Jan a Pecen, L.: (I - původní článek ve vědeckém / odborném časopise - cze) Fluorescenční cystoskopie a její místo v diagnostice a léčbě povrchových nádorů močového měchýře. Fluorescence Cystoscopy in the Diagnostics and Treatment of Superficial Urinary Bladder Tumors. In: Časopis lékařů českých, ČR, 0008-7335, 2005, 144, Suppl. 2, s. 15-18. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie Anotace: uroteliální karcinom močového měchýře, diagnostika, fluorescenční cystoskopie. - urotelial urinary bladder carcinoma, diagnostics, fluorescence cystoscopy. MSM 0021620808, ND6854, NR8095, PešI, Michal - Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Pavlík, Ivan a Dvořáček, Jan: (abstrakt příspěvku ve sborníku - eng) Survivin in nonivasive diagnosis of transitional cell carcinoma of the urinary bladder. In: Proceedings. ČR, 2005, s. 74-74. EAU 5th Central European Meeting. European Association of Urology. Předmětové zatřídění: urologie MSM0021620808, NC8095, PešI, Michal - Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Smolová, Helena - Dušková, Jaroslava - Dundr, Pavel - Dvořáček, Jan - Hanuš, Tomáš - Pavlík, Ivan - Šafařík, Libor et al.: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) 104

Primozáchyty tumorů močového měchýře. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2005, 9, 2, s. 18-19. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP s kurzy ESU a ESPU. ČR, Praha, 12.- 14.10.2005. Předmětové zatřídění: urologie MSM0021620808, NC8095, Soukup, Viktor: (monografie - cze) Nádory močového měchýře. Vzácné nádory močového měchýře. Rare tumors of the bladder. Jan Dvořáček - Marko Babjuk et al.: In: Onkourologie. ČR, Praha, 2005, s. 218-224. 1. vydání, Galén - Karolinum. 80-7262-349-4 (Galén) - 80-246-1108-2 (Karolinum) Předmětové zatřídění: urologie - onkologie Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - PešI, Michal a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Prognostický význam T1 subtypizace ve tkáni povrchových nádorů močového měchýře. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2005, 9, 2, s. 19-19. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP s kurzy ESU a ESPU. ČR, Praha, 12.- 14.10.2005. Předmětové zatřídění: urologie MSM 0021620808, NC8095, Trková, M. - Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Dušková, Jaroslava - Soukupová, A. - Mareš, J. a Sedláček, Z.: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Klonální původ mnohočetných povrchových uroteliálních nádorů močového měchýře. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2005, 9, 2, s. 28-28. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP s kurzy ESU a ESPU. ČR, Praha, 12.- 14.10.2005. Předmětové zatřídění: urologie Babjuk, Marko - Hanuš, Tomáš - Pavlík, Ivan - Šafařík, Libor - Soukup, Viktor - PešI, Michal a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Onkologické výsledky radikální cystektomie u pacientů s nádory močového měchýře. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2006, 11, 2, s. 43-43. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP. ČR, České Budějovice, 11.-13.10.2006. Předmětové zatřídění: urologie MSM0021620808, Babjuk, Marko - Housková, Lucie - PešI, Michal - Soukup, Viktor - Zemanová, Zuzana - Michalová, Kyra - Dvořáček, Jan a Pavlík, Ivan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eng) Fluorescence in-situ hybridisation (FISH) for the non-invasive bladder cancer detection. In: Urology, USA, 0090-4295, 2006, 68, Suppl. 5A, s. 132-133. 28th Congress of the Société Internationale d'urologie. JAR, Kapské Město, 12.-16.11.2006. 105

Předmětové zatřídění: urologie. IF = 2.139 (2005) MSM0021620808, NR8095, Babjuk, Marko - PešI, Michal - Soukup, Viktor - Housková, Lucie - Tejčková, E. - Pavlík, Ivan a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Neinvazivní diagnostika nádorů močového měchýře metodou FISH a stanovením hladiny survivinu v moči. In: Urológia, SR, 1335-3071, 2006, 11, 2, s. 30-31. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie MSM0021620808, NR8095, Babjuk, Marko - PešI, Michal - Soukup, Viktor - Koštířová, M. - Drncová, E. - Peš, Michal a Dvořáček, Jan: (I - původní článek ve vědeckém / odborném časopise - cze) Využití kvantitativní detekce proteinu blízkého faktoru H komplementu (BTA TRAK) v moči ke sledování pacientů s Ta a T1 uroteliálními nádory močového měchýře. Utilization of quantitative detection of complement factor H - related protein (BTA TRAK) in urine to minitor patients with Ta and T1 urothelial bladder carcinoma. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2006, 10, 3, s. 5-9. Předmětové zatřídění: urologie - onkologie Anotace: Ta a T1 uroteliální karcinomy močového měchýře, dispenzarizace, cystoskopie, BTA TRAK. - Ta and T1 urothelial cell carcinoma of the bladder, surveillance, cystoscopy, BTA TRAK. NR8095, Babjuk, Marko - PešI, Michal - Soukup, Viktor - Koštířová, M. - Tejčková, E. - Pecen, L. a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Význam průběžného hodnocení hladin testů BTA TRAK a UBC IRMA pro sledování pacientů s Ta a T1 nádory močového měchýře. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2006, 10, 2, s. 38-38. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP. ČR, České Budějovice, 11.-13.10.2006. Předmětové zatřídění: urologie NR8095, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Hanuš, Tomáš - Pavlík, Ivan - Šafařík, Libor - Dvořáček, Jan a Macek, Petr: (I - původní článek ve vědeckém / odborném časopise - eng) Ureteroenteric anastomosis in orthotopic ileal neobladder. In: Urologia Polska, Polsko, 0500-7208, 2006, 59, 2, s. 112-114. Ureteroenteritická anastomóza u ortotopických ileálních náhrad močového měchýře Předmětové zatřídění: urologie Anotace: Orthotopic ileal neobladder, ureteroenteric anastomosis. - - Ortotopická ileální náhrada močového měchýře, ureteroenterická anastomóza MSM0021620808, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Koštířová, M. - Tejčková, J. - Dvořáček, Jan a Pavlík, Ivan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eng) 106

Can urinary BTA TRAK and UBC IRMA predict the risk of recurrence in patients with Ta T1 bladder transitional cell carcinoma (TCC)? In: European Urology, Švýcarsko, 0302-2838, 2006, 1, 1, s. 19-19. EAU 6th Central European Meeting. ČR, Praha, 15.-16.9.2006. Předmětové zatřídění: urologie. IF = 3.542 (2005) ND8095, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Mareš, Jaroslav - Dušková, Jaroslava - Pecen, Ladislav - PešI, Michal - Pavlík, Ivan a Dvořáček, Jan: (I - původní článek ve vědeckém / odborném časopise - eng) Association of PAX5 expression with clinical outcome in patients with TaT1 transitional cell carcinoma of the bladder. In: Urology, USA, 0090-4295, 2006, 67, 4, s. 756-761. Význam exprese PAX5 genu pro klinické výsledky léčby pacientů s TaT1 nádory močového měchýře z přechodního epitelu Předmětové zatřídění: urologie - onkologie. IF = 2.139 (2005) Anotace: Association of Pax5 expression, clinical outcome. - - Význam exprese PAX5 genu, klinické výsledky MSM0021620808, NR8095, Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - PešI, Michal - Koštířová, Milada - Tejčková, E. - Dvořáček, Jan a Pavlík, Ivan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eng) The role of sequential evaluation of BTA TRAK and UBC IRMA in urine during followup in patients with Ta T1 bladder transitional cell carcinoma (TCC). In: Urology, USA, 0090-4295, 2006, 68, Suppl. 5A, s. 132-132. 28th Congress of the Société Internationale d'urologie. JAR, Kapské Město, 12.-16.11.2006. Předmětové zatřídění: urologie. IF = 2.139 (2005) NR8095, PešI, Michal - Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Pavlík, Ivan a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eng) Urine survivin in non-invasive diagnosis of transitional cell carcinoma of the urinary bladder. In: European Urology Supplements, Švýcarsko, 1569-9056, 2006, 5, 2, s. 822-822. Annual EAU Congres. Francie, Paříž, 5.-8.4.2006. Předmětové zatřídění: urologie. IF = 3.536 (2005) MSM0021620808, NC8095, NR8934, PešI, Michal - Babjuk, Marko - Soukup, Viktor - Smolová, Helena - Dušková, Jaroslava - Dundr, Pavel - Pavlík, Ivan a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Hodnocení souboru pacientů s povrchovými tumory močového měchýře. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2006, 11, 2, s. 42-42. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP. ČR, České Budějovice, 11.-13.10.2006. Předmětové zatřídění: urologie MSM0021620808, NR8095, NR8934, PešI, Michal - Soukup, Viktor - Szakacsová, Monika - Dvořáček, Jan a Mareš, J.: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eng) Prognostic value of BCL2 gene expression in the tissue of superficial urothelial 107

carcinoma of the urinary bladder. In: European Urology, Švýcarsko, 0302-2838, 2006, 1, 1, s. 23-23. EAU 6th Central European Meeting Prague. ČR, Praha, 15.-16.9.2006. Předmětové zatřídění: urologie. IF = 3.542 (2005) MSM0021620808, NR8934, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - PešI, Michal - Szakácsová, Monika - Dvořáček, Jan a Mareš, J.: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Prognostický význam exprese genu PAX5 ve tkáni povrchového uroteliálního karcinomu močového měchýře. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2006, 11, 2, s. 40-40. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP. ČR, České Budějovice, 11.-13.10.2006. Předmětové zatřídění: urologie MSM0021620808, NR8934, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - PešI, Michal - Szakácsová, Monika - Dvořáček, Jan a Mareš, J.: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - cze) Prognostický význam exprese genu BCL2 ve tkáni povrchového uroteliálního karcinomu močového měchýře. In: Česká urologie, ČR, 1211-8729, 2006, 11, 2, s. 41-41. Výroční konference České urologické společnosti ČLS JEP. ČR, České Budějovice, 11.-13.10.2006. Předmětové zatřídění: urologie MSM0021620808, NR8934, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - PešI, Michal - Szakacsová, Monika - Mareš, J. a Dvořáček, Jan: (X - abstrakt konferenčního příspěvku ve vědeckém / odborném časopise - eng) Evaluation of PAX5 gene expression in patients with transitional cell carcinoma of the urinary bladder and its prognostic value. In: European Urology, Švýcarsko, 0302-2838, 2006, 1,1,8. 22-22. EAU 6th Central European Meeting Prague. ČR, Praha, 15.-16.9.2006. Předmětové zatřídění: urologie. IF = 3.542 (2005) NR8934, Trková, Marie - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - Benešová-Minariková, L. - Soukup, Viktor - Mareš, Jaroslav - Minárik, Marek a Sedláček, Zdeněk: (I - původní článek ve vědeckém / odborném časopise - eng) Analysis of genetic events in 17p13 and 9p21 regions supports predominant monoclonal origin of multifocal and reccurrent bladder cancer. In: Cancer Letters, USA, 0008-5472, 2006, 242,1, s. 68-76. Analýza genetických změn v oblastech 17p13 a 9p21 podporuje teorii o monoklonálním původu mnohočetněho recidivujícího karcinomu močového měchýře Předmětové zatřídění: urologie - onkologie. IF = 7.616 (2005) Anotace: Transitional cell carcinoma (TCC), Bladder cancer. - - nádorové buňky - nádor močového měchýře MSM0021620808, Soukup, Viktor - Babjuk, Marko - Dušková, Jaroslava - PešI, Michal - Szakázcová, Monika - Dvořáček, Jan: 108