Intracelulární detekce Foxp3 Ústav imunologie 2.LFUK a FN Motol Daniela Rožková, Jan Laštovička
T regulační lymfocyty (Treg) Jsou definovány funkčně svou schopností potlačovat aktivaci a proliferaci CD4+ a CD8+ efektorových T lymfocytů. Hlavní funkcí Treg lymfocytů je udržování homeostázy v imunitním systému. Jejich tlumivé působení potlačuje zánětlivé reakce a zabraňuje poškození tkání Role v patogenezi a v regulaci autoimunitních onemocnění, infekcí, nádorových onemocnění a při rejekci transplantovaných orgánů.
Tregs tlumí efektorové T lymfocyty Mechanismy působení Produkce inhibičních cytokinů (TGFbeta, IL-1, IL-35) Cytolýza (granzymy, perforin) Metabolická disrupce Suprese antigen prezentujícíh buněk (dendritických buněk)
Typy T regs malá populace CD4 pozitivních lymfocytů výrazně exprimuje povrchový CD25 (IL-2 R) specificky exprimuje intracelulární transkripční faktor Forkhead box protein 3 (FoxP3), který kontroluje jejich vývoj a funkci. Povrchové markery: neustále se hledají, např. CD127
Fenotyp regulační buňky CD4 CD25 GITR CD4 CTLA-4 Koreceptor při TCR - MHC II/Ag interakci Foxp3 T reg CD25 IL-2Rα IL-2R složka, spolu s IL-2Rβγ vytváří vysokoafinitní receptor pro IL-2 Il2 je klíčový růstový faktor T Regs CTLA-4 cytotoxic T lymphocyte Ag-4 Váže se na B7 (CD8/86) na APC, působí jako kostimulační molekula pro T Regs (zablokování CTLA-4 inhibkuje T Regs ) CD127 IL-7Ralfa Efektorové T lymfocyty mají vysokou exprese Tregs jsou CD127dim izolace CD4+CD25+CD127dim GITR glucocorticoid induced TNF related protein agonista inhibuje T Regy, zablokování augments T R ) FoxP3 Forkhead/winged-helix TF kritický pro aktivitu a vývoj T Regs Na rozdíl od povrchových markerů T E neexprimují FoxP3
Foxp3
Analýza T regs Přirozené T regs v periferní krvi Tyto Treg lymfocyty tvoří přibližně 5-1% z celkových CD4+ T-lymfocytů. Nedostatek nebo snížená funkce Treg má za následek autoimunitní onemocnění Vyšší počty Treg jsou detekovány u pacientů s nádorovým onemocněním Rutinní stanovení Analýza indukovaných T regs (in vitro) Studium funkce dendritických buněk
Stanovení T regs příprava vzorků kit anti-human FoxP3 staining set 1. Ficollem izolované mononukleární periferní krevní buňky 2. Povrchové značení CD3, CD4, a CD25 v PBS+1%FBS 3. Promytí PBS+1%FBS 4. Fixace (speciální pufr Fix&Perm) 5. Promytí v perm. pufru 6. Značení Foxp3: v krysím séru (proti nespec. značení) 7. Promytí v perm pufru Připravit FMO pro CD25 Připravit izotyp/fmo pro Foxp3
Stanovení T regs analýza CD4+ lymfocyty CD4+ lymfocyty CD25 FoxP3 Alexa 488 Izotyp Alexa 488 1. Gating na CD4+ buňky 2. FoxP3 proti CD25 3. CD25+ nastavíme podle FMO 4. Foxp3+ nastavíme podle FMO/izotypové kontroly
Eliminace nespecifit CD8 CD25 CD4 Gatování z CD4+CD8- populace Foxp3 izotyp
Dendritické buňky Dendritické buňky: aktivace a polarizace naivních lymfocytů Maturace DC: bakteriální a virové signály cytokiny endogenní faktory DC se stávají profesionálními APC
Tregs a dendritické buňky Nezralé DC nebo semimaturované DC v tkáních pohlcují tělu vlastní antigeny a indukují proti nim toleranci, vznik T regulačních lymfocytů Testování polarizační kapacity DC: Indukují DC polarizaci lymfocytů do T regs? Za jakých podmínek? Jaký vliv má maturace DC: Jaká je exprese Foxp3 na lymfocytech aktivovaných různě maturovanými DC?
Indukované T regs in vitro Generace monocyte-derived DC (z CD14+ separ. monocytů) Izolace krevních DC Ovlivnění DC stimulem 5-6 dní 1-2 dny TLR ligand, TSLP Izolace naivních T CD45RA buněk allogeniho darce Kokultivace DC a T lymfo 7 dní Sledovani fenotyput lymfo (Foxp3, CD25) Problémy: U lidí T aktivované lymfocyty mohou přechodně zvýšit expresi Foxp3 Indukované T regs (Tr1) neexprimují Foxp3??
Dendritické buňky a TLR ligandy Jaký má vliv přidání TLR ligandů k DC na indukci T regs? 1 5 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 Nezralé 2 DC 91.9 6.7 24.5 1 5 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 Z gatu CD4+ 1% 9.73 1 5 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 Z gatu CD4+CD25+ 29.7 3% CD25 1 5 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 DC+ 1 2 LPS <B-53/3-A>: CD4 FITC 95.7 35.2 53.1 <B-53/3-A>: CD4 FITC 1 5 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 <B-576/26-A>: FOXP3 PE 4.77 5% <B-576/26-A>: FOXP3 PE 1 5 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 <B-576/26-A>: FOXP3 PE 7.16 <B-576/26-A>: FOXP3 PE CD4 Foxp3 Foxp3 7% LPS maturované DC indukují méně T regs
Krevní myelodní dendritické buňky a cytokin TSLP Z gatu CD4+ Z gatu CD4+CD25+ 25K 1 5 1 5 1 5 idc SSC 2K SSC-A 15K 1K 5K 97.9 <B-53/3-A>: CD4 FITC CD25 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 8.59 9% <B-576/26-A>: FOXP3 PE CD25 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 16.5 <B-53/3-A>: CD4 FITC <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 47.8 47% <B-576/26-A>: FOXP3 PE 25K 1 5 1 5 1 5 DC+ TSLP 2K SSC-A 15K 1K 5K 98.1 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 2.7 21% <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 72.1 <R-66/2-A>: CD25 Dy647 1 4 1 3 1 2 25.8 26 % <B-53/3-A>: CD4 FITC CD4 <B-576/26-A>: FOXP3 PE Foxp3 <B-53/3-A>: CD4 FITC CD4 <B-576/26-A>: FOXP3 PE TSLP ovlivněné DC: indukují masivní proliferaci lymfocytů, méně T regs
Tipy pro značení T regs Používat originální kity a pufry Značení Foxp3: nutná izotypová/fmokontrola přesné gatování na CD4+ buňky k vyloučení nespecifit Foxp3 je spolehlivý marker Tregs, ale je nutná permeabilizace nelze buňky sortovat V in vitro experimentech je lepší hodnotit Foxp3 v CD4+CD25+ lymfocytech, protože se mezi jednotlivými podmínkami liší zastoupení CD25+ lymfocytů
Poděkování Spolupracovníci z Ústavu imunologie, 2.LF UK analýzy periferní Tregs: Jan Laštovička