4.2.1. Základní technologie pro kvalitativní a semikvantitativní vyšetření Metody kvalitativní analýzy jsou založeny obvykle na významné chemické reakci určované látky s činidlem. Látka se dokazuje vznikem charakteristického zbarvení roztoku, vznikem sraženiny, zákalu, fluorescence či plynného produktu. V této kapitole se budeme setkávat s několika pojmy, které je třeba vysvětlit. Kvalitativní důkaz (průkaz) látky hledá pouze odpověď zda je hledaná látka přítomna či ne. Tedy odpověď zní pouze ano (pozitivní) nebo ne (negativní). Typickými příklady jsou průkazy gravidity nebo dusitanů v moči, či průkaz okultního krvácení ve stolici. Semikvantitativní vyšetření vypovídá už také o množství hledané látky. Výsledek se hodnotí pomocí arbitrárních jednotek (0, 1, 2, 3, 4). Někde můžeme vidět i hodnocení na kříže, případně pro průkaz na hranici meze detekce označení stopa. Obvykle se jedná o subjektivní vizuální hodnocení. Je ovšem možné i objektivní hodnocení pomocí reflexní fotometrie a někdy se místo arbitrárních jednotek používá interval ohraničený kvantitativními hodnotami koncentrace. Objektivní hodnocení má v tomto případě značnou míru nejistoty a koncentrace látek na hranicích intervalu mohou být poměrně často (např. z 20 %) přiřazeny přístrojem do intervalu sousedního. Dalším termínem, který se používá hojně u kvalitativních a semikvantitativních metod je screening. Tento termín obecně znamená proces třídění. V klinické biochemii má screening dva poněkud odlišné významy: buď se jedná o vyšetření vybrané populace (podle věku, pohlaví, pracovního rizika, lokality nebo jiných kritérií) na určité látky přítomné v biologických tekutinách anebo se jedná o individuální mnohočetné vyšetření, jehož úkolem je rychle identifikovat patogenní koncentraci jedné nebo více látek (např. soubor základních vyšetření moče nebo drogový screening). Tyto metody jsou jednoduché, aby je bylo možné provádět ve větším rozsahu, bez složité instrumentace a pokud možno i v mimolaboratorních podmínkách. Některé kvalitativní screeningy mohou být cenově náročné (např. paralelní průkaz osmi drog), ale obvykle představují nejlevnější variantu sledování daného analytu. Výrobci se snaží zamezit falešně pozitivním reakcím tak, že kvalitativní analýzy mají obvykle vyšší mez detekce než jejich kvantitativní varianty. Proto je citlivost kvalitativních testů obvykle snížena. Některé kvalitativní testy bývají velmi citlivé, např. průkaz gravidity nebo okultního krvácení. Požadavky na spolehlivost kvalitativních a semikvantitativních testů
mohou být dosti vysoké, např. test musí být pozitivní u > 95 % pacientů s mikroalbuminurií, aby byl akceptovatelný pro screening. V oblasti kvalitativních a semikvantitativních metod se setkáváme také s pojmem rychlé testy. Tento termín je značně vágní a může představovat velmi krátký čas (u běžných barevných reakcí přibližně 1 s) i poměrně dlouhou dobu (v imunochemii až 20 min). Z praktického hlediska nepovažujeme za vhodné v učebním textu obě kategorie od sebe oddělovat, protože často jsou součástí víceúčelového testu (např. proužky na základní vyšetření moče) jak kvalitativní tak semikvantitativní analýzy. Pro ilustraci si ukážeme jak široký sortiment rychlých imunochemických kvalitativních a semikvantitativních testů je k dispozici. Klinické aplikace jsou následující: alergie, degenerativní onemocnění, fertilita, forenzní účely, imunotypizace, indikátory stresu, infekční nemoci, kardiální markery, sérologické testy, sexuálně přenosné nemoci, toxikologie, tumorové markery, zneužívané drogy, aj. V kvalitativní a semikvantitativní analýze využíváme řadu analytických metod a fyzikálně-chemických způsobů detekce. Nejčastěji využíváme proužky (tedy prostředí celulózových nebo skleněných vláken se sofistikovaně umístěnými suchými reagenciemi), ale mohou to být také zkumavky, jamky mikrotitračních destiček, plotny pro tenkovrstevnou chromatografii, jednoúčelové zkumavky, kapiláry s lyofilizovanými reagenciemi, různé typy normalizovaných komůrek, sklíčka nebo jiná uspořádání. K detekci používáme kromě oka také mikroskopu, reflexní fotometrie, infračervené spektrofotometrie, kapilární elektroforézy a dalších metod. Nejfrekventovanější kvalitativní a semikvantitativní metody patří do souboru analýz uváděných jako základní vyšetření moče. Moč se vyšetřuje proužkem, který může mít řadu různých reagenčních políček. Některé barevné reakce na políčku nejsou příliš spolehlivé (např. důkaz bílkoviny) a pozitivity bývají ještě potvrzovány barevnými nebo srážecími reakcemi v kapalném prostředí ve zkumavce. Aby bylo popis základního vyšetření moče dobře srozumitelný, budeme popisovat analytické reakce na jednotlivých políčkách proužků a jako doplněk uvedeme reakci ve zkumavce, pokud se v praxi provádí. Proužky pro základní vyšetření moče je třeba chránit před vlhkostí, nepřiměřeným teplem a světlem, ale také nemrazit. Proužek se ponoří na 1 2 s do moče tak, aby byla pokryta všechna reagenční políčka. Výsledky se odečítají po 30 s. Tato doba by měla být poměrně přesně dodržována. V laboratořích je někdy rozšířený nešvar hromadného odečítání několika desítek vzorků
moče, takže analytická reakce u posledních v řadě probíhá i několik min a pochopitelně výsledky mohou být zkreslené. Glukosa je nejvíce semikvantitativně vyšetřovaným analytem v moči. reagenční políčko pro důkaz glukosy je impregnováno enzymy glukosaoxidasou a peroxidasou. Dále se využívá dvou uspořádání dalších impregnovaných reaktantů: buď je o-toluidin oxidován na modrozelenou Schiffovu bázi (se stabilní vazbou CH=N ) nebo je políčko impregnováno modrým barvivem a jodidem draselným, který se uvolněným kyslíkem oxiduje na jód a modré pozadí se mění na zelené až hnědé. Druhá varianta je méně oblíbená, protože reakci nelze vyhodnotit, je-li moč červeně nebo hnědě zbarvená. Podobný problém nastává při použití Trinderovy reakce (peroxid vodíku + 4-aminofenazon + substituovaný fenol), kdy je výsledkem červené až hnědé zbarvení políčka. V první ranní moči můžeme prokázat glykosurii již při koncentraci glukosy > 0,8 mmol/l. Falešnou pozitivitu stanovení může způsobit kontaminace odběrové zkumavky oxidačním činidlem (chlornan sodný), tento problém je vyřešen jednoúčelovými odběrovými nádobkami. Falešnou negativitu může způsobit kyselina askorbová (vitamin C), která je akceptorem kyslíku. Nejčastěji se vyskytuje ve větším množství v moči těhotných. Podobně reagují redukující látky: salicyláty, homogentisová kyselina, DOPA (dihydroxyfenylalanin) aj. Důkaz glukosy neruší ostatní redukující sacharidy (fruktosa, galaktosa aj.), protože reakce je pro glukosu specifická. Ketolátky v moči představuje aceton a kyselina acetoctová. V moči se vyskytuje při ketoacidóze zejména produkt její redukce kyselina 3-hydroxymáselná. To však už není ketolátka a proto není Legalovou (Rotherovou) reakcí prokazována. Principem analýzy je reakce ketoskupiny (z moče) s nitroprussidem sodným v silně alkalickém prostředí hydroxidu sodného (imobilizovány na políčku). Zbarvení reakčního pole se mění podle množství ketonů od bezbarvého přes krémové, růžové až do temně fialového. Mez detekce ketonů je přibližně 50 mg/l. Moč obsahující pigmenty nebo metabolity levedopa (dihydroxyfenylalanin) může poskytovat falešně pozitivní výsledky. Poměrně často se používají reagenční proužky umožňující pouze důkaz glukosy a ketonů. Bílkoviny není ideální označení pro příslušné reagenční políčko. Většina reagenčních proužků totiž detekuje albumin a reakce bývá negativní v přítomnosti ostatních proteinů, např. Bence-Jonesovy bílkoviny a odezva na globuliny je podstatně slabší ve srovnání s albuminem. Metoda je založena na využití tzv. proteinové chyby indikátoru ph. Políčko je impregnováno tetrabromfenolovou modří pufrovanou na ph 3,0. V nepřítomnosti albuminu je proužek žlutý.
Albumin (jeho aminoskupiny) poskytuje s barvivem komplex a barva políčka se mění přes žlutozelenou v zelenou až modrozelenou. Tato reakce probíhá při ph < 3,5 a okyselení moče je zajištěno pufrem z impregnace políčka. Citlivost metody se pohybuje mezi 0,15 až 0,2 g/l. Je-li moč alkalická (ph 8,0), musí se okyselit zředěnou kyselinou octovou na ph 5 6 a analýzu je třeba zopakovat s novým proužkem. Při důkazu albuminu interferují chininové a cholinové preparáty. Falešně pozitivní výsledky se objevují při kontaminaci moče vaginálním nebo uretrálním sekretem, je-li moč silně alkalická nebo když je odběrová nádobka kontaminována dezinfekčními prostředky či saponáty. Falešně pozitivní výsledky byly pozorovány při silném okyselení moče (např. před stanovením vápníku). Semikvantitativní důkaz albuminu proteinovou chybou indikátoru není dostatečně spolehlivý a proto se pozitivní reakce ještě potvrzuje důkazem močové bílkoviny ve zkumavce. Nejoblíbenější konfirmační důkaz je srážecí reakce bílkovin pomocí několika kapek 20 % kyseliny sulfosalicylové. Je možné použít i jiných srážecích postupů (kyselina trichloroctová nebo pikrylsulfonová, případně polyvalentní antiséra). Z barevných reakcí se někdy využívá reakce s pyrrogalolovou červení. ph moče určujeme pomocí reagenčního políčka obsahujícího tři indikátory: bromthymolovou modř, fenoftalein a methylovou červeň. Prolínáním barev těchto indikátorů lze získat široké spektrum barevných odstínů od oranžové pro kyselou moč, přes žlutou, zelenou až k modré pro alkalickou moč. Zkušený pracovník je schopen odečíst ph s přesností ± 0,5 jednotky v intervalu ph 4 9. Bilirubin v moči představuje pouze konjugovaný bilirubin (mono- nebo diglukuronid), neboť jen konjugovaný bilirubin je ve vodě (moči) rozpustný. Bilirubin se prokazuje kopulací s diazotovaným dichloranilinem v silně kyselém prostředí za vzniku červeného až červenofialového zbarvení indikačního políčka. Za normálních okolností je bilirubin v moči negativní. Pozitivní reakce na bilirubin v moči se objevuje při koncentraci konjugovaného bilirubinu v krvi > 30 µmol/l. V moči prokážeme obvykle koncentrace > 9 mmol/l. Falešně pozitivní reakce bývá způsobena některými léčivy, které jsou v kyselém prostředí červené (např. fenazopyridin). Moč nesmí být vystavena přímému slunečnímu světlu, aby nedošlo k oxidaci bilirubinu, což by mělo za následek falešně nižší nález. Při vyšší koncentraci kyseliny askorbové nebo dusitanu v moči rovněž reakce ztrácí citlivost. Urobilinogen se prokazuje na podobném principu jako bilirubin. Jen se používá jiný typ diazoniové soli (4-methoxybenzendiazoniumfluoroborát), která je specifická vůči
urobilinogenu. Jelikož detekční limit 7 mmol/l je asi v polovině normálního rozmezí urobilinogenu v moči, bývají často tyto proužky po reakci s močí bledě růžové. Při pozitivní reakci ovšem proužky bývají červené. Falešně pozitivní reakci působí léky, které barví moč na červeno. Reakce je specifičtější než původní Ehrlichova reakce (neruší porfobilinogen, indikan, PAS, sulfonamidy). Nicméně některé proužky používají principu Ehrlichovy reakce (4-dimethylaminobenzaldehyd v kyselém prostředí dává růžovočervené zbarvení) a proto je třeba výběr proužků provádět s ohledem na tuto skutečnost. Stání na slunečním světle působí oxidaci urobilinogenu a falešné snížení nálezu, rovněž použití formaldehydu (stabilizátor moče) likviduje urobilinogen. Krev se dokazuje reakcí hemoglobinu z erytrocytů, které jsou na proužku lyzovány. Využívá se katalytických vlastností hemoglobinu (podobně reaguje myoglobin) při oxidaci barevného indikátoru (3,3,5,5 -tetramethylbenzidin) organickým hydroperoxidem (2,5- dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid). Vzniká modrozelené zbarvení, které původně žlutý proužek zbarví zeleně. Proužek s reagenciemi je potažený síťovinou obsahující jodid draselný, který oxiduje kyselinu askorbovou, je-li ve vzorku moče přítomna. Detekční limit proužku je přibližně 5 erytrocytů/µl. Reakci neruší další buněčné elementy (epitelie, leukocyty, spermie). Vysoké koncentrace dusitanů mohou reakci zpomalit. Falešně nižší výsledky může způsobit konzervace moče formaldehydem a také vysoká proteinurie (> 5 g/l). Falešně pozitivní výsledky jsou v případě nedokonalého vymytí čistících oxidačních prostředků při opakovaném používání sběrných nádobek. Leukocyty vylučované do moče jsou téměř výhradně granulocyty. Dokazují se reakcí při které se štěpí ester indoxylu esterasou z granulocytů (nebo histiocytů v případě zánětů) na indoxyl. Volný indoxyl poskytuje s diazoniovou solí fialové zbarvení. Mez detekce reakce se pohybuje v intervalu 10 25 leukocytů/µl, přičemž > 20 leukocytů/µl je považováno za patologickou koncentraci. Reakce je tedy hrubě orientační a v žádném případě nenahrazuje mikroskopické vyšetření. Nicméně výhodou esterasové reakce je to, že jsou prokázány nejen neporušené, ale také lyzované leukocyty, které v mikroskopu nevidíme. Reakce je vysoce specifická a další látky přítomné v moči ji neruší. Dusitany jsou detekovány Griessovou reakcí. Využívá se toho, že jakýkoliv dusičnan přítomný v moči je baktériemi redukován na dusitan. Aromatický amin s dusitany v prostředí kyselého pufru poskytuje diazoniovou sůl, která s kopulačním činidlem (3-hydroxy-1,2,3,4- tetrahydrobenzochinolinem dává červené azobarvivo. Intenzita zbarvení (růžová až fialová) odpovídá koncentraci dusitanů, ale nic neříká o závažnosti infekce. Mez detekce reakce je 11
mmol/l. Reakce je pozitivní zejména v přítomnosti gramnegativních bakterií. Vzorky nutno vyšetřit do 4 h od odběru, jinak je nebezpečí vnější bakteriální kontaminace. Falešně negativní výsledky jsou při vysoké diuréze, hladovění, parenterální výživě a dietě bez rostlinného podílu. Specifická hmotnost se prokazuje semikvantitativním testem. Nalezené hodnoty jsou v intervalu 1,003 1,040 a podávají informaci o koncentraci iontů v moči. Ionty vytěsňují z komplexu protony a ph na proužku se měří směsí tří indikátorů popsaných u měření ph. Při nízké koncentraci iontů je zbarvení tmavomodré a se zvyšující koncentrací iontů se mění na zelené až žlutozelené. Reakci neruší neionogenní látky (glukosa, močovina). Proteinurie > 1 g/l způsobuje falešně vyšší hodnoty specifické hmotnosti naměřené na proužku. Také je-li ph moče 7 je změřený výsledek vyšší o 0,005. Morfologická analýza moče má několik variant, ale pro všechny je společné, že mikroskopické vyšetření se má provádět v čerstvé moči, ne starší než 1 h. V krajním případě lze použít moč po konzervaci ještě 3 h po odběru, ale buněčné elementy mohou být už z části degradované vlivem nepříznivého ph nebo nízkého osmotického tlaku, je-li hustota moče < 1,010. K vyšetření se používá tzv. středního proudu první ranní moče. Obvykle se používá desetkrát koncentrovaný močový sediment. Zahuštění se dosáhne odstřeďováním moče 5 min při 400 g. Výskyt elementů se hodnotí ve 20 polích sklíčka při zvětšení 200x. Vyšetření bez zahuštění má smysl pouze k orientačnímu sledování akutních infekcí močových cest s výraznou leukocyturií a ke sledování hematurií. Obvykle se provádí morfologická analýza bez barvení, ale je možné také sediment vybarvit podle Sternheimera-Malbina roztokem genciánové violeti a safraninu O. V mikroskopu můžeme vidět v kyselé moči amorfní cihlově zbarvené uráty, či hnědé hrudky bilirubinu. V alkalické moči lze rozeznat amorfní uhličitan vápenatý a bezbarvé fosforečnany. V krystalické formě v kyselé moči bývá žlutá až hnědá kyselina močová, bezbarvý šťavelan vápenatý a urátová drť. V alkalické moči je možné spatřit krystaly nahnědlého močanu amonného, zelenavě fluoreskujícího fosforečnanu hořečnato-amonného a vápenatého a bezbarvého uhličitanu vápenatého. Můžeme identifikovat různé druhy válců (hyalinní, voskové, epiteliální, erytrocytární, leukocytární, granulované, dlaždicovité), buňky (erytrocyty, leukocyty, spermie) a parazity. Spolehlivé odečítání morfologického nálezu vyžaduje určitou zkušenost. Čtenáře odkazujeme na vynikající atlas močového sedimentu OKB MN Ostrava http://sediment.d2.cz/. Analýza konkrementů (kamenů) chemicky je stále méně používaná. Jedná se o kapkové reakce na průkaz vápníku, hořčíku, amonných iontů, oxalátů, fosfátů, kyseliny močové a cystinu. Vzhledem k tomu, že počet požadavků na tyto analýzy je malý, jeví se
výhodnější tyto analýzy soustředit na několik vybraných pracovišť a provádět je spolehlivěji pomocí infračervené spektroskopie (popřípadě pomocí rentgenové difrakce - v ČR se tento postup používá zcela výjimečně). Příprava pro analýzu v infračervené oblasti vyžaduje promíchat 1 mg konkrementu s 300 mg bromidu draselného v achátovém moždíři a ze směsi vylisovat tabletu, která se pak měří ve vlnovém rozsahu 5 40 µm (podle zadání a typu přístroje). Konkrementy se někdy skládají z několika příměsí a rozborem IR spekter můžeme prokázat přítomnost minoritní složky v množství 15 20 %. Těhotenské testy obvykle využívají principu sendvičové imunoanalýzy. Na membráně je nanesen konjugát myší monoklonální protilátky proti choriogonadotropinu (hcg) s koloidním zlatem (způsobuje červené zbarvení v testovací a kontrolní zóně). Po ponoření do moče po značku na proužku reaguje hcg (je-li přítomen) ze vzlínající moče se značenou protilátkou a vzniklý imunokomplex se v testovací zóně projeví jako červený proužek. Nezreagovaný konjugát je imunochromatograficky unášen do kontrolní zóny, kde je imobilizována kozí protimyší protilátka a tam vznikne další červený proužek (bez ohledu na přítomnost hcg). Místo koloidního zlata se může použít i jiné barvivo, ale koloidní zlato je obecně v imunochemických kvalitativních testech nejvíce používáno. Průkaz drog nebo jejich screening v moči nebo slinách používá podobný postup. Imunochromatografický nebo chromatografický princip je využíván i při aplikaci tenkovrstvé chromatografie v kvalitativní analýze. C-reaktivní protein (CRP) je často sledovaný parametr bakteriálního zánětu v séru. K jeho důkazu je široká nabídka kvalitativních testů. Mez detekce je v případě aglutinačních testů kolem 10 mg/l CRP. Imunochemický princip vychází z latexových částic potažených protilátkou, které v přítomnosti CRP aglutinují (zákal) až precipitují (sraženina). Okultní krvácení ve stolici je kvalitativním testem, kdy se prokazuje hemoglobin podobným způsobem jak byl popsán u proužků pro stanovení hemoglobinu v moči. Kvalitativní a semikvantitativní testy tvoří menší část laboratorních testů v klinické biochemii. Nicméně se stále rozšiřuje nabídka, která umožňuje provádět analýzy jak dalšímu zdravotnickému personálu, tak také mimo oblast zdravotnictví (domácnosti, policie, sportovní střediska aj.). V těchto případech testy patří do dynamicky rostoucí oblasti testů v místě péče (POCT point of care test), ale používání kvalitativních testů na klinických odděleních v nemocnici může být někdy problematické, např. důkaz troponinu. Literatura
1. Jacobs, D. S., Demott, W. R., Finley, P. R., Horvat, R. T., Kasten, B. L., Tilzer, L. L. Laboratory test handbook. Hudson (Cleveland) : Lexi-comp Inc, 1994, 1513 p., ISBN 0-916589-12-9. 2. Schneiderka, P., Bezdíčková, D., Jirsa, M. et al. Stanovení analytů v klinické biochemii 1. část. Praha : Karolinum, 1999, 153 s., ISBN 80-7184-761-5. 3. Táborský, O., Štern, P., Valovičová, E., Bezouška, K., Novák, M. Metody klinické biochemie. Praha : Státní pedagogické nakladatelství, 1990, 160 s.