HYDRAGEL 3 CSF Ref. 4350 HYDRAGEL 6 CSF Ref. 4351 2017/04
POUŽITÍ kitu HYDRAGEL 3 & 6 CSF - 2017/04 HYDRAGEL 3 CSF a HYDRAGEL 6 CSF kity jsou určeny ke kvalitativní detekci a identifikaci "oligoklonálních" proužků v mozkomíšním moku. Vizuálně jsou porovnávány imunofixační vzorky Ig G, Ig A, a Ig M a / nebo imunoglobulinů s vázanými lehkými řetězci Kappa či Lambda v mozkomíšním moku a séru téhož pacienta. Analýza se provádí v nezahuštěném mozkomíšním moku. V závislosti na detekčních antisérech lze detekovat na každém agarózovém gelu : - 1 až 3 dvojic CSF - sérum - HYDRAGEL 3 CSF kit. - 2 až 6ti dvojic CSF - sérum - HYDRAGEL 6 CSF kit. Pro diagnostické použití In Vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2. PRINCIP TESTU Celá řada onemocnění CSF se vyznačuje zvýšením proteinů v mozkomíšním moku v důsledku zvýšené permeability cévně-mozkomíšní bariéry nebo zvýšené syntézy imunoglobulinů - v první řadě Ig G v CSF. Druhý případ - intratekální syntéza Ig - je často spojen s heterogenitou Ig, jež se manifestuje jako "oligoklonální proužkování" vzorků, rozdělených HR elektroforézou. Proužky v zóně globulinů gama nejsou vždy pravými oligoklonálními proužky a proto nemají tentýž diagnostický význam. Imunofixace je technikou volby pro identifikaci Ig v těchto proužcích. K potvrzení intratékální syntézy Ig je nutno analyzovat sérum a mozkomíšní mok paralelně - potvrzení je významnou informací vedoucí k dg. zánětlivého onemocnění CSF jakým je např. skleróza multiplex. Standardní imunofixace, která používá neznačená antiséra, potřebuje koncentrace Ig G kolem 0.05 g/dl. Vzhledem k tomu, že se Ig G koncentrace v mozkomíšním moku pohybuje v rozmezí 1-5 mg/dl, je nutné mít k zahuštění alespoň 2-5 ml likvoru. Ve srovnání se standardní imunofixací je stonásobné zvýšení citlivosti detekce dosaženo na gelech HYDRAGEL 3 CSF nebo HYDRAGEL 6 CSF, které používají protilátky značené enzymy. Koncentrační limit detekce je 0.5 mg/dl. Ig mohou být tak detekovány a jejich distribuce rozlišena bez zahuštění vzorku likvoru. Test se provádí ve dvou stupních : Vysoce rozlišovací (HR) elektroforéza rozdělující proteiny v likvoru a séra. Imunofixace s enzymy značenými antiséry proti Ig G, Ig A a Ig M a / nebo Ig s vázanými Kappa a Lambda řetězci - k identifikaci a detekci oligoklonálních proužků v likvoru a k průkazu rozdílů nebo absence v likvoru či v séru. Poloautomatizovaný systém HYDRASYS provádí všechny kroky k obdržení gelů připravených k interpretaci. REAGENCIE A MATERIÁL V kitech HYDRAGEL 3 CSF A HYDRAGEL 6 CSF VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽkY kat. Č. 4350 kat. Č. 4351 Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů 10 gelů Pufrované stripy (připraveno k použití) 10 bal. po 2 ks 10 bal. po 2 ks Sample Diluent CSF / A1AT / TRF (připraveno k použití) 1 lahv., 85 ml 1 lahv., 85 ml Ředicí roztok protilátky CSF / TRF (připravený k použití) 1 lahv., 6 ml 1 lahv., 6 ml Promývací roztok CSF (připravený k použití) 1 lahv., 70 ml 1 lahv., 70 ml Rehydratační roztok (připraveno k použití) 1 lahv., 70 ml 2 lahv., 70 ml Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 (připravené k použití) 1 lahv., 40 ml 1 lahv., 40 ml TTF1 (zásobní roztok) 1 lahv., 0.5 ml 1 lahv., 0.5 ml TTF2 (zásobní roztok) 1 lahv., 0.5 ml 1 lahv., 0.5 ml Aplikátory (připraveno k použití) 1 bal. - 10 ks (6 zubů) 1 bal. - 10 ks (15 zubů) Segment pro antiséra (připraveno k použití) 2 bal. po 5 ks 2 bal. po 5 ks Tenké filtrační papíry 1 bal. - 10 ks 1 bal. - 10 ks Tlusté filtrační papíry 5 bal. po 10 ks 5 bal. po 10 ks Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 9.1 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu a imunofixaci. - 202 - SEBIA NÁVOD - Czech
Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech - šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Zamezit prudkým změnám teploty - neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. PUFROVANÉ STRIPY Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s ph 9.0 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufrované stripy slouží jako rezervoár pufru a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami. Lze skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu a štítcích balení s proužky. NEMRAZIT! Nepoužívejte vyschlé stripy z poškozených obalů. POZNÁMKA: Během skladování se může barva pufrovacích proužků změnit na žlutou, což nemá nepříznivý vliv na jejich vlastnosti. 3. ŘEDÍCÍ ROZTOk NA VZORkY CSF / A1AT / TRF Ředicí roztok vzorku je připraven k použití. Obsahuje : přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K ředění vzorků likvoru a séra. Skladovat v chladničce. Stabilní do data exspirace uvedeného na balení kitu a štítku lahvičky. Při výskytu sraženin nepoužitelné. 4. ŘEDICÍ ROZTOk PRO ANTISÉRUM PRO CSF / TRF Ředicí roztok na antisérum je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s ph 7.0 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K ředění antisér před použitím. Skladovat v chladničce. Stabilní do data exspirace uvedeného na balení kitu a štítku lahvičky. Při výskytu sraženin nepoužitelné. POZNÁMKA : Během skladování se může barva ředicího roztoku změnit na žlutou, což nemá nepříznivý vliv na jeho vlastnosti. 5. CSF PROMÝVACÍ ROZTOk Promývací roztok CSF je připraven k použití. Obsahuje : tlumivý roztok s ph 10,3 ± 0,5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro vymývání agarózového gelu po odsávacím kroku, který následuje po inkubaci s peroxidázou značeném antiséru. Skladování, stabilita a známky zhoršování Promývací roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v chladničce a je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Promývací roztok nesmí obsahovat sraženinu. 6. REHYDRATAČNÍ ROZTOk Rehydratační roztok je připraven k použití. Obsahuje : přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K rehydrataci agarózového gelu před a po vizualizačním kroku, založeném na působení peroxidázy. Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do doby exspirace. Nesmí obsahovat sraženiny. 7. ROZPOUŠTĚDLO TTF1 / TTF2 Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 je připraveno k použití. Obsahuje složky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro přípravu vizualizačního roztoku TTF, jak je popsáno v bodu 8. Skladování, stabilita a známky zhoršování Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 lze skladovat a je stabilní při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla TTF1 / TTF2. Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 nesmí obsahovat sraženiny. - 203 -
8. TTF1 A TTF2-30 minut před použitím uložte lahvičky TTF1 a TTF2 při pokojové teplotě. - každou lahvičku před přípravou pracovního vyvolávacího roztoku dobře homogenizujte promícháním. - Těsně před použitím připravte pracovní vyvolávací roztok TTF. Abyste vyloučili riziko srážení, přidávejte nezbytné reagencie v následujícím pořadí : 2 ml rozpouštědla TTF1 / TTF2, 50 μl TTF1, 50 μl TTF2 a 2 μl 30 % peroxidu vodíku (H 2 O 2 ). Vizualizace imunofixovaných imunoglobulinů Skladování, stabilita a známky zhoršování Lahvičky TTF1 a TTF2 skladujte v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítcích lahviček TTF1 a TTF2. Roztoky TTF1 a TTF2 nesmí obsahovat sraženiny. DŮLEŽITÉ : Po skladování při 2 8 C mají zásobní roztoky TTF1 a TTF2 pevné skupenství, ale při pokojové teplotě se snadno znovu rozpustí. Lahvičky TTF1 a TTF2 musí být umístěny v pokojové teplotě 30 minut před použitím. Každou lahvičku před přípravou pracovního vyvolávacího roztoku dobře homogenizujte promícháním. 9. APLIkÁTORY K aplikaci vzorků - na jedno použití. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 10. ANTISÉROVÉ SEGMENTY Barevné segmenty na jedno použití určené k aplikaci antisér na gel při imunofixaci. POZOR : Pečlivě manipulujte se segmenty s antisérem. 11. TENkÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Nařezané bločky tenkého absorpčního papíru pro jednorázové použití jsou určeny pro odsátí přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před nanesením vzorků. Skladování Tenké filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 12. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Bločky tlustého absorpčního papíru pro jednorázové použití určené k odsátí nevysrážených bílkovin z povrchu gelů po provedení imunofixace, vymývání, rehydratace a přebytků vizualizačního činidla. Skladování Tlusté filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. ANTISÉRUM ANTI-Ig G - PER Lahvička antiséra (SEBIA, kat. č. 4743) obsahuje savčí imunoglobuliny zaměřené proti lidskému Ig G konjugované s peroxidázou. Antisérum je ve stabilizované lyofilní formě. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho použití je antisérum obarveno neškodným barvivem tak, aby jeho barva odpovídala štítku lahvičky. Rozpusťte obsah lahvičky antiséra v 0,7 ml destilované nebo deionizované vody. Nechte 5 minut stát a lehce zamíchejte (dbejte, ať nedojde k tvorbě pěny). Potom připravte těsně před použitím pracovní roztok. Pro každý pár CSF / sérum zřeďte antisérum ředicím roztokem pro antisérum, 6 μl rozpuštěného anti-ig G - PER a 34 μl ředicího roztoku pro antisérum. Dobře zamíchejte. POZNÁMKA : Chcete-li analyzovat šest párů CSF/sérum na jednom gelu HYDRAGEL 6 CSF, zřeďte antisérum ředicím roztokem na antisérum, tj. 30 μl anti-ig G - PER a 170 μl ředicího roztoku na antisérum. Dobře zamíchejte. K imunofixaci a vizualizaci elektroforézou rozdělených proteinů. Před rozpuštěním skladujte lyofilní anitsérum v chladu (2 až 8 C) a temnu. Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku nebo krabice. Rozpuštěné roztoky antiséra skladujte při 2 8 C a v temnu. Vzhledem k riziku mikrobiologické kontaminace a denaturace je použijte během jednoho týdne. Rozpuštěné antisérum může být rovněž zmraženo (v alikvotních podílech) a uloženo při teplotě - 18 / - 30 C po dobu nejvýše 6 měsíců ; doporučuje se zmrazit v mikrozkumavkách se šroubovacími víčky, aby se zabránilo vypařování. Toto vypařování zvyšuje koncentraci, která vede k příliš vysoké intenzitě barvení během enzymatické vizualizace. DŮLEŽITÉ : Po uložení při 2 8 C nebo při - 18 / - 30 C DOBŘE homogenizujte rozředěné antisérum před přípravou pracovního roztoku (zředěné antisérum). Před použitím uložte rozmražené antisérum při 2 8 C a použijte je během jednoho dne. Nezmrazujte a nerozmrazujte antisérum více než dvakrát. Antisérum vyřaďte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. - 204 -
2. ANTISÉRUM ANTI-Ig A - PER Lahvička antiséra (SEBIA, kat. č. 4742) obsahuje savčí imunoglobuliny zaměřené proti lidskému Ig A, konjugované s peroxidázou. Antisérum je ve stabilizované lyofilní formě. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho použití je antisérum obarveno neškodným barvivem tak, aby jeho barva odpovídala štítku lahvičky. Rozpusťte obsah lahvičky antiséra v 0,7 ml destilované nebo deionizované vody. Nechte 5 minut stát a lehce zamíchejte (dbejte, ať nedojde k tvorbě pěny). Potom připravte těsně před použitím pracovní roztok. Pro každý pár CSF / sérum zřeďte antisérum ředicím roztokem pro antisérum, 6 μl rozpuštěného anti-ig A - PER a 34 μl ředicího roztoku pro antisérum. Dobře zamíchejte. K imunofixaci a vizualizaci elektroforézou rozdělených proteinů. Před rozpuštěním skladujte lyofilní anitsérum v chladu (2 až 8 C) a temnu. Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku nebo krabice. Rozpuštěné roztoky antiséra skladujte při 2 8 C a v temnu. Vzhledem k riziku mikrobiologické kontaminace a denaturace je použijte během jednoho týdne. Rozpuštěné antisérum může být rovněž zmraženo (v alikvotních podílech) a uloženo při teplotě - 18 / - 30 C po dobu nejvýše 6 měsíců ; doporučuje se zmrazit v mikrozkumavkách se šroubovacími víčky, aby se zabránilo vypařování. Toto vypařování zvyšuje koncentraci, která vede k příliš vysoké intenzitě barvení během enzymatické vizualizace. DŮLEŽITÉ : Po uložení při 2 8 C nebo při - 18 / - 30 C DOBŘE homogenizujte rozředěné antisérum před přípravou pracovního roztoku (zředěné antisérum). Před použitím uložte rozmražené antisérum při 2 8 C a použijte je během jednoho dne. Nezmrazujte a nerozmrazujte antisérum více než dvakrát. Antisérum vyřaďte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. 3. ANTISÉRUM ANTI-Ig M - PER Lahvička antiséra (SEBIA, kat. č. 4744) obsahuje savčí imunoglobuliny zaměřené proti lidskému Ig M, konjugované s peroxidázou. Antisérum je ve stabilizované lyofilní formě. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho použití je antisérum obarveno neškodným barvivem tak, aby jeho barva odpovídala štítku lahvičky. Rozpusťte obsah lahvičky antiséra v 0,7 ml destilované nebo deionizované vody. Nechte 5 minut stát a lehce zamíchejte (dbejte, ať nedojde k tvorbě pěny). Potom připravte těsně před použitím pracovní roztok. Pro každý pár CSF / sérum zřeďte antisérum ředicím roztokem pro antisérum, 6 μl rozpuštěného anti-ig M - PER a 34 μl ředicího roztoku pro antisérum. Dobře zamíchejte. K imunofixaci a vizualizaci elektroforézou rozdělených proteinů. Před rozpuštěním skladujte lyofilní anitsérum v chladu (2 až 8 C) a temnu. Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku nebo krabice. Rozpuštěné roztoky antiséra skladujte při 2 8 C a v temnu. Vzhledem k riziku mikrobiologické kontaminace a denaturace je použijte během jednoho týdne. Rozpuštěné antisérum může být rovněž zmraženo (v alikvotních podílech) a uloženo při teplotě - 18 / - 30 C po dobu nejvýše 6 měsíců ; doporučuje se zmrazit v mikrozkumavkách se šroubovacími víčky, aby se zabránilo vypařování. Toto vypařování zvyšuje koncentraci, která vede k příliš vysoké intenzitě barvení během enzymatické vizualizace. DŮLEŽITÉ : Po uložení při 2 8 C nebo při - 18 / - 30 C DOBŘE homogenizujte rozředěné antisérum před přípravou pracovního roztoku (zředěné antisérum). Před použitím uložte rozmražené antisérum při 2 8 C a použijte je během jednoho dne. Nezmrazujte a nerozmrazujte antisérum více než dvakrát. Antisérum vyřaďte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. 4. ANTI-kAPPA / LAMBDA - PER BALENÍ ANTISÉR Balení antiséra ANTI-KAPPA / LAMBDA PER, SEBIA, kat.č. 4745, obsahuje 1 lahvičku antiséra anti-kappa PER v lyofilní formě a 1 lahvičku antiséra anti-lambda PER v lyofilní formě. 4.1. ANTISÉRUM ANTI-kAPPA - PER Lahvička antiséra obsahuje savčí imunoglobuliny zaměřené proti lidským lehkým vázaným řetězcům kappa, konjugované s peroxidázou. Antisérum je ve stabilizované lyofilní formě. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho použití je antisérum obarveno neškodným barvivem tak, aby jeho barva odpovídala štítku lahvičky. Rozpusťte obsah lahvičky antiséra v 0,7 ml destilované nebo deionizované vody. Nechte 5 minut stát a lehce zamíchejte (dbejte, ať nedojde k tvorbě pěny). Potom připravte těsně před použitím pracovní roztok. Pro každý pár CSF / sérum zřeďte antisérum ředicím roztokem pro antisérum, 6 μl rozpuštěného anti-kappa - PER a 34 μl ředicího roztoku pro antisérum. Dobře zamíchejte. K imunofixaci a vizualizaci elektroforézou rozdělených proteinů. Před rozpuštěním skladujte lyofilní anitsérum v chladu (2 až 8 C) a temnu. Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku nebo krabice. Rozpuštěné roztoky antiséra skladujte při 2 8 C a v temnu. Vzhledem k riziku mikrobiologické kontaminace a denaturace je použijte během jednoho týdne. - 205 -
Rozpuštěné antisérum může být rovněž zmraženo (v alikvotních podílech) a uloženo při teplotě - 18 / - 30 C po dobu nejvýše 6 měsíců ; doporučuje se zmrazit v mikrozkumavkách se šroubovacími víčky, aby se zabránilo vypařování. Toto vypařování zvyšuje koncentraci, která vede k příliš vysoké intenzitě barvení během enzymatické vizualizace. DŮLEŽITÉ : Po uložení při 2 8 C nebo při - 18 / - 30 C DOBŘE homogenizujte rozředěné antisérum před přípravou pracovního roztoku (zředěné antisérum). Před použitím uložte rozmražené antisérum při 2 8 C a použijte je během jednoho dne. Nezmrazujte a nerozmrazujte antisérum více než dvakrát. Antisérum vyřaďte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. 4.2. ANTISÉRUM ANTI-LAMBDA - PER Lahvička antiséra obsahuje savčí imunoglobuliny zaměřené proti lidským lehkým vázaným řetězcům lambda, konjugované s peroxidázou. Antisérum je ve stabilizované lyofilní formě. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho použití je antisérum obarveno neškodným barvivem tak, aby jeho barva odpovídala štítku lahvičky. Rozpusťte obsah lahvičky antiséra v 0,7 ml destilované nebo deionizované vody. Nechte 5 minut stát a lehce zamíchejte (dbejte, ať nedojde k tvorbě pěny). Potom připravte těsně před použitím pracovní roztok. Pro každý pár CSF / sérum zřeďte antisérum ředicím roztokem pro antisérum, 6 μl rozpuštěného anti-lambda - PER a 34 μl ředicího roztoku pro antisérum. Dobře zamíchejte. K imunofixaci a vizualizaci elektroforézou rozdělených proteinů. Před rozpuštěním skladujte lyofilní anitsérum v chladu (2 až 8 C) a temnu. Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku nebo krabice. Rozpuštěné roztoky antiséra skladujte při 2 8 C a v temnu. Vzhledem k riziku mikrobiologické kontaminace a denaturace je použijte během jednoho týdne. Rozpuštěné antisérum může být rovněž zmraženo (v alikvotních podílech) a uloženo při teplotě - 18 / - 30 C po dobu nejvýše 6 měsíců ; doporučuje se zmrazit v mikrozkumavkách se šroubovacími víčky, aby se zabránilo vypařování. Toto vypařování zvyšuje koncentraci, která vede k příliš vysoké intenzitě barvení během enzymatické vizualizace. DŮLEŽITÉ : Po uložení při 2 8 C nebo při - 18 / - 30 C DOBŘE homogenizujte rozředěné antisérum před přípravou pracovního roztoku (zředěné antisérum). Před použitím uložte rozmražené antisérum při 2 8 C a použijte je během jednoho dne. Nezmrazujte a nerozmrazujte antisérum více než dvakrát. Antisérum vyřaďte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. POZNÁMKA : Antiséra mohou pocházet z různých zvířecích druhů. Nemísit dvě různé lahvičky s antiséry i když jsou stejné specificity a při výměně lahviček s antiséry VŽDY měnit špičky pipety. Během přepravy mohou být antiséra uchovány bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. 5. PEROXID VODÍkU : H 2 O 2, 110 objemů (30 %) K přípravě vizualizačního roztoku TTF, jak je popsáno v části "TTF1 A TTF2". Skladování Peroxid musí být uchováván v tmavé lahvi a v chladničce (2 až 8 C). Při dávkování vždy používejte čistou pipetu, abyste zabránili kontaminaci obsahu lahve. 6. ODBARVOVACÍ ROZTOk Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku (SEBIA, kat č. 4540, 10 lahviček, 100 ml v každé) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 100 litrů. Praktické je zředit pouze 5 ml zásobního roztoku na 5 litrů, což je objem láhve na odbarvovací roztok. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Pro promyti gelu po enzymatické vizualizaci a sušení. Pro promývání barvicího prostoru systému HYDRASYS. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 ml 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH ( 19 M NaOH). Skladování, stabilita a známky zhoršování Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování v uzavřené láhvi při pokojové teplotě. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. Nepřidávat azid sodný. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. - 206 -
7. HYDRASYS PROMÝVACÍ ROZTOk Každá lahvička promývacího roztoku HYDRASYS (SEBIA, kat č. 4541, 10 lahviček, 80 ml každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumivý roztok ph 8,7 ± 0,5. Prací roztok HYDRASYS je určen pro čištění barvicího prostoru HYDRASYS. Používejte pravidelně, například když se přístroj používá denně, čistěte barvicí prostor jednou týdně Viz příbalový leták s návodem k použití. Skladování, stabilita a známky zhoršování Zásobní i pracovní roztok skladujte v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní jsou do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok zlikvidujte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. NUTNÉ VYBAVENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č. 1210 nebo kat. č. 1211 nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č. 1212. 2. Manuální nebo automatizovaný mikropipetor (SEBIA HYDRAPLUS, kat. č. 1216, SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č. 1217 nebo SEBIA ASSIST, kat. č. 1218) jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Suchá skladovací komora pro zaostření vzorku, SEBIA, kat. č. 1271. 4. Vodící tyčka pro aplikační šablonu, dodávaná s HYDRASYS systémem. 5. Dynamická maska, SEBIA kat. č. 1255. 6. HYDRASYS Accessory kit pro CSF s Dynamickou maskou, SEBIA, kat. č 1259. 7. Pipety 2 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl a 5 ml. ANALYZOVANÉ VZORkY Odběr a skladování vzorků Nejlepších výsledků se dosahuje analýzou čerstvých vzorků. Sérum i cerebrospinální tekutina se odebírá současně - dle zavedených postupů používaných laboratoří. Po odběru je lze skladovat v chladničce po dobu jednoho týdne. Mražené vzorky jsou stabilní nejméně 1 měsíc. vzorků Odpovídajícími metodami změřte koncentraci jednotlivých porovnávaných imunoglobulinů v séru i v moku. Koncentrace porovnávaných imunoglobulinů séra a moku musí být vždy nastavena u obou vzorků na stejnou hladinu Nastavení závisí na původní koncentraci imunoglobulinů v CSF ; pro všechna ředění použijte ředicí roztok pro vzorky : 1. Koncentrace určovaného Ig je vyšší než 1 mg/dl Zřeďte cerebrospinální tekutinu a sérum pomocí sample diluentu na hodnotu stanovovaného imunoglobulinu 1 mg/dl. 2. Koncentrace určovaného Ig v moku v rozmezí 0.5 a 1 mg/dl Použijte neředěný mozkomíšní mok. Sérum nařeďte na stejnou koncentraci Ig jako je v likvoru. 3. Koncentrace určovaného Ig v mozkomíšním moku je nižší nežli 0.5 mg/dl Likvor je nutno zahustit na koncentraci stanovovaného Ig mezi 0.5 a 1 mg/dl. Sérum nařeďte na koncentraci Ig v likvoru. Příklad ředění (jen pro vzorky s koncentrací určovaného Ig nad 1.0 mg/dl) : Pro likvor (CSF) : A (mg/dl) = koncentrace Ig nad 1.0 mg/dl. Vezměte x μl likvoru a přidej [x (A -1)] diluentu (doporučená hodnota x = 10 μl). Pokud je A nižší než 1.0 mg/dl použijte neředěný likvor. Pro sérum : B (mg/dl) = koncentrace určovaného Ig. - Sérum nařeďte 20 x diluentem (např. : 5 μl séra + 95 μl diluentu). - Vezměte y μl ředěného séra a přidejte [y(b/20-1)] diluentu (doporučená hodnota pro y = 2 μl). Vzorky, které není vhodné používat Neanalyzujte vzorky uložené ve skladovacích zkumavkách s TransFix /EDTA (použitých k analýzám v průtokové cytometrii), styk mozkomíšního moku se stabilizačním roztokem obsaženým v těchto zkumavkách změní migraci a výsledek nebude interpretovatelný. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. - 207 -
PRACOVNÍ POSTUP HYDRAGEL 3 & 6 CSF - 2017/04 HYDRASYS je multiparametrický, poloautomatizovaný systém. Automatizované kroky zahrnují postupně nanesení vzorků, elektroforetickou migraci, inkubaci se substrátem, zastavení enzymatické reakce, odsávání a osušení gelové plotny. Manipulace se vzorky, gely, vkládání reagencií a nastavení přístroje k uvedení do chodu se provádí ručně. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2. DŮLEŽITÉ : Nastavte pozici dynamické šablony tak, aby byly vyrovnány elektroforetické profily a jamky masky (viz uživatelský návod systému HYDRASYS / HYDRASYS 2). POZNÁMKA : Postup s dynamickou maskou HYDRAGEL CSF může být prováděn s verzí softwaru 7.01.18 systému HYDRASYS nebo verzí softwaru 2.2x systému HYDRASYS 2 a následujících verzích. I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte HYDRASYS. 2. Umístěte šestizubý aplikátor HYDRAGEL 3 CSF nebo patnáctizubý - HYDRAGEL 6 CSF na rovnou plochu čísly jamek vpravo nahoře. - Naneste 15 μl vzorku do každé jamky (viz Obr. 1). Aplikátor musí být napipetován ve 2 minutách. Následující příklad ukazuje analýzu 3 nebo 6 párů likvor / sérum na jednom gelu s jedním typem protilátky (např. anti-ig G), jiné požadované kombinace mohou být provedeny podobně - např. 2 páry likvor / sérum mohou být analyzovány pro Ig G, Ig A a Ig M. Pacient č. : 1 2 3 Jamka č. : Likvor 1 3 5 (aplikátor 6 zoubků) Sérum 2 4 6 Pacient č. : 1 2 3 4 5 6 Jamka č. : Likvor 2 4 6 9 11 13 (aplikátor 15 zoubků) Sérum 3 5 7 10 12 14 DŮLEŽITÉ : Jamky č.1, 8 a 15 se v tomto testu nepoužívají, je vhodné je označit, aby nebyly omylem naplněny vzorky. - Naneste 15 μl diluentu do jamek č. 1, 8 a 15 patnáctizubého aplikátoru. - Uchopte aplikátor za okraj plastikového rámečku a uložte ho zuby nahoru do suché komůrky, předtím reaktivované. Detaily viz příbalový leták komůrky. - Komůrku uzavřete víčkem. - Ponechejte aplikátor v suché komůrce 15 minut při pokojové teplotě. Proteiny ve vzorku budou soustředěny do špičky zubů aplikátoru a zahuštěny částečným odpařením. DŮLEŽITÉ : Po 15ti minutách proveďte ihned krok č. 8 - aplikaci vzorků na gel. V průběhu zahušťování vzorků připravte migraci. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte nosiče elektrod a aplikátorů. POZOR : Nikdy nezavírejte víko pokud jsou ještě zvednuty nosiče! 4. Z menu přístroje zvolte program migrace "3 CSF SM/DM TTF" pro HYDRAGEL 3 CSF nebo "6 CSF SM/DM TTF" pro HYDRAGEL 6 CSF. 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy - uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na výstupky elektrodového nosiče. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte agarózovou plotnu HYDRAGEL. - Plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej po povrchu gelu narolujete, aby přilnul k celé ploše a odsál přebytek tekutiny. Papír ihned odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu hrozí dehydratace gelu! - Naneste 120 μl (pro HYDRAGEL 3 CSF) destilované nebo deionizované vody nebo 200 μl (pro HYDRAGEL 6 CSF) na dolní třetinu rámečku vyznačeného na migrační ploše. - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (viz Obr. 3). - Nyní gel ohněte a pokládejte do kontaktu s kapkou vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem, bez vzduchových bublin. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Snižte migrační rámeček dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU! 8. Po zahuštění vzorků na aplikátoru : - Odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Aplikátor umístěte do nosiče aplikátorů do pozice č. 8. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Ihned zahajte postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda nejsou blokovány vzduchové otvory přístroje. MIGRACE - POPIS AUTOMATICkÝCH ČINNOSTÍ Všechny části migračního rámečku jsou sníženy - stripy s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu - probíhá aplikace vzorků do gelu. Nosič aplikátorů vzorků se zvedne, části s elektrodami nesoucí stripy s pufrem zůstávají v kontaktu s povrchem gelu. Proběhne migrace při konstantních 10 W pro HYDRAGEL 3 CSF, nebo 20 W pro HYDRAGEL 6 CSF při 20 C až do akumulovaných 80 Vh (po dobu asi 17-ti minut). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Ozve se pípnutí a odjistí se víko. Signál trvá do zásahu operátora. Na displeji se objeví následující zpráva "e AS" / "e ANTISERA" signalizující pokyn pro aplikaci antiséra. POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků. - 208 -
II. NASTAVENÍ IMUNOFIXACE Dynamická maska sestává z barevné referenční šablony pro aplikaci reagencií, segmentu pro antiséra, držáku segmentu pro antiséra, vodícího rámečku dynamické masky a rámečku pro redukci délky (Obr. 5). 1. Položte vodící rámeček pro sestavení dynamické masky na rovnou plochu. 2. Umístěte rámeček pro redukci délky do vodícího rámečku. 3. Nacvakněte segment pro nanášení antisér do jeho držáku (Obr. 6) : - Segment pro antiséra nakloněný v úhlu 45 vtlačte proti plastikovým pružinkám do držáku. - Současně táhněte segment i držák od sebe a otáčejte segment tak, aby se zafixoval do zoubků držáku. POZOR : Ujistěte se o správném umístění segmentu v držáku : výstupky na koncích segmentu musí být zablokovány v zoubcích držáku. 4. Umístěte držák se segmentem pro nanášení antisér do vodícího rámečku dynamické masky (viz Obr. 7). 5. Reagencie aplikujte následovně : Pro HYDRAGEL 3 CSF : aplikujte 15 μl antiséra anti-ig G - PER do každé ze 6-ti jamek antisérového segmentu, Pro HYDRAGEL 6 CSF : aplikujte 15 μl antiséra anti-ig G - PER do jamky č. 2 až 7 a 9 až 15 antisérového segmentu. DŮLEŽITÉ : Pro HYDRAGEL 6 CSF nepoužívejte jamky č. 1, 8 a 15 antisérového segmentu. Při pipetování se vyvarujte tvorby a nasátí bublin do špičky pipety. 6. Napipetujte reagencie (Obr. 8) : - Pipetu držte v úhlu a při aplikaci špičku zlehka opřete o boční stranu jamky. - Vstříkněte kapku reagencie do jamky bez dotyku dna jamky. III. IMUNOFIXACE 1. Po skončení migrace otevřete víko. 2. Vyjměte aplikátory vzorků a odstraňte je. 3. Zdvihněte oba nosiče a vyjměte je. - Vyjměte pufrované proužky za plastové konce a zneškodněte. - Pečlivě otřete elektrody měkkým zvlhčeným hadříkem nebo gázou. - Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 4. Připravte dynamickou masku pro aplikaci reagencií následovně (Obr. 9) : - Umístěte kovovou vodící tyčku na ukotvující výstupky v HYDRASYSu (může být ponechán v migračním modulu po celou dobu). - Uchopte dynamickou masku za úchytky a vložte ji do vodiče tak, aby zářezy byly zarovnány se značkami. 5. Sklopte dynamickou masku na migrační plochu HYDRASYSu. DŮLEŽITÉ : Upravte pozici dynamické masky pro dokonalé spojení mezi elektroforetickými profily a jamkami masky. 6. Ujistěte se, že nosič segmentu pro antiséra je v nejnižší pozici (nejblíže k obsluze) v základním rámečku DM - uchopte držák segmentu za úchytku na pravé straně a zatlačte prstem druhé ruky na centrálně umístěný označený bod tak, aby se segment pro antiséra dostal do kontaktu s gelem. Po uvolnění tlaku se reagencie rozprostřou pod každou jamkou - stopou (Obr. 10). 7. Nyní okamžitě, za použití úchytky držáku segmentu, pohybujte pomalu, ale plynule nahoru a dolů po celé délce gelu - opakujte tento krok dvakrát, až dojde k rovnoměrné aplikaci reagencií. Aplikace by měla trvat pokaždé přibližně 5 sekund (Obr. 11). POZOR : Během tohoto kroku držte masku pouze za úchytku držáku segmentu pro nanášení antisér. Nedotýkejte se základního rámečku masky. Nemačkejte vícekrát na centrálně umístěný bod - hrozí křížová kontaminace. 8. Vyjměte DM z migračního modulu HYDRASYSu. 9. Vyjměte držák segmentu pro antiséra za úchytku na pravé straně. 10. Vyjměte segment pro aplikaci antisér z držáku a odstraňte jej. POZOR : Manipulujte se segmentem pro aplikaci antisér opatrně. 11. Po aplikaci mohou v jamkách zůstat zbytky reagencií. Na výsledky testů by to však nemělo mít vliv. 12. Uzavřete víko migračního modulu. 13. Ihned zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "[INCUBATION]". IMUNOFIXACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků Inkubace 10 minut při 20 C, řízeno Peltierovým efektem. Zazní pípnutí a víko migračního modulu se odjistí. Na displeji se objeví následující zpráva : "e PAP." / "e THICK FILTER PAPER" signalizující nutnost aplikovat tlustý filtrační papír pro odsátí. POZN. : Během inkubace zůstává víko migračního modulu uzavřeno. IV. ODSÁTÍ GELU (BLOTTING) 2. Položte na gel tlustý filtrační papír : - Hladkou stranou dolů. - Zarovnejte dolní okraj filtračního papíru s okrajem gelu (nakloňte jej v úhlu 45 ). - Zlehka jej položte na gel. POZOR : Pevně tlačte na celý povrch filtračního papíru k zajištění jeho dokonalého přilnutí ke gelu. 3. Zavřete víko migračního modulu. 4. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. ODSÁTÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků K odsání gelu při 20 C jsou vymezeny 3 minuty (řízeno Peltier. efektem). Na disleji se zobrazí zpráva "[BLOTTING]". Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a PAP. + e WASH" / "a THICK FILTER PAPER, e WASH" signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést promývací roztok CSF. - 209 -
V. OMYTÍ GELU 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na desce migračního modulu. 3. Připravte šablonu pro aplikaci R1 pro HYDRAGEL 3 CSF nebo ENZ 2 ml pro HYDRAGEL 6 CSF (viz obr. 12). 4. Aplikujte 2 ml promývacího roztoku CSF pro HYDRAGEL 3 CSF nebo 4 ml pro HYDRAGEL 6 CSF otvorem v šabloně do prostoru pod ní (viz obr. 13). Zkontrolujte, že je roztok pod šablonou rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru se středem v otvoru šablony. 5. Při pipetování promývacího roztoku CSF se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Rekonstituce promývacího roztoku : - Pipetu držte kolmo. - Lehce zatlačte špičku pipety do otvoru šablony. - Opatrně a postupně vstříkněte roztok pod šablonu, aniž by došlo ke vniknutí vzduchu. 6. Uzavřete víčko migračního modulu. 7. Ihned zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. PROMÝVÁNÍ GELU POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 5 minut při 20 C. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a WASH + e PAP." / "a WASH, e THICK FILTER PAPER" signalizuje odstranění promývacího roztoku CSF odpipetováním přebytku kapaliny a použitím tlustého filtračního papíru. VI. ODSTRANĚNÍ PROMÝVACÍHO ROZTOkU 2. Odstraňte promývací roztok. 3. Držte pipetu kolmo a lehce vtiskněte špičku do jamky (obr. 13). 4. Opatrně a postupně odstraňte promývací roztok. 5. Uchopte aplikační šablonu na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte. Oblast gelu musí být rehydratována. VII. ODSÁTÍ GELU 1. Položte na gel silný filtrační papír, jak je popsáno v odstavci IV (hladkou stranou dolů na gel). 2. Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu pro zajištění dokonalého přilnutí. 3. Uzavřete víčko migračního modulu. 4. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. ODSÁVÁNÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí při 20 C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým jevem. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "[BLOTTING]". Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva: "a PAP. + e REHYD 1" / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATING 1" signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést první rehydratační roztok. VIII. REHYDRATACE GELU 2. Ponechte gel na ploše migračního modulu. 3. Nastavte reag. aplikační šablonu R1 pro HYDRAGEL 3 CSF nebo ENZ 2 pro HYDRAGEL 6 CSF (viz Obr. 12). 4. Aplikujte 2 ml rehydratačního roztoku pro HYDRAGEL 3 CSF nebo 4 ml pro HYDRAGEL 6 CSF otvorem v šabloně do prostoru pod ní (viz Obr. 13). Zkontrolujte, že je roztok pod šablonou rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru se středem v otvoru šablony. 5. Nasajte do špičky pipety rehydratační roztok bez bublin. - Proto držte pipetu kolmo. - Lehce vtiskněte špičku pipety do otvoru v šabloně. - Pečlivě postupně vstřikujte roztok bez bublin pod šablonu. 6. Uzavřete víko migračního modulu. 7. Zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. REHYDRATACE GELU - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků 5 min. inkubace při 20 C řízených Peltierovým efektem. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a REHYD1 + e PAP." / "a REHYDRATING 1, e THICK FILTER PAPER" signalizující pokyn k odstranění rehydratačního roztoku a aplikaci tlustého filtračního papíru. IX. ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOkU 2. Odstraňte rehydratační roztok, jak bylo popsáno v odstavci VI. 3. Vyjměte reagenční aplikační šablonu. Povrch gelu musí být rehydratovaný. X. ODSÁTÍ GELU 1. Položte jeden tlustý filtrační papír na rehydratovanou oblast gelu jako ve čl. IV. 2. Filtrační papír přitlačte po celé ploše tak, aby plně přilnul na gel. 3. Uzavřete víko migračního modulu. 4. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. ODSÁTÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ 3 minuty odsávání při 20 C regulovaných Peltierovým efektem. Ozve se pípnutí a na displeji se objeví následující zpráva "a PAP. + e REHYD2" / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATING 2" signalizující pokyn k vynětí filtračního papíru a aplikaci rehydratačního roztoku. - 210 -
XI. REHYDRATACE GELU 2. Ponechte gel na ploše migračního modulu. 3. Nastavte reag. aplikační šablonu R1 pro HYDRAGEL 3 CSF nebo ENZ 2 ml pro HYDRAGEL 6 CSF (viz Obr. 12). 4. Aplikujte 2 ml rehydratačního roztoku pro HYDRAGEL 3 CSF nebo 4 ml pro HYDRAGEL 6 CSF otvorem v šabloně do prostoru pod ní (viz obr. 13). Zajistěte rovnoměrné rozprostření tekutiny po obdélníkové ploše pod šablonou se středem na otvoru šablony. 5. Při pipetování rehydratačního roztoku se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Naneste rehydratační roztok, jak bylo popsáno v odstavci V. 6. Uzavřete víko migračního modulu. 7. Zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. REHYDRATACE GELU - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 5 minut při 20 C. Po skončení inkubace zazní zvukový signál a teplota desky se zvýší z 20 na 30 C. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a REHYD2 + e TTF" / "a REHYDRATING 2, e TTF", která signalizuje nutnost odstranit rehydratační roztok a nanést vizualizační roztok. XII.ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOkU 2. Odstraňte rehydratační roztok - dříve popsáno v čl. VI. 3. Ponechte šablonu na místě. XIII. VIZUALIZACE 1. Aplikujte 1 ml vizualizačního roztoku TTF (připraveného těsně před použitím) pro HYDRAGEL 3 CSF nebo 2 ml pro HYDRAGEL 6 CSF do prostoru pod šablonou. 2. Zkontrolujte, že je roztok pod šablonou rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru se středem v otvoru šablony. Při pipetování vizualizačního roztoku TTF se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Naneste vizualizační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci V. 3. Uzavřete víko migračního modulu. 4. Ihned zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. INkUBACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ 15 min. inkubace při 30 C řízených Peltier. efektem. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a TTF + e PAP." / "a TTF, e THICK FILTER PAPER", která signalizuje nutnost odstranit vizualizační roztok a nanést jeden silný filtrační papír. XIV. ODSTRANĚNÍ VIZUALIZAČNÍHO ROZTOkU 2. Odstraňte vizualizační roztok - jak bylo dříve popsáno v čl. VI. 3. Odstraňte reagenční aplikační šablonu. XV.ODSÁTÍ GELU (BLOTTING) 1. Položte jeden tlustý filtrační papír na rozvinutou oblast gelu jako v čl. IV. 2. Filtrační papír přitlačte po celé ploše tak, aby plně přilnul na gel. 3. Uzavřete víko migračního modulu. 4. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. 5. Opláchněte šablonu destilovanou vodou nebo alkoholem a důkladně osušte měkkým absobčním papírem. Těsně před dalším použitím zkontrolujte, zda je šablona zcela suchá, kapky z jamek odstraňte poklepáním. ODSÁTÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ 3 minuty odsávání při 30 C regulovaných Peltierovým efektem. Ozve se pípnutí a na displeji se objeví následující zpráva "a PAP. + e REHYD3" / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATING 3" signalizující pokyn k vynětí filtračního papíru a aplikaci rehydratačního roztoku. XVI. REHYDRATACE GELU 2. Ponechte gel na ploše migračního modulu. 3. Nastavte reag. aplikační šablonu R1 pro HYDRAGEL 3 CSF nebo ENZ 2 ml pro HYDRAGEL 6 CSF (viz Obr. 12). 4. Aplikujte 2 ml rehydratačního roztoku pro HYDRAGEL 3 CSF nebo 4 ml pro HYDRAGEL 6 CSF otvorem v šabloně do prostoru pod ní (viz obr. 13). Zajistěte rovnoměrné rozprostření tekutiny po obdélníkové ploše pod šablonou. - Nasajte do špičky pipety rehydratační roztok bez bublin. Naneste rehydratační roztok, jak bylo popsáno v odstavci V. 5. Uzavřete víko migračního modulu. 6. Zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. REHYDRATACE GELU - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků 5 min. inkubace při 30 C řízených Peltierovým efektem. Na displeji je zobrazena následující zpráva : "a REHYD 3 + e PAP." / "a REHYDRATING 3, e THICK FILTER PAPER" signalizující pokyn k odstranění rehydratačního roztoku a aplikaci tlustého filtračního papíru. XVII. ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOkU 2. Odstraňte rehydratační roztok - dříve popsáno v čl. VI. 3. Uchopte reagenční aplikační šablonu, zvedněte ji a vyjměte. - 211 -
XVIII. ODSÁTÍ A OSUŠENÍ GELU 1. Položte jeden tlustý filtrační papír na rozvinutou oblast gelu jako v čl. IV. 2. Filtrační papír přitlačte po celé ploše tak, aby plně přilnul na gel. 3. Uzavřete víko migračního modulu. 4. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. 5. Omyjte šablonu destilovanou vodou nebo alkoholem a důkladně vysušte jemným absorpčním papírem. Před opakovaným použitím zkontrolujte, že je šablona zcela suchá a odstraňte kapky z jamek poklepáním na měkkém papíru. POZNÁMKA : Poznámka: Alkohol je možné použít na čištění aplikační šablony R1 nebo ENZ 2 ml po vizualizačním kroku roztokem TTF. Opláchněte vodou. ODSÁNÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ 3 minuty sání při 30 C regulovaných Peltierovým efektem. Ozve se pípnutí a na displeji se objeví zpráva "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER" signalizující pokyn k vynětí filtračního papíru. XIX. OSUŠENÍ GELU 1. Otevřeteb víko migračního modulu. 2. Vyjměte filtrační papír a gel ponechejte na místě. 3. Uzavřete víko HYDRASYSu. 4. Vysoušení zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Na displeji je zobrazena zpráva "[DRYING]". SUŠENÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ 3 minuty sušení při 50 C. Ozve se pípnutí signalizující otevření víka. 5. Otevřete víko. 6. Když je gel vysušen, ihned jej vyjměte k dalšímu zpracování. POZN. : - Teplota migrační plochy klesne na 20 C v méně než 5 min. Při dosažení 20 C může být zahájena další migrace. - Umístěte migrační rámeček zpět na své místo. - Otřete temperovanou migrační plochu měkkým vlhkým čtverečkem. XX. OMYTÍ A konečné ZPRACOVÁNÍ GELU Po vysušení se musí gel bez prodlení promýt v barvicím prostoru pomocí programu "WASH ISOENZ/GEL". Pokud byl tento prostor použit k barvení gelu, vyčistěte jej pomocí programu "WASH CHAMBER". 1. Otevřete držák gelu. Položte jej na rovnou plochu a gel umístěte (gelovou stranou vzhůru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je uvnitř držáku správně umístěn (viz obr. 14). 2. Držák gelu vložte do modulu pro vyvíjení a barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před spuštěním programu pro vyvíjení / barvení zkontrolujte následující : - zda nádoba na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 400 ml odbarvovacího roztoku ; - nádoba na odpad je prázdná. 3. Připojení vedení činidel : Viz informace zobrazené na obrazovce přístroje (vyberte klávesu : VEDENÉ ČINIDEL). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte uzavřít nepoužívané přívody. 4. Z menu přístroje vyberte promývací program "WASH ISOENZ/GEL" a spusťte program stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Během promývání, odbarvování a sušení je tento prostor uzamčen. Po ochlazení se odjistí víko migračního modulu (větrání zůstane zapnuté až do vyjmutí držáku gelu). 5. Vyjměte držák gelu z modulu, otevřete úchytky a vyjměte vysušený gel. Je-li zapotřebí, očistěte zadní stranu (plastovou nosnou stranu) vysušeného filmu vlhkým jemným papírem. kontrola kvality Doporučuje se ke každé řadě analýz séra přidat kontrolní sérum (například CSF Control, SEBIA, kat. č. 4794). INTERPRETACE SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Intratékální syntéza v CNS je naznačena následnými komparativními pozorováními : Rozdílné výsledky imunofixace v likvoru v porovnáním se sérem. Oligoklonální proužky jsou přítomny ve většině případů (ne ve všech). Silnější proužek, přídatný proužek, dokonce jednoduchý slabý imunofixační proužek pozorovaný v likvoru, nikoliv však v séru, všechny svědčí pro intratékální syntézu. Vzácně nejsou pozorovány žádné oligo- nebo monoklonální Ig proužky i když klinicky jde o sklerózu multiplex. V takových případech mohou být polyklonální proužky imunoglobulinů v likvoru umístěny blíže katodě nežli v séru. Ve většině případů se jedná o intratékální imunoglobuliny třídy Ig G, jen vzácně se jedná o Ig A a Ig M. Intratékální syntéza Ig A se manifestuje migrací blíže katodě v likvoru ve srovnání s migrací Ig A v séru. - 212 -
K zajištění správné komparativní interpretace je zcela nezbytné zajistit : Vzorky likvoru a séra musí být odebrány ve stejném čase, od téhož pacienta manipulací se vzorky nesmí být pozměněny koncentrace imunoglobulinů. Koncentrace imunoglobulinů v likvoru i v séru musí být určeny přesně, aby bylo možno na gel nanášet stejná množství materiálu se stanovovanými Ig. Detekce intratékální syntézy imunoglobulinů citlivou imunofixací je specifičtějším a citlivějším indikátorem nežli informace plynoucí z různých kvocientů počítaných z celkových koncentrací imunoglobulinů a dalších proteinů v séru a likvoru. Potvrzení intratékální syntézy Ig je důležitou informací v dg. zánětlivých onemocnění CSF. Oligoklonální profil či jiné známky intratékální syntézy Ig mohou být nalezeny u různých onemocnění CSF - např. : v 70-95 % roztroušené sklerózy mozkomíšní, v 100 % neléčené neurosyfilitidy, v 100 % subakutní sklerotizující leukoencefalitidy. Diagnóza však nemůže být založena jen na imunofixačních nálezech. Tyto musí být brány v úvahu vždy ve spojení s klinickými pozorováními a anamnézou a musí být doplněny dalšími biochemickými a mikrobiologickými testy. Omezení jiných antisér než těch, které jsou určené pro soupravu HYDRAGEL 3 a 9 CSF, může mít nedobrý vliv na výsledky. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Problémy Odstraňování závad a řešení problémů. Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu společnosti SEBIA. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com. ÚDAJE O VÝkONU Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost na gelu Každý pár vzorků CSF a séra od dvou pacientů (jeden pár po intratekální syntéze a jeden pár bez provedení intratekální syntézy) a roztok SEBIA CSF Control byly analyzovány postupem HYDRAGEL CSF na gelech ze stejné šarže a inkubovány antisérem anti-ig G značeným peroxidázou. Každý pár CSF / sérum byl analyzován šestkrát na jednom gelu a roztok CSF Control byl analyzován na 12 stopách jednoho gelu. Reprodukovatelnost mezi gely Čtyři páry CSF / sérum (2 páry po intratekální syntéze a dva páry bez provedení intratekální syntézy), 1 vzorek patologického séra s monoklonálními složkami a roztok SEBA CSF Control byly analyzovány postupem HYDRAGEL CSF a inkubovány antisérem anti-ig G značeným peroxidázou na 10 gelech za stejné šarže, což zahrnovalo jednu analýzu každého páru CSF / sérum na gel a 2 analýzy vzorku patologického séra a roztoku CSF Control. Výsledky : Výsledky získané postupem HYDRAGEL CSF ukazují u antiséra anti-ig G značeného peroxidázou velmi dobrou reprodukovatelnost v rámci gelu i mezi gely. Na základě vizuální zkoušky byly ve všech studiích reprodukovatelnosti v každém vzorku a na všech gelech správně identifikovány oligoklonální pásy, nedošlo k žádnému falešně pozitivnímu / negativnímu stanovení a mezi jednotlivými opakováními se nevyskytovaly žádné rozdíly. Přesnost Detekce a identifikace oligoklonálních pásů Vzorky od 77 pacientů zahrnující 28 párů CSF / sérum a 49 vzorků patologického séra s monoklonálními složkami byly analyzovány postupem HYDRAGEL CSF s imunofixací s použitím antiséra anti-ig G značeného peroxidázou, antisér anti-ig A nebo anti-ig M a antisér proti lehkým řetězcům anti-kappa nebo lambda souběžně s elektroforézou v komerčně dostupném imunofixačním agarózovém gelu určenou pro detekci oligoklonálních Ig pásů. Oba elektroforetické záznamy byly vizuálně vyhodnoceny na přítomnost oligoklonálních Ig pásů. Studie prokázala 100 % shodu mezi oběma technikami. U 28 párů CSF / sérum (zahrnujícími 18 normálních párů a 10 patologických párů) : úplná shoda U 49 patologických vzorků séra : úplná shoda Citlivost Citlivost postupu HYDRAGEL CSF je následující : detekční limit monoklonálního pásu typu Ig G je v rozmezí 3,1 až 12,5 μg/dl, kolem 12,5 μg/dl u typu Ig A, kolem 25 μg/dl u typu Ig M a kolem 3,1 až 12,5 μg/dl u paraproteinů s navázaným lehkým řetězcem kappa a lambda. - 213 -