HYDRAGEL IF K20 Ref. 3031 2018/07
POUŽITÍ KÍTU HYDRAGEL IF K20-2018/07 HYDRAGEL IF K20 kit je určen ke stanovení monoklonálních bílkovin imunoxační elektroforézou na agarózových gelech o ph 9.2. K detekci po provedené elektroforéze se používá imunofixace pomocí antisér proti těžkým řetězcům anti-ig G, anti-ig A a anti-ig M a proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům anti-kappa a anti-lambda. Po imunofixaci jsou precipitované bílkoviny obarveny kyselou violetí. Přebytek barvičky se odstraní kyselým roztokem. Každý agarózový gel HYDRAGEL IF K20 je určen pro analýzu jednoho vzorku. Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Abnormální proužky zjištěné elektroforézou v zóně beta a gamaglobulinů mohou vyvolávat podezření na výskyt monoklonálních proteinů a tím gamapatie. K identifikaci těchto abnormálních proužků slouží imunofixace. Imunofixační elektroforéza umožní zafixování proteinů in situ, kde tvoří nerozpustné komplexy s odpovídajícími protilátkami. Provedení testu : 1. Vzorek se simultánně elektroforeticky dělí v šesti stopách na alkalicky pufrovaném agarózovém gelu. 2. Fixační roztok a antiséra jsou naneseny na povrch gelu do příslušných elektroforetických migračních stop a difundují do gelu precipitujíce všechny bílkoviny, resp. odpovídající antigeny. První stopa (ELP) slouží jako referenční, zbývajících 5 stop je použito k nanesení specifických antisér proti těžkým řetězcům (G, A, M), anti-kappa a anti-lambda volným a vázaným lehkým řetězcům. 3. Nezprecipitované, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny odsátím a promytím. Komplex antigen-protilátka zůstává v gelové vrstvě. 4. Precipitované proteiny jsou vizualizovány barvením kyselou violetí. Imunoprecipitátové proužky jsou poté porovnávány s odpovídajícími abnormálními proužky v elektroforeogramu sérového vzorku. Elektroforetické dělení, jehož cílem je detekce a identifikace podezřelých monoklonálních složek, probíhá současně v šesti stopách. Po elektroforéze slouží jedna stopa jako referenční a poskytuje úplné elektroforetické uspořádání bílkovin ve vzorku. Zbývajících pět řad umožňují charakterizaci monoklonální složky (nebo absenci) z reakce s antisérem proti těžkým řetězcům gama (Ig G), alfa (Ig A) a mu (Ig M) a proti volným a vázaným lehkým řetězcům kappa a lambda. Tato jednoduchá a rychlá technika poskytuje jasné a lehce interpretovatelné výsledky. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL IF K20 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY KAT. Č. 3031 Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů Pufr Tris-barbital (zásobní roztok) 3 lahv. po 75 ml Kyselá violeť (zásobní roztok) 1 lahv. 75 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahv. 100 ml Diluent pro vzorky (připraveno k použití) 1 lahv. 32 ml Aplikátory (6 zubů) (připraveno k použití) 1 bal. po 10 ks Tenké filtrační papíry 1 bal. po 10 ks Hřebínkové papíry filtry 1 bal. po 10 ks Tlusté filtrační papíry 2 bal. po 10 ks POZN. : Fixační roztok a antiséra jsou dodávána zvlášť vyjma soupravy kit (viz článek DALŠÍ POTŘEBNÉ REAGENCIE). OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 9.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu a imunofixaci. Skladujte gely v horizontální poloze v originálních ochranných obalech při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady a na balení gelu (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zamezte prudkým změnám teploty při skladování. NEMRAZIT. Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). - 122 - SEBIA NÁVOD - Czech
2. TRIS-BARBITAL PUFR Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumicí roztok ph 9.2 ± 0.5. Elektroforetický pufr. Pufr lze skladovat při pokojové teplotě nebo v ledničce. Je stabilní několik let, při nejmenším do data expirace vyznačeného na balení či lahvičkách. Zředěný pufr je stabilní po dobu 1 roku při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Při zjištění zákalu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace, je nutno pufr vylít. 3. KYSELÁ VIOLEŤ Lahvička zásobní kyselé violeti může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 300 ml. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; kyselou violeť ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro barvení gelů po elektroforéze a imunofixaci. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo při 2-8 C v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní roztok vydrží 6 měsíců. 4. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 1 litr pracovního roztoku doplněním 1 ml zásobního roztoku do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný! Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 5. DILUENT PRO VZORKY Ředící roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok ph 7.5 ± 0.5 ; bromofenolová modř ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Používejte k ředění vzorků. Bromfenolová modř usnadňuje nanášení vzorku a slouží jako marker migrace. Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu kitu a na štítku lahvičky. Po vzniku precipitátů nelze použít. 6. APLIKÁTORY Jednorázové aplikátory k nanesení vzorků - připraveny k použití Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 7. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 8. HŘEBENY Z TLUSTÉHO FILTRAČNÍHO PAPÍRU K odsátí přebytečného fixačního roztoku a antisér z povrchu gelu po imunofixačním kroku. HYDRAGEL IF K20-2018/07-123 -
9. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY K odsátí nezprecipitovaných proteinů z gelu po imunofixaci. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. HYDRAGEL IF K20-2018/07 POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. SOUPRAVA ANTISÉR A FIXAČNÍ ROZTOK Balení antisér a fixačního roztoku pro imunofixaci IF se standardní maskou, SEBIA, kat. č. 4815, obsahuje 5 lahviček s antiséry proti Ig G, Ig A, Ig M, řetězcům Kappa (lehké volné a vázané) a řetězcům lambda (lehké volné a vázané), každou o objemu 1 ml, a 1 lahvičku s fixačním roztokem o objemu 2.5 ml. Jsou specifická pro imunofixační postup s maskou 1 IF, SEBIA. 1.1 ANTISÉRA Všechna antiséra jsou savčí imunoglobuliny protilátky proti lidským bílkovinám, ihned použitelná k analýze. Ke snadnějšímu rozlišení jsou antiséra obarvena různými barvami. Štítky na lahvičkách jsou zbarveny stejně. Lehký zákal, který se může vyskytnout v antisérech a zůstává i po 10 minutách při pokojové teplotě, při imunologické reakci nevadí. K imunofixaci bílkovin, které byly rozděleny elektroforezou. POZN. : Antiséra jsou specifická pro imunofixační postup s maskou 1 IF. Antiséra mohou pocházet od různých živočišných druhů. Nemíchejte proto antiséra ze dvou různých lahviček ani pokud jsou specifikovány stejně. Při výměně lahviček s antiséry VŽDY měňte špičku pipety. DŮLEŽITÉ : K zabránění kontaminace mezi reagenciemi, nezaměňte jejich víčka. Skladujte v chladničce při 2-8 C. Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu kitu a na štítcích lahviček. Pokud se výrazným způsobem změní vzhled antisér díky mikrobiální kontaminaci, vyřaďte je z použití. 1.2 FIXAČNÍ ROZTOK Fixační roztok je připraven k použití. Obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K usnadnění identifikace je zbarven žlutě, což odpovídá i barvě nálepky na lahvičce. K fixaci separovaných proteinů v referenční (ELP) stopě. POZN. : Fixační roztok je specifický pro imunofixační postup s maskou 1 IF. DŮLEŽITÉ : K zabránění kontaminace mezi reagenciemi, nezaměňte jejich víčka. Fixační roztok skladujte v chladu při teplotě 2 až 8 C. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady či na štítku lahvičky fixačního roztoku. Fixační roztok nesmí obsahovat sraženiny. POZNÁMKA : Během přepravy je možné uchovávat antiséra a fixační roztok při pokojové teplotě (15 až 30 C) po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na jejich vlastnosti. 2. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Musí se připravit v laboratoři 0.9 g/dl NaCl (0.15 M) roztok v destilované nebo deionizované vodě. K oplachování gelů po inkubaci s fixačním roztokem a antisery. Skladuje se při teplotě místnosti nebo v chladničce. Přestaňte používat po 3 měsících nebo při změně vzhledu roztoku. Pro delší skladování lze konzervovat 0.1 g/dl azidem sodným. 3. AMIDOČERŇ (volitelná položka SEBIA, kat. č. 4554) Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvícího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správného rozpuštění barvícího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 ml ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku pořádně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. Opakujte tento krok 2 3x, až do úplného rozpuštění koncentrované amidočerni. 6. Nalijte zbylý obsah lahvičky s ředícím roztokem pro amidočerň do odměrného válce a doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5-10 minut. Barvící roztok je připraven k použití. - 124 -
POZN. : Nesprávná příprava barvícího roztoku povede k nedostatečnému barvení albuminové frakce (nízká procentuální hodnota světlého středu frakce). Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o ph 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla. 4. FLUIDIL Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahvička, 5 ml) je připraven k použití. Používá se k ředění velmi viskózních nebo turbidních vzorků sér, t.j. obsahujících kryoglobulin nebo kryogel. Skladovat při teplotě místnosti do data expirace vyznačeného na lahvičce nesmí obsahovat sraženiny. HYDRAGEL IF K20-2018/07 5. BETA-MERKAPTOETHANOL (BME nebo 2-MERKAPTOETHANOL) (nedodávaný SEBIA) 6. ŘEDÍCÍ ROZTOK DTT (IF / IT) Složení Lahvička ředicího roztoku DTT (IF / IT) (SEBIA, kat. č. 4589 : 1 lahvička, 13 ml) obsahuje : fosfátový tlumivý roztok s ph 7,4 ± 0,5 a přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Ředicí roztok DTT (IF / IT) je určen pro přípravu lahvičky dithiothreitolu (DTT) na přípravu redukčního roztoku 0,5 M DTT, který se používá pro depolymerizaci monoklonálních bílkovin. Redukční roztok dithiothreitolu může být použit jako náhrada roztoku ß-merkaptoetanolu. Viz pokyny k použití ředicího roztoku DTT (IF / IT), SEBIA. Skladování, stabilita a známky zhoršování Viz pokyny k použití ředicího roztoku DTT (IF / IT), SEBIA. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. ZAŘÍZENÍ NEZBYTNÁ K PROVEDENÍ TESTU 1. Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. 2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, kat. č. 1409, obsahující aplikační zařízení HYDRAGEL K20 a standardní masku 1 IF k aplikaci antisér a fix. roztoku. 3. Vlhká Komůrka kat. č. 1270. 4. Elektroforetická komora, K20 SEBIA, kat. č. 1400. 5. Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi HYDRAGEL K20 Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420. 6. Pipety 10 µl, 20 µl, 100 µl a 200 µl. 7. Sušička - Inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorků Nejlepších výsledků se dosahuje analýzou čerstvých sér v případě nutnosti lze po dobu jednoho týdne skladovat v chladničce. Mražené vzorky jsou stabilní nejméně 1 měsíc. Po rozpuštění mohou zanechávat na startu stopu z denaturovaných bílkovin. Zmražení s azidem sodným, 0.02 g/dl zvyšuje stabilitu. POZOR : Kyselinu boritou jako konzervační činidlo nepoužívejte. U některých vzorků můžete pozorovat slabý otisk po aplikaci, což je způsobeno denaturací bílkovin a lipidů. vzorků Sérum se ředí před aplikací pro prevenci prozónového efektu (možné překrytí paraproteinů) při vysokých hladinách. Dobře promíchejte. STOPA SERUM (µl) DILUENT (µl) Imunofixační stopa Ig G 20 100 Referenční stopa ELP a všechny další imunofixační stopy 30 60-125 -
HYDRAGEL IF K20-2018/07 Zvláštní případy Je-li hladina celkového imunoglobulinu > 2 g/dl (hypergamaglobulinemie), použijte vyšší ředění vzorku (kromě stopy ELP) pro získání normální koncentrace imunoglobulinů. Je-li hladina celkového imunoglobulinu < 0,5 g/dl (hypogamaglobulinemie), použijte menší ředění vzorku. Sérum by mělo být rovněž testováno na Bence Jonesovu bílkovinu. Pak je doporučeno použít BENCE JONES proceduru. Vzorky by měly být testovány pomocí IF kitu při použití antisér anti-kappa volné řetězce (SEBIA, kat. č. 4610), anti-lambda volné řetězce (SEBIA, kat. č. 4611) nebo pomocí kitu HYDRAGEL BENCE JONES K20 SEBIA, kat. č. 3038. V tomto případě nařeďte sérum fyziologickým roztokem nebo diluentem pro imunofixaci, předředěným 1/4 (1 díl diluentu a 3 díly destilované nebo deionizované vody), v poměru 1/10 v případě stop ELP, GAM, K a L (1 díl séra + 9 dílů ředěného diluentu nebo fyziologického roztoku) a 1/3 (1 díl séra + 2 díly ředěného diluentu nebo fyziologického roztoku) pro stopy kappa free a lambda free. Je-li hladina celkových Ig menší než 5 g/l, vzorek se naředí v menším poměru např. : 1/5 pro stopy ELP, GAM, K a L, popř. 1/2 pro stopy Kf a Lf. Při skladování v chladničce nebo po zmrazení se některá séra (zvláště ta, obsahující kryoglobulin nebo kryogel) mohou stát viskózními nebo zakalenými. Taková séra mohou špatně difundovat do zubů aplikátoru. V takovém případě přidejte 25 µl Fluidilu na 75 µl séra a promíchejte (na vortexu) 15 sekund. Dále pokračujte podle standardního postupu. Některé monoklonální proteiny mohou polymerizovat a výsledkem je "monoklonální frakce" ve všech imunofixačních stopách. V tomto případě (i) připravte 1 % beta-merkaptoetanol (BME nebo 2 ME) ve Fluidilu, (ii) přidejte 25 µl tohoto roztoku k 75 µl séra, (iii) promíchejte na vortexu a čekejte minimálně 15 minut (maximálně 30 minut). Teprve potom použijte standardní postup. POZNÁMKA : Úprava roztoku ß-merkaptoetanolu může být nahrazena úpravou dithiothreitolu rozpuštěného v ředicím roztoku DTT (IF / IT), SEBIA, kat. č. 4589. Viz kapitola "VYŽADOVANÉ REAGENTY" a pokyny pro použití ředicího roztoku DTT (IF / IT) s dalšími informacemi. Pro analýzu Ig D a / nebo Ig E použijte stejné řešení jako pro volné a vázané lehké řetězce kappa a lambda. Nepoužívat Vzorky plasmy proužek fibrinogenu v blízkosti místa aplikace v g-zóně by mohl být zaměněn za monoklonální imunoglobulin. Hemolyzované vzorky. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje. Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE 1. Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu (viz Obr. 1) a zvedněte část s očíslovanými zuby. 2. Naneste 120 µl destilované (deionizované) vody na dolní třetinu rámečku vyznačeného na základové desce aplikačního zařízení. 3. Z obalu opatrně vyjměte agarózovou plotnu. 4. Gelovou plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej z jedné strany narolujte, aby přilnul k celé ploše a rychle odstraňte. POzOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu hrozí dehydratace gelu! 5. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku (gelem k sobě) (Obr. 2). 6. Nyní gel ohněte a položte na plochu nosiče do vyznačeného rámečku tak, aby se kapka destilované vody pod ním rovnoměrně, bez tvorby bublin rozprostřela. Gel musí být v rámečku zarovnán (viz Obr. 2). 7. Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. 8. Umístěte jeden aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (Obr. 3). 9. Do jamek aplikátoru pipetujte 10 µl vzorku dle následující tabulky. Vzorky je nutno napipetovat do aplikátoru v průběhu 2 minut. IMUNOFIXAČNÍ STOPA ČÍSLO JAMKY ELP 1 G 2 A 3 M 4 K 5 L 6 - Použijte aplikátor okamžitě - Pro delší uchování (až 8 hodin) umístěte aplikátor do vlhké komory zoubky nahoru, uchopením za plastikovou část chránící zoubky, komoru zakryjte víčkem a umístěte do chladničky. Podrobnosti najdete v návodu pro vlhkou komoru. 10. Po aplikaci vzorků nebo po vynětí aplikátoru z vlhké komory odlomte spodní část, která chrání zoubky. 11. Umístěte aplikátor do pozice č. 6 na nosiči. DŮLEŽITÉ : Čísla natištěná na aplikátoru musí směřovat k obsluze (viz Obr. 4). 12. Nyní snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ. 13. Po 1 minutě aplikátor uvolněte, vyjměte jej a vyhoďte! 14. Gelovou plotnu vložte do migrační elektroforetické komory dle polarity vyznačené na gelu - dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte HYDRAGELovou plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru. Okraje plotny budou ponořeny asi 1 cm. Podrobnosti najdete v návodu pro migrační komoru K20. 15. Připojte komoru ke zdroji proudu. - 126 -
HYDRAGEL IF K20-2018/07 PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) SEBIA K20 150 ml 300 ml 20 minut 100 V 16 ± 3 ma 16. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu. Modrý marker musí umístěn asi 5 mm od anodické části vyznačeného rámečku. II. IMUNOFIXACE 1. Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu. 2. Napipetujte 120 µl destilované nebo deionizované vody na dolní třetinu vyznačeného rámečku na nosiči. 3. Opřete plotnu dolním okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku (viz Obr. 2) gelem k sobě. 4. Gel ohněte a pokládejte na plochu s kapkou vody tak, aby se tato rovnoměrně pod ním rozprostřela bez tvorby vzduchových bublin (viz Obr. 2). 5. Aplikační šablonu 1 IF nastavte na nosiči následujícím způsobem (viz Obr. 5) : - umístěte aplikační šablonu na ukotvující příchytky, - držte šablonu za ouško a položte ji na gel, - stopy na šabloně musí být přesně srovnány s vyznačením zubů aplikátoru vlevo na gelu. 6. Reagencie pipetujte dle následující tabulky : STOPA OBJEM (µl) REAGENCIE BARVA ELP 40 fixační roztok žlutá G 25 antisérum proti těžkým řetězcům gama růžová A 25 antisérum proti těžkým řetězcům alfa tmavomodrá M 25 antisérum proti těžkým řetězcům mu žlutozelená K 25 antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům kappa světlezelená L 25 antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům lambda světlemodrá POZN. : Aby nedošlo k záměně, zbarvení antisér a barvy na štítcích lahviček antisér odpovídají barevnému označení jamek aplikační šablony. - Při pipetování se vyvarujte tvorby a nasátí bublin do špičky pipety. - Napipetujte reagencie (viz obr. 6) : - Pipetu držte kolmo a při aplikaci špičku zlehka opřete o dno jamky. - Antisérum musí zaplnit celou zónu pod jamkou bez bublin. 7. Následuje inkubace 5 min. při teplotě místnosti. III. ODSTRANĚNÍ REAGENCIÍ 1. Odstraňte přebytek reagencií hřebenem z tlustého filtračního papíru (viz Obr. 7). 2. Reagencie odstraňte v průběhu 30 sekund. - Papírový hřeben lehce zasuňte pod úhlem 30 do štěrbiny na dolním konci aplikační šablony tak, aby se jeho zuby lehce dotkly hladin antisér (viz Obr. 8). - Jemným vychýlením hřebene od sebe do úhlu maximálně 45 lze odsát přebytečnou reagencii (viz Obr. 8). DŮLEŽITÉ : Hřeben musí zůstat nakloněn do úhlu maximálně 45. Pokud by byl kolmo ke gelu, mohl by jej poškodit. IV. ODSTRANĚNÍ NEZAPRECIPITOVANÝCH PROTEINŮ 1. Vyjměte hřeben. 2. Zkontrolujte, zda jsou antiséra dobře odsáta, t.j. : - na gelu nejsou žádná antiséra, - zuby hřebene jsou obarveny po celé jejich délce. Pokud není odsátí antisér úplné, vložte stejný papírový hřeben znovu do téže pozice a zopakujte předchozí postup. 3. Vyjměte aplikační šablonu. 4. Na gel položte na 4 minuty jeden tlustý filtrační papír. DŮLEŽITÉ : Dokonale přitiskněte tlustý filtrační papír k celému povrchu gelu a přesvědčte se, že dobře přilnul. 5. Filtrační papír sejměte. V kolmé poloze promývejte ve fyziologickém roztoku po dobu 5 minut. Gel musí být umístěn tak, aby stopa ELP byla na dolním konci držáku. 6. Gel položte na rovnou plochu. 7. Na gel přiložte nový tlustý filtrační papír tak, aby celou plochou přilnul k povrchu gelu. 8. Osušte gel v sušičce při 80 C tak, aby filtrační papír kompletně vyschl. 9. Aplikační šablonu očistěte malým kartáčkem (např. kartáčkem na zuby) podle postupu uvedeného v části "POSTUP ČIŠTĚNÍ MASKY. Ověřte, že je šablona před opakovaným použitím zcela suchá ; pomocí sacího papíru odstraňte z jamek kapky vody. V. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ 1. Po usušení ponořte usušený gel kolmo do fyziologického roztoku na 3 minuty. 2. Na 4 minuty vložte v kolmé poloze do barvícího roztoku. 3. Odbarvěte ve třech po sobě následujících lázních s odbarvovacím roztokem dokud není pozadí zcela bezbarvé a průhledné. 4. Osušte gel v proudu 80 C teplého vzduchu. Zadní stranu gelu očistěte vlhkým, měkkým papírem. KONTROLA KVALITY Po každé změně série reakčního činidla se doporučuje analyzovat kontrolní sérum (jako např. Kontrolní sérum IT / IF, SEBIA PN 4788). POZNÁMKA : Je-li to nezbytné, může být normální kontrolní roztok séra SEBIA, kat. č. 4785 použit jako negativní kontrola. - 127 -
HYDRAGEL IF K20-2018/07 VÝSLEDKY Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Monoklonální komponenta není přítomna Normální vzorek séra vykazuje lehké difúzní zbarvení polyklonálních imunoglobulinů ve všech stopách. Hypergamaglobulinemie je charakterizována sytě zbarvenou, difúzní zónou a nepřítomností jakýchkoliv proužků. Monoklonální komponenta je přítomna přítomnost monoklonálního proteinu (gamapatie) je charakterizována monoklonálním proužkem detekovaným jedním z antisér proti těžkým řetězcům (G, A, M) a proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda. Detekovaný monoklonální proužek, typicky ostrý a ohraničený, musí být umístěn ve stejné migrační vzdálenosti jako podezřelý monoklonální proužek v referenční stopě (ELP). Chybějící reakce s antisérem proti těžkým řetězcům a pozitívní reakce s jedním z antisér proti lehkým ředězcům může znamenat : a) velmi vzácnou Ig D nebo Ig E gamapatii - musí být potvrzeno antiséry proti těžkým řetězcům anti-delta nebo anti-epsilon, b) gamapatii lehkých řetězců - musí být potvrzeno antiséry proti volným lehkým řetězcům anti-kappa nebo anti-lambda. Absence pozitívní reakce s aplikovanými antiséry proti lehkým řetězcům znamená velmi vzácnou gamapatii těžkých řetězců (g, a nebo µ). Přítomnost dvou nebo více monoklonálních komponent Ve vzácných případech proliferuje několik klonů B-buněk, což se projeví několika monoklonálními proužky : Biklonální gamapatie je charakterizována přítomností dvou proužků těžkých řetězců (identických nebo odlišných) a dvou proužků lehkých řetězců (identických nebo odlišných). Polymerizované imunoglobuliny jsou charakterizovány několika proužky téhož typu těžkých řetězců. K potvrzení monoklonální abnormality je nutno vzorek upravit depolymerizací pomocí beta-merkaptometanolu a imunofixaci opakovat. Oligoklonální gamapatie je charakterizována přítomností několika proužků jednoho nebo více typů těžkých řetězců a jedním nebo dvěma typy lehkých řetězců. Zvláštní případy Je-li v ELP stopě přítomen monoklonální proužek ale chybí při potvrzení imunofixací musíme myslet především na fibrinogen (vzorek plazmy). Pokud je monoklonální proužek ve všech imunofixačních stopách, může se jednat o kryoglobulin nebo polymerizovaný Ig M. Potom je nutno vzorek depolymerizovat (viz čl. "ANALYZOVANÉ VZORKY"). Omezení Viz kapitola ANALYZOVANÉ VZORKY. jiných, než specifických antisér pro tuto imunofixační metodu pro použití standardní masky, může mít špatný vliv na výsledky. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com. HODNOTY Byly použity standardní materiály, příprava vzorků a techniky. Všechny elektroforeogramy byly hodnoceny vizuálně. Reprodukovatelnost mezi vzorky a specificita Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na dvou patologických vzorcích s jednou monoklonální komponentou o nízké a jednou o vysoké koncentraci a jednom vzorkem se dvěmi monoklonálními komponentami. Každý vzorek byl podroben testům na 2 gelech 2 šarží, při použití barvení kyselou violetí. Všechny testované vzorky daly identické výsledky pro obě šarže, a jak se očekávalo, i shodný typ testovaného vzorku. Reprodukovatelnost mezi gely a specificita Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na dvou patologických vzorcích s jednou monoklonální komponentou o nízké a jednou o vysoké koncentraci. Tyto vzorky byl podrobeny testům na 20-ti gelech 2 různých šarží, při použití barvení kyselou violetí. Všechny testované vzorky daly identické výsledky pro obě šarže, a jak se očekávalo, i shodný typ testovaného vzorku. Přesnost Třicet dva (32) různých patologických sérových vzorků a osm (8) normálních sér bylo podrobeno analýze na HYDRAGEL IF K20 gelech a jiných komerčně dostupných agarózových gelových systémech. Ve všech případech, výsledky analyzované na gelech SEBIA a jiných komerčně dostupných testech, byly identické. Citlivost Následně ředěné 3 patologické vzorky séra s monoklonální bílkovinou byly analyzovány HYDRAGEL IF K20 metodou. Pro barvení byla použita jak kyselá violet, tak i amidočerň. Výsledky jsou následně sumarizovány. - 128 -
VZOREK Č. MONOKLONÁLNÍ KOMPONENTA HYDRAGEL IF K20-2018/07 DETEKČNÍ LIMIT (g/l) Typ KONC. (g/l) KYSELÁ VIOLET AMIDOČERŇ 1 alfa 5.33 0.25 0.25 1 kappa 0.25 0.25 2 mu 10.9 0.12 0.12 2 lambda 0.25 0.25 3 gama 17.2 0.25 0.50 3 lambda 0.12 0.12-129 -
HYDRAGEL IF K20-2018/07 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir (1) et (2): For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to 1. and 2.: 1. Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris. 2. Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd ed., 1994, 397 pp. 3. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité. Impact-Internat, 1986, Sept : 93-97. - 172 -
HYDRAGEL IF K20-2018/07 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Figure 5 Figure 6-173 -
HYDRAGEL IF K20-2018/07 SCHÉMAS / FIGURES Figure 7 Figure 8-174 -
Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 Fax : 32 (0)2 702 64 60 e-mail : sebia.benelux@sebia.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP 04602-000 Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : sebia@sebia.com.br GmbH Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : sebia@sebia.de Hispania S.A. C/Sicilia, n 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : sebia@sebia.es Inc. 400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446-3707 Fax : 1 770 446-8511 e-mail : info@sebia-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : info@sebia.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : info@sebia.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : sebia@sebia.com Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : sebia@sebia.cn