UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE. Nové markery jaterní fibrózy

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 2. LÉKAŘSKÁ FAKULTA Ústav lékařské chemie a klinické biochemie Lenka Skřebská bakalářská práce Praha 2014

Autor práce: Lenka Skřebská Vedoucí práce: MUDr. Jana Čepová, Ph.D., MBA Oponent práce: Prof. MUDr. Richard Průša, CSc. Datum obhajoby: 2014

Bibliografický záznam SKŘEBSKÁ, Lenka.. Praha: Univerzita Karlova, 2. Lékařská fakulta, Ústav lékařské chemie a klinické biochemie, 2014. 40 s. Anotace Tato bakalářská práce pojednává o problematice jaterní fibrózy. Jedná se o závažné onemocnění jater způsobené chronickým poškozováním jaterní tkáně. Následkem toho je porucha vyrovnaného procesu fibrogeneze a fibrolýzy. Včasná diagnostika jaterní fibrózy je důležitá pro zahájení efektivní léčby. V současné době se k diagnostice jaterní fibrózy nejčastěji používá biopsie jater, která však představuje mnoho rizik a nevýhod pro pacienta, což vede k hledání nových neinvazivních metod. Existuje řada výpočtů, které používají k určení stupně závažnosti fibrotizace specifické i nespecifické markery. Cílem této práce je porovnat nový automatizovaný imunochemický ELF test, používající markery specifické pro jaterní fibrózu, s dosud používanými výpočty APRI a Hepascore. Annotation This material is talking about problems of liver fibrosis. It Is a very fundamental liver s disease which is bringing about a chronic harm of the liver s tissue. An effect of it is a process defect of fibrogenesis and fibrolysis which has to be balanced. A diagnosis of liver fibrosis on time is important for start an efficient therapy. At this time we are getting diagnosis of the liver fibrosis by liver s biopsy which is bringing many risks for patients and it is disadvantageus for them. This situation is running us to search for a new non-invasive methods. It is a lot of calculations they are using a specific and unspecific markers to determine fundamental measures of specific fibrotisation and nonspecific too. A goal of this work it is to get a contrast between a new automatic imunochemicle ELF test which is using specific markers for the liver fibrosis and using calculations APRI and the Hepascore until now.

Klíčová slova Jaterní fibróza, skóre ELF, kyselina hyaluronová, N-terminální peptid prokolagenu typu III, tkáňový inhibitor matrix metaloproteináz, jaterní biopsie, APRI skóre, Hepascore Keywords Liver fibrosis, score ELF, hyaluronic acid, amino-terminal propeptide of type III procollagen, tissue inhibitor of metalloproteinases 1, liver biopsy, APRI score, Hepascore

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci zpracovala samostatně pod vedením MUDr. Jany Čepové, Ph.D., MBA, uvedla všechny použité literární a odborné zdroje a dodržovala zásady vědecké etiky. Dále prohlašuji, že stejná práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze 28. 4. 2014

Poděkování Chtěla bych poděkovat své vedoucí bakalářské práce MUDr. Janě Čepové, Ph.D., MBA za odborné vedení. Mé poděkování též patří Ing. Elišce Glasové a Ing. Martě Pechové za pomoc a cenné rady při zpracování této práce.

Obsah ÚVOD... 7 1 ANATOMIE A FYZIOLOGIE JATER... 8 1.1 ANATOMIE JATER... 8 1.2 STAVBA JATER... 9 1.3 FYZIOLOGIE JATER... 10 1.3.1 Metabolická funkce jater... 10 1.3.2 Funkce jater... 10 1.3.2.1 Metabolismus sacharidů... 11 1.3.2.2 Metabolismus lipidů... 12 1.3.2.3 Metabolismus proteinů a aminokyselin... 12 2 JATERNÍ FIBRÓZA... 13 2.1 PATOGENEZE JATERNÍ FIBRÓZY... 13 2.2 PROGRESE JATERNÍ FIBRÓZY... 14 2.3 KOMPLIKACE JATERNÍ FIBRÓZY... 14 2.4 LÉČBA JATERNÍ FIBRÓZY... 14 3 DIAGNOSTIKA JATERNÍ FIBRÓZY... 15 3.1 KLINICKÝ OBRAZ... 15 3.2 JATERNÍ BIOPSIE... 15 3.3 LABORATORNÍ VYŠETŘOVACÍ METODY... 16 3.3.1 Biochemická vyšetření... 16 3.3.1.1 Markery hepatocelulárního poškození... 16 3.3.1.2 Markery cholestázy... 16 3.3.1.3 Markery syntetické funkce jater... 17 3.3.1.4 Markery jaterní fibrózy... 17 3.3.1.5 Kombinace serologických testů... 18 3.3.2 Skóre ELF (Enhanced Liver Fibrosis Test)... 21 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 23 4.1 POPIS PŘÍSTROJE... 23 4.2 POPIS REAGENCIÍ ELF TESTU... 25 4.3 POPIS KALIBRÁTORŮ ELF TESTU... 26 4.4 POPIS KONTROLNÍHO MATERIÁLU... 27 4.5 POSTUP PŘI KALIBRACI A MĚŘENÍ KONTROL... 27 4.6 POPIS MĚŘENÍ PACIENTŮ... 28 5 VÝSLEDKY... 30 6 DISKUZE... 34 ZÁVĚR... 36 REFERENČNÍ SEZNAM... 37 INTERNETOVÉ ZDROJE... 39

ÚVOD Jaterní fibróza je velmi závažné jaterní onemocnění způsobené chronickým poškozováním jaterní tkáně, jehož následkem je porucha vyrovnaného procesu jaterní fibrogeneze a fibrolýzy. Jaterní fibrózu provází řada komplikací, které mohou ohrožovat pacienta na životě, a proto je včasná diagnostika velmi důležitá pro zahájení efektivní léčby. K diagnostice jaterních onemocnění se nejčastěji používá biopsie jater, při které je získán vzorek jaterní tkáně. Biopsie patří k invazivním metodám diagnostiky a pro pacienta představuje řadu nevýhod, jako například strach z výkonu, narkóza, bolest po odběru. Odběr také přináší mnoho rizik například krvácení, infekce v místě vpichu nebo dokonce smrt. Odebraný vzorek tkáně představuje jen malou část jater a často nelze zjistit celkový stav orgánu. Dalším problémem je i rozdílná interpretace výsledků. Pro lepší diagnostiku a monitorování jaterní fibrózy se hledají nové neinvazivní metody. Existuje řada výpočtů, které zahrnují nespecifické markery spojené se vznikem jaterní fibrózy. Tématem mé bakalářské práce je porovnání nového skóre pro posouzení jaterní fibrózy. Jedná se o první standardizovaný rutinní test. Tento test kombinuje tři markery specifické pro jaterní fibrózu a to kyselinu hyaluronovou, N-terminální peptid prokolagenu typu III a tkáňový inhibitor matrix metaloproteináz. Výsledkem je výpočet skóre ELF (Enhanced Liver Fibrosis), který by mohl pomoci v lepším hodnocení závažnosti jaterní fibrózy u pacientů s chronickým jaterním onemocněním. 7

1 Anatomie a fyziologie jater 1.1 Anatomie jater Játra (hepar) s průměrnou hmotností okolo 1 500 g jsou největší exokrinní žlázou lidského těla. Leží v peritoneální dutině pod pravým obloukem žeberním. Horní strana naléhá na bránici, ke které je připevněno vazivové pouzdro, v němž jsou játra uložena. Dolní plochou naléhají na orgány dutiny břišní (Obr. 1). [1] Játra se rozdělují na laloky pravý (lobus dexter), levý (lobus sinister), které od sebe odděluje srpovitý vaz jater (ligamentum falciforme hepatis), a dále čtyřhranný lalok (lobus quadratus), ocasatý lalok (lobus caudatus). [2] Obr. 1 Umístění jater v peritoneální dutině (URL 1) Zásobení jater je zajištěno jaterní tepnou (arteria hepatica communis), jež se před vstupem do jater rozděluje na pravou a levou jaterní tepnu (arteria hepatica dextra a sinistra). Tato tepna zajišťuje přísun okysličené krve, živin a dalších látek do jater. Vrátnicovou žílou se do jater dostává krev z nepárových orgánů dutiny břišní (pankreas, slezina, tenké střevo a žaludek), spolu s lipidy, sacharidy a proteiny vstřebanými v trávicí soustavě a v játrech dochází k jejich metabolizování. Z jater je odváděna 8

neokysličená krev dolní dutou žílou do srdce a z něj do plic, kde je krev znovu okysličena. [1,2] 1.2 Stavba jater Základní morfologickou jednotkou jater je lalůček centrální žíly. Tvoří jej polyedrické jaterní buňky (hepatocyty) uspořádané do trámců. Mezi trámci probíhají žilní sinusoidy, které se skládají z fenestrovaných endotelových buněk (Obr. 2). Na povrchu endotelových buněk se nacházejí tzv. Kupfferovy buňky. Jedná se o buňky mononukleárního fagocytárního systému, tzv. makrofágy. Mezeru mezi hepatocyty a sinusoidy označujeme jako Disseho prostor, ve kterém probíhá výměna látek. Nalézají se zde i tzv. jaterní hvězdicové buňky (Itovy buňky) skladující tuky a v nich uchovaný vitamin A. [3,8] Obr. 2 Schéma lalůčku centrální žíly (URL 2) Jaterní trámce jsou paprsčitě uspořádány od periferie k centru, zde se nachází centrální žíla (vena centralis). Tyto veny odvádějí neokysličenou krev z jater, postupně se spojují v jaterní žíly a ty ústí do dolní duté žíly. [1,3] V místě kontaktu jaterních lalůčků se nalézá portobiliární prostor, který je tvořen interlobulární arterií (arteria interlobularis), interlobulární venou (vena interlobularis) a interlobulárním žlučovodem (ductus biliferi interlobularis). [1] Funkčními strukturami jater jsou portální acinus a portální lalůček. V centru portálního lalůčku se nachází portobiliární prostor. Každý portální lalůček se skládá z částí sousedních lalůčků centrálních žil. Hepatocyty v tomto místě odvádějí žluč v nich vzniklou do jednoho žlučovodu (Obr. 3). Portální acinus je definován různými metabolickými procesy hepatocytů. [3] 9

Portální acinus Portální lalůček Obr. 3 Znázornění jaterních portálních lalůčků (URL 3) 1.3 Fyziologie jater 1.3.1 Metabolická funkce jater Portální acinus je rozčleněn na 3 zóny s různou metabolickou aktivitou. První zóna je nejblíže přívodným cévám a obsahuje hepatocyty, které jako první přichází do kontaktu s krví bohatou na živiny a kyslík. Buňky v této zóně jsou více odolné k nedostatku živin a k hypoxii, probíhají v nich převážně oxidativní procesy, např. glukoneogeneze, tvorba močoviny a žluče. [4,8] Ve druhé tzv. přechodné zóně, je nižší zásobení buněk kyslíkem a živinami než v první zóně. Probíhají zde oxidativní procesy, a také se začínají objevovat redukční procesy, např. detoxikace. [4,8] Nejvzdálenější, třetí zóna se nachází v blízkosti centrálních žil. Tato oblast je ovlivněna aktivitou buněk v předchozích zónách a krev, která do této zóny přitéká, má sníženou koncentraci živin a kyslíku. Zde již probíhají hlavně redukční procesy. Mezi tyto procesy patří detoxikace amoniaku, glykolýza, syntéza lipidů. [4,8] 1.3.2 Funkce jater Játra jsou orgánem, který plní mnoho životně důležitých funkcí, ty souvisí s metabolismem všech živin, biotransformací, detoxikací, inaktivací, exkrecí a tvorbou různých látek. [7] V hepatocytech probíhají vzájemné přeměny živin, jejich syntéza a degradace. Základní stavební kameny jednotlivých složek potravy, po vstřebání a rozštěpení, se dostávají portální žílou (vena portae) do jater. Zde se z nich syntetizují látky jako 10

glykogen, plazmatické bílkoviny a další. Látkové přeměny spotřebovávají velké množství energie a kyslíku, při těchto procesech se krev v játrech ohřívá, a tím se ohřívá i celý organismus. [4,6] Jednou z funkcí jater je tvorba a sekrece žluči, denně se vytvoří asi 600 ml žluči, která je shromažďována ve žlučníku a v případě potřeby se uvolňuje do duodena. Žluč se tvoří v hepatocytech, obsahuje žlučová barviva a žlučové kyseliny, které jsou nezbytné pro emulgaci a vstřebávání lipidů. [6,7] V játrech se tvoří i celá řada plazmatických bílkovin jako např. albumin, což je transportní protein pro mnoho látek, které nejsou rozpustné ve vodě. Tvoří se zde i koagulační faktory jako fibrinogen, protrombin a další faktory, které jsou důležité pro hemokoagulaci. [2,6] Důležitou funkcí je i detoxikace organismu. V játrech se metabolizují veškeré exogenní látky, např. léky, jedy, ale také i alkohol. [4,6] Játra mají vztah i ke krvetvorbě, skladují vitamin B12 a železo, které je navázáno na bílkovinu feritin. Prenatálně mají důležitou roli v tvorbě erytrocytů, později se tato funkce přesunuje do kostní dřeně. [6] V jaterní tkáni se také syntetizují, degradují a inaktivují hormony. Jedním z hormonů, který je v játrech syntetizován, je angiotenzinogen. Ten se podílí na regulaci vody a solí v organismu, a tím na regulaci krevního tlaku. Působení růstového hormonu je možné pouze v přítomnosti somatomedinů (růstových faktorů), které zajišťují jeho účinek v cílové tkáni. V játrech také probíhá degradace steroidních hormonů redukcí a konjugací s kyselinou glukuronovou nebo sírovou. [2,6] 1.3.2.1 Metabolismus sacharidů Játra hrají roli v udržení stálé hladiny glukózy v krvi, tzv. glykostatická funkce jater. V případě nadbytku glukózy v krvi dojde k syntéze a uskladnění glukózy ve formě glykogenu a stimulaci lipogeneze. Při poklesu glykémie, dochází ke štěpení zásobního polysacharidu glykogenu (glykogenolýze) a následnému uvolnění glukózy do krve. Pokud dojde ke snížení zásob glykogenu, játra začnou syntetizovat glukózu z necukerných substrátů procesem glukoneogeneze. Ke zpracování sacharidů jsou hepatocyty vybaveny různými specifickými enzymy, které se aktivují po jídle nebo při hladovění. [6,8] 11

1.3.2.2 Metabolismus lipidů V játrech probíhá syntéza a beta-oxidace mastných kyselin, syntéza triacylglycerolů, cholesterolu a fosfolipidů, tvorba ketolátek. Při beta-oxidaci mastných kyselin vzniká acetyl-coa, který je důležitý pro syntézu cholesterolu. Tuky vstřebané v duodenu jsou hepatocyty oxidovány na ketolátky, které jsou zdrojem energie pro některé orgány. Hepatocyty také tvoří lipoproteinové částice, např. LDL cholesterol, který transportuje lipidy do tkání, a HDL cholesterol, který naopak odstraňuje lipidy z tkání do jater. Zde se přebytečný cholesterol přeměňuje na žlučové kyseliny. [6,8,9] 1.3.2.3 Metabolismus proteinů a aminokyselin Játra udržují hladinu aminokyselin v plazmě. Přebytečné aminokyseliny jsou odbourávány v močovinovém cyklu, za přeměny dusíku na močovinu, která je vyloučena ledvinami. Zbylé uhlíkové kostry jsou dále využity na syntézu glukózy nebo k produkci energie. [8,9] Při metabolismu aminokyselin se vytvoří značné množství amoniaku. Jaterní acinus je vybaven dvěma systémy pro detoxikaci amoniaku. Prvním je močovinový nebo také ornitinový cyklus, v němž je amoniak detoxikován za vzniku močoviny. Druhým systémem je syntéza glutaminu. [9] 12

2 Jaterní fibróza Chronické poškození jater může nastat z různých příčin např. virové, toxické, metabolické, cholestatické a autoimunitní. To pak vede k onemocnění zvanému jaterní fibróza. Klinické projevy mohou být velmi variabilní a odvíjí se od typu a stupně pokročilosti onemocnění. Počínající jaterní fibróza má většinou asymptomatický průběh. V pozdějších stádiích se mohou objevit různé komplikace, ale ty jsou spíše spojené s rozvojem konečného stadia fibrotizace jaterní cirhózou. [5] 2.1 Patogeneze jaterní fibrózy Fibróza jater je strukturální změna jaterní tkáně s nadměrným ukládáním vaziva. Dochází k nahromadění extracelulární matrix (mezibuněčné hmoty) následkem zvýšené syntézy a snížené degradace. Syntéza extracelulární matrix, neboli fibrogeneze, je důležitá pro hojivé procesy jater. Naopak fibrolýza, odstraňování extracelulární matrix, je nezbytná po skončení hojivých procesů jater. Oba procesy jsou za fyziologického stavu vyrovnané, ale při poruše buď dojde ke zvýšené fibrotizaci vlivem chronického poškození nebo ke snížené fibrolýze. [5,10] Fibrogeneze se účastní nejen extracelulární matrix, ale také buňky. Hvězdicové buňky jsou schopné přeměny na myofibroblasty, které produkují extracelulární matrix. Ke stimulaci hvězdicových buněk dochází velmi složitým mechanismem, na kterém se podílejí i látky vyprodukované poškozenými hepatocyty. Do procesu fibrogeneze jsou zapojené i Kupfferovy buňky, které produkují transformující růstové faktory. Také trombocyty, monocyty a další buněčné elementy produkují destičkový růstový faktor, který svou aktivitou podporuje fibrogenezi. [10,12] Následkem nárůstu vaziva v Disseho prostorách dochází ke změně charakteru jaterních sinusů. Jaterní sinusoidy jsou drobné kapiláry, které se skládají z fenestrovaných endotelových buněk. Tyto kapiláry umožňují transport látek z krve přes Disseho prostor do hepatocytů a naopak. Důsledkem zmnožení kolagenu a vaziva tento transport zaniká a dochází k jevu zvanému kapilarizace jaterních sinusů. Následkem toho dochází ke zhoršení zásobování hepatocytů kyslíkem a živinami. Z toho vyplývá zhoršení funkce hepatocytů a vznik portální hypertenze. [5,10,12] Endoteliální sinusoidální buňky postupně zvětšují svůj objem a produkují látky, jež vedou k aktivaci jaterních hvězdicových buněk. Působením transformujícího růstového faktoru beta (TGFbeta) na endoteliální buňky se snižuje hodnota 13

plazminogenu, který se přeměňuje na plazmin, což je aktivátor metaloproteináz degradující extracelulární matrix. [10] Extracelulární matrix je tvořena různými makromolekulami, několika typy kolagenu a nekolagenními glykoproteiny, glykosaminoglykany a proteoglykany. Ve zdravých játrech je kolagen uložen v pouzdru a kolem velkých cév. Následkem fibrózy se zvyšuje obsah kolagenu v játrech. Jako první začíná přibývat kolagen typu III, ale později začne převládat obsah kolagenu typu I. [5,10] Na rozvoji jaterní fibrózy se podílí nejen zvýšená tvorba extracelulární matrix, ale také její snížená degradace. Na procesu fibrolýzy se podílí tzv. metaloproteinázy, enzymy, které se podílejí na odbourávání extracelulární matrix. Proces degradace je také ovlivněn existencí tkáňových inhibitorů metaloproteináz. Tyto látky působí proti degradaci. [10,12] 2.2 Progrese jaterní fibrózy Primárními zdroji fibrogeneze jsou např. virová hepatitida C, alkohol a HIV, což vede k poškození jaterní tkáně. Proces fibrotizace ke svému rozvoji vyžaduje několik měsíců až let. Také se předpokládá vliv genetických faktorů. Rozsáhlé studie odhalily některé geny důležité při regulaci fibrózy jater a význam polymorfismů v genech regulující hepatocelulární apoptózu, nekrózu a zánětlivou odpověď. Poruchy ve funkci těchto genů mohou ovlivňovat rozsah poškození.[5,11] 2.3 Komplikace jaterní fibrózy Následkem poruchy jaterní mikrocirkulace vzniká portální hypertenze, která zahrnuje venostázu v portálním řečišti, rozvoj kolaterál, tvorbu ascitu a rozvoj jaterní encefalopatie. Pokročilá stadia jaterní fibrózy s výrazně narušenou jaterní strukturou označujeme jako jaterní cirhózu.[15] 2.4 Léčba jaterní fibrózy Při léčbě jaterní fibrózy je nejdůležitější odstranit primární zdroj fibrogeneze, např. abstinenci u alkoholické choroby jater nebo léčbu virové infekce u hepatitidy C. Pacientům se také mohou podávat různé přípravky na utlumení fibrogeneze. [5] 14

3 Diagnostika jaterní fibrózy Diagnostika a klasifikace fibrózy jater je důležitá při volbě a zahájení léčby. Vzhledem k narůstajícím důkazům, že fibróza jater je reverzibilní stav, se hledají nové markery pro včasnou a přesnou diagnostiku. [14] Dříve byla fibróza diagnostikována pouze nálezem tuhých, zvětšených a hrbolatých jater palpitací. Zvrat přinesla až technika biopsie jater, která se stala nejdůležitějším vyšetřením. V posledních letech vzrůstá snaha objevit nové neinvazivní postupy a zobrazovací techniky. [5,10] 3.1 Klinický obraz Klinický obraz jaterní fibrózy je velmi různorodý. V mnoha případech probíhá fibróza bezpříznakově (asymptomaticky). U některých pacientů se projeví bolestmi, tlakem, nevolností, nechutenstvím, krvácením, depresemi a mnoha dalšími příznaky, které se postupně stupňují. [14] 3.2 Jaterní biopsie Jaterní biopsie je výkon, při kterém je pomocí bioptické jehly odebrán malý vzorek jaterní tkáně. Tento vzorek je zafixován a odeslán na histologické vyšetření k určení stupně fibrotizace. [10] Existují různé způsoby provedení jaterní biopsie. Může se provádět tzv. odběr naslepo, nebo naopak pokud lékař potřebuje jaterní tkáň z určitého místa, např. z místa fibrotizace, je vhodné používat cílenou biopsii, která probíhá pod kontrolou ultrazvukem nebo CT. [10,13] Jaterní biopsie patří mezi invazivní metody vyšetření a není bez rizika. Pro pacienta představuje biopsie řadu nevýhod, jako např. strach z výkonu, narkóza, bolest po odběru. Mohou se objevit i různé komplikace, mezi ty nejčastější patří krvácení z místa odběru. Z méně častých komplikací se může vyskytnout pneumotorax, absces či peritonitida. [10] Problémem jaterní biopsie není jen riziko komplikací, ale i rozdílná interpretace hodnocení. Vzorek odebrané tkáně je velmi malý a také zmnožení vaziva není ve všech částech jater stejné. Přes všechna úskalí se stále jaterní biopsie používá k diagnostice jaterní fibrózy. [10,13] 15

3.3 Laboratorní vyšetřovací metody V dnešní době je poškození jaterní tkáně stále častěji diagnostikováno a vyšetření jaterních funkcí patří mezi základní vyšetřovací postupy. Laboratorní testy již nejsou založeny jen na biochemických vyšetřeních, ale také na analýzách hematologických, sérologických a imunologických. [8] 3.3.1 Biochemická vyšetření Biochemická vyšetření bývají někdy označovány jako jaterní testy, jedná se o soubor biochemických markerů. Tyto markery nejsou pro játra specifická a mohou mít patologické hodnoty jak u jaterních chorob, tak i u některých jiných onemocnění. [8,16] 3.3.1.1 Markery hepatocelulárního poškození Alaninaminotransferáza (ALT) a aspartátaminotransferáza (AST) jsou enzymy používané k posouzení hepatocelulárního poškození. [8] ALT se vyskytuje především v cytoplazmě buněk jater, kosterního svalstva, srdce, sleziny, plic a dalších. Naopak AST je nejen v cytoplazmě, ale spíše v mitochondriích jater, kosterního svalstva, srdce, erytrocytů a ledvin. Kvůli výskytu AST i ALT v různých tkáních není jejich specifita příliš vysoká. Avšak pokud budou hodnoty aktivity vyšší, může se hodnotit poměr AST/ALT nazývaný jako deritisův index. Pokud je poměr více jak 1, znamená to závažnější prognózu a může to signalizovat nekrózu jaterních buněk. [16,17] S hodnotami AST souvisí i tzv. APRI skóre (AST to platelet ratio index), které je popsáno v kapitole 3.3.1.5. [5] 3.3.1.2 Markery cholestázy Do této skupiny markerů patří alkalická fosfatáza (ALP) a gamaglutamyltransferáza (GGT). Ke zvýšení aktivity těchto enzymů dochází při poruše sekrece a toku žluče. [16] Alkalická fosfatáza je enzym, který se vyskytuje v různých izoformách, nejvýznamnějšími izoenzymy jsou jaterní, kostní, střevní a placentární. Tento enzym také není specifický jenom pro játra, ale pokud dojde ke zvýšení aktivity ALP spolu se zvýšením aktivity GGT může tento nález svědčit o cholestáze. [16,17] 16

Gama-glutamyltransferáza se vyskytuje v mnoha tkáních, např. v epitelu žlučových cest, pankreatu, střevě, ale také v prostatě, čímž se vysvětluje vyšší aktivita GGT u mužů. Zvýšená aktivita GGT nastává při užívání různých exogenních látek, při mnoha chorobách, ale také při nadměrném užívání alkoholu, což je jednou z příčin jaterní fibrózy. [8,16] 3.3.1.3 Markery syntetické funkce jater Játra syntetizují řadu proteinů, mezi nejdůležitější patří albumin. Měření koncentrace albuminu je vhodné k posouzení chronického poškození jater z důvodu delšího poločasu (přibližně 19 dnů). Snížené hodnoty albuminu jsou typické u dekompenzované jaterní cirhózy a ascitu. [8,16] Řada koagulačních faktorů je syntetizována v játrech, např. protrombin a fibrinogen. Koncentrace většiny koagulačních faktorů v séru je v nadbytku, k poklesu hodnot dochází při významné poruše syntetické funkce jater. [8] Stanovení koncentrací jednotlivých plazmatických faktorů se v praxi moc nevyužívá, častěji se používá stanovení protrombinového času (tzv. Quickův test). Tímto stanovením se hodnotí zevní koagulační kaskáda, kdy dojde k přeměně protrombinu na trombin. Protrombin má krátký poločas a změny se projeví rychleji než u albuminu. [8] 3.3.1.4 Markery jaterní fibrózy Ideální marker jaterní fibrózy by měl být specifický pro játra, jeho hladina by neměla být ovlivnitelná metabolickými změnami ani onemocněním ledvin. Dalším kritériem je snadné provedení stanovení, možnost opakovatelnosti a nižší cena. Dále by měl hodnotit aktivitu ukládání nebo degradace extracelulární matrix. [5,21] K markerům jaterní fibrózy patří řada molekul a enzymů, které v různé míře odrážejí přítomnost a stupeň fibrózy. Využití markerů je možné ke stanovení diagnózy, k monitorování fibrotických změn a ke kontrole průběhu léčby. [5,20] Alfa2-makroglobulin (A2M) je protein akutní fáze, který je produkován aktivovanými hvězdicovými buňkami. Zvýšená syntéza A2M může ovlivnit degradaci proteinů extracelulární matrix a tím i rozvoj fibrózy. U jaterní fibrózy dochází k nárůstu hodnot A2M, a A2M je považován za přínosný marker jaterní fibrózy. [10,23] Laminin je glykoprotein bazální membrány, který je syntetizován jaterními hvězdicovými buňkami. Spolu s lamininem je součástí bazálních membrán kolagen IV. Jejich koncentrace dobře korelují se stupněm jaterní fibrózy. Ke zvýšení koncentrace 17

lamininu dochází u chronických onemocnění jater různé etiologie. Při odstranění základní příčiny onemocnění se koncentrace mění, např. při abstinenci. [10,21] Ke skupině glykoproteinů patří YKL-40 (Chondrex), jedná se o růstový faktor fibroblastů a chondrocytů. Jeho hodnoty odráží degradaci a remodelaci extracelulární matrix. U pacientů s chronickým onemocněním jater se koncentrace YKL-40 zvyšuje a odpovídá stupni fibrózy. [5,21] Karboxy-terminální peptid prokolagenu typu I (PICP) je markerem přeměny prokolagenu I na kolagen I, ke zvýšení dochází u pacientů s jaterní cirhózou. [10] 3.3.1.5 Kombinace serologických testů K odlišení různých stupňů fibrotizace byl navržen jednotný systém METAVIR. Tento systém rozděluje proces fibrotizace do 5 stupňů: F0 - bez fibrózy, F1 - fibróza bez sept, F2 - fibróza s málo septy, F3 - fibróza s mnoha septy, F4 - cirhóza. [22] APRI skóre Jedná se o skóre, které je vhodné pro sledování jaterní fibrózy u pacientů s chronickou hepatitidou C. APRI skóre hodnotí poměr aktivity AST a počtu trombocytů viz tabulka č. 1. [5,18] Ve výpočtu se používá aktivita AST v μkat/l, hodnota horní hranice normálu aktivity AST (ULN), která je pro FN Motol 0,72 μkat/l a PLT = počet trombocytů * 10 9 /l. Tab. č. 1: Vyhodnocení APRI skóre Hodnoty Vyhodnocení APRI < 0,5 Nepřítomnost fibrózy APRI 1,5 Přítomnost fibrotizace stupně F2 až F4 18

FibroTest Mezi používané výpočty patří FibroTest (FT) používá se k hodnocení fibrotizace u pacientů s chronickou hepatitidou C. Tento výpočet kombinuje 7 parametrů: alfa2- makroglobulin, celkový bilirubin, aktivita GGT, apolipoprotein A1, haptoglobin, věk a pohlaví. Hodnocení výsledků FibroTestu viz tabulka č. 2. [23] Ve výpočtu se používají koncentrace alfa2-makroglobulinu (A2M) v g/l, koncentrace haptoglobinu (Hp) v g/l, aktivita GGT v IU/l, věk pacienta v letech, koncentrace bilirubinu (Bil) v μmol/l, koncentrace apolipoproteinu A1 (APO A1) v g/l, u pohlaví muž = 1, žena = 0 a log10 = dekadický logaritmus. Tab. č. 2: Vyhodnocení FibroTestu Hodnoty Vyhodnocení FT < 0,1 Nepřítomnost fibrózy 0,1 < FT < 0,6 Nejasný výsledek FT > 0,6 Přítomnost fibrotizace stupně F2 až F4 Fornsův index Ukazatelem fibrózy jater je tzv. Fornsův index (FI), který byl sestaven k odlišení přítomnosti fibrózy u pacientů s chronickou hepatitidou C. Tento výpočet kombinuje věk nemocného, počet trombocytů, aktivitu GGT a koncentraci cholesterolu. Hodnocení výsledků Fornsova indexu viz tabulka č. 3. [5,10] Ve výpočtu se používá hodnot PLT = počet trombocytů *10 9 /l, aktivita GGT v IU/l, věk pacienta v letech, koncentrace cholesterolu (chol) v mg/dl a ln = přirozený logaritmus. 19

Tab. č. 3: Vyhodnocení Fornsova indexu Hodnoty Vyhodnocení FI < 4,2 Nepřítomnost fibrózy FI > 6,2 Přítomnost fibrotizace stupně F2 až F4 Fib-4 index K určení stupně jaterní fibrózy u pacientů s chronickou hepatitidou C je možné použít index Fib-4. Tento výpočet kombinuje standardní biochemické markery: počet trombocytů, aktivitu AST a ALT s věkem pacienta. Hodnocení výsledků Fib-4 indexu viz tabulka č. 4. [24] Ve výpočtu se používá věk pacienta v letech, aktivita AST v IU/l, PLT = počet trombocytů *10 9 /l a aktivita ALT v IU/l. Tab. č. 4: Vyhodnocení Fib-4 indexu Hodnoty Vyhodnocení Fib-4 < 1,45 Nepřítomnost fibrózy Fib-4 > 3,25 Přítomnost fibrotizace stupně F2 až F4 HepaScore Dalším z řady testů pro posouzení stupně fibrotizace u pacientů s chronickou hepatitidou C je tzv. HepaScore (HS). Tento výpočet zahrnuje věk a pohlaví pacienta, dále hodnoty alfa2-makroglobulinu, celkového bilirubinu, kyseliny hyaluronové a aktivitu GGT. Hodnocení výsledků Hepascore viz tabulka č. 5. [25] 20

Ve výpočtu se používá věk pacienta v letech, u pohlaví - muž = 1, žena = 0, koncentrace alfa2-makroglobulinu (A2M) v g/l, koncentrace kyseliny hyaluronové (HA) v μg/l, koncentrace bilirubinu (Bil) v μmol/l a aktivita GGT v IU/l. Hodnoty HS < 0,5 HS 0,5 Tab. č. 5: Vyhodnocení Hepascore Vyhodnocení Nepřítomnost fibrózy Přítomnost fibrotizace stupně F2 až F4 Skóre FibroFast FibroFast je výpočet kombinující počet trombocytů, aktivitu AST, ALT a alkalické fosfatázy (ALP), a hodnoty albuminu. [10] Ve výpočtu se používají koncentrace albuminu (alb) v g/l, PLT = počet trombocytů *10 9 /l a aktivity ALP, AST a ALT v IU/l. 3.3.2 Skóre ELF (Enhanced Liver Fibrosis Test) Skóre ELF napomáhá v diagnostice a stanovení závažnosti jaterní fibrózy u pacientů s chronickým jaterním onemocněním. Výsledné skóre je vypočteno z hodnot kyseliny hyaluronové (HA), N-terminálního peptidu prokolagenu typu III (PIIINP) a tkáňového inhibitoru matrixové metaloproteinázy 1 (TIMP-1). Všechny tyto testy jsou standardizované a jedná se o přímé markery jaterní fibrózy. Stanovení všech markerů probíhá ze séra pacienta. Vyhodnocení skóre ELF (viz tabulka č. 6.) odpovídá závažnosti fibrózy jater stanovené jaterní biopsií. [příbalový leták firmy Siemens] Kyselina hyaluronová Jedním z markerů je kyselina hyaluronová (HA), která patří do skupiny glykosaminoglykanů. Skládá se z opakujících se disacharidových molekul kyseliny glukuronové a N-acetyl-D-glukosaminu. Kyselina hyaluronová je složkou extracelulární matrix tvořená v jaterních hvězdicových buňkách. Ve zdravých játrech je koncentrace HA nízká, ve fibrotických játrech ovšem stoupá. Zvýšení hodnot odráží vyšší aktivitu 21

hvězdicových buněk. Vyšetření kyseliny hyaluronové je většinou součástí dalších testů, spolu s dalšími markery. [5,10,20] N-terminální peptid prokolagenu typu III Markerem ukládání kolagenu typu III je N-terminální peptid prokolagenu typu III (PIIINP). Vzniká v jaterních hvězdicových buňkách při přeměně prokolagenu III na kolagen III. Ke zvýšení koncentrace dochází následkem ukládání kolagenu III v časných stádiích fibrogeneze. Vyšší hodnoty nejsou typické jen u jaterní fibrózy, ale také při plicní fibróze, revmatických chorobách a dalších onemocněních. U jaterních chorob dochází ke zvýšení PIIINP u alkoholového onemocnění, chronické hepatitidy C a u cirhózy. Při účinné léčbě primárního onemocnění dochází k poklesu koncentrace PIIINP. [20,21] Tkáňový inhibitor matrix metaloproteináz Degradaci extracelulární matrix ovlivňují matrix metaloproteinázy (MMP), jedná se o skupinu proteolytických enzymů. K nejvýznamnějším enzymům patří MMP- 2 a MMP-9. Antagonisty MMP jsou tkáňové inhibitory matrix metaloproteináz (TIMP), které kontrolují aktivitu MMP. V případě vyšší aktivity MMP dochází ke vzniku vazby s TIMP. Existují 4 typy TIMP-1 až TIMP-4. [5,21] ELF skóre se vypočítá ze vzorce: Ve výpočtu se používá koncentrace HA, PIIINP a TINP1 v ng/ml a ln = přirozený logaritmus. Tab. č. 6: Vyhodnocení skóre ELF Hodnoty Vyhodnocení ELF < 7,7 Nepřítomnost fibrózy 7,7 ELF < 9,8 Přítomnost fibrotizace stupně F1 ELF 9,8 Přítomnost fibrotizace stupně F2 až F4 22

4 Experimentální část 4.1 Popis přístroje ADVIA Centaur XP (Obr. 4) je automatizovaný imunochemický analyzátor využívající k detekci metodu chemiluminiscence. Chemiluminiscence je chemická reakce emitující energii ve formě světla. U přístroje ADVIA Centaur XP jde o přímou chemiluminiscenci za užití acridinium esteru (AE), který jej oxidován peroxidem vodíku. Emise světla je maximální při změně prostředí z kyselého (po přídavku peroxidu vodíku a kyseliny dusičné ACID) do alkalického (hydroxid sodný BASE). Obr. 4 Analyzátor ADVIA Centaur XP (URL 4) Ke stanovení využívá ADVIA Centaur XP principy: 1. Sendvičových metod 2. Kompetitivních metod 23

Sendvičové metody Reagencie obsahují tyto složky: - Reagencie Lite obsahuje AE kovalentně navázaný na protilátku proti stanovovanému antigenu (Ab1) - Pevná fáze obsahuje paramagnetické částice (PMP), na kterých je navázána specifická protilátka proti stanovovanému antigenu (Ab2) Vzorky pro měření vložíme ve stojánku do přístroje. Přístroj odebere jednorázovou špičkou potřebný objem vzorku a nadávkuje ho do kyvety. Ke vzorku se automaticky napipetují reagencie. Po inkubaci při 37 C jsou kyvety vystaveny magnetickému poli, kdy je na stěně přidržen komplex AE Ab1 Ag Ab2 PMP a zbytek je odmyt. K vyvolání chemiluminiscenční reakce se ke vzorku přidá ACID a BASE reagencie. Po proběhnutí chemiluminiscenční reakce se v luminometru změří emise světla v relativních světelných jednotkách (RLU reference light units), která je přímo úměrná množství stanovovaného analytu. Kompetitivní metody Reagencie obsahují tyto složky: - Reagencie Lite s antigenem značeným AE - Pevná fáze obsahující protilátku navázanou na PMP Obě části reagencie jsou přidány ke vzorku. Dochází zde k soutěži (kompetici) při vazbě značeného (AE) a přesně limitovaného množství antigenu a neznačeného (stanovovaného) antigenu na protilátku navázanou na PMP. K navázání dochází ve stejném poměru, v jakém jsou oba antigeny obsaženy v roztoku. Čím je ve vzorku větší množství stanovovaného antigenu, tím méně se naváže značeného antigenu. Po inkubaci a odmytí nenavázaného antigenu, přidáním ACID a BASE se změří emise světla, která je nepřímo úměrná stanovovanému antigenu. 24

4.2 Popis reagencií ELF testu v tabulce č. 7. Složení reagencií, čísla šarží (LOT), expirace a objemy vzorků jsou uvedeny Tab. č. 7: Složení reagencií, čísla šarží, expirace a objemy vzorků HA LOT 124011 Expirace 13. 2. 2015 Objem vzorku 20 μl typ metody Sendvičová metoda Reagencie Lite Protein (hovězí) vázající kyselinu hyaluronovou značený akridinium esterem (~0,5 μg/ml) v pufru s hovězím sérovým albuminem, detergentem a konzervačními přísadami Pevná fáze Paramagnetické částice potažené (myší monoklonální) protilátkou proti FITC (~37,8 μg/ml) v pufru s hovězím sérovým albuminem, detergentem a azidem sodným (< 0,1%) Reagencie Ancillary Well Protein (hovězí) vázající kyselinu hyaluronovou značený fluoresceinem (~0,55 μg/ml) v pufru s hovězím sérovým albuminem, detergentem a konzervačními přísadami PIIINP LOT 125013 Expirace 15. 10. 2015 Objem vzorku 20 μl typ metody Sendvičová metoda Reagencie Lite Protilátka (myší monoklonální) proti PIIINP značená akridinium esterem (~2,0 μg/ml) v pufru s hovězím sérovým albuminem, myším IgG, detergentem a azidem sodným (< 0,1%) Pevná fáze Paramagnetické částice potažené streptavidinem (~0,225 mg/ml) v pufru s hovězím sérovým albuminem, detergentem a azidem sodným (< 0,1%) Reagencie Ancillary Well Protilátka (myší monoklonální) proti PIIINP značená biotinem (~0,7 μg/ml) v pufru s hovězím sérovým albuminem, myším IgG, detergentem a azidem sodným (< 0,1%) 25

TIMP-1 LOT 126013 Expirace 27. 8. 2015 Objem vzorku 25 μl LOT 126008 Expirace 5. 4. 2015 typ metody Sendvičová metoda Reagencie Lite Protilátka (monoklonální myší) proti TIMP-1 značená akridinium esterem (~0,1 μg/ml) a protilátka (monoklonální myší) proti TIMP- 1 značená FITC (~1,8 μg/ml) v pufru s kozím sérem, hovězím sérovým albuminem, hovězím gamaglobulinem, myším IgG, detergentem a konzervačními přísadami Pevná fáze Paramagnetické částice potažené protilátkou (monoklonální myší) proti fluoresceinu (~26,3 μg/ml) v pufru s kozím sérem, hovězím sérovým albuminem, hovězím gamaglobulinem, myším IgG, detergentem a konzervačními přísadami 4.3 Popis kalibrátorů ELF testu ELF test využívá ke kalibraci všech tří parametrů, tedy HA, PIIINP a TIMP- 1 společný kalibrátor, viz tabulka č. 8. Tab. č. 8: Parametry společného kalibrátoru ELF testu Kal LOT C3105 Expirace 13. 11. 2014 Po rozpuštění, nízká a vysoká hladina HA, PIIINP (hovězí), TIMP-1 s hovězím sérovým albuminem, pufrem, azidem sodným (< 0,1 %) a konzervačními přísadami Návaznost metod pro stanovení HA, PIIINP a TIMP-1 je uvedena v tabulce č. 9. Tab. č. 9: Návaznost metod pro stanovení HA, PIIINP a TIMP-1 Návaznost HA PIIINP Stanovení ADVIA Centaur HA je odvozeno od vnitřního standardu připraveného z materiálu vysoké čistoty. Pro tento test není zatím k dispozici žádný referenční standard. Přiřazené hodnoty kalibrátorů a kontrol jsou odvozeny od této vnitřní standardizace. Stanovení ADVIA Centaur PIIINP je odvozeno od vnitřního standardu připraveného z hovězího PIIINP. Přiřazení hodnoty bylo upraveno tak, aby u vzorků pacientů poskytovalo stejné výsledky jako zavedený imunologický test. Pro tento test neexistuje žádný referenční standard. Přiřazené hodnoty kalibrátorů a materiálů pro kontrolu kvality jsou odvozeny od této standardizace. 26

TIMP-1 Stanovení ADVIA Centaur TIMP-1 je odvozeno od interního standardu připraveného z materiálu vysoké čistoty. Pro tento test není zatím k dispozici žádný referenční standard. Přiřazené hodnoty kalibrátorů a kontrol jsou odvozeny od této vnitřní standardizace. 4.4 Popis kontrolního materiálu K ověření správnosti kalibrací byly použity firemní kontroly. Složení, čísla šarží a povolené rozmezí jsou uvedeny v tabulce č. 10. KON 1 Tab. č. 10: Složení, čísla šarží a povolené rozmezí firemních kontrol Expirace 30. 4. 2015 LOT HA [μg/l] PIIINP [μg/l] Po rozpuštění, delipidaci, zbavení lidského séra, obsahuje různé úrovně HA, PIIINP (hovězí), TIMP- 1 s azidem sodným TIMP- 1 [μg/l] 2412051 18,4 ±4,6 2,15 ±0,538 101 ±25,3 KON 2 2412052 47,5 ±11,9 5,41 ±1,35 278 ±69,5 KON 3 (< 0,1%) a konzervačními 2412053 191 ±47,8 11,7 ±2,93 568 ±142 látkami 4.5 Postup při kalibraci a měření kontrol Po vložení kazety s reagenciemi do přístroje je nutné z příbalového letáku načíst údaje o firemní master křivce. Pro nahrání dat musí být zavřena všechna okna. Na obrazovce přístroje otevřeme záložku Calibration a z nabídky vybereme Master Curve Definition, po stisknutí tlačítka Scan Data, načteme údaje pomocí čtečky. Takto se získají údaje o nové reagencii číslo šarže, datum expirace, informace o master křivce, což je deseti bodová kalibrační křivka, která byla vytvořena výrobcem reagencií. Pro uložení stiskneme tlačítko Save. Obdobně v záložce Calibrator Definition načteme údaje o použitém kalibrátoru. K adjustaci na určitý přístroj je nutné vytvoření kalibrační křivky za použití dvou kalibrátorů, jeden o nízké (Low) a druhý o vysoké (High) koncentraci. Dodané firemní kalibrátory jsou lyofilizované a musí se rozpustit ve 2,0 ml deionizované vody po dobu 15-30 min za občasného promíchání. 27

Pro objednání kalibrací otevřeme záložku Worklist a z nabídky vybereme Schedule. V záložce Calibrator vybereme příslušný analyt. V dolní části okna označíme číslo šarže, kterou chceme kalibrovat. Po rozpuštění si vezmeme dvě zkumavky, na které si nalepíme příslušné čárové kódy. Kalibrátory napipetujeme do zkumavek a vložíme je do stojánku. Stojánek umístíme do přístroje, ve kterém se stanoví koncentrace kalibrátorů v tripletu. Správnost kalibrace byla ověřena změřením dodaných kontrol. Příprava dodaných kontrol probíhá stejně jako příprava kalibrátorů. Lyofilizované kontroly se musí rozpustit ve 2,0 ml deionizované vody po dobu 15-30 min za občasného promíchání. Po rozpuštění a objednání vložíme kontroly do přístroje. Objednání kontrol provedeme jako objednání pacientů. Otevřeme záložku Worklist a z nabídky vybereme možnost Schedule. Objeví se okno, v němž klikneme na možnost Patient, pojmenujeme kontroly a vybereme příslušný analyt. Výsledek je třeba zkontrolovat dle příbalového letáku kontrolního materiálu. 4.6 Popis měření pacientů Byl měřen soubor 29 pacientů ve věku 29 67 let s diagnózou hypertriglyceridémie a na léčbě fibráty trvající minimálně 5 let. Pacientům byla odebrána venepunkcí krev a centrifugací při 4 000 rpm (revolutions per minute otáček za minutu) došlo k oddělení krvinek od séra. Sérum bylo odpipetováno do označených zkumavek a zmraženo na -70 C. Pořadová čísla pacientů, datum odběru, věk, koncentrace cholesterolu a triacylglycerolů jsou uvedeny v tabulce č. 11. Tab. č. 11: Pořadová čísla pacientů, datum odběru, věk, koncentrace cholesterolu a triacylglycerolů pořadové číslo pacientů datum odběru věk [roky] chol [mmol/l] TAG [mmol/l] 1 26. 9. 2013 65 2,9 5,13 2 1. 10. 2013 55 5,6 3,37 3 1. 10. 2013 40 5,0 1,11 4 1. 10. 2013 48 4,7 1,48 5 2. 10. 2013 57 4,9 1,58 6 2. 10. 2013 65 6,3 8,46 7 7. 10. 2013 62 5,6 3,63 28

8 7. 10. 2013 38 5,3 2,61 9 9. 10. 2013 60 3,2 1,32 10 9. 10. 2013 59 6,6 1,82 11 9. 10. 2013 64 6,1 1,90 12 10. 10. 2013 51 5,1 1,70 13 10. 10. 2013 31 4,6 1,64 14 10. 10. 2013 67 6,5 1,98 15 11. 10. 2013 29 5,6 3,49 16 11. 10. 2013 61 5,6 0,98 17 14. 10. 2013 66 6,3 2,78 18 15. 10. 2013 64 5,5 1,94 19 16. 10. 2013 62 4,4 1,28 20 16. 10. 2013 64 5,2 1,01 21 17. 10. 2013 61 5,5 2,56 22 17. 10. 2013 66 6,0 2,22 23 22. 10. 2013 45 5,2 3,52 24 22. 10. 2013 67 3,8 1,91 25 22. 10. 2013 56 5,1 1,48 26 25. 10. 2013 50 5,4 1,93 27 31. 10. 2013 43 6,2 3,24 28 31. 10. 2013 42 6,7 2,20 29 31. 10. 2013 67 5,4 1,21 29

5 Výsledky Všechny provedené kalibrace, splňovaly předepsané parametry zadané firmou. Následně provedená kontrola kvality potvrdila správnost kalibrací, výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 12. Kalibrace analytu TIMP-1 byla provedena dvakrát z důvodu problémů s kalibrací, vzniklých netěsností jednoho z čerpadel, takže bylo po opravě analyzátoru nutno použít dvě reagencie, které však byly rozdílných šarží, viz tabulka č. 12. Tab. č. 12: Výsledky kontroly kvality KON 1 KON 2 KON 3 HA PIIINP TIMP-1 (LOT 126008) TIMP-1 (LOT 126013) μg/l 18,27 48,09 201,25 SD -0,06 0,10 0,43 μg/l 2,01 5,16 11,38 SD -0,52-0,37-0,22 μg/l 99 286,8 556,4 SD -0,16 0,25-0,16 μg/l 102,7 283,2 586,9 SD 0,13 0,15 0,27 Po úspěšně provedených kalibracích a kontrole kvality byly změřeny markery pro výpočet skóre ELF ze vzorků pacientů. Naměřené hodnoty jsou uvedeny v tabulce č. 13. Tab. č. 13: Naměřené hodnoty markerů pro výpočet skóre ELF pořadové číslo pacientů HA [μg/l] PIIINP [μg/l] TIMP-1 [μg/l] skóre ELF 1 54,25 8,18 275,8 9,5 2 32,51 4,84 232 8,6 3 15,44 4,76 255 8,0 4 36,73 4,53 219,3 8,6 30

5 124,63 8,21 230,8 10,1 6 22,62 9,22 233,8 8,7 7 104,88 12,86 264,4 10,4 8 14,08 5,34 158,3 7,8 9 61,88 3,99 209,2 8,9 10 51,29 11,91 291,1 9,7 11 77,51 5,58 236,4 9,4 12 23,87 5,82 297,1 8,5 13 20,82 7,34 262,9 8,6 14 65,9 6,97 199,1 9,4 15 80,97 7,16 303,6 9,7 16 54,06 6,11 245,4 9,2 17 50,76 3,61 235,8 8,7 18 51,17 7,95 228,9 9,3 19 19,32 5,96 228,4 8,3 20 50,65 5,89 259,4 9,1 21 109,32 7,37 328,7 10,1 22 100,27 7,1 284,1 9,9 23 38,53 7,52 203,2 9,0 24 91,68 9,32 251,1 10,0 25 24,43 6,08 214,9 8,5 26 34,93 5,68 261,4 8,8 27 78,84 5,03 257,3 9,4 28 27,22 12,11 259,7 9,2 29 73,08 6,7 238,5 9,5 V tabulce č. 14 jsou uvedeny markery pro výpočet APRI skóre a Hepascore, které byly získány od školitele této práce z oddělení ÚLCHKB UK 2. LF a FN Motol (Ústav lékařské chemie a klinické biochemie). Tab. č. 14: Markery pro výpočet APRI skóre a Hepascore získané od školitele této práce pořadové číslo pacientů A2M [g/l] Bil [μmol/l] AST [μkat/l] GGT [μkat/l] PLT * 10 9 /l HA [mg/l] 1 2,05 7,1 0,39 0,69 54,25 2 1,19 6,6 0,38 0,88 181 32,51 3 1,12 6,2 0,38 0,58 251 15,44 4 1,55 18,6 0,44 0,55 270 36,73 5 1,65 9,3 0,74 3,18 178 124,63 6 1,50 4,3 0,40 1,12 216 22,62 7 2,37 9,6 0,64 1,53 144 104,88 31

8 1,30 7,5 0,42 0,84 174 14,08 9 2,49 25,1 0,33 0,26 265 61,88 10 1,89 12,3 0,38 4,60 252 51,29 11 1,77 6,0 0,41 1,13 230 77,51 12 1,17 5,7 0,41 0,71 289 23,87 13 1,55 16,9 0,44 0,74 295 20,82 14 1,65 10,8 0,54 1,74 144 65,9 15 1,21 12,4 0,32 0,98 222 80,97 16 1,29 10,7 0,67 2,80 308 54,06 17 1,37 11,0 0,29 0,39 221 50,76 18 1,81 8,9 0,35 0,47 242 51,17 19 1,34 10,1 0,53 0,80 253 19,32 20 1,40 10,2 0,77 1,53 226 50,65 21 1,59 7,2 0,30 0,62 278 109,32 22 2,94 11,8 0,95 0,55 217 100,27 23 0,96 10,9 0,55 0,69 208 38,53 24 1,44 10,5 0,43 1,51 240 91,68 25 1,13 11,6 0,51 0,43 246 24,43 26 1,42 7,7 0,41 0,46 310 34,93 27 1,69 9,5 0,73 0,40 221 78,84 28 1,39 12,0 0,77 3,00 256 27,22 29 2,00 8,0 0,43 0,42 211 73,08 V tabulce č. 15 jsou uvedené vypočtené hodnoty skóre ELF, APRI a Hepascore ze vzorců uvedených v kapitole 3.3.1.5 a 3.3.2. Pro výpočet Hepascore bylo nutné převést hodnoty GGT z μkat/l na jednotky IU/l. U pacienta č. 1 nebyla odebrána zkumavka pro krevní obraz, takže nemohl být změřen počet trombocytů a také nebylo vypočítáno APRI skóre. Tab. č. 15: Vypočítané hodnoty skóre ELF, APRI a Hepa pořadové číslo pacientů skóre ELF APRI skóre Hepascore 1 9,5 0,3 2 8,6 0,3 0,1 3 8,0 0,2 0,1 4 8,6 0,2 0,3 5 10,1 0,6 0,8 6 8,7 0,3 0,1 7 10,4 0,6 0,8 8 7,8 0,3 0,1 32

9 8,9 0,2 0,8 10 9,7 0,2 0,3 11 9,4 0,2 0,4 12 8,5 0,2 0,1 13 8,6 0,2 0,3 14 9,4 0,5 0,3 15 9,7 0,2 0,6 16 9,2 0,3 0,2 17 8,7 0,2 0,2 18 9,3 0,2 0,3 19 8,3 0,3 0,1 20 9,1 0,5 0,2 21 10,1 0,1 0,6 22 9,9 0,6 0,9 23 9,0 0,4 0,2 24 10,0 0,2 0,5 25 8,5 0,3 0,1 26 8,8 0,2 0,2 27 9,4 0,5 0,6 28 9,2 0,4 0,2 29 9,5 0,3 0,4 tabulce č. 16. Klasifikace fibrotizace a barevné vyhodnocení jsou uvedeny v následující Tab. č. 16: Klasifikace fibrotizace a barevné vyhodnocení nepřítomnost fibrotizace fibrotizace F1 fibrotizace F2 až F4 šedá zóna 33

6 Diskuze Testováno bylo 29 mužů ve věku 29 67 let s diagnózou hypertriglyceridémie a na léčbě fibráty trvající minimálně 5 let. Odběry byly prováděny v ranních hodinách (mezi 6-8 hodinou). Kromě nového skóre ELF bylo u jednotlivých pacientů vypočteno i Hepascore a APRI skóre. Všechny dosud známé výpočtové testy jaterní fibrózy slouží spíše k jejímu vyloučení než k určení jejího stupně, například podle klasifikace METAVIR. Je prezentováno mnoho studií, které se snaží určit cut-off pro jednotlivé testy pro rozlišení významné fibrózy, pokročilé fibrózy a cirhózy. Pro naše hodnocení jsme použili pro APRI skóre hodnoty pod 0,5 pro nepřítomnost fibrózy, hodnoty nad 1,5 pro přítomnost závažné fibrotizace, hodnoty 0,5 až 1,5 jsou v tzv. šedé zóně a nelze určit stupeň fibrotizace. A pro Hepascore hodnoty pod 0,5 značí nepřítomnost fibrózy, naopak hodnoty nad 0,5 naznačují přítomnost závažné fibrotizace. Pro skóre ELF jsou výrobcem definovány hodnoty pod 7,7 pro nepřítomnost fibrózy, hodnoty v rozmezí 7,7 až 9,8 naznačují mírnou fibrotizaci, hodnoty nad 9,8 značí přítomnost závažné fibrotizace. Problémem hodnocení APRI i Hepascore je, že převážná část studií pracuje s hodnotami pacientů s chronickou hepatitidou C či alkoholovou jaterní chorobou. U našeho souboru testovaných subjektů je vzhledem k diagnóze předpoklad nealkoholické steatohepatitidy. Vzhledem k malému rozsahu našeho výzkumu a velké zátěži pro pacienty nebylo možno provést jaterní biopsii, která by případně potvrdila výsledky ELF testu. Pokud bychom naše pacienty hodnotili podle APRI skóre, tak nikdo nepřesáhl hodnotu cut-off 1,5 pro pokročilou fibrózu. Šest pacientů (pořadové číslo pacienta 5, 7, 14, 20, 22, 27) se nacházelo v tzv. šedé zóně (hodnoty mezi 0,5 až 1,5). U Hepascore byla použita hodnota cut-off 0,5 pro pokročilou fibrózu. Sedm pacientů (pořadové číslo pacienta 5, 7, 9, 15, 21, 22, 27) tuto hodnotu přesáhlo. Překvapivých výsledků jsme dosáhli při hodnocení ELF testu. Všichni pacienti z našeho souboru se pohybovali v pásmu středně závažné fibrózy, kromě šesti pacientů, kteří podle tohoto výpočtu mají závažnou fibrózu (pořadové číslo pacienta 5, 7, 15, 21, 22, 24). 34

Všechna vypočítaná skóre korelovala pouze u čtyř pacientů (pořadové číslo pacienta 5, 7, 22, 27). U APRI skóre se tito pacienti nacházeli v šedé zóně, u Hepascore byli jejich hodnoty nad cut-off pro závažnou fibrózu a u skóre ELF se jejich hodnoty nacházeli v zóně závažné resp. střední fibrózy (pořadové číslo pacienta 27). Ze získaných hodnot se skóre ELF jeví jako citlivější nástroj záchytu pacientů s počínající jaterní fibrózou. APRI i Hepascore slouží spíše k potvrzení pokročilé jaterní fibrózy a cirhózy převážně u pacientů s chronickou či alkoholovou jaterní chorobou. V úvahu je ovšem třeba vzít studii z roku 2013 z pracovišť v Hannoveru [26]. V této práci bylo sledováno skóre ELF u 400 zdravých jedinců a u 79 pacientů trpících chronickou hepatitidou C. Závěry této studie vypovídají, že i u zdravé populace jsou hodnoty skóre ELF signifikantně vyšší, než je udáváno výrobce viz tabulka č. 6. Zároveň bylo zjištěno, že jsou hodnoty u mužů vyšší než u žen. Se zvyšujícím se věkem jsou hodnoty skóre ELF vyšší, rovněž cirkadiální rytmus hraje svou roli, kdy jsou odpolední hodnoty vyšší. 35

ZÁVĚR Jaterní fibróza je stále častější onemocnění jater způsobené chronickým poškozováním jaterní tkáně. Včasný záchyt je důležitý pro zahájení efektivní léčby. K diagnostice jaterních onemocnění se nejčastěji používá biopsie jater, při které je odebrán malý vzorek jaterní tkáně. Jaterní biopsie patří mezi invazivní metody vyšetření a pro pacienta představuje řadu nevýhod a rizik například krvácení, infekce v místě vpichu nebo dokonce smrt. K odstraněné těchto rizik se proto hledají nové neinvazivní postupy. Existuje řada výpočtů, které používají k určení stupně závažnosti fibrotizace specifické a nespecifické markery. Nové skóre ELF využívá k hodnocení markery specifické pro jaterní fibrózu, a to kyselinu hyaluronovou, N-terminální peptid prokolagenu typu III a tkáňový inhibitor matrix metaloproteináz. V této bakalářské práci bylo porovnáváno skóre ELF s APRI a Hepascore. Z výsledků vyplývá, že nové skóre ELF citlivěji zachycuje mírnou i závažnou fibrotizaci. V úvahu je ale třeba vzít práci z roku 2013 z pracovišť v Hannoveru [26], která poukázala na příliš vysokou citlivost skóre ELF. Výsledky této studie ukazují, že i u zdravých jedinců jsou hodnoty skóre ELF vyšší než hodnoty udané výrobcem. Kvůli malému rozsahu našeho výzkumu a velké zátěži pro pacienty nebylo možno provést jaterní biopsii, která by případně potvrdila výsledky ELF testu. Dále by bylo vhodné provést další testování rovněž zdravých jedinců a vypracovat nové referenční rozmezí pro naši populaci. 36

REFERENČNÍ SEZNAM [1] VÁLEK, Vlastimil, Zdeněk KALA a Igor KISS. Maligní ložiskové procesy jater: diagnostika a léčba včetně minimálně invazivních metod /. 1. vyd. Praha: Grada, 2006, 416 s. ISBN 80-247-0961-9 [2] MERKUNOVÁ, Alena a Miroslav OREL. Anatomie a fyziologie člověka: pro humanitní obory. Vyd. 1. Praha: Grada, 2008, 302 s. Psyché (Grada). ISBN 978-802-4715-216 [3] DYLEVSKÝ, Ivan. Funkční anatomie. 1. vyd. Praha: Grada, 2009, 544 s. ISBN 978-80-247-3240-4 [4] LANGMEIER, Miloš. Základy lékařské fyziologie. 1. vyd. Praha: Grada, 2009, 320 s. ISBN 978-802-4725-260 [5] ŠPIČÁK, Julius. Novinky v gastroenterologii a hepatologii. 1. vyd. Praha: Grada, 2008, 424, [20] s. ISBN 978-802-4717-838 [6] MOUREK, Jindřich. Fyziologie: učebnice pro studenty zdravotnických oborů. 1. vyd. Praha: Grada, 2005, 204 s. ISBN 80-247-1190-7 [7] KITTNAR, Otomar. Lékařská fyziologie: učebnice pro studenty zdravotnických oborů. 1. vyd. Praha: Grada, 2011, 790 s. ISBN 978-802-4730-684 [8] EHRMANN, Jiří a Petr HŮLEK. Hepatologie. 1. vyd. Praha, 2010, xxii, 590 s. ISBN 978-802-4731-186 [9] KOOLMAN, Jan a Klaus-Heinrich RÖHM. Barevný atlas biochemie. 1. české vyd. Praha: Grada, 2012. ISBN 978-802-4729-770 [10] AIGLOVÁ, Květoslava. Jaterní fibróza a její diagnostika. Postgraduální medicína, 2012, roč. 14, č. 3, s. 297-304. ISSN: 1212-4184 [11] TAIMER, Pavel. Patogeneze fibrózy jater. Bulletin HPB chirurgie, 2002, roč. 10, č. 2-3, s. 47-49. ISSN: 1210-6755 [12] BATALLER, Ramón, et al. Liver fibrosis. Journal of Clinical Investigation, 2005, 115.2: 209-218 [13] BEDOSSA, Pierre. Liver biopsy. Gastroenterol Clin Biol. 2008, 32(6Suppl. 1), 4-7 [14] EHRMANN, Jiří, Petr SCHNEIDERKA a Jiří EHRMANN. Alkohol a játra. 1. vyd. Praha: Grada, 2006, 166 s., [16] s. barev. obr. příl. ISBN 80-247-1048-X 37