Protilátky třídy IgE proti pylovým a potravinovým alergenům Návod pro EUROLINE Crossreactions Objednací číslo Určení Ig-třída Substrát Formát DP 3711-1601 E Inhalační a potravinové alergeny IgE Ag-potažené mikrotitrační jamky 16 x 01 (16) Indikace: Potenciální alergické reakce (zánět spojivek, senná rýma nebo astma) u osob s rodinnou dispozicí k alergickým onemocněním. Princip testu: Kit EUROLINE test nabízí semikvantitativní in-vitro test na lidské IgE protilátky proti inhalačním alergenům. Testovací kit obsahuje proužky potažené dvaceti různými alergeny. Testovací proužek je nejprve navlhčen a potom inkubován v prvním reakčním kroku s naředěným sérem pacienta. V případě pozitivních vzorků, se specifické IgE protilátky naváží na alergeny. V druhém kroku jsou použity enzymově značené protilátky proti lidským IgE protilátkám, které následně katalyzují barevnou reakci. Obsah kitu: - Proužky potažené alergeny: 16 testovacích proužků - Enzymový konjugát: alkalickou fosfatasou značené myší protilátky proti lidským IgE: 1 x 20 ml, připraveno k použití. - Koncentrovaný pufr: 1x 100 ml 10x koncentrovaného pufru, ze kterého se získá 1 l univerzálního pufru pro okamžité použití (vzorkový a promývací pufr). - Chromogen/substrátový roztok: 1 x 30 ml, připraveno k použití. Chromogen: nitrobluetetrazoliumchlorid/5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (NBT/BCIP). - Návod k provedení testů - Evaluační protokol - Plastová fólie - Inkubační vaničky: 2x8 drážek Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až +8 o C, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. Upozornění: Veškerý materiál musí být brán jako potenciálně nebezpečný a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie obsahují toxické látky. Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody. Nakládání s odpadem: S neředěnými séry a inkubovanými stripy je nutné zacházet jako s infekčním odpadem. Substrát musí být zlikvidován po inkubaci, pufry nemusí být skladovány a likvidovány odděleně. Příprava reagencií Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu!!! Potažené testovací proužky: Připravené pro použití. Balení s testovacími proužky otevřete pouze tehdy, dosáhlo-li pokojové teploty. Předejdete tak kondenzaci vody na proužcích. Po
odebrání příslušného proužku musí být balení dobře zataveno a kit uchováván při teplotě +2 o C až +8 o C. Univerzální pufr: Dodávaný pufr je 10x koncentrovaný. Při přípravě univerzálního pufru odeberte pipetou příslušný objem a nařeďte ho v poměru 1:10 deionizovanou destilovanou vodou. Například pro jeden testovací proužek nařeďte 1,5 ml pufru 13,5 ml vody. Naředěný pufr je stabilní maximálně jeden týden při teplotě +2 o C až +8 o C. Poznámka: Pokud začne koncentrovaný pufr krystalizovat, zahřejte ho na teplotu 37 o C a dobře ho promíchejte. Enzymový konjugát: Připraven k použití, před použitím je potřeba řádně promíchat. Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Příprava vzorků Vzorky séra a plazmy používejte neředěné nebo alternativně pro analýzu nařeďte 1: 11 univerzálním pufrem (100 µl séra může být přidáno do 1,0 ml univerzálního pufru), dobře promíchejte a inkubujte přes noc. Inkubace Blokování: Naplňte příslušný počet žlábků v inkubační destičce 1,0 ml univerzálního pufru. Počet žlábků závisí na počtu testovaných sér. Vyjměte příslušný počet proužků a umístěte je do žlábky tak, aby bylo vidět číslo stripu. Inkubujte 5 minut při pokojové teplotě na třepačce. Poté veškerou kapalinu odstraňte. Inkubace séra: Naplňte každý žlábek 1,0 ml naředěného séra a inkubujte při 1. Krok. pokojové teplotě 60 minut na třepačce. (Alternativa: séra ředěná 1:11 inkubujte přes noc při RT na třepačce). Promývání: Vyprázdněte žlábky a následně každou drážku promyjte 3 x 5 minut 1,5 ml univerzálního pufru na třepačce. Inkubace konjugátu: Pipetujte 1,0 ml enzymového konjugátu (alkalická fosfatasa 2. Krok. konjugovaná s anti-lidským IgE, monoklonální) do každého žlábku a inkubujte po dobu 60 minut při pokojové teplotě na třepačce. Promývaní: Vyprázdněte žlábky a následně každý žlábek promyjte 3 x 5 minut 1,0 ml univerzálního pufru na třepačce. Inkubace substrátu: Pipetujte 1,0 ml roztoku chromogen/substrát do každého žlábku. 3. Krok. Inkubujte po dobu 10 minut při pokojové teplotě na třepačce.
Zastavení: Odsajte kapalinu z každé drážky a každý proužek opláchněte 3 x deionizovanou destilovanou vodou. EUROLINE Atopy Inkubační protokol Příprava: Vložte proužky do inkubačních žlábků obsahujících 1,0 ml univerzálního pufru 5 min Třepat 1. Inkubace vzorku Odsajte pufr, pipetujte do žlábku 1,0 ml séra 60 min Třepat Promytí: 3 x 5 min 2. Inkubace s konjugátem Odsajte, do žlábků pipetujte 1,0 ml enzymového konjugátu 60 min Třepat Promytí: 3 x 5 min 3. Inkubace se substrátem Odsajte, do žlábků pipetujte 1,0 ml chromogen/substrát roztoku 10 min Třepat Zastavení: Odsajte, propláchněte vodou Vizuální stanovení nebo EUROLineScan
Hodnocení a interpretace výsledků Zpracování: Položte testovací proužek na filtrační papír, opatrně ho otřete filtračním papírem a umístěte proužek na vyznačené místo na vyhodnocovacím protokolu. Proužek se na fólii na protokolu přilepí a dále již s ním není možno hýbat. Na vytištěném vyhodnocovacím proužku je každý proužek spojen s daným alergenem a tento proužek může být srovnán s analyzovaným proužkem. Výsledky mohou být vyplněny do příslušné tabulky. Na proužku jsou tři kalibrační proužky. Test byl proveden správně pouze v případě, že tyto tři proužky mají různě intenzivní barvu (málo pozitivní, středně pozitivní a vysoce pozitivní). Testovací proužek obsahuje následující alergeny: g6 t3 w6 f4 f5 f13 f17 f20 f48 f89 f271 f275 f44 f49 f348 f237 f328 f31 f35 f85 Co1 Co2 Co3 Pozice Ozn. Alergen 1 g6 bojínek 2 t3 bříza 3 w6 pelyněk 4 f4 pšeničná mouka 5 f5 žitná mouka 6 f13 burský oříšek 7 f17 lískový ořech 8 f20 mandle 9 f48 cibule 10 f89 hořčice 11 f271 anýz 12 f275 13 f44 jahody 14 f49 jablko 15 f348 lytchi 16 f237 meruňka 17 f328 fíky 18 f31 mrkev 19 f35 brambory 20 f85 celer a Co1 málo pozitivní b Co2 středně pozitivní c Co3 vysoce pozitivní Interpretace výsledků: Hodnocení testu se skládá z určení pozice a intenzity zabarvení proužků. Konkrétní alergeny jsou identifikovány na základě natištěného vyhodnocovacího
proužku. Některá séra mají tmavší pozadí, bílé proužky na pozicích alergenů musí být interpretovány jako negativní. Semikvantitativní hodnocení je možné provést na základě srovnání intenzity zabarvení s kontrolními proužky. Výsledky mohou být rozděleny do čtyř skupin: Třída Výsledek Vzhled 0 negativní, proužek chybí žádný klinický nález + nízká koncentrace alergen-specifického IgE částečný klinický nález proužek je slabě zabarven jako u kontr. proužku 1 ++ střední koncentrace alergen-specifického IgE často s klinickými symptomy proužek je zabarven jako u kontr. proužku 2 +++ vysoká koncentrace alergen-specifického IgE téměř vždy klinické symptomy proužek je zbarven intenzivně jako u kontr. proužku 3 Klinický význam: Alergie je hypersenzitivní reakce k cizím látkám, které jsou v enormně nízkých koncentracích, ale způsobují silnou reakci u člověka postiženého alergií. Z různých typů alergií je nejčastější typ 1, pro který je charakteristická tvorba specifických IgE protilátek. Více než 15% populace ve vyspělých zemích trpí alergií. Typickými symptomy jsou rýma, zánět spojivek nebo astma. Pokud je pozorována systémová alergická reakce, mohou se objevit i reakce ohrožující život pacienta (anaphylaxe). Alergie může být způsobena sezóními alergeny (pyl ze stromů, travin nebo plevelů) nebo celoročními alergeny (prach, spóry plísní, sliny a domácí zvířata). Alergie však nemusí být způsobeny pouze alergeny přenášenými vzduchem jako pyl, prach nebo spóry, ale mohou být rovněž způsobeny jídlem. Nejčastěji způsobují alergii ořechy, sója, pšenice, mušle, ryby, mléko a vejce. Alergie na jídlo je reakce způsobená IgE, která nastává do hodiny po požití. Obvykle se vyskytující symptomy jsou pálení rtů, jazyka a patra nebo svědění, nevolnost, průjem a erytém. Symptomy mohou zahrnovat také astma, tlukot srdce a dušnost. Někdy se může objevit dokonce i anaphylaxe. IgE protilátky proti jednomu rostlinnému alergenu mohou zkříženě reagovat na jídlo pocházející z rostlin nebo na jiné alergeny. Například u osob, které jsou alergické na pyl z břízy, se může objevit alergie na jablka, mrkev, celer, rajčata nebo kiwi.