Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici na Moravě Ústav Vinohradnictví a vinařství

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici na Moravě Ústav Vinohradnictví a vinařství Studená před-fermentační macerace ve výrobě červených vín Diplomová práce Vedoucí bakalářské práce: doc. Ing. Mojmír Baroň, Ph.D. Vypracoval: Bc. Jiří Blasch Lednice 2018

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Studená před-fermentační macerace ve výrobě červených vín vypracoval samostatně a veškeré použité prameny a informace jsou uvedeny v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/199 Sb. o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 Autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity o tom, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Lednici dne:... Podpis

Poděkování Rád bych poděkoval vedoucímu práce doc. Ing. Mojmíru Baroňovi, Ph.D. za odborné vedení a pomoc s prací. Dále bych rád poděkoval Ing. Boženě Průšové za pomoc s měřením a vyhodnocením. V neposlední řadě bych rád poděkoval své rodině za trpělivost a pomoc.

Obsah 1. Úvod... 9 2. Cíl práce... 10 3. Literární část... 11 3.1 Vliv macerace rmutu na látky obsažené ve víně... 11 3.2 Zvýšené látky ve víně vlivem macerace... 13 3.3 Studená macerace... 21 3.3.1 Macerace modrých odrůd... 21 3.3.2 Macerace bílých odrůd... 24 3.3.3 Nalezení ideálního poměru teploty a času... 25 3.3.4 Metody zchlazení... 26 4. Praktická část... 32 4.1 Surovina... 32 4.2 Metodika... 33 4.2.1 Kontrola... 34 4.2.2 Varianta 3 denní studené macerace... 34 4.2.3 Varianta 7 denní studené macerace... 35 4.2.4 Varianta 14 denní studené macerace... 35 4.3 Metody měření... 36 4.3.1 ph... 36 4.3.2 Veškeré titrovatelné kyseliny... 36 4.3.3 Asimilovatelný dusík... 37 4.3.4 Teplota... 37 4.3.5 FTIR spektrometr ALPHA WINE ATR... 37 4.3.6 Spektrofotometrická stanovení pomocí automatického biochemického analyzátoru MIURA ONE... 38 4.3.7 Senzorické hodnocení... 40 5. Výsledky... 41 6. Diskuze... 56 7. Závěr... 58 8. Souhrn... 60 9. Summary... 61 10. Zdroje... 62 5

Seznam obrázků Obr. 1 Potřeba asimilovatelného dusíku... 13 Obr. 2 Antokyany... 19 Obr. 3 Extrakce flavonoidů (A) a neflavonoidů (B) u odrůdy Chardonnay (Jackson 2014)... 25 Obr. 5 Suchý led forma nuget (Burg 2014)... 27 Obr. 6 Přepravní kontejner (www. spektro.cz)... 28 Obr. 7 Kryomacerační linka: (1) násypka; (2) soustava trysek pro CO2; (3) vibrační stůl; (4) soustava trysek pro CO2; (5) pásový dopravník; (6) otvor s teploměrem; (7) mlýnkoodzrňovač (Carillo et al. 2011)... 31 6

Seznam tabulek Tab. 1 Fenolové sloučeniny ve víně... 15 Tab. 2 Hydroxylové deriváty kyseliny benzoové a skořicové... 16 Tab. 3 Skupina fenolických látek (Pavloušek 2010)... 20 Tab. 4 Základní analytické hodnoty moštu... 41 Tab. 5 Teploty macerace... 41 Tab. 6 Základní analytické hodnoty z Alpha wine atr... 42 Tab. 7 Hodnocení 100 bodovou tabulkou výsledných vín... 53 7

Seznam grafů Graf 1 Vývoj celkového obsahu fenolů... 43 Graf 2 Celkový obsah fenolů u výsledného vína... 44 Graf 3 Vývoj antiradikálové aktivity... 45 Graf 4 Antiradikálová aktivita u výsledných vín... 46 Graf 5 Vývoj celkových flavanolů... 47 Graf 6 Celkové flavanoly u výsledných vín... 48 Graf 7 Vývoj celkových antokyanů... 49 Graf 8 Celkové antokyany u výsledných vín... 50 Graf 9 Vývoj redukční síly... 51 Graf 10 Redukční síla u výsledných vín... 52 Graf 11 Profil struktury a mohutnosti výsledných vín... 54 Graf 12 Aromatický profil výsledných vín... 55 8

1. Úvod Prvním úkolem vinaře během sklizně hroznů je dobré zvážit, jak se postarat co nejlépe o sklizenou surovinu. Samotná fermentace sklizených hroznů nastává zhruba do dvou dnů a není proto moc času na dlouhé rozhodování. Je tedy velice důležité si dopředu rozmyslet, jakými výrobními kroky surovinu zpracujeme a jaké víno z ní vytvoříme. V současnosti technologie pro přepravu a zpracování hodně pokročila a dochází tak k šetrnému zpracování hroznů. Bez negativních vlivů jako je oxidace nebo kontaminace jinými látkami. Hlavním způsobem, jak dostat sekundární metabolity ze stěn bobulí do moštu, je macerace. Macerace rmutu je jedna z prvních výrobních operací, proto je velmi důležitá. Pro získání kvalitního produktu je takřka klíčová. Macerací rmutu dochází k uvolňování antokyanů, fenolických látek, asimilovatelného dusíku a dalších velmi potřebných složek pro víno ze stěn slupek bobule. Toto uvolňování je podpořeno jednak narušením bobulí pomocí mlýnku, ale také enzymatickou aktivitou. Naší snahou je vytvoření co nejlepších podmínek pro maceraci. Z tohoto hlediska je důležité stanovit si teplotu a čas, po který necháme rmut macerovat. Vyšší teplotou dochází sice k rychlejšímu uvolňování látek, ale také k rychlejšímu vyprchání aromatických látek. Delším časem dochází naopak k příliš velké extrakci látek, což může vést k negativním projevům, kterými mohou být vyšší hořkost či bylinné tóny. V dnešní době dochází k využívání studené macerace nebo-li kryomacerace. Kryomacerace znamená macerace rmutu v nižších teplotách, v tomto případě za použití suchého ledu. U rmutu dojde při kontaktu se suchým ledem k výraznému snížení teploty. Tímto krokem je docíleno vytlačení kyslíku, a to oxidem uhličitým, což zabrání následné oxidaci. Také dochází ke zvýšení obsahu asimilovatelného dusíku, ph, polyfenolů a dalších látek. Vzniklé víno se prosazuje svým vyšším aromatickým profilem, hladkostí a lehkostí. 9

2. Cíl práce Cílem diplomové práce je seznámit se s problematikou studené před-fermentační macerace a její finanční nákladností. Pomocí experimentu v praxi využít nabyté znalosti a ověřit je. Nedílnou součástí je i získání nových poznatků z analytických i senzorických hodnot, ze kterých vyvodíme patřičná doporučení pro praxi. 10

3. Literární část 3.1 Vliv macerace rmutu na látky obsažené ve víně Macerace, extrakce či louhování všechny tyto technologické metody mají zvýšit množství uvolněných látek z bobulí, bylin či jiných látek do roztoku. V praxi se proces vyextrahování látek používá už tisíce let. Například vermuty, léčivé odvary, bylinné likéry. Při výrobě vína se využívá macerace. Tento proces vyextrahování látek z třapin a bobulí je známý již od pravěku. V tehdejší Kolchidě (nynější Gruzii) byla vyráběna vína pomocí dlouhé macerace, během níž vykvasil samotný mošt a vzniklo z něho víno. Tento způsob výroby vína se dá pokládat za nádherný příklad vyextrahování látek. Obsah látek v takhle vytvořeném víně bývá i dvěstěnásobně vyšší než u vín bez jakékoliv macerace. Vysoká extrakce látek je zapříčiněna tím, že se ne všechny látky uvolňují ve vodném roztoku. Mnoho látek se začíná uvolňovat až se stoupajícím alkoholem. U pojmu macerace se trochu zastavíme. Tento technologický proces u výroby vína, je základním pilířem pro výrobu vín vysoké kvality. V procesu dochází ke kontaktu pevných částí rmutu ( třapiny, slupky, dužniny a semínek) s moštem. Tímto kontaktem se pomalu uvolňují látky do moštu a zvyšuje se tak obsah dusíkatých látek, jenž slouží jako živiny pro kvasinky. Podstatnější u této metody je zvýšení aromatických látek, barviv a v neposlední řadě extraktu.(steidl 2002) Macerace je dvousečná zbraň a nemůže se použít za každých podmínek. Ne nadarmo se říká, že někdy méně je více. Během ní dochází k extrakci jak chtěných látek tak i nechtěných. Každý vinař si proto musí najít ideální poměr zdravotního stavu a vyzrálosti suroviny. Do moštu se jinak extrahují travnaté tóny, hrubé taniny, glukany a oxidázy. Mimo to, jak dlouho se nechá macerovat surovina, je podstatná i teplota macerace. Možností teplot pro maceraci je mnoho stejně jako jednotlivých typů. Například kryomacerace, studená macerace, macerace při,,normální teplotě (15-20 C) a macerace za vysokých teplot (termovinifikace). Každá varianta vytvoří jiný charakter vína. V dnešní době je stále hojněji využívaná studená macerace. Kromě této varianty, která bude podrobněji popsána v kapitole 3.3, se stále můžeme setkat s použití vysokých teplot. 11

Rmut se zahřeje na teplotu 65-70 C po dobu 15 minut a pak dojde ke zpětnému ochlazení. Během těchto 15 minut dochází k velmi rychlé extrakci látek, inaktivaci enzymů a usmrcení kvasinek. Ty se po zchlazení musí znovu dodat, aby mohla začít alkoholová fermentace. V praxi se nejčastěji setkáme s macerací při teplotě 15-20 C. Během této macerace dochází k aktivaci pektolytických enzymů, uvolňování barviv, aromatických látek a jejich prekurzorů. (Pavloušek 2011) Tento technologický proces řídí řada mechanizmů. Jedná se o extrakci různých substancí a jejich následné rozpuštění. Kdy dojde k přechodu jedné složky, například antokyanů, z vakuol buněk obsažených v pevných částech matolin do kapalné fáze. Nutno ale podotknout, že rozpuštění závisí především na charakteru odrůdy a stavu vyzrálosti hroznů. U zmíněných antokyanů je to dobře pozorovatelné. Když podrtíme dobře vyzrálou surovinu, vidíme, že je mošt z této suroviny už zbarven, na rozdíl od nevyzrálé suroviny, kde se mnohokrát čeká 24 až 48 hodin. Samotné rozpouštění do moštu ulehčuje dostatečná destrukce pletiv. K tomu můžeme využít mechanické narušení, využitím enzymů nebo například použitím suchého ledu. Možností, jak je možné narušit buňky, je několik. Jednou z cest je umrtvit pletiva buňky, ať už použitím oxidu siřičitého, anaerobiózou, etanolem, delším kontaktem nebo teplotou. (Michlovský 2015) Dalším mechanizmem je difúze látek v množství vyluhovaných substancí. K extrakci dochází v pevných částech matolin, kdy tekutina, která je v blízkosti, je rychle saturována vyluhovanými složkami a dále k extrakci nedochází. Aby bylo možné v extrakci pokračovat, je nutný tok moštu. Ponořením matolinového klobouku nebo remontáží se zajistí dostatečná výměna moštu a rozpouštění dále pokračuje. (Michlovský 2015) V neposlední řadě se jedná o zpětné fixování na třapiny, kvasinky nebo matoliny. V moštu dochází i k přeměnám vyluhovaných substancí. Příkladem je možnost redukce bezbarvých derivátů antokyanů. (Michlovský 2015) 12

3.2 Zvýšené látky ve víně vlivem macerace 3.2.1 Dusíkaté látky Dusík patří k hlavním složkám zemské atmosféry, která je z něj tvořena 78 %. Je potřebný pro správný vývoj rostlin i živočichů. Dusíkaté sloučeniny jsou obsaženy v bílkovinách, aminokyselinách, alkaloidech či amonných sloučeninách. Ve víně se dusíkaté sloučeniny hojně nevyskytují. Jejich množství se zde pohybuje od 0,5 g/l až po 5 g/l. V celkovém souhrnu 25 až 50 % tvoří polypeptidy, 25 až 30 % volné aminokyseliny, 5 až 10 % vlastní bílkoviny, které postupně mizí, 3 až 10 % tvoří amoniakální dusík, který má velkou roli během fermentace, kde je využíván jako výživa kvasinek. Zbytek tvoří aminy a amidy. Během fermentace dochází k asimilaci dusíkatých složek kvasinkami, a to hlavně během fáze rozmnožování. Preferovaným zdrojem dusíku je u kvasinek amoniak, případně jednodušší aminokyseliny (arginin). Minimální množství pro úspěšnou alkoholovou fermentaci je 150 mg.l -1. Optimální množství pro bezproblémovou fermentaci se udává nad 200 mg.l -1 asimilovatelného dusíku v moštu. Když je asimilovatelného dusíku nedostatek, může dojít k negativnímu ovlivnění aromatických látek, a to vznikem kyseliny octové a sirných sloučenin, zpomaleným nebo zastaveným kvašením. Množství dusíku uloženého v hroznech je ovlivněno mnoha aspekty. Ať už odrůdou, půdním hnojením, zatravněním nebo klimatickými podmínkami daného ročníku. Obr. 1 Potřeba asimilovatelného dusíku (Zdroj:http://www.agroporadenstvo.sk/index.php?start&t=rastlinna-vyroba-vinic-avino&t2=&article=324) 13

Amoniakální dusík Oblíbenou živinou kvasinek je amoniakální dusík, a to především pro jeho snadné využití. Důležitý je zejména na začátku fermentace, kdy usnadňuje start alkoholové fermentace. V zásadě se dá říct, že mošt bývá touto formou dusíku dobře zásoben. Výjimka však nastává u příliš zralých hroznů, kdy je potřeba 300 mg*l -1 a více asimilovatelného dusíku. K ulehčení začátku fermentace je legislativně povolen přídavek amonné soli (NH 4 ) 2 HPO 4 (max. 0,3 g*l -1 ) nebo (NH 4 ) 2 SO 4 (max. 0,2 g*l -1 ). Přidání amoniakálního dusíku by mělo nastat ještě před začátkem fermentace, i když nové výzkumy ukazují, že toto pojetí nemusí být nutně dogmatem. Pravdou ale zůstává, že přídavek této sloučeniny může vyvolat zdlouhavé kvašení a s ním spojené problémy. (Michlovský 2014) Aminokyseliny Aminokyseliny jsou sloučeniny, které obsahují jednu nebo více kyselých karboxylových skupin ( -COOH) a jednu nebo více aminových skupin (-NH 2 ). Aminokyseliny v hroznech vznikají navázáním amoniaku na organické ketokyseliny. Rozmanitost aminokyselin, stejně jako jejich množství, je závislé na odrůdě, klimatických podmínkách a vinifikaci. Působením kvasinek během fermentace dochází k časté změně podstaty aminokyselin. Hlavními aminokyselinami jsou prolin, arginin a glutamin. Tyto tři aminokyseliny tvoří zhruba 80 % aminokyselin vína. Nalezneme zde ovšem všechny známé aminokyseliny. Nejvíce zastoupen bývá prolin, jehož množství se při dozrávání zvyšuje. Bohužel je však pro kvasinky hůře využitelný. K asimilaci dochází jen za přítomnosti kyslíku. Kvasinkami nejvíce využívanou aminokyselinou je arginin. (Michlovský 2014; Jégou et al. 2017) Množství jednotlivých aminokyselin od bobule k hotovému vínu je velmi proměnlivé a můžeme konstatovat, že při delší vinifikaci a vyšší teplotě stoupá extrakce dusíkatých látek. Z tohoto důvodu nebývá problém u červených vín s výživou kvasinek. Tyto vína obsahují až dvojnásobek aminokyselin než bílé vína. (Michlovský 2014; Ribéreau- Gayon et al. 2006b) 14

Peptidy Sloučeniny organického původu, které vznikly spojením několika aminokyselin peptidovou vazbou, se nazývají peptidy. Obsah peptidů ve víně je ovlivněn, stejně jako jiné dusíkaté látky, odrůdou a vinifikací. Jejich množství se pohybuje až do 4 g*l -1. Během termovinifikace dochází k trojnásobnému nárůstu polypeptidů oproti celkovému asimilovatelnému dusíku. Tento jev lze vysvětlit denaturací bílkovin při zahřátí rmutu. Vlivem peptidů se může objevit u vína hořkost. 3.2.2 Fenolové sloučeniny Pokud můžeme říci, že páteř vína tvoří kyseliny, pak jeho tělo je tvořeno fenolickými sloučeninami. Tyto sloučeniny, které obsahují jedno nebo více fenolových jader, odpovídají za barvu a strukturu vín. Jsou důležité při uchovávání a ležení vína, dále také ovlivňují hořkost a jímavost kyslíku při zrání vína. Ačkoliv byly objeveny relativně nedávno, v šedesátých letech minulého století, můžeme říci, že už se nám o nich díky systematickému studiu vytváří ucelený pohled. Obsah fenolových sloučenin je ovlivňován počasím daného roku, způsobem vinifikace, odrůdou a zdravotním stavem suroviny. Obecně se u bílých vín obsah fenolových sloučenin vyskytuje do 0,25 g*l -1 a u červených do 4,5 g*l -1. (Michlovský 2014; Taillandier a Bonnet 2005; Ribéreau-Gayon et al. 2006a) Třídíme je do 4 skupin: Fenolové kyseliny Třísloviny (Taniny) Flavony a flavonoly Antokyany Tab. 1 Fenolové sloučeniny ve víně Sloučenina Bílá vína Červená vína Fenolové kyseliny 1 až 10 100 až 200 Flavonoidy stopové množství do 15 Antokyany stopové množství 200 až 500 Třísloviny 1 až 100 1000 až 5000 15

Fenolové kyseliny V hroznech jsou fenolové kyseliny nejčastěji vázány v esterech kyseliny vinné, nalezneme je však i navázané na třísloviny nebo cukry. Během vinifikace a zrání vína dochází k pomalé hydrolýze a odštěpené fenolové kyseliny zůstávají ve volném stavu. Fenolové kyseliny rozdělujeme na dvě skupiny viz Tab.2 Hydroxylové deriváty kyseliny benzoové a skořicové. První skupinu představují hydroxylové deriváty kyseliny benzoové. Řadíme zde kyseliny vanilovou, gallovou, p-hydroxybenzoovou, syringovou, protokatechovou, salicylovou a gentisovou. Jejich výskyt ve vínech je minoritní. V hroznech révy vinné se vyskytují hlavně formou esterů a glykosidů. Nejvýznamnějším zástupcem je kyselina gallová, která je obsažena v pevných částech bobule. Do druhé skupiny řadíme deriváty kyseliny skořicové. Jsou to kyseliny kávová, p- kumarová, ferulová, sinapová. Tyto kyseliny tvoří hlavní fenolické sloučeniny pro bílá vína. Jsou bezbarvé, ale při kontaktu se vzduchem oxidují na žlutou až hnědou barvu. Vyskytují se také u červených odrůd, kde mají nezastupitelnou roli pro kopigmentaci. (Michlovský 2014) Tab. 2 Hydroxylové deriváty kyseliny benzoové a skořicové Do fenolových kyselin řadíme také kumariny a stilbeny. Kumariny ale přirozeně nenacházíme v hroznech révy vinné. Do vína se dostávají z dřeva dubu, a to během zrání vína v sudech. Jejich organoleptický projev je hořký s velmi nízkým prahem vnímání. 16

Mezi stilbeny řadíme asi nejznámější látku s pozitivními účinky na zdraví, a to resveratrol. (Pavloušek 2011; Michlovský 2014) Třísloviny Ve víně i hroznech se setkáme s tříslovinami, které vznikají kondenzací katechinu. Mezi pozitivní účinky na zdraví patří snížení hladiny cholesterolu a rozšíření cév. Negativním účinkem je podpora bolestí hlavy tzv. migrén. Kdy třísloviny spojené s histaminem způsobí v lidském těle reakcí projevující se právě migrénou. V hroznech a víně jsou třísloviny zastoupeny monomery flavanolů a kondenzovanou formou sloučenin flavanolů, které můžeme označit jako tříslovité látky v pravém slova smyslu. Kondenzací monomerů vznikají u mladých vín třísloviny s 2 až 3 jednotkami flavanolů. Ty se v průběhu zrání vína ještě dále kondenzují a ve starších vínech můžeme nalézt třísloviny v řádu desítek jednotek. V hroznech se kondenzované třísloviny vyskytují ve všech částech (třapina, semena a slupka). Celkově se nejvíce vyskytují v hroznech jako krátké oligomery (70 až 85 %). Dlouhé řetězce mají nižší výskyt a to 5-15 %. Celkově víno může obsahovat 2-5 g*l -1 tříslovin. Výraznou schopnost ovlivnění množství a kvality tříslovin má metoda vinifikace, především teplota fermentace, délka macerace, kontakt moštu s matolinami, počet remontáží a jejich délka nebo koncentrace etanolu. Dlouhá macerace a vyšší teplota fermentace slouží k získání maxima tříslovin. Takto vyrobené víno je však příliš svíravé a nevyrovnané. Potřebuje delší čas na vyzrávání a ležení. Třísloviny jakožto antioxidant nám chrání víno. Dokáží se navázat s antokyany a tím stabilizovat barvu. Kromě antokyanů se spojují s bílkovinami, které se vysráží. Tím pádem v červených vínech bývá minimální problém s bílkovinami a není nutné jejich čiření. Třísloviny dosahují nejlepší rozpustnosti v alkoholovém roztoku. Proto dochází k největšímu uvolňování až během fermentace a pokračuje i během zrání vína a ležení. Při ležení v dřevěných sudech dochází k uvolňování pyrogalových tříslovin. Jejich organoleptický projev je spíše sladký na rozdíl od projevu tříslovin z hroznů. Kvantitu a kvalitu gallových tříslovin lze očekávat hlavně u nových dřevěných sudů. Počtem použití se množství uvolněných tříslovin ze dřeva klesá. Nový sud o objemu 225 l může difuzovat zhruba 200 mg/l hydrolyzovatelných tříslovin. (Michlovský 2014) 17

Přídavek tříslovin je dle naších předpisu povolen, pokud je jejich původ výhradně z hroznů. Vinařské třísloviny jsou tvořeny řetězci epikatechinu 60 %, katechinu 20-25 %, galátepikatechin 5-20 % a epigalátkatechinem 0-10 %. Využívají se k čiření červených vín a zbavení se tak přebytečné bílkoviny. Podle nařízení (ES) č. 606/ 2009 je povolen přídavek 5-25 g*hl -1 enotříslovin ( tříslovin z hroznů révy vinné) a je povolen přídavek kousků dubového dřeva o velikosti nad 2 mm. Flavonoidy Sloučeniny s centrálním skeletem a sumárním vzorcem C 6 -C 3 -C 6. Tyto sloučeniny tvoří jednu z nejvýznamnějších skupin fenolických sloučenin. Patří sem antokyany, flavonoly, flavony, flavonony a flavanonoly. Flavonoidy bývají často vázané jednou nebo více molekulami glukózy. Takto vzniklé jednotky se pak nazývají glukosidy. Právě tato přítomnost glukózových jednotek zapříčiňuje větší rozpustnost ve vodně- alkoholickém prostředí. Flavonoidy ve víně způsobují hořkost. Flavonoly a flavony Flavonoly a flavony jsou jakožto žluté pigmenty přítomné ve slupce jak bílých tak modrých hroznů. Vyskytují se jako sloučeniny kamferolu, kvercentinu, miricentinu a isoramnetinu s cukernými jednotkami. Tyto glukosidy jsou následně v průběhu vinifikace rozloženy a hydrolyzovány na centrální strukturu tzv. aglykon a cukernatou jednotku. Proto ve víně nalézáme jen volné aglykony flavonolů. V červených vínech se jejich obsah pohybuje od 20-100 mg*l -1. V bílých vínech je jejich množství mnohem nižší, a to 1-3 mg*l -1. Flavony tvoří jen minoritní skupinu flavoidních sloučenin. Jejich struktura je odvozena ze struktury flavonolů a svůj původ mají ze slupek hroznů a listů révy vinné. Flavanonolyny a flavonony Ve víně se vyskytují jen v malém množství, v řádu desítek miligramu na litr. Zastoupeny jsou ve slupkách bílých odrůd. Jedná se o taxifolin nebo dihydrokvercentin, který bývá i nejčastěji identifikovaný flavonoid v hroznech a víně. 18

Flavanony nemají svůj původ spojený s hrozny révy vinné, ale vyskytují se ve vínech, která ležela v dřevěných sudech. Mezi hlavní zástupce patří eriodictyol a naringenin. (Michlovský 2014; Ribéreau-Gayon et al. 2006b) Antokyany Jedná se o červené pigmenty ovoce (hroznů, borůvek). Jejichž výskyt je prokázán i na listech rostlin. Antokyany v přírodě jsou hlavně v glykosidické formě. Podle počtu jednotek cukru navázaných na aglykon dělíme antokyany na monoglukosidy a diglukosidy. Ušlechtilé evropské odrůdy obsahují hlavně monoglukosidy a jen nepatrné množství diglukosidů. Za to americké odrůdy a hybridy z nich stvořené obsahují obě formy antokyanů. Do antokyanu v monoglukosidické podobě patří cyanidin-3-glukosid, delfinidin-3-glukosid, petunidin-3-glukosid, malvidin-3-glukosid a peonidin-3-glukosid. Největší obsah z monoglukosidů má malvidin-3-glukosid, a to až 70 %. U diglukosidů se setkáváme s nejčastěji s malvidin-3,5-diglukosidem. Obr. 2 Antokyany zdroj:http://www.icpf.cas.cz/cs/system/files/users/public/bendova_8/anthokyan.png 19

V hroznech antokyany obsahují hlavně buňky slupky. Jejich množství stoupá ve směru k povrchu hroznové bobule. Mimo slupku se vyskytují v dužnině, a to hlavně u odrůd označovaných jako barvířky. Přesná barva antokyanů závisí na ph vína a obsahu SO 2 ve víně či moštu. Po skončení vinifikace se vyskytují antokyany ve volném stavu a začínají se slučovat s tříslovinami nebo se sloučí s kalovými částmi, případně vysrážejí a z vína při stočení definitivně zmizí. U mladých červených vín se jejich obsah pohybuje od 200 do 500 mg*l -1. V průběhu prvních tří měsíců se může ztratit až 50 % antokyanu obsažených ve víně, ale i poté dochází ke ztracení antokyanů, až se nakonec stabilizuje množství na 10 až 20 mg*l -1, jak můžeme vidět v tabulce. U bílých vín to bývá jen stopové množství. (Michlovský 2014; Farkaš 1983; Ribéreau-Gayon et al. 2006b; Pavloušek 2011) Tab. 3 Skupina fenolických látek (Pavloušek 2010) 20

3.3 Studená macerace V dnešní době se jedná o stále více využívanou technologii pro před-fermentační maceraci rmutu. V podstatě se jedná o rychlé zchlazení pomletých a odstopkovaných hroznů na teplotu pod 5 C a následné udržení macerační teploty po dobu 5 až 15 dnů. Vzhledem k nízké teplotě nedochází k fermentaci a látky obsažené v bobulích (ve slupce a dužnině) jsou intenzivně extrahovány ve vodném roztoku. Takto se do rmutu uvolňují aromatické látky, flavanoly, taniny a antokyany. Po ukončení samotné fermentace a následně po fermentační maceraci se do alkoholového roztoku uvolňují hlavně proantokyanidiny ze semen hroznů. Díky využití této macerační technologie dosahují vína lepší celkové aromatické komplexnosti vín, plnější odrůdové chuti a vyšší stabilnější barvy u červených vín. Dosahují i vyšší stability vůči oxidaci než u vín vyrobených bez použití studené macerace. V provozech se k použití studené macerace a kryomacerační technologie využívá více metod. Mezi nejvíce používanou metodu zchlazení v praxi patří využití suchého ledu. Ten při aplikaci na rmut nebo hrozny sublimuje a vzniká plynný oxid uhličitý. Oxid uhličitý je těžší než vzduch, a díky této vlastnosti dochází k vytlačení kyslíku od hroznů nebo rmutu, které jsou tak chráněny od nežádoucí oxidace. Jeho značná výhoda je hlavně pro menší podniky, a to díky nízké pořizovací ceně a menší náročnosti na prostor, než je tomu například u jiných metod. Nevýhodou je ale neustálá sublimace a tím i každodenní ztráta zhruba 10 % z nádob na uskladnění. Nebezpečná je i manipulace s ním. Musí se věnovat velká pozornost bezpečnosti práce a ochranným pomůckám. Mezi další metody patří využití chladicích boxů, chladícího dvouplášťového tanku nebo chlazení tepelným výměníkem. Možnosti představují i chlazení plynným CO 2 nebo tekutým dusíkem (N 2 ). 3.3.1 Macerace modrých odrůd Při výrobě červených vín dochází zpravidla k delšímu kontaktu slupek a semínek s moštem. Během macerace dochází k přechodu jednotlivých složek obsažených v matolinách do moštu. Hlavně se jedná o aromatické složky a fenolové sloučeniny (přesněji antokyany a třísloviny). U studené macerace dochází k opožděnému nástupu fermenta- 21

ce vlivem nízké teploty a lehkým zasířením (20 mg*l -1 ), kdy po zchlazení na 5 C se hrozny udržují při této teplotě 5 až 15 dnů. Teplotním šokem dochází k rozpraskání stěn buněk a následně dochází k mikrobuněčné maceraci. Posléze je uvolněna intenzivně zbarvená šťáva. Po ohřevu se provádí vinifikace normální klasickou metodou. Studená macerace se provádí proto, že dochází k vyšší extrakci fenolových sloučenin (hlavně barviv), aromatických látek a zvyšuje se také ionizační index. Takto vytvořená vína mají lepší barevnou stabilitu. To zapříčiňuje vyšší množství polymerizovaných taninů.(álvarez et al. 2006; Gardner et al. 2011; Michlovský 2015) Pro použití studené macerace ve výrobě červených vín, bylo uskutečněno mnoho výzkumů. Zkoumaných bylo mnoho odrůd a bylo dosaženo různých výsledků. U odrůdy André bylo prokázáno výzkumem Ševcecha a kolektivu, že studená macerace má pozitivní vliv na zvýšení antokyanů a polyfenolů oproti kontrole. Při použití studené macerace došlo i k zlepšení stability barvy. U odrůd Tannat, Syrah a Merlot prokázal Gustavo Gonzalez-Neves s kolektivem, že k vyšší extrakci antokyanů došlo jen u odrůd Tannat a Merlot. Odrůda Syrah vykazovala vyšší hodnoty u kontroly než u studené macerace nebo za použití pektolytických enzymů. (Ševcech et al. 2015; González-Neves et al. 2016) S odrůdami Syrah a Cabernet Sauvignon provedli také výzkum Gil-Munoz a kolektiv. Došli k podobnému zjištění s odrůdou Syrah, která dosahovala lepších výsledků za použití kryoselekce než studené macerace. Na rozdíl od Cabernetu Sauvignonu, který dosáhl vyššího množství antokyanů u studené macerace. Odrůda Syrah má pevnější buněčnou strukturu jader ve slupce a tím pádem dosahuje lepších výsledků extrakce zmražením. Během zmražení dochází k roztržení buněčné stěny a dojde tak k vyšší extrakci látek než jen u studené macerace nebo za použití enzymu. (Gil-Muñoz et al. 2009) Zajímavý výzkum provedli čínští vědci Jun Wang, Sufang Huo, Yuxiu Zhang, Yaping Liu a Weixin Fan, kteří zkoumali u odrůd Cabernet Sauvignon, Merlot a Cabernet Franc využití studené macerace, macerace při vysokých teplotách a pektolytických enzymů. Zjistili, že všechny varianty výroby vedli ke zlepšení a vyšším hodnotám barviv, tříslovin a flavonoidům. Další výzkum provedl L. Federico Casassa s kolektivem, kdy srovnával odrůdy Barbera D'Asti, Cabernet Sauvignon, Malbec, Merlot, Pinot Noir a Syrah. Došli k závěru, že v současném globálním kontextu nízko nákladových vinařství 22

je používání oxidu uhličitého k provádění studené macerace u červených vín málo efektivní. Měla pouze mírný (i když pozitivní) vliv na chromatické vlastnosti vína z odrůd Barbera D'Asti a Cabernet Sauvignon, ale neměla žádný vliv na vína odrůd Malbec, Merlot, Pinot Noir a Syrah ani po chemické analýze a smyslové analýze. Použití suchého ledu u studené macerace způsobuje mírné až drobné změny v chemickém a smyslovém složení vína, která s největší pravděpodobností nebude převyšovat náklady a logistiku spojenou s jeho aplikací. (Wang et al. 2016; Casassa et al. 2015) Na rozdíl od předchozího výzkůmu v studii pana Heatherbella s kolektivem došlo u odrůdy Rulandské modré studenou macerací k lepším výsledkům. Při maceraci kolem 4 C bylo dosaženo vín se sytější a vyšší barvou a zároveň méně hořkých vín než u macerace při vyšší teplotě. (Heatherbell et al. 1996) Celkově by se dalo říct, že použití studené macerace je přínosné pro zvýšení množství antokyanů, tříslovin a aromatických látek. Aplikace vede k lepší stabilitě barev, vyšší plnosti a tělnatosti vína. Je potřeba se rozhodnout u jakých odrůd se použije studená macerace. U některých odrůd je aplikace studené macerace zbytečná a drahá, příkladem může být odrůda Syrah. Z modrých odrůd je možné vyrábět i růžové víno. Použití studené macerace je možné i při výrobě růžových vín. Mělo by se jednat o kratší macerace v rámci několika dnů. Při snížení teploty dochází ke zpomalení extrakce barviv do moštu. Je možné lépe kontrolovat množství uvolněných barviv a také intenzitu barvy, jaká je vyžadována pro výrobu rosé vín. Při výrobě je nutná kratší macerace než například u výroby červených vín. Ke stejnému závěru dospěl i pan Holešinský ve své diplomové práci Využití suchého ledu v technologii vín révy vinné. V jeho pokusu šlo o srovnání růžového a červeného vína vyrobených z odrůdy Frankovka při aplikaci 14 denní studené macerace. U obou barevnostních variant vín byly shledány výhody použití studené macerace. Avšak u vína růžového byla doporučená kratší macerace než 14 dnů. Hlavně díky vysoké extrakci barviv, těžší vůni sušeného ovoce až zelených tónů. Celkově bylo provedeno i mnoho dalších zahraničních studií na použití studené macerace při výrobě růžových vín. Pan Salinas s kolektivem provedl experiment s odrůdou Monastrell. V experimentu srovnával různé teploty macerace. Došel k závěru, že víno vyrobená s macerací při teplotě 15 C dosahují intenzivnější barvy. Mají vysoké množství malvidin-3-glukosidu, 23

který má dominantní zastoupení (80 %) v antokyanech. Tyto vína měla též nižší obsah ethylacetátu a alkohol. Na rozdíl od vína vyrobeného s použitím macerace při 5 C, které dosahovalo nižší barvy a většího obsahu esterů. Po senzorické stránce tato vína obdržela nejnižší hodnocení. (Salinas et al. 2005; Holešinský 2017) Jiný experiment provedl E. Puértolas s kolektivem, který dospěl k podobným závěrům. Pro vína, která mají vyšší zastoupení antokyanů, stanovili rozmezí teplot pro maceraci na 12 až 15 C. Pro vína s vyšší ovocností, svěžestí a množstvím antokyanů doporučují maceraci při teplotě kolem 5 C a využití pulzního elektrického pole. (Puértolas et al. 2011) Pulzní elektrické pole je relativně nová technologie, která se začíná uplatňovat v zahraničí. Daný technologický proces je založený na využití vnějšího elektrického pole, jenž vyvolá elektroporaci v eukaryotických buněčných membrán. Vzniknou póry v membránách buněk a ty jsou využívány ke zvýšení difuze rozpuštěných látek ven z buněk. Permeabilizace buněk membrány lze dosáhnout mírným elektrickým polem (<10 kv.cm -1 ) a nízkou specifickou energii (<10 kj.kg -1 ). (Puértolas et al. 2011; Corrales et al. 2008; Puértolas et al. 2010) 3.3.2 Macerace bílých odrůd Pokud srovnáváme s našimi tradičními bílými víny, tak se při výrobě bílých vín nepoužívá zpravidla dlouhé macerace, jako je tomu u výroby vín červených. V provozních podmínkách se setkávám s macerací v řádu hodin, nejčastěji do 48 hodin. V této době se do moštu rozpouští aromatické látky, polyfenoly, dusíkaté látky a mnoho dalších. Prodloužením doby macerace a snížením teploty dochází k vyšší extrakci látek než u klasické macerace, což potvrzují výsledky mé bakalářské práce Vliv různých technik studené macerace na obsahové látky vína. Zde byl proveden pokus s odrůdou Ryzlinku rýnského a získalo se lepší struktury, tělnatosti a odrůdového aroma. Nutno zmínit, že je potřeba najít ideální poměr mezi teplotou a časem macerace, kterému se dále věnuji v následující podkapitole. Při ideálním poměru dochází k extrakci žádoucích polyfenolů z třapin a semen, bohužel při moc dlouhé maceraci se začnou extrahovat i nežádoucí polyfenoly, které mají trpké a hořké tóny. 24

3.3.3 Nalezení ideálního poměru teploty a času Určení teploty a délky macerace nám tvoří jednu z velice důležitých rozhodnutí, o tom jaké budoucí víno bude. Je třeba zvolit podle stavu suroviny, její vyzrálosti a také požadovanému stylu vína. Množství extrahovaných látek bývá často velmi závislé na kombinaci těchto dvou parametrů macerace. Látky ve víně jsou poutány rozdílnou silou a jejich uvolňování tak probíhá v různorodém časovém rozpětí. Lze říci, že extrakce taninových látek probíhá pomalu, vzhledem k nutnosti degradace pektinové lamely. Naproti tomu extrakce antokyanových látek probíhá velice snadno a rychle. Vzhledem k tomu, že je nepřítomen alkohol, se formují barviva s vyšší molekulární hmotností, které jsou stabilnější. Druhým atributem pro zrychlení /zpomalení extrakce látek je teplota dané macerace. S vyšší teplotou se zkracuje čas pro extrakci látek. Naopak s nižší teplotou je potřebný delší čas k extrakci látek. Obr. 3 Extrakce flavonoidů (A) a neflavonoidů (B) u odrůdy Chardonnay (Jackson 2014) Vlivem použití kratší před-fermentační macerace v řádu 3-5 dnů při teplotě od 4-15 C nám dochází k pomalé progresivní extrakci antokyanů, kterou můžeme ještě podpořit přídavkem oxidu siřičitého. Typický přídavek kolem 50 mg*l -1 oxidu siřičitého. Přídavek oxidu siřičitého nám zajistí ještě vyšší extrakci antokyanů. Zároveň prodlouží extrakci taninových látek. Tato metoda, jak píše pan Jackson, zvýší stabilitu barvy a pozitivně ovlivňuje senzorické vlastnosti, nicméně po 2 letech se intenzita barvy vrací na stejnou úroveň jako je u vína vyrobeného tradičním postupem. (Jackson 2008) 25

Bylo provedeno mnoho výzkumů na toto téma s různými časovými a teplotními variantami. (Gómez-Plaza et al. 1999; Gil-Muñoz et al. 2009; González-Neves et al. 2016; Ortega-Heras et al. 2012; Salinas et al. 2005; Heatherbell et al. 1996) Gomez-Plaza s kolektivem v roce 1999 použil odrůdu Monastrel, tuto odrůdu zchladil na teplotu 10 C po dobu 5 dnů. O rok později pan Gomez- Plaza s kolektivem testoval různou délku macerace a to 4, 5 a 10 dnů při teplotě 10 C. V obou studiích dospěli k závěru, že ideální je teplota 10 C a delší macerace po dobu 10 dnů, kdy došlo k pozitivnímu ovlivnění antokyanové koncentrace a chromatické charakteristice. (Gómez-Plaza et al. 1999, 2001) Pan Ševcech s kolektivem provedl v roce 2015 výzkum, kdy srovnával kryomaceraci odrůdy André s normální macerací a termovinifikací. Kryomacerace po dobu 4 dnů při teplotě 4 C vyšla ve srovnání nejlépe. Dosáhla pozitivního ovlivnění koncentrace antokyanů a obsah všech polyfenolů. (Ševcech et al. 2015) Nel s kolektivem v roce 2014 srovnávali kryomaceraci při 15 C po dobu 3 dnů s použití enzymů a po-fermentační maceraci. Došli k závěru, že ačkoliv došlo k pozitivnímu efektu na extrakci antokyanů, tak použití pektolytických enzymů je mnohem efektivnější. K podobnému závěru dospěli ve své studii pan Wang s kolektivem. Srovnávali kryomaceraci, termovinifikaci, použití enzymů s kontrolním vzorkem. (Nel et al. 2014; Wang et al. 2016) 3.3.4 Metody zchlazení Způsobů, jak rychle a účinně zchladit hrozny, rmut, nebo mošt je hned několik. Některé jsou více efektivnější jiné zase méně. V této kapitole si srovnáme jednotlivé metody a jejich výhody a nevýhody v použití. Mezi malými a středními vinařskými podniky je nejoblíbenější zchlazení pomocí suchého ledu nebo plynným oxidem uhličitým. Tyto metody mají počáteční náklady relativně nízké. Dalšími možnostmi jak zchlazovat je využití tepelného výměníku, chladícího dvouplášťového tanku, chladícího boxu nebo lze chladit tekutým dusíkem. V praxi jsem se setkal u malých a středních podniků s využitím suchého ledu a u velkých podniků s chlazením pomocí tepelného výměníku a chladících dvouplášťových tanků. 26

Suchý led Je to pevná forma oxidu uhličitého (CO 2 ). Pojem suchý nám představuje jeho vlastnosti, a to že nevytváří kapalné skupenství při aplikaci. Při teplotě -78,48 C rovnou sublimuje do plynného skupenství. Ve zkrácené verzi se suchý led vyrábí expandací oxidu uhličitého za vzniku jemného prášku (sněhu), který je následně protlačován matricemi. Protlačením dochází k zhuštění a slisování do dané formy suchého ledu. Těchto forem je několik. Suchý led můžeme vytvořit ve formě bloků s váhou 1 10 kg, plátků, pelet nebo nuget s průměrem 3 10 mm a délkou 10 30 mm. Pro představu se můžeme podívat na obrázek 5 suchý led forma nuget (Burg, 2014) Obr. 4 Suchý led forma nuget (Burg 2014) Na samotnou výrobu kilogramu suchého ledu se použije 541 litrů oxidu uhličitého. Cena se momentálně pohybuje od 18 Kč do 40 Kč v závislosti na výrobci a celkovém odebraném množství. Suchý led se uchovává při nízkých teplotách kvůli zamezení ztrát. Pro přepravu se používají speciální kontejnery, jak vidíme na obrázku č. 6 nebo v menších odizolovaných nádobách. Celkově je možné v těchto přepravních nádobách transportovat 5 až 350 kg, nevýhodou je, že nejsou plynotěsné a dochází tak ke ztrátám kolem 10% denně. (www.linde-gas.cz; www. spektro.cz; Burg 2014) 27

Obr. 5 Přepravní kontejner (www. spektro.cz) Suchý led se využívá hojně nejen ve vinařství, ale i v potravinářském průmyslu, jako součást cateringu pro vytvoření kouřových efektů sublimací. Kromě toho se hojně využívá v chemickém průmyslu, k metodě tryskáním suchým ledem, která slouží k čištění materiálů či trubek. Setkat se s ním mohou i žáci na školách při výuce chemie, kde se využívá k různým pokusům. Vlastnosti suchého ledu : nejedovatý a hygienicky nezávadný, nezápalný, nedýchatelný bez projevu chutě a vůně velmi účinné chladivo, proto se využívá hojně ve vinařství, rychlým zchlazením se inhibuje enzym polyfenoloxidáza neobsahuje choroboplodné zárodky, je bakteriostatický při sublimaci vytlačuje vzdušný kyslík přímou sublimací nedochází k tání a tím pádem nezanechává mokré stopy a nedochází tak k poškození zboží nebo obalu Pro zchlazení o 1 C se ve vinařských podnicích požívá zhruba 800-1000 g suchého ledu na 100 kg moštu. Zajímavou úvahou je, pokud by střední nebo větší vinařský podnik investoval a jímal by z fermentujícího moštu plynný CO 2, ten by pak přeměnil na suchý led a dále ho využíval při zpracování hroznů révy vinné. Jímaný plynný oxid uh- 28

ličitý by se musel zkapalnit a přeměnit pomocí peletizéru na suchý led. V naší republice je dostupných několik variant peletizérů v cenovém rozpětí od 1,5 až po 3,2 milionů Kč bez DPH. Jednotlivé typy se liší množstvím vyrobeného suchého ledu. Peletizéry dodává firma Sedláček s.r.o.. Jednotlivé typy: Typ KÄRCHER IP 55- výroba suchého ledu 55 kg*h -1,pořizovací cena kolem 1,5 mil. Kč bez DPH. Typ KÄRCHER IP 120- výroba suchého ledu 120 kg*h -1, pořizovací cena kolem 2,33 mil. Kč bez DPH. Typ KÄRCHER IP 220- výroba suchého ledu 220 kg*h -1, pořizovací cena kolem 3,2 mil. Kč bez DPH. Chladicí box Jedná se o chlazení v klimatizované místnosti. Do této místnosti se pak dováží celé hrozny v bednách nebo kontejnerech. Chlazení je zde mnohem pomalejší v porovnání s okamžitým zchlazením při použití suchého ledu. K moštu nebo rmutu by zde byl i přístup kyslíku a musel by se chránit přídavkem plynu, který by kyslík vytlačil, a nebo sířením. Z tohoto důvodu není vhodný pro chlazení rmutu a moštu. Samotná místnost musí být dobře izolovaná, ať už vezmeme v úvahu stěny nebo dveře. Samozřejmostí pro udržení požadované teploty je dostatečná klimatizační jednotka nebo jejich sestava. Pro dobrou manipulaci by neměli chybět dostatečně velké dveře, kterými je možné projet s kontejnery na paletovém vozíku. Pokud si představíme, jak by byla velká počáteční investice a také náklady na provoz, zjistíme, že tato metoda zchlazení nemá velké zastoupení mezi vinaři. Nevýhodou této metody je pouze sezonní využití. (Ortega-Heras et al. 2012; Heredia et al. 2010; Burg 2014) Chladicí dvouplášťový tank V dnešních moderních vinařstvích docela hojně využívaná metoda chlazení během fermentace. Existuje mnoho typů dvouplášťových tanků nebo využití dvoupláště ke chlazení rototanků nebo vinifikátorů pro výrobu červených vín. Pro uchlazení fermentace nám stačí obyčejná proudící voda. Výhodou této metody je, že pokud se nahradí gly- 29

kol za vodu, můžeme použít tyto nádoby na studenou maceraci. Mezi další výhodu můžeme považovat, že dvouplášťový tank nemusí být používán jen sezónně. Jedná se totiž o normální nádobu, která může být plně využívaná během celého roku. Mezi nevýhody tohoto chlazení můžeme řadit nerovnoměrné chlazení homogenní směsi. To postupuje směrem od pláště tanku ke středu tanku. Tepelný výměník Tato metoda je využívaná u větších vinařství. Obzvláště pokud využívají pro dopravu rmutu nebo moštu potrubí. V tomto případě je zařazen tepelný výměník na začátku potrubí a surovina, která jím proudí, se rychle zchladí v rámci minut. Používá se i jako první zchlazení suroviny a dále je využíváno dalších metod chlazení. Ať už plnění do boxpalet a jejich převoz do chladících boxů nebo následné načerpání do chladícího dvouplášťového tanku. Možné je i snížení teploty před použitím suchého ledu. Nevýhodou této metody je nešetrnost ke rmutu a možné snížení kvality během čerpaní a tření uvnitř soustavy.(burg 2014) Vstřikování plynného CO 2 Vstřikování plynného oxidu uhličitého je, stejně jako použití suchého ledu, vysoce efektivním chladícím prostředkem. U nás je tato metoda méně využívanou. V zahraničí se s ní setkáme častěji. Například v Austrálii se využívá k chlazení při přepravě sesbíraných hroznů. Hrozny zde putují velké vzdálenosti, než se zpracují, aby tak vinohradníci zabránili oxidaci a ztrátě kvality, využívají tuto metodu chlazení. Výhodou této metody je odpadnutí problému se skladováním, jaký je u suchého ledu. A snadná transportovatelnost tlakové láhve a vstřikovací pistole. U této metody nejsou ani vysoké počáteční náklady. Ty představuje pouze pořízení tlakové láhve, vstřikovací pistole a ochranných pomůcek. Nevýhodou je dražší provoz, cena za 1 kg plynného oxidu uhličitého se zde pohybuje kolem 50 Kč, podle odebraného množství. Samotná metoda spočívá v tom, že kapalný oxid uhličitý se mění vstřikováním na plynný a z vstřikovací pistole vychází plynné CO 2, které vytlačuje kyslík a sníh. (Burg 2014) Další možností využití kapalného oxidu uhličitého je kryomacerační linka. Její prototyp zveřejnil pan Carillo s kolektivem v roce 2011. Tento prototyp dokázal zpracovat 2-3 tuny za hodinu. Samotná linka by měla začínat násypkou a dále pokračovat uzavře- 30

ným vibračním stolem. V uzavřeném vibračním stole by se nacházely trysky pro vstřikování kapalného oxidu uhličitého, tak aby byl celý prostor zaplněn plynným CO 2 a byla dosažena teplota - 20 C. Tato teplota by při rychlosti posunu hroznů 0,5 m*s -1 zajistila ochlazení hroznů na teplotu 9,8 C. Za vibrační pás by byl dále napojen pásový dopravník s nastavitelným sklonem, který by dopravoval zchlazené hrozny do mlýnkoodstopkovače. Oxidace hroznů by zde byla minimalizována díky tomu, že hrozny jsou celou dobu obklopeny oxidem uhličitým. Celá soustava by měla být důkladně odizolována pro minimalizaci teplotních ztrát a vyrobená z nerezové ocele pro snadnou sanitaci. Samozřejmostí jsou i teplotní čidla pro efektivní dávkování CO 2. Celý prototyp je možné si prohlédnout na obrázku č..(burg 2014; Carillo et al. 2011) Obr. 6 Kryomacerační linka: (1) násypka; (2) soustava trysek pro CO2; (3) vibrační stůl; (4) soustava trysek pro CO2; (5) pásový dopravník; (6) otvor s teploměrem; (7) mlýnkoodzrňovač (Carillo et al. 2011) Tekutý dusík (N 2 ) Další možnost jak zchladit rmut nebo hrozny představuje použití tekutého dusíku. Tekutý dusík má bod varu -196 C a k chlazení hroznů je málo využívaný pro svou velmi nízkou teplotu. Při kontaktu dochází ihned k izotermickému šoku. Velkou nevýhodou je vysoké poškození a vznik velkého množství kalových částic. Cena za 1 litr se pohybuje kolem 230 Kč. 31

4. Praktická část 4.1 Surovina Rulandské modré Rulandské modré nebo-li Pinot Noir je starobylá francouzská odrůda pravděpodobně pocházející z oblasti Burgundska. Ačkoliv není křížení přesně známo, nejnovější studie říkají, že by se mělo jednat o příbuznou odrůdu v přímé linii divoké révy Vitis Vinifera. Původně se myslelo, že se jedná o křížence Tramínu červeného a Pinot Meunier. Posléze se zjistilo, že Pinot Meunier je mutací odrůdy Pinot Noir. (Boss a Thomas 2002) Že je odrůda opravdu starobylá nám dokládá i fakt, že se pěstovala na území dnešní Francie už v době Římské říše. Postupně se rozšířila do celého světa a dnes ji najdeme aspoň minoritně zastoupenou ve všech významných vinařských oblastech. Nejvíce proslavenou pěstující oblastí je právě Burgundsko ve Francii. Pinot Noir se nepoužívá jen k výrobě červených vín či rosé vín. Je také jednou z povolených odrůd pro výrobu šampaňského. Není tedy divu, že druhou nejslavnější oblastí ve Francii je pravě Champange. K nám se dostala pravděpodobně až po vládě Karla IV, který se zasloužil o rozvinutí vinařství a o import burgundských odrůd. Samotné slovo Pinot vzniklo totiž jen 3 roky před jeho smrtí. Po Evropě se tato odrůda rozšířila v 15. a 16. století a byla synonymem velké kvality. (Žůrek 2017) Z ampelografického hlediska jsou listy malé až středně velké. Listy jsou mělce pětilaločnaté, výjimečně trojlaločnaté. Řapíkový výkrojek je lyrovitý a úzce otevřený. Vrchol mladého letorostu je bělavě zelený. Mladé listy jsou hnědavé a ochlupené. Hrozen je malý až střední, nejčastěji válcovitého tvaru. U některých klonů Rulandského modrého mohou být hrozny větší a u základu třapiny více rozvětvené. Uspořádání bobulí v hroznech je husté. Bobule je malá nejčastěji kulatá, u některých klonů je lehce oválná. Barva slupky je tmavomodrá s voskovitým ojíněním. Dužnina je šťavnatá. Rulandské modré má velmi vysoké požadavky na polohu. Za nejvhodnější polohy se považují svahovité pozemky s dobrou expozicí ke slunečnímu záření. Nemá ráda vlhké ani příliš suché půdy. Vhodné půdy jsou záhřevné, vápenité, typem štěrkovité s hlinitými částicemi nebo kamenito-štěrkovité a kamenito-písčité. V těžkých půdách 32

dobře plodí, ale s nižší intenzitou barvy. Tuto odrůdu je možné vzít jako skvělý příklad velkého vína z vynikajícího terroir. Z Rulandského modrého se vyrábí především vysoce kvalitní přívlastkové vína. Fenolická zralost a cukernatost jsou u většiny ročníků vyhovující pro výrobu vína metodou dlouhé macerace, díky které dochází k zvýšení kvality výsledného vína. Důležitou součástí při výrobě vín z Rulandského modrého je makrooxidace. Ta už v průběhu macerace vede k vyšší stabilizaci barvy. Při dlouhé maceraci často dochází i k odbourávání kyseliny jablečné malolaktickou fermentací. Následně je pro zvýšení kvality vhodné provádět mikrooxidaci nejlépe v sudech. Optimální obsah alkoholu u těchto vín se pohybuje okolo 13 % obj. alkoholu. Vína bývají světlejší granátové až cihlové barvy, díky nižšímu obsahu antokyanových barviv. Aroma vína je výrazně ovocné s tóny lesního ovoce, višní a sušených švestek. Vína jsou obvykle hodně extraktivní s lehkou příjemně zaoblenou chutí taninů. Vína jsou vhodná pro archivaci. Z Rulandského modrého se často vyrábí i rosé vína a klarety. Je také jednou z povolených odrůd pro výrobu šampaňského. 4.2 Metodika Technologie přípravy: Hrozny byly nasbírány na vinici Školního statku Lednice dne 22.9.2016 do plastových červených beden do hmotnosti 30 kg. Odtud byly převezeny a následně zpracovány ve školním sklepě Zahradnické fakulty Mendlovy univerzity v Brně. Hrozny byly rozděleny podle délky kryomacerace. 33

Schéma: 4.2.1 Kontrola Hrozny určené pro kontrolu byly pomlety a odstopkovány. Poté byl rmut doslazen 1,4 kg cukru a inokulován kvasinkami Saccharomyces cerevisiae, pod obchodní značkou Oenoferm Rouge. Došlo ke kvašení v délce 24 dnů a ponechání postfermentační macerace po dobu 10 dnů. Dne 27.10.2016 byl vylisován kontrolní vzorek, který se naočkoval bakteriemi Oenococcus oeni pro malolaktickou fermentaci. Po ukončení malolaktické fermentace došlo k míchání na kvasničných kalech. Dne 20.6.2017 bylo víno staženo z kalů a zasířeno na 30 mg*l -1 volného oxidu siřičitého. Do lahvování dne 30.10.2017 došlo ještě ke dvěma přidáním oxidu siřičitého a to dne 24.8.2017 o 15 mg*l -1 a 30.9.2017 o 10 mg*l -1 oxidu siřičitého. 4.2.2 Varianta 3 denní studené macerace Hrozny určené pro variantu 3 dnů kryomacerace byly pomlety a odstopkovány. Poté byl rmut doslazen o 1,4 kg cukru a okamžitě zchlazen přídavkem suchého ledu v množství 6,6 kg. Došlo ke zchlazení z teploty 21,5 C na teplotu mezi 3-4 C. V průběhu kryomacerace byla udržována teplota pomocí chlazení a kontrolována co 12 hodin. Po třech dnech 25.9.2016 byla varianta ohřátá na teplotu 18 C a zakvašena kvasinkami 34

Saccharomyces cerevisiae (Oenoferm Rouge). Následně došlo ke kvašení v délce 21 dnů a ponechání postfermentační macerace po dobu 10 dnů. Dne 27.10.2016 byla vylisována varianta 3 dnů kryomacerace a naočkována bakteriemi Oenococcus oeni pro malolaktickou fermentaci. Po ukončení malolaktické fermentace došlo k míchání na kvasničných kalech. Dne 20.6.2017 bylo víno staženo z kalů a zasířeno na 30 mg*l -1 volného oxidu siřičitého. Do lahvování dne 30.10.2017 došlo ještě ke dvěma přidáním oxidu siřičitého a to dne 24.8.2017 o 15 mg*l -1 a 30.9.2017 o 15 mg*l -1 oxidu siřičitého. 4.2.3 Varianta 7 denní studené macerace Hrozny určené pro variantu 7 denní kryomacerace byly pomlety a odstopkovány. Poté byl rmut doslazen o 1,4 kg cukru a okamžitě zchlazen přídavkem suchého ledu v množství 6,6 kg, došlo ke zchlazení z teploty 21 C na teplotu mezi 4-5 C. V průběhu kryomacerace byla udržována teplota pomocí chlazení a kontrolována co 12 hodin. Po sedmi dnech 29.9.2016 byla varianta ohřátá na teplotu 18 C a zakvašena kvasinkami Saccharomyces cerevisiae (Oenoferm Rouge). Následně došlo ke kvašení v délce 22 dnů a ponechání postfermentační macerace po dobu 9 dnů. Dne 3.11.2016 byla vylisována varianta 7 denní kryomacerace a naočkována bakteriemi Oenococcus oeni pro malolaktickou fermentaci. Po ukončení malolaktické fermentace dochází k míchání na kvasničných kalech. Dne 20.6.2017 bylo víno staženo z kalů a zasířeno na 30 mg*l -1 volného oxidu siřičitého. Do lahvování dne 30.10.2017 došlo ještě ke dvěma přidáním oxidu siřičitého a to dne 24.8.2017 o 10 mg*l -1 a 30.9.2017 o 15 mg*l -1 oxidu siřičitého. 4.2.4 Varianta 14 denní studené macerace Hrozny určené pro variantu 14 denní kryomacerace byly pomlety a odstopkovány. Poté byl rmut doslazen o 1,4 kg cukru a okamžitě zchlazen přídavkem suchého ledu v množství 6,6 kg, došlo ke zchlazení z teploty 21 C na teplotu mezi 4-5 C. V průběhu kryomacerace byla udržována teplota pomocí chlazení a kontrolována každých 12 hodin. Dne 6.10.2016 byla varianta ohřátá na teplotu 18 C a zakvašena kvasinkami Saccharomyces cerevisiae (Oenoferm Rouge). Následně došlo k nejkratšímu kvašení, a to v délce 18 dnů a ponechání postfermentační macerace po dobu 10 dnů. Varianta 14 denní kryomacerace byla vylisována dne 8.11.2016 a naočkována bakteriemi Oenococcus 35

oeni pro malolaktickou fermentaci. Po ukončení malolaktické fermentace došlo k míchání na kvasničných kalech. Dne 20.6.2017 bylo víno staženo z kalů a zasířeno na 30 mg*l -1 volného oxidu siřičitého. Do lahvování dne 30.10.2017 došlo ještě ke dvěma přidáním oxidu siřičitého a to dne 24.8.2017 o 10 mg*l -1 a 30.9.2017 o 10 mg*l -1 oxidu siřičitého. 4.3 Metody měření U porovnání metod studené macerace bylo sledováno více parametrů. Kromě sledování ph, cukernatosti, veškerých titrovatelných kyselin, obsahu asimilovatelného dusíku (YAN) byl také sledován obsah antokyanů, celkový obsah fenolů, obsah katechinů, antiradikálová aktivita a redukční síla. U vín byla provedena celková analýza přístrojem Alpha one. Všechny prováděné měření byly uskutečněny v ústavní laboratoři vinohradnictví a vinařství na Zahradnické fakultě Mendelovy univerzity v Lednici. 4.3.1 ph Hodnota ph je formulována jako záporný dekadický logaritmus aktivity vodíkových iontů v moště nebo víně. Hodnota ph se stanovuje na základě měření potenciálu skleněné elektrody, která závisí na aktivitě vodíkových kationtů, vzhledem k referenční kalomelové elektrodě vhodným milivoltmetrem (ph - metr), kalibrovaným tlumivými roztoky o známém ph. (Balík 1998) 4.3.2 Veškeré titrovatelné kyseliny Dominantní role ve veškerých titrovatelných kyselinách hrají kyselina jablečná a vinná. Kyselina vinná je senzoricky ostřejší a kyselejší. Kyselina jablečná se senzoricky projevuje spíše nezralými zelenými tóny. (Pavloušek 2010) Zastoupeny jsou zde i další kyseliny, ale pouze minoritně, řadíme zde například kyselinu citronovou. Veškeré titrovatelné kyseliny chápeme jako sumu kyselin titrovatelných odměrným alkalickým roztokem do ph 7. (Balík 1997) 36

Potenciometrickou titrací zjišťujeme veškerý obsah kyselin. Titrujeme 0,1 M Na- OH do ph 7 na automatickém titrátoru TitroLine EASY. Postup titrace: Pipetou odebereme vzorek moštu nebo vína o obsahu 10 ml. Vzorek nalijeme do 50 ml kádinky a přidáme 10 ml destilované vody. Vzorek promícháme za pomocí elektromagnetického míchadla a za stálého míchání necháme přístrojem automaticky titrovat roztokem 0,1 M NaOH do hodnoty ph 7. 4.3.3 Asimilovatelný dusík Asimilovatelný dusík je hojně využíván kvasinkami a jeho dostatečné množství je základem pro bezproblémovou fermentaci. Základním zdrojem asimilovatelného dusíku jsou aminokyseliny. Díky jejich amfoterní povaze je těžké jej stanovit, a proto je nezbytné zablokovat formaldehydem jejich aminoskupinu. Následně je takto upravené můžeme titrovat hydroxidy. Postup titrace: Pipetou odebereme 10 ml vzorku moštu nebo vína do kádinky a zneutralizujeme jej 0,1 M NaOH. Následně přidáme 5 ml roztoku formaldehydu a titrujeme pomocí 0,01 M NaOH do slabého růžového zabarvení. (bod ekvivalence ph 8,8) 4.3.4 Teplota Měření teploty rmutu během studené macerace uskutečňujeme pomocí rtuťového teploměru. Teplota se měřila v C každý den v ranních a večerních hodinách. 4.3.5 FTIR spektrometr ALPHA WINE ATR Principem infračervené spektrometrie je absorbance infračerveného záření molekulami látek. Aby se mohlo infračervené záření absorbovat, musí jeho energie odpovídat příslušným vibračním a rotačním přechodům. Ty jsou u různých skupin atomů odlišné, proto z vlnočtu získáme informace pro kvalitativní analýzu. (Klouda 2003) Postup měření: Pomocí injekční stříkačky odebereme 1 ml vzorku a aplikujeme do spektrometru ve 3 krocích. V prvním kroku aplikujeme do přístroje 0,5 ml vzorku a spektrometr propláchneme a naředíme případné zbytky. Posléze aplikujeme do přístroje 2x po sobě 0,25 ml vzorku. U každého měření přístroj Alpa wine atr zahřál vzorek na 40 C a provedl měření s analýzou vzorku tzv. scan. Výstupem získáme hodnoty jednotlivých parametrů a graf zkoumaného spektra. 37

4.3.6 Spektrofotometrická stanovení pomocí automatického biochemického analyzátoru MIURA ONE Úprava vzorku: Vzorky vína odstředíme před stanovením jednotlivých parametrů (3000 x g; 6 min). Následně zředíme 5x ředicím pufrem o složení : 40 mm kyselina vinná, 40 mm octan sodný; 12% ethanolu. Folin Pomocí upravené metody Folin Ciocalteu stanovujeme ve víně obsah celkových fenolů. Postup: Ke 198 μl vody přidáme 12 μl vzorku a 10 μl Folin Ciocalteu činidla. Po uběhnutí 36 sekund přidáme 30 μl roztoku dekahydrátu uhličitanu sodného (20 %). Absorbanci měříme při vlnové délce 700 nm po dobu 600 vteřin. Obsah celkových fenolů stanovujeme na základě kalibrační křivky při použití kyseliny gallové jako standardu (25-1000 mg.l -1 ). Výsledky vyjádříme ve formě mg.l -1 ekvivalentů kyseliny gallové. (Waterman 1994) Anthokyany Měření celkových antokyanů provedeme SO 2 metodou. Použijeme diferenciální měření dvou činidel. Postup: K 30µl vzorku přidáme 220µl činidla. Jako první činidlo dáváme 1,1 M HCl. Jako druhé činidlo máme 0,1M K 2 S 2 O 5 s 0,2M kyselinou citronovou(so 2 ). Po 600 sekundách inkubační doby změříme absorbanci při vlnové délce 520nm. (Somers et al.1977; Zoecklein et al. 1990) Katechiny Celkové flavanoly stanovujeme na základě metody založené na reakci p- dimethylaminocinnamaldehydu (DMACA). V této metodě nedochází k interferenci s antokyaniny, oproti reakci s vanilinem, výhodou je také vyšší citlivost a selektivnost reakce. 38

Postup: Smícháme 240 μl činidla (0,1 % DMACA a 300 mm HCl v MeOH) a 10 μl vzorku, po dobu 600 vteřin necháme směs reagovat. Výslednou absorbanci směsi změříme na spektrofotometru při vlnové délce 620 nm. Na základě kalibrační křivky stanovujeme celkovou koncentraci flavanolů. Za standart si zvolíme epikatechin (10-200 mg.l -1 ). Výsledky vyjádříme jako ekvivalenty katechinu ve formě mg.l -1. (Li et al. 1996) FRAP Metoda stanovení redukční síly je založena na redukci železitých iontů. Postup: K 12µl vzorku přidáme 198 μl základního pufru (obsahující 200mM octanu sodného, který je upraven kyselinou octovou na hodnotu ph 3,6), 20µl roztoku 20 mm FeCl 3 a 20µl 10mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazin) v 40mM HCl. Ponecháme 600 vteřin a následně změříme absorbanci při vlnové délce 620 nm. Z výsledné kalibrační křivky vypočítáme redukční sílu. Jako standart použijeme kyselinu askorbovou (AA; 0,1-3mM) nebo kyselinu gallovou (GA;10-300 mg/l). Výsledky vyjádříme ve formě mmol.l -1 ekvivalentů kyseliny askorbové (mm AA), nebo ve formě mg.l -1 ekvivalentů kyseliny gallové (GA). (Raquel Pulido et al. 2000) DPPH Pro stanovení antiradikálové aktivity použijeme metodu založenou na deaktivaci 2,2-difenyl-β-pikrylhydrazylového radikálu (DPPH), který se projevuje úbytkem absorbance při vlnové délce 520 mn. Postup: K 12 μl vzorku přidáme 268 μl roztoku DPPH v methanolu (300 μm). Změříme absorbanci při vlnové délce 520 nm v čase 0 sekund a následně opět změříme po 360 sekundách. Při vyhodnocení odečteme hodnotu v čase 0 sekund od hodnoty v čase 360 vteřin. Antiradikálovou aktivitu stanovíme na základě kalibrační křivky. Jako standart můžeme použít Trolox (0,1-3mM) nebo kyselinu gallovou (GA;10-300 mg/l). Výsledky vyjádříme ve formě mmol.l -1 ekvivalentů Troloxu nebo ve formě mg.l -1 ekvivalentů kyseliny gallové (GA). (Anis Arnous et al. 2001) 39

4.3.7 Senzorické hodnocení Senzorické hodnocení proběhlo dne 24. 10. 2017 v areálu Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Lednici. Hodnotilo celkem 12 zkušených degustátorů s certifikací pro senzorickou analýzu vín podle ČSN ISO 8586-1 nebo ČSN ISO 8586-2. Vzorky se hodnotily v pořadí variant: 0 hodin macerace, 14 dní studené macerace, 3 dny studené macerace a 7 dní studené macerace. Senzoricky hodnotíme strukturu a mohutnost červeného vína, aromatický profil vín a 100 bodovou stupnici. 40

5. Výsledky Analytické hodnoty Měření na přístrojích TitroLine EASY, Alpha wine atr a MIURA ONE probíhalo ve třech opakováních. Následně byly výsledky statisticky zpracovány v programech Excel a STATISTICA. Získané výsledky přehledně uvádějí následující tabulky a grafy. Tab. 4 Základní analytické hodnoty moštu Cukernatost 20,1 ± 0,2 NM ph 3,27 ± 0,08 Kyseliny 9,8 ± 0,3 g.l-1 YAN 256 ± 15 mg.l-1 Tabulka 4 prezentuje základní analytické hodnoty moštu, který byl následně macerován podle variant pokusu. U kryomaceračních variant byla udržována teplota kolem 5 C, jak lze vidět v tabulce 5. Pouze první den byla u variant vlivem použití suchého ledu ke zchlazení teplota nižší než 3 C. Tab. 5 Teploty macerace Varianta měření 1 den 2 den 3 den 4 den 5 den 6 den 7 den 8 den 9 den 10 den 11 den 12 den 13 den 14 den 3dny ráno 1 C 6 C 5 C večer 3 C 4 C 4 C 7dní ráno 1 C 5 C 4 C 5 C 5 C 4 C 5 C večer 3 C 4 C 4 C 3 C 4 C 5 C 5 C 14 dní ráno 1 C 5 C 5 C 4 C 3 C 4 C 5 C 5 C 4 C 5 C 4 C 5 C 4 C 5 C večer 4 C 3 C 5 C 5 C 5 C 5 C 4 C 5 C 5 C 4 C 5 C 5 C 5 C 5 C 41

Z výsledných vín byly změřeny základní analytické hodnoty na přístroji Alpha wine atr (tabulka 6). Byl změřen i obsah fruktózy a glukózy, který vyšel 0 ± 0,1 g.l-1. Podle očekávaní u variant se studenou macerací došlo k poklesu titrovatelných kyselin a ke zvýšení ph oproti kontrolní variantě 0 hodin macerace. 0 h macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace Tab. 6 Základní analytické hodnoty z Alpha wine atr Titr Alkohol kys. Red.cukry ph Jablečná Mléčná Octová Vinná Glycerol % g/l g/l g/l g/l g/l g/l g/l 11,84 4,92 0 3,41 0,51 1,9 0,35 0,84 7,97 11,86 4,69 0 3,45 0,37 1,82 0,41 0,97 6,89 11,73 4,86 0 3,47 0,52 1,81 0,35 1,01 6,87 11,56 4,76 0 3,49 0,65 1,88 0,32 1,06 6,28 42

Graf 1 ukazuje vývoj celkových fenolů u všech 4 variant. U všech metod studené macerace došlo ke zvýšení celkových fenolů. Nejvyšší obsah 2041 mg*l -1 byl po skončení fermentace u 14 denní studené macerace. U posledního měření po půl roce dosahoval nejvyšších výsledků 3 denní macerace s hodnotou 1929 mg*l -1. 2400 Celkové fenoly Wilksovo lambda=,00119, F(45, 128,35)=10,006, p=0,0000 Dekompozice efektivní hypotézy Vertikální sloupce označují 0,95 intervaly spolehlivosti ekvivalent kyseliny gallové / mg.l -1 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 hodin macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace 0 Mletí hroznů Konec MLF Konec fermentace Po půl roce Graf 1 Vývoj celkového obsahu fenolů 43

Graf 2 ukazuje 3 statisticky rozdílné skupiny. Skupinu s nejvyššími hodnotami obsahu fenolů 1929 mg*l -1, zastoupenou variantami 3 denní a 14 denní macerací. Druhou statistickou skupinou je 7 denní studená macerace a poslední třetí skupinou s nejnižším obsahem celkových fenolů 1547 mg*l -1 je kontrolní vzorek 0 hodin macerace. Celkové fenoly 2000 1950 ekvivalent kyseliny gallové / mg.l -1 1900 1850 1800 1750 1700 1650 1600 Průměr Průměr±SmCh Průměr±2*SmOdch Odlehlé Extrémy 1550 1500 0 h macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace Graf 2 Celkový obsah fenolů u výsledného vína 44

Z grafu 3, kde se sledoval vývoj antiradikálové aktivity. Po ukončení alkoholové fermentace je antiradikálová aktivita velmi podobná. Nejvyšší hodnoty 712 mg*l -1 dosahuje varianta 14 denní studené macerace. Po fermentaci dochází k rozrůznění výsledných hodnot, kdy nejvyšších hodnot dosahují varianty 3 a 14 dní macerace. 1000 Antiradikálová aktivita Wilksovo lambda=,00119, F(45, 128,35)=10,006, p=0,0000 Dekompozice efektivní hypotézy Vertikální sloupce označují 0,95 intervaly spolehlivosti ekvivalent kyseliny gallové / mg.l -1 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 hodin macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace -100 Mletí hroznů Konec MLF Konec fermentace Po půl roce Graf 3 Vývoj antiradikálové aktivity 45

V grafu 4 se vytvořily dvě statisticky průkazné skupiny. V první skupině jsou varianty s aplikovanou studenou macerací v délce 3, 7 a 14 dní. S nejvyšší hodnotou 787 mg*l -1 u 14 denní varianty. V druhé skupině s menší antiradikálovou aktivitou je varianta 0 hodin macerace s výsledkem 520 mg*l -1. 850 Antiradikálová aktivita 800 ekvivalent kyseliny gallové / mg.l -1 750 700 650 600 550 Průměr Průměr±SmCh Průměr±2*SmOdch Odlehlé Extrémy 500 450 0 h macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace Graf 4 Antiradikálová aktivita u výsledných vín 46

U vývoje celkových flavanolů z grafu 5 lze zjistit, že od konce fermentace až do výsledného vína má nejnižší hodnoty 605 mg*l -1 varianta 0 hodin macerace. Po ukončení fermentace je varianta 3 dny macerace statisticky neprůkazně vyšší než 0 hodin macerace. Nejvyšší hodnoty po fermentaci dosáhla varianta 14 denní macerace, a to 802 mg*l -1. V průběhu dalšího zrání dochází ke zvýšení obsahu celkových flavanolů u variant studené macerace. 1000 Celkové flavanoly Wilksovo lambda=,00118, F(45, 128,35)=10,029, p=0,0000 Dekompozice efektivní hypotézy Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby ekvivalent katechinu / mg.l -1 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 hodin macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace -100 Mletí hroznů Konec MLF Konec fermentace Po půl roce Graf 5 Vývoj celkových flavanolů 47

U výsledných vín je obsah celkových flavanolů rozdělen do dvou statistických skupin (graf 6). Prokazatelně vyšších hodnot dosahují varianty s použitím studené macerace. Nejvyšší hodnota 818 mg*l -1 vychází u 3 denní macerace a nejnižších hodnoty 635 mg*l -1 dosahuje metoda s 0 hodin macerace. 900 Celkové flavanoly 850 ekvivalent katechinu / mg.l -1 800 750 700 650 Průměr Průměr±SmCh Průměr±2*SmOdch Odlehlé Extrémy 600 550 0 h macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace Graf 6 Celkové flavanoly u výsledných vín 48

Z grafu 7, vyobrazující vývoj celkových antokyanů, lze zjistit rozdíl oproti předešlým grafům. Vyšších hodnot celkových antokyanů dosahuje metoda 0 hodin macerace a naopak nižších hodnot dosahují varianty s použití studené macerace. Pouze u varianty 3 denní macerace po ukončení malolaktické fermentace je celkový obsah antokyanů srovnatelný s 0 hodin macerace a u finálního vína vyšší. 130 Celkové antokyany Wilksovo lambda=,00118, F(45, 128,35)=10,029, p=0,0000 Dekompozice efektivní hypotézy Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby 120 110 100 mg.l -1 90 80 70 60 0 hodin macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace 50 40 30 Mletí hroznů Konec MLF Konec fermentace Po půl roce Graf 7 Vývoj celkových antokyanů 49

V grafu 8 jsou dvě statistické skupiny, kdy do první skupiny řadíme 0 hodin macerace a variantu 3 dny kryomacerace, statisticky zde můžeme řadit i variantu 14 denní kryomacerace. Varianta 3 denní macerace dosahuje nejvyšších hodnot 103 mg*l -1. Do druhé skupiny s menším obsahem celkových antokyanů řadíme 7 a 14 denní maceraci. S nejnižším obsahem antokyanů 7 denní varianty s 97 mg*l -1. 130 Celkové antokyany 125 120 mg.l -1 115 110 105 Průměr Průměr±SmCh Průměr±2*SmOdch Odlehlé Extrémy 100 95 90 0 h macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace Graf 8 Celkové antokyany u výsledných vín 50

V grafu 9, který ukazuje vývoj redukční síly, se po fermentaci vytvořili 2 statistické skupiny, a to skupina 0 hodin macerace, varianty 3 a 7 dní kryomacerace a další skupina tvořená variantou 14 denní kryomacerace s nejvyšší hodnotou 1187 mg*l -1. Po půl roce se vytvořily 3 statistické skupiny a je pozorovatelný rozdíl mezi aplikovanou kryomacerací a variantou 0 hodin macerace. 1400 Redukční síla Wilksovo lambda=,00119, F(45, 128,35)=10,006, p=0,0000 Dekompozice efektivní hypotézy Vertikální sloupce označují 0,95 intervaly spolehlivosti ekvivalent kyseliny gallové / mg.l -1 1200 1000 800 600 400 200 0 0 hodin macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace -200 Mletí hroznů Konec MLF Konec fermentace Po půl roce Graf 9 Vývoj redukční síly 51

Graf 10 zobrazuje 3 statistické skupiny u výsledného vína po půl roce, a to s nejvyšší redukční silou 1249 mg*l -1 u varianty 14 denní kryomacerace, následovanou variantou 3 denní macerace. Ve třetí skupině se nachází varianty 7 denní kryomacerace a 0 hodin macerace s nejnižší hodnotou 954 mg*l -1. 1300 Redukční síla 1250 ekvivalent kyseliny gallové / mg.l -1 1200 1150 1100 1050 1000 950 Průměr Průměr±SmCh Průměr±2*SmOdch Odlehlé Extrémy 900 850 0 h macerace 3 dny macerace 7 dní macerace 14 dní macerace Graf 10 Redukční síla u výsledných vín 52

Senzorická analýza Jak už bylo zmíněno v kapitole 4.3.8. v senzorické analýze se hodnotilo 100 bodovou stupnicí. Nejlépe dopadla varianta 3 dny kryomacerace s necelými 83 body, následovaná variantou 7 dní kryomacerace. Nejméně bodů získala varianta 0 hodin kryomacerace, jak ukazuje tabulka 7. Tab. 7 Hodnocení 100 bodovou tabulkou výsledných vín 53