Tento návod platí pro výrobek Dako EnVision+ System -HRP (EnVision+ System, HRP).

Dako EnVision+ System-HRP (DAB) Pro použití s králičími primárními protilátkami Kód K4010 5 ml Kód K4011 110 ml Použití In vitro diagnostikum. Tento návod platí pro výrobek Dako EnVision+ System -HRP (EnVision+ System, HRP). Tento kit je určen k používání v kombinaci s králičími primárními protilátkami dodanými uživatelem ke kvalitativní identifikaci antigenu pomocí světelné mikroskopie v normálních a patologických tkáních zalitých do parafínu, kryostaticky zpracovaných tkáních nebo buněčných preparátech. Lze použít tkáni zpracované pomocí různých fixačních prostředků, mezi něž může patřit etanol, fixační roztok B-5, Bouinův fixační roztok, vodný roztok formaldehydu a zinku a neutrální pufrovaný formalín. V části Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení nebo v části Pokyny pro detekční systémy v imunohistochemických postupech naleznete následující kapitoly: (1) Princip metody, (2) Potřebný materiál, který není součástí dodávky, (3) Uchovávání, (4) Příprava vzorků, (5) Postup barvení, (6) Kontrola jakosti, (7) Odstraňování problémů, (8) Interpretace barvení, (9) Obecná omezení. Souhrnné informace a vysvětlení Principy metody EnVision+ System-HRP je dvoustupňová imunohistochemická metoda barvení. Tento systém je založen na polymeru značeném křenovou peroxidázou (HRP), konjugovaném se sekundárními protilátkami. Značený polymer neobsahuje avidin ani biotin. Proto jsou eliminovány nebo výrazně redukovány nespecifické výsledky barvení, vznikající v důsledku endogenní avidin-biotinové aktivity v játrech, ledvinách, lymfatické tkáni a kryostatických řezech. Všechna činidla pro systém EnVision+ System-HRP, kromě položky Liquid DAB+ Substrate-Chromogen, jsou ve stavu "ready-to-use", neboli připravena k okamžitému použití. Tento systém představuje extrémně citlivou metodu a v důsledku toho jsou optimální ředění primární protilátky až dvacetkrát vyšší než ředění používaná při tradiční technice s využitím komplexu peroxidáza anti-peroxidáza (PAP) a několikrát vyšší než ředění používaná pro tradiční metody jako je ABC nebo metoda používající značený streptavidin-biotin (LSAB). Tento protokol nabízí vylepšený systém generování signálů sloužících k detekci antigenů přítomných v nízkých koncentracích nebo primárních protilátek s nízkým titrem. Primární protilátky produkované králíky dobře reagují se značeným polymerem. Interpretace jakéhokoli pozitivního zbarvení nebo jeho nepřítomnosti by měla být doplněna morfologickými a histologickými studiemi s použitím vhodných kontrol. Veškerá endogenní peroxidázová aktivita se potlačí pětiminutovou inkubací vzorku s činidlem Peroxidase Block, blokujícím endogenní peroxidázu. Vzorek je pak inkubován se zředěnou králičí primární protilátkou s vhodnými charakteristikami. Poté následuje inkubace se značeným polymerem, skládající se ze dvou po sobě následujících třicetiminutových inkubací. Je třeba si uvědomit, že pro protilátky vyžadující natrávení pomocí enzymů nebo odmaskování cílové struktury může být potřebné prodloužit časy inkubace s primární protilátkou a značeným polymerem o 5 až 10 minut. Barvení je dokončeno po 5 až 10 minutách inkubace s roztokem substrát- chromogen obsahujícím 3,3 -diaminobenzidin (DAB+). Vznikne hnědě zbarvený precipitát na antigenním místě. (DAB je pravděpodobný karcinogen. Podrobnosti uvádí část Upozornění.) Dodaná činidla Kód K4010: Součástí dodávaného kitu jsou následující materiály, které stačí pro 150 tkáňových řezů při dávkování 100 µl na jeden řez: Množství 1x15 ml Popis Činidlo blokující peroxidázu 0,03% peroxid vodíku obsahující azid sodný. 1x15 ml Značený polymer Polymer značený peroxidázou, konjugovaný s kozími imunoglobuliny proti králičím protilátkám v pufru Tris-HCl, obsahujícím stabilizační protein a antimikrobiální činidlo. (127929-001) P04047CZ_01_K4010_K4011/2015.07 str. 1/7

1x18 ml Substrátový pufr Roztok substrátového pufru, ph 7,5; obsahuje peroxid vodíku a konzervační látku. 1x1 ml Roztok obsahující chromogen DAB+ Roztok chromogenu 3,3'-diaminobenzidinu. Kód K4011: Součástí dodávaného kitu jsou následující materiály, které stačí pro 1100 tkáňových řezů při dávkování 100 µl na jeden řez: Množství 1x110 ml Popis Činidlo blokující peroxidázu 0,03% peroxid vodíku obsahující azid sodný. 1x110 ml Značený polymer Polymer značený peroxidázou, konjugovaný s kozími imunoglobuliny proti králičím protilátkám v pufru Tris-HCl, obsahujícím stabilizační protein a antimikrobiální činidlo. 1x120 ml Substrátový pufr Roztok substrátového pufru, ph 7,5; obsahuje peroxid vodíku a konzervační látku. 1x5 ml Roztok obsahující chromogen DAB+ Roztok chromogenu 3,3'-diaminobenzidinu. Doplňky 1 Kalibrovaná zkumavka 1 Plastová Pasteurova pipeta Potřebný materiál, který není součástí dodávky Absorpční materiál pro otírání Kontrolní tkáň, pozitivní a negativní Kontrastní barvivo, na vodné bázi, jako například Mayerův hematoxylin nebo Mayerův hematoxylin modifikovaný podle Lillieho (kód S3309) Krycí sklíčka Destilovaná voda Etanol, absolutní a 95% Světelný mikroskop (20x-800x) Média pro fixaci mikroskopického preparátu, jako například Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo fixační médium na bázi vody Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kód S3025) nebo bezvodé permanentní fixační médium Ultramont (kód S1964) Primární protilátky a negativní kontrolní činidlo Podložní sklíčka, potažená poly-l-lysinem nebo silanizovaná (kód S3003) Barvící lázně nebo nádobky Časovač (kde je možné nastavit 3 až 40minutové intervaly) Promývací láhve Roztok promývacího pufru Xylen, toluen nebo náhrady xylenu Doplňkový materiál, který není součástí dodávky Hydroxid amonný, 0,015 mol/l, zředěný na 0,037 mol/l PAP Pen (kód S2002) Upozornění 1. Pouze pro profesionální uživatele. 2. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN3 ), chemikálii, která je v čistém stavu vysoce toxická. V koncentracích, v nichž se azid sodný nachází v produktu, není klasifikován jako nebezpečný, usazeniny NaN 3 však mohou reagovat s olověnými a měděnými armaturami a vytvářet vysoce výbušné oxidy kovů. Při likvidaci používejte pro výplach velká množství vody, abyste zabránili tvorbě azidů v armaturách. 1,2 3. Nepoužívejte činidla po datu expirace platném pro předepsanou metodu uchovávání. Jsou-li činidla uchovávána v jakýchkoli jiných podmínkách než je uvedeno na příbalovém letáku, musí uživatel provést jejich validaci. 4. Nenahrazujte činidla činidly z jiných šarží nebo činidly ze systémů vyráběných jinými výrobci. (127929-001) P04047CZ_01_K4010_K4011/2015.07 str. 2/7

5. Pokud vystavíte enzymy nebo substrát-chromogen nadměrnému osvětlení, může je to negativně ovlivnit. Neuchovávejte součásti kitu v prostředí se silným osvětlením jako například na přímém slunečním světle, ani za takových podmínek neprovádějte barvení. 6. Jiné časy inkubace a inkubační teploty než ty, které jsou zde uvedeny, mohou být příčinou chybných výsledků. Jakékoli změny tohoto charakteru musí uživatel validovat. 7. Stejně jako u jiných výrobků z biologických zdrojů i zde dodržujte správné postupy zacházení. 8. Aby nedošlo ke kontaktu s očima a kůží, používejte vhodné osobní ochranné pomůcky. 9. Nespotřebované roztoky je třeba zlikvidovat v souladu s místními, celostátními, případně federálními předpisy. 10. Bezpečnostní list (BL) je profesionálním uživatelům k dispozici na vyžádání. Nebezpečí DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Může vyvolat rakovinu. H341 Podezření na genetické poškození. P201 Před použitím si obstarejte speciální instrukce. P202 Nepoužívejte, dokud jste si nepřečetli všechny bezpečnostní pokyny a neporozuměli jim. P281 Používejte požadované osobní ochranné prostředky. P308 + P313 PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. P405 Skladujte uzamčené. P501 Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. Uchovávání Činidla systému EnVision+ System-HRP uchovávejte při teplotě 2 8 C. Nevystavujte mrazu. Nepoužívejte po datu expirace uvedeném na lahvičkách s činidly a na etiketě kitu. Změna vzhledu kteréhokoli činidla, jako například precipitace, může znamenat nestabilitu nebo zhoršení vlastností. V takovém případě nemají být činidla používána. Nestabilita výrobku není signalizována žádnými zřetelnými příznaky. Testujte proto současně se vzorky od pacientů i pozitivní a negativní kontroly. Pokud dojde ke zbarvení neočekávaného typu, které nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech, a máte-li podezření na problém s kitem, kontaktujte službu technické podpory společnosti Dako. Příprava činidel Před barvením je vhodné připravit si následující činidla. Roztok promývacího pufru Doporučeným promývacím pufrem pro automatickou a manuální imunohistochemickou detekci je TBST, 0,05 mol/l, fyziologický roztok pufrovaný Tris s Tween (kód S3006). TBS, 0,05 mol/l fyziologický roztok pufrovaný Tris (kód S1968) a PBS, 0,02 mol/l fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (kód S3024) jsou rovněž vhodné roztoky promývacích pufrů pro ruční barvení. Nedoporučuje se používat roztoky promývacích pufrů obsahující azid sodný. Azid sodný inaktivuje křenovou peroxidázu (HRP), což má za následek negativní zbarvení. Nepoužitý pufr skladujte při teplotě 2 až 8 C. Pokud je pufr zakalen, zlikvidujte jej. Pro vypláchnutí činidla blokujícího peroxidázu, substrátu a kontrastního barviva lze použít destilovanou vodu. Primární protilátka Společnost Dako dodává rovněž koncentrované protilátky. Optimální ředění však musí experimentálně stanovit uživatel. Vzhledem k vysoké citlivosti systému EnVision+ System-HRP mohou být ředění primárních protilátek pětkrát až dvacetkrát vyšší než ředění používaná v tradičních imunohistochemických metodách Zředěné roztoky je třeba připravit s použitím roztoku pro ředění protilátek Antibody Diluent (kód S0809), který obsahuje 0,05 mol/l pufr Tris-HCI s ph 7,2-7,6 a 1% hovězí sérový albumin (BSA). Pro většinu primárních protilátek používaných při práci s tímto kitem je dostačující inkubační dobou 30 minut. Protilátky NP-Series Plus typu ready-to-use jsou optimalizovány pro použití při práci s vysoce citlivými detekčními systémy Dako Plus a jejich použití v kombinaci s těmito systémy se doporučuje. Společnost Dako dodává rovněž koncentrované protilátky. Optimalizaci koncentrovaných protilátek zajistí koncový uživatel. Zředěné roztoky je třeba připravit za použití roztoku pro ředění protilátek Antibody Diluent (kód S0809) nebo roztoku pro ředění, který obsahuje 0,05 mol/l pufr Tris-HCI a 1% hovězí sérový albumin (BSA). Protilátky Dako N-Series typu ready-to-use nejsou optimalizovány pro použití při práci s detekčními systémy Dako Plus. (127929-001) P04047CZ_01_K4010_K4011/2015.07 str. 3/7

Negativní kontrolní činidlo V ideálním případě obsahuje negativní kontrolní činidlo protilátku, která nevykazuje žádnou specifickou reaktivitu s lidskými tkáněmi nebo s normálním/neimunním sérem ve stejné matrix/roztoku jako zředěná primární protilátka. Negativní kontrolní činidlo by mělo mít stejnou podtřídu a mělo by pocházet od stejného živočišného druhu jako primární protilátka, mělo by být zředěno na stejnou koncentraci imunoglobulinu nebo proteinu jako zředěná primární protilátka a mělo by být ředěno pomocí stejného roztoku pro ředění. Čas inkubace pro negativní kontrolní činidlo by měl odpovídat času inkubace primární protilátky. Při použití protilátek Dako NP-Series "Plus typu "ready-to-use" se doporučuje používat jako negativní kontrolní činidla Universal Negative Control+. Tato kontrolní činidla jsou optimalizována pro použití buď v kombinaci s myšími protilátkami (kód NP015) nebo s králičími protilátkami (NP001) NP-Series Plus typu "ready-to-use". Roztok substrát-chromogen Následuje protokol pro přípravu 1 ml roztoku substrát-chromogen. Toto množství vystačí pro obarvení maximálně deseti tkáňových řezů nebo pěti buněčných roztěrů. Krok 1 Krok 2 Podle počtu barvených sklíček přeneste odpovídající počet 1mL objemů pufru z láhve 3a (substrátový pufr) do poskytnuté kalibrované zkumavky. Na každý 1 ml pufru přidejte jednu kapku (20 µl) z láhve 3b (Liquid DAB+ Chromogen). Ihned směs zamíchejte a nanášejte na tkáňové řezy pomocí dodané Pasteurovy pipety. Připravený roztok substrát-chromogen je stabilní přibližně po dobu 5 dní při uchovávání při teplotě 2 8 C. Tento roztok by měl být před použitím důkladně promíchán. Precipitát, který v roztoku případně může vzniknout, nemá vliv na kvalitu barvení. Po každém použití důkladně vypláchněte zkumavku a pipetu. Pokud použijete celých 18 ml substrátového pufru dodaného se sadou K4010, získáte objem, který vystačí na 150 testů. Může zbýt určitý objem roztoku. Pokud použijete celých 120 ml substrátového pufru dodaného se sadou K4011, získáte objem, který vystačí na 1100 testů. Může zbýt určitý objem roztoku. Kontrastní barvivo Barevný konečný produkt barvicí reakce je nerozpustný v alkoholu. Při této metodě lze použít barvení kontrastním barvivem na alkoholové nebo vodné bázi, jakým je například Mayerův hematoxylin nebo Mayerův hematoxylin modifikovaný podle Lillieho (kód S3309). Kontrastní barvení hematoxylinem by mělo být následováno důkladným propláchnutím destilovanou vodou a ponořením sklíček s tkání do lázně 0,037 mol/l amoniaku nebo podobného modřidla. Vodný roztok amoniaku 0,037 mol/l se připraví smícháním 2,5 ml (koncentrovaného) 0,015 mol/l hydroxidu amonného s 1 litrem vody. Nepoužitý 0,037 mol/l amoniak lze uchovávat při pokojové teplotě (20 25 C) v pevně uzavřené láhvi po dobu maximálně 12 měsíců. Jiné postupy pro kontrastní barvení jsou uvedeny v pokynech výrobce. Fixační média Pro fixaci ve vodném médiu se doporučuje Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kód S3025). Glycergel je třeba těsně před použitím zahřát na teplotu nejméně 50 C. Je rovněž možné použít bezvodé permanentní fixační médium Ultramount (kód S1964). Příprava vzorků Informace naleznete naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení anebo ve specifikacích protilátek. Před imunohistochemickým barvením je třeba tkáně fixovat a zpracovat. Fixace zabraňuje autolýze a hnilobě odebraných tkání, zachovává antigenní vlastnosti, zvyšuje index lomu součástí tkání a zvyšuje odolnost buněčných elementů při zpracování tkání. Postupy pro zpracování tkání zahrnují dehydrataci, odstranění dehydratačních činidel, infiltraci média pro zalévání, vlastní zalití a přípravu tkáňových řezů. Popis fixačních prostředků nejběžněji používaných při přípravě tkání pro imunohistochemické barvení je uveden v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Jedná se však pouze o obecné pokyny. Optimální postupy musí stanovit uživatel. Uživatel rovněž musí provést jejich verifikaci. (127929-001) P04047CZ_01_K4010_K4011/2015.07 str. 4/7

Postup barvení Poznámky k postupu Před použitím by si měl uživatel tyto pokyny pečlivě přečíst a seznámit se s obsahem kitu. Činidla a návod dodané v rámci tohoto kitu byly vyvinuty tak, aby poskytovaly optimální výsledky. Další ředění činidel, jež jsou součástí kitu, nebo změna doby nebo teploty inkubace mohou být příčinou chybných výsledků. Všechna činidla by měla být před imunologickým barvením temperována na laboratorní teplotu (20 25 C). Podobně všechny inkubace by měly být prováděny při laboratorní teplotě. Tkáňové řezy nesmí během barvení vyschnout. U vyschlých tkáňových řezů může dojít ke zvýšenému nespecifickému barvení. Pokud jsou sklíčka vystavena průvanu, přikryjte je. Pokud použijete prodlouženou inkubaci, umístěte tkáně do vlhkého prostředí. Citlivost systému EnVision+ System-HRP lze dále zvýšit prodloužením doby inkubace v kroku 2 a 3 o 5 až 10 minut. Protokol barvení KROK 1 PEROXIDASE BLOCK (ČINIDLO BLOKUJÍCÍ PEROXIDÁZU) Poklepáním odstraňte přebytek pufru. Pomocí materiálu, který nepouští vlákna (jako například gázové tampony nebo tampony Kimwipe) pečlivě otřete okolí vzorku, aby se odstranila zbývající tekutina a činidla zůstala pouze ve zpracovávané oblasti. Naneste takové množství činidla blokujícího endogenní peroxidázu Peroxidase Block z láhve 1, aby byl vzorek pokryt. Inkubujte po dobu 5 (±1) minut. Jemně vzorek opláchněte destilovanou vodou nebo roztokem pufru z promývací láhve (proud nesmí být namířen přímo na tkáň) a umístěte do čerstvě připravené pufrové lázně. KROK 2 PRIMARY ANTIBODY (PRIMÁRNÍ PROTILÁTKA) NEBO NEGATIVE CONTROL REAGENT (NEGATIVNÍ KONTROLNÍ ČINIDLO) Poklepáním odstraňte přebytek pufru a otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Naneste takové množství optimálně ředěné primární protilátky nebo negativního kontrolního činidla, aby byl vzorek pokryt Inkubujte po dobu 30 (±1) minut. Jemně vzorek opláchněte roztokem pufru z promývací láhve (proud nesmí být namířen přímo na tkáň) a umístěte do čerstvě připravené pufrové lázně. Pokud je nutné barvení přerušit, je možné ponechat sklíčka po inkubaci primární protilátky v pufrové lázni (krok 2) při laboratorní teplotě (20 25 C) maximálně po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě (20 25 C), aniž by byly výsledky barvení ovlivněny. KROK 3 PEROXIDASE LABELLED POLYMER (POLYMER ZNAČENÝ PEROXIDÁZOU) Poklepáním odstraňte přebytek pufru a otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Naneste takové množství značeného polymeru z láhve 2, aby byl vzorek pokryt. Inkubujte po dobu 30 (±1) minut. Opláchněte sklíčka stejným způsobem jako v kroku 2. KROK 4 SUBSTRATE-CHROMOGEN (SUBSTRÁT-CHROMOGEN) Otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Naneste takové množství připraveného roztoku Liquid DAB+ Substrate-Chromogen, aby byl vzorek pokryt (viz část Příprava činidel). Inkubujte po dobu 5 10 minut. Jemně vzorek opláchněte destilovanou vodou z promývací láhve (proud nesmí být namířen přímo na tkáň). Použitý roztok substrát-chromogen shromažďujte v nádobce na nebezpečné materiály, aby mohl být zlikvidován náležitým způsobem. KROK 5 HEMATOXYLIN COUNTERSTAIN (KONTRASTNÍ BARVIVO) (volitelný krok) Ponořte sklíčka do lázně vodného hematoxylinu (kód S3309). Délka inkubace závisí na koncentraci použitého hematoxylinu. Jemně sklíčka opláchněte v lázni s destilovanou vodou. Ponořte sklíčka 10krát do lázně 0,037 mol/l amoniaku nebo podobného modřidla Oplachujte sklíčka v lázni s destilovanou nebo deionizovanou vodou po dobu 2 5 minut. KROK 6 FIXACE MIKROSKOPICKÉHO PREPARÁTU Vzorky lze fixovat na sklíčka a pokrýt krycími sklíčky s použitím fixačního média na bázi vody, jako je například fixační médium Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo médium Faramount (kód S3025) nebo bezvodé permanentní fixační médium Ultramount (kód S1964). Sklíčka lze rovněž odvodnit a trvale fixovat. (127929-001) P04047CZ_01_K4010_K4011/2015.07 str. 5/7

Kontrola jakosti Odlišnosti při zpracování tkání a technických postupech používaných v laboratoři uživatele mohou být příčinou signifikantní proměnlivosti výsledků, takže kromě níže uvedených postupů je nutné pravidelné provádění kontrolních vyšetření v rámci příslušného pracoviště. Další informace naleznete v pokynech týkajících se kontroly jakosti v certifikačním programu organizace College of American Pathologists (CAP) pro imunohistochemii a v literárních odkazech 3 až 5. Podrobnosti týkající se citlivosti a imunoreaktivity naleznete ve specifikacích jednotlivých primárních protilátek. Další informace o pozitivních a negativních kontrolách naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Interpretace barvení Omezení Pokyny týkající se interpretace naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Informace o obecných omezeních naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Vybarvení tkání závisí na správném zacházení s tkáněmi před barvením a na jejich správném zpracování. Nesprávná fixace, zmrazení, rozmrazení, promývání, sušení, zahřátí, zhotovení řezů nebo kontaminace jinou tkání nebo tekutinou mohou být příčinou vzniku artefaktů, nahromadění protilátek nebo falešně negativních výsledků. Použití starých nebo nepufrovaných fixačních prostředků nebo vystavení tkání nadměrně vysoké teplotě (vyšší než 60 C) v průběhu zpracovávání může mít za následek sníženou citlivost pro barvení. V hemoproteinech, jako je například hemoglobin, myoglobin, cytochrom a kataláza, a rovněž v eosinofilech lze zjistit aktivitu endogenní peroxidázy nebo pseudoperoxidázy. 6,7 Tuto aktivitu lze zablokovat inkubací vzorků s činidlem blokujícím peroxidázu (Peroxidase Block, láhev 1 v systému EnVision+ System-HRP) po dobu pěti minut před nanesením primární protilátky. Toto činidlo lze rovněž použít pro krevní roztěry, roztěry kostní dřeně a zmrzlé tkáně. Tento postup však neodstraní červenohnědý pigment hemoproteinů. Jako alternativu lze použít roztok metanolu a peroxidu vodíku. Při použití tohoto postupu může dojít k denaturaci některých antigenů. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy typu B, obsahující povrchový antigen viru hepatitidy B (HbsAg), se mohou nespecificky barvit křenovou peroxidázou. 8 Pokud jsou jako sekundární antiséra v blokačních krocích použita normální a neimunní séra stejného živočišného druhu, mohou být příčinou falešně negativních nebo falešně pozitivních výsledků, způsobených autoprotilátkami nebo přirozenými protilátkami. Činidla dodaná v tomto kitu byla optimálně naředěna. Další ředění může způsobit ztrátu schopnosti detekovat antigeny. Odstraňování problémů Problém Pravděpodobná příčina Navrhovaná akce 1. Žádné sklíčko není vybarveno. 1a. Činidla nebyla použita ve správném pořadí. 1b. Přítomnost azidu sodného v 1a. Zkontrolujte aplikaci činidel. 1b. Použijte čerstvý pufr bez 2. Slabé vybarvení všech sklíček. 3. Nadměrné zbarvení pozadí u všech sklíček. pufrové lázni. 2a. Po promytí zůstalo v řezech příliš mnoho roztoku. 2b. Sklíčka nebyla dostatečně dlouho inkubována s protilátkami nebo se směsí substrátu. 3a. Vzorky obsahují vysokou endogenní peroxidázovou aktivitu. 3b. Parafín nebyl úplně odstraněn. 3c. Řezy nebyly pořádně opláchnuty. 3d. Reakce substrátu byla rychlejší než obvykle, například v důsledku příliš vysoké laboratorní teploty. azidu. 2a. Jemným poklepáním odstraňte přebytek roztoku a pak otřete okolí řezu. 2b. Je třeba ověřit doporučené časy inkubace. 3a. Použijte delší čas inkubace činidla blokujícího endogenní peroxidázu Peroxidase Block z láhve 1. 3b. Použijte čerstvou xylenovou nebo toluenovou lázeň. Při současném barvení několika sklíček by druhá xylenová lázeň měla obsahovat čerstvý xylen. 3c. Používejte čerstvé roztoky pro pufrové lázni a promývání. Jako alternativu lze použít TBST: 0,05 mol/l pufr Tris obsahující 0,3 mol/l NaCl a 0,1% Tween (kód S3306). 3d. Použijte kratší dobu inkubace pro roztok substrátchromogen. (127929-001) P04047CZ_01_K4010_K4011/2015.07 str. 6/7

3e. Řezy během barvení vyschly. 3f. Nespecifická vazba činidel na tkáňové řezy. 3g. Protilátka je příliš koncentrovaná. 3e. Použijte vlhkou komůrku. Před aplikací činidla otřete současně pouze tři až čtyři sklíčka. 3f. Použijte blokující roztok, který obsahuje irelevantní protein. 3g. Použijte vyšší ředění primární protilátky. POZNÁMKA: Pokud nelze vznik problému připsat žádné z výše uvedených příčin nebo pokud navrhovaná nápravná akce jako řešení problému selže, obraťte se s žádostí o další pomoc na službu technické podpory společnosti Dako. Další informace o technikách barvení a přípravě vzorků lze najít v následujících pramenech: Handbook - Immunochemical Staining Methods 9 (dostupné u společnosti Dako), Atlas of Immunohistology 10 a Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 11 Literatura 1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976 2. Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, 1976. 3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 6. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 9. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Corporation 1989 10. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 11. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Doplňková literatura Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Edition 07/15 (127929-001) P04047CZ_01_K4010_K4011/2015.07 str. 7/7