Některé vlastnosti DNA důležité pro analýzu Spiralizace Denaturace Záporný náboj Syntéza Ligace Rekombinace Mutabilita Despiralizace Reasociace Štěpení
Metody používané k analýze DNA Southern blotting PCR Klonování v plazmidech Elektroforéza Analýza na kapilární elektroforéze Microarray technologie Sekvencování
Southern blotting
PCR
PCR
Využití PCR
Alelo-specifická PCR
TaqMan assay
Inverzní PCR
Klonování v plazmidech
Elektroforéza Horizontální, separace v agarózovém gelu Vertikální, separace v polyakrylamidovém gelu Denaturační gradientní gelová elektroforéza, SSCP 2D gelová elektroforéza Kapilární elektroforéza
Separace molekul v kapilární elektroforéze
Detekce fluorescence v KE
Využití kapilární elektroforézy při prenatální diagnostice Vodička R., Vrtěl R., Krejčiříková E., Čapková P., Adamová K. Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny FN Olomouc
Microarray technologie
Sekvencování
Sekvencování
Aplikace metod analýzy DNA na našem pracovišti Cystická fibróza, deltaf508, del2,1 Využití kapilární elektroforézy v PD Detekce mikrodelecí na Y chromozomu u sterilních mužů Kvantifikace Y pozitivních pacientek s TS Analýza mutací genů TSC1 a TSC2 u pacientů s tuberózní sklerózou Huntingtonova chorea
Možnosti využití QF PCR v PD
Základní metodika
Detekce aneuploidií využití STR
Využití mikrosatelitních sekvencí (STR) ke stanovení počtu alel 2-4 bp opakující se jednotka Po celém genomu Velká variabilita délky Heterozygozita v populaci Předpoklad: 1alela = 1 chromozom; Pečlivý výběr vhodných primerů
Výběr vhodných lokusů a sestavení funkčních multiplexů 21, 21 21, 18 X/Y, Y, 13 18, 13
Rozmístění STR lokusů v karyotypu 46,XY D13S631/13q31-32 D18S535/18q12.2-3 MBP/18q23 D21S1411/21q22.3 D21S1412/21q22.3 D21S1414/21q21 AMX/p22.3 DYZ3/centromera AMY/q11.1
QF PCR v lokusech D21S1414 a MBP (18) D21S1414 Trizomie 21
Srovnání fyziologického nálezu s trizomií 21 QF PCR
Prenatální detekce aneuploidií: Cytogenetika vs. FISH vs. QF PCR Získaná informace Finance Pracnost Čas
Posun limitů QF PCR v r.2003 možnost účinně detekovat i vzácné gonozomální mozaiky - vytvoření kalibrační křivky ze vzorků s různým poměrem gonozomální mozaiky možnost hodnotit vzorky s příměsí maternální krve paralelní vyšetření DNA z periferní krve matky
Stanovování mozaik různým ředěním DNA byly vytvořeny umělé mozaiky, podrobeny PCR a odebrány po jednom cyklu v rozmezí 20 30 PCR cyklů kalibrační křivka pro odečtení mozaik byla sestrojena z geometrických průměrů podílů RFUX a RFUY v jednotlivých mozaikách Ln (RFUY/RFUX + 1) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Ln (RFUY/RFUX+1) = 0.00827.(Mosaics, %) 0 20 40 60 80 100 120 Mozaic (% ) Model regression line 95% confidence for calibration predictions Experimental data: mean estimates Experimental data: range of values
Analýza kontaminovaných vzorků Paralelní analýza DNA plodu a matky s použitím shodných STR lokusů Vyhodnocení výstupů z KE
Srovnání výstupů z kapiláry plod vs. matka Lokus D21S1435 dvojče A dvojče B matka Lokus D21S1446 dvojče A dvojče B matka
Prenatální detekce aneuploidií pomocí QF PCR od roku 2001 Celkový počet vyšetření 164 Trizomie 21 3 Trizomie 18 6 Trizomie 13 1 ------------------------------------------------------------- Falešně pozitivní 0 Falešně negativní 1 Celkem 10 nalezených patologií ze 164 = 6,09 %
FISH a QF PCR Rychle dostupný výsledek Malé množství výchozího materiálu Možnost zpětného vyšetření uložených vzorků (odpadá nutnost opakovaného odběru)
Srovnání efektivnosti FISH a QF PCR FISH QF PCR Rychlost Pracnost Finační náročnost malé množství materiálu velmi malé množství ( 3-5 ml) materiálu (0.5-1 ml) vhodné pro čerstvé preparáty vhodné k detekci mozaik vzorky kont. maternální krví nelze hodnotit nezáleží na stáří preparátu (i zmražené vzorky) mozaiky lze detekovat u vybraných chromozomů vhodné i pro analýzu kontaminovaných vzorků
Využití fetální DNA (RNA) v maternálních tkáních v neinvazivní prenatální diagnostice
Analýza fetálních molekul v maternálních tkáních Jaderné fetální buňky fetální erytroblasty 1 in 10 3 10 7 Fetální buňky v apoptóze?????? Volná fetální DNA 5% Fetální cdna??????
Diagnostické využití fetálních molekul v periferní krvi Separace fetálních buněk Rozpoznání fetální DNA Přesná kvantifikace Analýza zodpovědných lokusů
Metodika separace fetálních buněk (MACS FACS)
FISH na fetálních erytroblastech Major problems with FISH is that 1 2% of normal diploid cells give three-signal nuclei and about 10 20% of trisomic cells give two-signal nuclei
Detekce fetálních apoptických buněk TUNEL test Komet test Systém založen na detekci kaspázové aktivity
Komet test
Analýza volné DNA (RNA) z maternální plazmy Izolace DNA ze séra Značení Amplifikace Kvantifikace požadovaného lokusu Rozpoznání patologie
Kvantifikace fetální DNA Real time PCR amplifikace DNA v reálném čase IQF PCR amplifikace DNA v reálném čase + separace v kapilární elektroforéze
Detekce fetální alely D21S1446 v maternálním séru
Detekce lokusu TSPY v maternální plazmě
Organizace lidského genomu
DNA člověka 3,2 Gb, Euchromatin 2,95Gb Proteiny kodující DNA 1,1-1,4%, transkribující DNA 5%-28% 30.000genů (pův. odhady 80.000-120.000), kvasinka 6.000, moucha 13.000, rostliny 26.000,
DNA člověka repetitivní sekvence 50%: parazitické elementy 45% (většinou vznikly reverzní transkripcí RNA), krátké repetice 3%, duplikace dlouhých segmentů DNA 5% Náš genom se podobá moři reverzně transkribované cizorodé DNA s malou příměsí genů.( D. Baltimore).
DNA člověka Pouze 94 z 1278 proteinových rodin v našem genomu je specifických pro obratlovce. Základní buněčné funkce zůstaly fixovány od bakterií a kvasinek až po člověka. Největší rozdíly mezi člověkem a např. červem nebo mouchou spočívají ve větší komplexnosti proteinů.: více domén, složitější kombinace domén. Evoluce je v podstatě novější a kvalitnější stavba pořád ale ze stejných cihel. Zdá se, že některé geny pocházejí přímo z bakterií. Je zřejmé, že náše DNA je chiméra a obsahuje geny z několika organizmů. Další odlišnosti mezi organismy je možné odvodit z alternativního sestřihu a vlastních interakcí mezi proteiny.
DNA člověka
DNA člověka