MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE Bakalářská práce Brno 2013 Roman Hudeček
MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE TRÁVENÍ PROTEINŮ U HEMATOFÁGNÍCH MNOHOBUNĚČNÝCH PARAZITŮ Bakalářská práce Roman Hudeček Vedoucí práce: RNDr. Martin Kašný, Ph.D. Rok 2013
Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Roman Hudeček Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Biochemie Trávení proteinů u hematofágních mnohobuněčných parazitů Biochemie Studijní obor: Biochemie Vedoucí práce: RNDr. Martin Kašný, Ph.D. Akademický rok: 2013 Počet stran: 7 + 49 Klíčová slova: Trávení, krev, peptidázy, hemoglobin, hematofágní parazitický organismus.
Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Roman Hudeček Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Protein digestion by hematophagous multicellular parasites Biochemistry Field of Study: Biochemistry Supervisor: RNDr. Martin Kašný, Ph.D. Academic Year: 2013 Number of Pages: 7 + 49 Keywords: Digest, blood, peptidases, haemoglobin, hematophagous parasitic organism
Abstrakt Tato práce se zaměřuje na proces degradace krve u vybraných zástupců hematofágních parazitických organismů ze skupin Trematoda, Monogenea, Nematoda, Arthropoda a Insecta. Pro hematofágní parazitické organismy je krev hostitele hlavním zdrojem energie nezbytným pro vývoj a reprodukci. V textu níže je rozpracována zejména problematika proteolytických enzymů zapojených do procesu trávení krevních složek, jako jsou erytrocyty a hemoglobin, ale i další proteiny krevní plazmy. Praktická část práce se věnuje trávicím enzymům u krev sajícího parazita Eudiplozoon nipponicum ze skupiny Monogenea. Peptidázy přítomné v homogenizovaném vzorku byly charakterizovány pomocí zymografie a fluorometrie. Navíc peptidázy a jejich afinita k hemoglobinu otevírá nový úhel pohledu na koevoluci parazita s hostitelem. Abstract This work focuses on the process of degradation of the blood in chosen members of hematophagous parasites from groups Trematoda, Monogenea, Nematoda, Arthropoda and Insecta. Host s blood is major source of energy for this parasite and also necessary for their development and reproduction. The text below is particularly focused on the proteolytic enzymes involved in process of digestion of blood components such as red blood cells and hemoglobin, as well as other plasma proteins. The practical part of this work is devoted to the digestive enzymes of the bloodfeeder parasitic helmint Eudiplozoon nipponicum from group Monogenea. Homogenized samples were analyzed by zymography and fluorometry for the peptidases activity. Peptidases and their ability to degrade hemoglobin open a new perspective on parasite co-evolution with the host.
Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat RNDr. Martinu Kašnému, Ph.D. za odborné vedení, ochotu, trpělivost a cenné rady při zpracovávání bakalářské práce a také bych chtěl poděkovat Bc. Lucii Jedličkové za ochotu a cenné rady při práci v laboratoři. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 14. květen 2013 Roman Hudeček
Obsah 1. Úvod... 11 2. Trávení... 11 2.1. Lokalizace... 12 3. Proteolytické enzymy... 12 4. Krev... 12 5. Modelové parazitické hematofágní organismy... 13 5.1. Trematoda... 13 5.2. Monogenea... 18 5.3. Nematoda... 21 5.4. Členovci... 26 5.4.1. Třída Chelicerata (klepítkatci)... 29 5.4.2. Třída Insecta (hmyz)... 33 Tabulka č. 1: Hematofágní parazité... 37 6. Cíle práce... 38 7. Materiál... 40 7.1. Použitý modelový organismus... 40 7.2. Použité chemikálie... 40 7.3. Složení roztoků a pufrů... 41 7.4. Přístroje... 41 8. Metody... 41 8.1. Fluorometrie... 41 8.2. Zymografie... 43 9. Výsledky a diskuze... 45 9.1. Fluorometrické měření... 45 9.2. Zymografické měření... 47 10. Závěr... 48 ~ 8 ~
11. Literatura... 49 11.1. Elektronické odkazy... 55 ~ 9 ~
Teoretická část ~ 10 ~
1. Úvod Parazitismus je jednou z nejvíce rozšířených životních strategií organismů a hraje důležitou roli v evoluci. Mnoho parazitických organismů se řadí mezi tzv. hematofágy. Hematofágie je jednou z důležitých potravních strategií. Jedná se o proces příjmu a zpracování krve. Tento způsob příjmu potravy se vyvinul zejména u motolic, monogeneí, hlístic, klíšťat a hmyzu. Do procesu trávení krve se zapojují produkty mnohých žláz s biologicky aktivními substancemi, jako jsou např. proteolytické enzymy. Procesy zpracování (degradace) složek hostitelské krve se mohou mezi jednotlivými skupinami značně lišit, nejenom v účasti enzymů ale také lokalizací těchto procesů. Z nejširšího pohledu může trávení probíhat intracelulárně či extracelulárně. Hematofágní paraziti svým hostitelům často působí závažná onemocnění, popř. se stávají efektivními přenašeči některých dalších onemocnění, a to jak lidských, tak i nemocí domácích a volně žijících zvířat. Studium interakce parazit-hostitel na molekulární či biochemické úrovni může vyústit charakterizaci významných parazitárních molekul, čehož může být využito v přípravě efektivních léčiv. Jelikož mezi nutné předpoklady zpracování hostitelské krve spadá digesce krevních složek zprostředkovanou mimo jiné kaskádou proteolytických enzymů - peptidáz, tak jsou vlastnosti některých z nich uvedeny a diskutovány v této práci. Předložená práce shrnuje základní dostupnou literaturu týkající se fyziologie a biochemie zpracování krevních proteinů u vybraných skupin parazitů. 2. Trávení Trávení (digesce), je metabolický biochemický proces, jehož cílem je získání živin z potravy. V rámci trávení jsou jednotlivé složky potravy rozkládány na jednodušší látky, tak aby mohly být absorbovány v těle. Při trávení se disacharidy a sacharidy mění na jednoduché cukry, tuky se štěpí na (acyl)glycerol a mastné kyseliny, bílkoviny na aminokyseliny. Nukleové kyseliny se štěpí na nukleotidy, ty dále na nukleosidy a kyselinu fosforečnou (Campbell and Reece, 2005). ~ 11 ~
2.1. Lokalizace Primitivnější organismy tráví veškerou potravu uvnitř svých buněk, což lze označit jako nitrobuněčné (intracelulární) trávení. Dalším způsobem může být trávení související s fagocytózou a následným transportem nutrientů do vnitřního prostoru buňky a jejich degradaci v potravních vakuolách. U vyspělejších živočichů se za účelem trávení vyvinuly speciální orgánové soustavy, které umožňují tzv. mimobuněčné (extracelulární) trávení, které je vývojově pokročilejší. U mimobuněčného trávení se do trávicí dutiny vylučují enzymy štěpící živiny na látky jednodušší, které jsou absorbovýány a dále zpracovány. Tento způsob trávení nalézáme jako typický u vyšších bezobratlých a u obratlovců. Trávicí soustava se vyskytuje u většiny živočichů, postrádáme ji však u některých specializovaných mnohobuněčných parazitů, kteří se mohou vyživovat osmotrofně (získávání potravy vstřebáváním celým povrchem těla např. tasemnice) (Campbell and Reece, 2005; Vácha M., 2004). 3. Proteolytické enzymy Proteolytické enzymy jsou přítomny prakticky ve všech živých buňkách všech organismů. Mohou být vylučovány i do vnějšího prostředí a u vyšších organismů do trávicího systému. Obecně byly definovány jejich mnohé funkce v metabolismu a řadě dalších fyziologických procesů (regulovaná proteolýza, aktivace trávicích enzymů, aktivita při různých obranných mechanizmech atd.). Proteolytické enzymy (peptidázy) katalyzují hydrolýzu peptidických vazeb mezi aminokyselinami proteinů. Rychlost a specifita štěpení závisí zejména na složení substrátu a na typu peptidázy (Adler-Nissen, 1986). Peptidázy můžeme klasifikovat také na základě několika dalších kritérií, a to např. podle původu (rostlinné, živočišné, mikrobiální), podle jejich lokalizace (intracelulární, extracelulární), podle ph jejich optimální reaktivity (kyselé, neutrální, alkalické), místa jejich reakce (exopeptidázy, endopeptidázy), katalytického typu (např. cysteinové, serinové, metalopeptidázy) či funkce atd. (Šturdík et al., 2004). 4. Krev Krev je kapalná, viskózní, cirkulující, živná směs, složena z tekuté plazmy a buněk, jejíž základní funkcí je přenos látek především kyslíku a oxidu uhličitého. Krev obsahuje zejména suspenzi buněk, jako jsou erytrocyty (červené krvinky), leukocyty (bílé ~ 12 ~
krvinky) a trombocyty (krevní destičky). Erytrocyty jsou bezjaderné a dobře deformovatelné buňky. S ohledem na příjem krve parazitickými organismy a její trávení mají největší význam erytrocyty, jejichž součástí je hemoglobin krevní metaloprotein. Běžný hemoglobin se skládá ze dvou podjednotek α a dvou podjednotek β. Každá podjednotka je tvořena bílkovinnou složkou globinem a prostetickou (nebílkovinnou) částí hemem. Globin je bílkovina složena ze čtyř polypeptidových řetězců. Hem se skládá z protoporfyrinu, který váže železo (Murray, 1998). 5. Modelové parazitické hematofágní organismy 5.1. Trematoda Taxonomie: Říše: Animalia (živočichové) Podříše: Eumetazoa Nadkmen: Bilateria (trojlistí) Kmen: Platyhelminthes (ploštěnci) Třída: Trematoda (motolice) Obecná charakteristika: Početná skupina (asi kolem 8000 známých druhů) výhradně parazitických platyhelmintů zahrnující až na výjimky endoparazity obratlovců se složitými vývojovými cykly, většinou s vazbou na měkkýše jako první mezihostitele. Parazitují prakticky ve všech orgánových soustavách, hlavně v trávicím systému, ale i v dýchacích cestách, nervové soustavě, urogenitálním traktu, tělních dutinách a v neposlední řadě v krevním řečišti. Tělo motolic bývá často dorzoventrálně zploštělé, oválného či kopinatého tvaru, většinou alespoň s jednou (ústní) přísavkou, často i s druhou (břišní) přísavkou (acetabulem). Přísavky mají hlavně přichycovací funkci. Motolice jsou většinou hermafroditi; výjimku tvoří gonochoristická čeleď Schistosomatidae, u jejichž zástupců se vyskytuje i výrazný pohlavní dimorfismus, a někteří zástupci čeledi Didymozoidae (paraziti tkání mořských ryb). Tělní povrch dospělých motolic je tvořen syncytiálním tegumentem, který v základní charakteristice odpovídá struktuře neodermis celé skupiny Neodermata. Z něj často vystupují na povrch různě veliké ostny kryté svrchu vnější cytoplazmatickou ~ 13 ~
membránou syncytia. Povrch je obvykle krytý různě silným glykokalyxem, zvláště u druhů vyskytujících se v agresivním prostředí trávicího traktu, kde plní především ochrannou funkci (Volf P., 2007; Fried and Graczyk, 1997). Trávící soustava: Obrázek č. 1: Morfologie dospělé motolice, (Laverack-Dando, 1987, http://www.kbi.z cu.cz/ob/studium/invert/obra/3_moto.gif, upraveno, citováno 5. 5. 2013). Trávicí soustava (Obr. č. 1) je u většiny motolic dobře vyvinuta a slouží k aktivnímu příjmu a zpracování potravy (např. střevní trávenina hostitele, ale také jeho krev či, nervová tkáň). Začíná ústním otvorem, většinou obklopeným ústní přísavkou, který je zároveň otvorem vyvrhovacím. Následuje předhltan (prefarynx), svalnatý hltan (farynx), jícen (esofagus) a samotné střevo. To může mít podobu jednoduchého vaku (např. podtřída Aspidogastrea nebo digenetická čeleď Bucephalidae), dvou slepě končících větví (většinou), nebo se větve mohou v zadní části spojovat a vytvořit tak okruh (např. čeleď Cyclocoelidae). V některých případech se větve mohou v přední části spojit a pokračovat jako jedna trubice (např. rod Schistosoma) nebo ze střeva mohou vybíhat postranní slepé výběžky (např. rod Fasciola), případně střevní větve vyúsťují v zadní části těla ven (např. některé druhy čeledi Acanthosomatidae). Část živin přijímají motolice povrchem těla, a to i v případě, že mají dobře vyvinutý trávicí systém (Volf P., 2007). ~ 14 ~
Modelový organismus: Schistosoma mansoni Obrázek č. 2: Schistosoma mansoni (skenováno pomocí elektronového mikroskopu), (Claudineide Nascimento Fernandes de Oliveira, Tarsila Ferraz Frezza, and Silmara Marques Allegretti, 2013, upraveno), Legenda: s samec, sa samice, cg canalis gynaecophorus, up ústní přísavka, vp ventrální přísavka. Charakteristika: Schistosoma mansoni (krevnička střevní) je parazitický helmint z čeledi Schistosomatidae, který způsobuje tzv. střevní schistosomózu. U krevniček jako u ostatních schistosom existuje výrazný pohlavní dimorfismus. Samci jsou větší oproti samičkám. Samice jsou tmavší a skrze samčí břišní rýhu tzv. canalis gynaecophorus spojeni se samcem (Obr. č. 2). Dospělci jsou lokalizování v portální žíle a cévách mezenteria. Vajíčka mají výrazný trn, který je umístěn laterálně. Nemoc schistosomóza způsobuje u zasažených jedinců fibrózu ledvin a jater a také může v této souvislosti dojít k iniciaci nádorového onemocnění (Fried and Graczyk, 1997; Volf P., 2007). Trávení a významné molekuly: Dospívající a dospělý jedinci rodu Schistosoma žijí v krevních cévách jejich lidských hostitelů, kde přijímají erytrocyty. Hostitelův hemoglobin (Hb), který je získáván z absorbovaných degradovaných erytrocytů, je nezbytný pro jejich růst, vývoj a reprodukci (Brindley et al., 1997). Podle odhadů, samička S.mansoni pohltí až 331 000 ~ 15 ~
erytrocytů za 3 hodiny, na rozdíl od samců, kteří pozřou méně než samičky, přibližně 39 000 za 4 hodiny (Lawrence, 1973). Po pozření jsou červené krvinky rozkládány působením hemolyzinu; proteinů a lipidů podílejících se na rozkladu červených krvinek v jícnu parazitů (Brindley et al., 1997). Hemoglobin, uvolněný z erytrocytů, je dále zpracováván ve střevě parazita, kde je degradován, pravděpodobně extracelulárně, na dipeptidy nebo volné aminokyseliny. Ty jsou nejspíš absorbovány do gastrodermálních buněk (Bogitsh, 1989). Hematin (hemoglobin, kde je centrální atom železo v ionizovaném stavu Fe 3+ ), jako konečný produkt trávení hemoglobinu je pak vyvrhován parazitem a následně se hromadí v játrech infikovaných hostitelů (Brindley et al., 1997). Trávení u Schistosom je kromě jiného zprostředkováno proteolytickými enzymy, které hrají významnou roli v trávicí kaskádě. Mezi tyto enzymy patří katepsiny B, L, D, C a Legumain. Katepsin B (klan CA, skupina C1), také známý pod názvem Sm31, patří do skupiny cysteinových peptidáz. Je syntetizován jako pre-proenzym. Ten se skládá z 340 aminokyselinových reziduí. Po zpracování a dozrání enzym obsahuje jen 250 aminokyselinových reziduí. Jeho zdánlivá molekulová hmotnost je 31 kda, i když ze sekvence aminokyselin a výsledků N-glykosylace aktivního enzymu bylo předpovězeno 28 kda (Felleisen and Klinkert, 1990). Je to tedy enzym, který je zapojen v degradaci hemoglobinu u Schistosom a nachází se v jejich trávicím traktu (Götz and Klinkert, 1993). Jeho optimální aktivita se pohybuje při ph 6 a je umocněna redukujícími podmínkami. Aktivita nevykazuje výraznou substrátovou specifičnost vůči hemoglobinu (Lipps, Füllkrug, and Beck, 1996). Katepsin L (klan CA, skupina C1) je další z významných cysteinových peptidáz u S. mansoni. Jeho optimální aktivita se pohybuje při ph 4-6, spíše kyselejší, oproti katepsinu B. Pre-prokatepsin L je kódován 319 aminokyselinovými residui, kde je zahrnut i signální peptid. Po zpracování se plnohodnotný enzym skládá z 215 aminokyselinových residuí. Jeho molekulová hmotnost je něco kolem 24 kda. Katepsin L je u S. mansoni exprimován v několika isoformách např. SmCL1 a SmCL2. SmCL2 neboli katepsin L2 je nadměrně exprimován u samice ve srovnání se samcem a předpokládá se, že je zapojen do reprodukčních procesů samice a trávících procesů ve střevě samce (Brindley et al., 1997). Katepsin D (klan AA, skupina A1) byl lokalizován pomocí konfokálního mikroskopu v gastrodermis Schistosom, a byla také prokázána zvýšená exprese této peptidázy u samiček parazita oproti samcům. Další analýza katepsinu D potvrdila výskyt ~ 16 ~
na sub-buněčné úrovni a to konkrétně v povrchových trávicích vakuolách střeva a ve vezikulách gastrodermálního drsného endoplazmatického retikula. Po podrobnějším prozkoumání aktivity bylo zjištěno, že peptidáza štěpí Hb při ph optimu 2,5-4,6. Schistosoma mansoni katepsin D rozkládá Hb na 15 různých místech. Z toho většina těchto míst má určitou podobnost se štěpy vznikajícími po účinku lidského katepsinu D v přítomnosti Hb. Výše uvedené informace společně poskytují přesvědčivé důkazy o významném podílu katepsinu D na degradaci hemoglobinu u Schistosom (Brindley et al., 2001). Katepsin C (klan CA, skupina C1) patří mezi exopeptidázy, patřící do skupiny diaminopeptidáz zahrnující i skupinu papain. Syntetizován jako pre-prokatepsin C složený ze 454 aminokyselinových residuí, z nichž 29 patří signálnímu peptidu, 193 patří propeptidu a zbylých 237 je samotný aktivovaný enzym, který je lokalizován ve střevě. Funkce propeptidu není zatím zcela jasná, ale jak je tomu u ostatních peptidáz, bude hrát roli ve správném složení aktivovaného enzymu. Schistosoma mansoni katepsin C je z 30% identický s enzymy Sm31 a SmCL a vykazuje strukturní podobnost s enzymem papain. Z biochemického hlediska hraje důležitou roli v degradaci hostitelova Hb na snadno vstřebatelné peptidy, které vytváří svým štěpením až po degradaci Hb endopeptidázami jako je například katepsin D. Nejvyšší aktivitu štěpení Hb vykazuje katepsin D v ph optimu 5,5 (Brindley et al., 1997). Legumain (klan CD, skupina C13) je další významná molekula, která je součástí proteolytické kaskády u Schistosom. Patří do asparagových endopeptidáz, což jsou nový členové skupiny cysteinových peptidáz nazývané jako Legumainy. Je také známý jako Sm32 nebo SmEA a byl lokalizován v epitelu střeva a cephalic glands, což jsou žlázy blízko hlavy u cerkarií. Funkce této peptidázy není dle dostupné literatury zcela jasná. Předpokládá se, že hraje roli v degradaci Hb, ale než v jeho rozkladu, tak v procesech posttranslačních modifikacích, které regulují aktivitu jiných molekul. Jeho molekulová hmotnost se odhaduje na 50 kda a jednořetězcová mrna tohoto proteinu má 429 aminokyselinových residuí s optimální ph 6,8 a teplotu mezi 37-45 C. Legumain hydrolyzuje peptidické vazby na karboxylovém konci, kde se nachází Asn (asparagin). Kromě případů, kdy Asn je na NH 2 -konci nebo na druhé pozici od NH 2 -konce polypeptidu nebo tam, kde je Asn glykosylován (Oliver et al., 2006; Skelly and Shoemaker, 2001; J P Dalton, Hola-Jamriska and Brindley, 1995; Brindley et al., 1997). ~ 17 ~
5.2. Monogenea Taxonomie: Říše: Animalia (živočichové) Podříše: Eumetazoa Nadkmen: Bilateria (trojlistí) Kmen: Platyhelminthes (ploštěnci) Třída: Monogenea Obecná charakteristika: Monogenea jsou parazitní platyhelminti, kteří mají přímé životní cykly, bez účasti střídání generací nebo hostitelů. Většina monogeneí jsou ektoparaziti a zamořují kůži a žábry mořských a sladkovodních ryb. Ostatní jsou endoparaziti, jako jsou polystomatidae, kteří se nacházejí v močovém měchýři obojživelníků a plazů a mezi amphibdellidae parazitující na žábrách existují tři druhy, kteří ve svých mladistvých stádiích obývají krevní systém parejnoka elektrického. Trávicí soustava: Obrázek č. 3: Obecná morfologie Monogeneí, (Smyth and Halton, 1984, upraveno). ~ 18 ~
Modelový organismus: Eudiplozoon nipponicum Obrázek č. 4: Eudiplozoon nipponicum, (Hodová I., 2008, upraveno), Legenda: vi vitelária, po přichycovací orgán, hl hltan, op opishaptor, sv svorky. Charakteristika: Druhy rodu Diplozoon jsou žaberními cizopasníky kaprovitých ryb. Jde o relativně velké parazity (asi 7 mm). Jejich důležitou životní fázi je vyhledávání vhodného hostitele, které probíhá ve stádiu vajíčka s onkomiracidiem. Po přichycení se vajíčko přemění na larvu zvanou diporpa. Tato larva musí najít jinou diporpu, se kterou se vzájemně přichytí malými přísavkami a dojde ke srůstu obou jedinců. Dospělý parazit má proto tvar písmene X (Volf P., 2007). U třídy Monogenea existuje několik málo způsobů příjmu potravy, ten nejvíce prostudovaný je u Entobdella soleae. Ventrální přísavka připomíná kruhovitý zvon, který je těsně přiložen na epidermis hostitele. Poté se příslušné žlázy, které jsou součásti hltanu, vychlípí přes ventrální ústa až na epidermis (Obr. č. 5). Přisátí trvá asi 5 minut. V průběhu této doby, jsou trávicí sekrety z hltanu, a pravděpodobně i z jícnu uvolňovány na kůži, která byla pomocí úst oddělena a uzavřena od vnějšího prostředí. Produkty trávení jsou pak transportovány do střeva pomocí peristaltické kontrakce hltanu. Mimotělní trávení hostitelových buněk je omezeno na epidermis. Žaberní paraziti jako je Diclidophora a Diplozoon, ze skupiny monogenea, se pomocí přísavek přichytávají k žaberní tkáni ryb. Pravděpodobné sání spárovaných bukálních přísavek a hltanu naruší cévy a uvolněná krev se pak dostává do střeva pomocí hltanu. Sekrety některých žláz v přední části trávicí trubice mohou mít ~ 19 ~
proteolytickou funkci (usnadňují rozpad organické tkáně) a usnadňují tak rupturu krevních cév, jiné mohou obsahovat antikoagulační látky a předcházet tak ucpání přední části trávicí trubice sraženinou tvořenou z krve. Jakmile je krevní céva narušena, může dojít skoro k nepřetržitému krmení, jak je známo v případě parazita čeledi Diplozoon, oproti přerušovanému krmení tkáně u většiny Monopisthocotylea (Smyth and Halton, 1984). Obrázek č. 5: Příjem potravy Entobdella soleae, (Smyth and Halton 1984). Trávení a významné molekuly: Na rozdíl od motolic, trávení jednorodých je pravděpodobně z velké části intracelulární a zdá se, že jsou zapojeny všechny prvky lysozomálního systému (např. trávicí enzymy obsažené v lysozomu). Předběžná extracelulární fáze je zahájena působením sekretů žláz v přední části trávicí trubice a slouží k degradaci složitějších složek (např.: hostitelské epidermální buňky, hlen, krvinky) na velikost vhodnou pro endocytózu pomocí gastrodermis. U rodu Calicotyle, jsou jednotlivé složky rozloženy na poměrně homogenní směs pomocí extracelulárního trávení, u většiny krev sajících zástupců podtřídy Polyopisthocotylea existuje intraluminální hemolýza, která rozkládá hostitelské erytrocyty do tří hodin po požití. Nutrienty (hlen, zbytky epidermálních buněk, uvolněný hemoglobin) jsou poměrně rychle transportovány prostřednictvím endocytózy do intracelulárního zažívacího ústrojí membránově vázaných vakuol (např. Calicotyle, Protopolystoma) nebo do kanálků (např. Diclidophora, Euzetrema). Tento typ intracelulárního trávení vyúsťuje v transport rozpustných produktů do cytoplasmy. Nestrávené a nestravitelné zbytky potravy jsou pak přeneseny exocytózou zpět do střevní lumen (Smyth and Halton, 1984). Mezi významné skupiny molekul zapojených do interakce parazit-hostitel patří proteolytické enzymy - peptidázy. Avšak zatím jediná popsaná peptidáza u Monogeneí je však pro tuto chvíli cysteinová peptidáza typu katepsin L, (Neobenedenia melleni) ~ 20 ~
(Rao and Yang, 2007), tato peptidáza byla identifikována a charakterizována u mnoha dalších nepříbuzných parazitárních organismů (Franta et al., 2011; Day et al., 1995; Harmsen et al., 2004). Jediná studie týkající se katepsinu L u mořských Monogeneí (N. melleni) naznačuje, že exprese katepsinu L je závislá na vývojovém stádiu (nejnižší míra exprese vajíčka a nejvyšší dospělci). Primární sekvence katepsinu L N. melleni je významně podobná dříve popsaným katepsinům L jiných druhů parazitických organismů, což jen potvrzuje pravděpodobný podíl na trávení. Příkladem může být degradace krevních složek některých proteinů (fibronektin, laminin a nativní kolagen) či imunoglobulinů hostitele (Rao and Yang, 2007). U skupiny monogenea, konkrétně u parazita Neobenedenia girellae, byl zjištěn výskyt aktivních peptidáz. Studie byla provedena pomocí zymografie, kde se pracovalo s homogenizovanými vzorky dospělého parazita N. girellae a vzorky onkomiracidií (larvální stádium jednorodých). V rámci experimentu s extrakty dospělců byly objeveny čtyři oblasti s peptidázovou aktivitou a to v molekulové hmotnosti 88, 107, 149, 167 kda a dva aktivní enzymy u onkomiracidia s molekulovou hmotností 147 a 166 kda. Tyto aktivní enzymy byly inhibované Pefabloc SC (inhibitor serinových peptidáz). Zato inhibitory E-64 (inhibice cysteinových peptidáz) a Pepstatin A (inhibice asparagových peptidáz) nevykazovaly žádnou inhibici aktivních enzymů. Z toho lze předpokládat, že objevené peptidázy patří do skupiny serinových peptidáz. Jejich optimální aktivita je při ph 8,5 v rozmezí teplot od 15 C do 37 C (Hirazawa et al. 2006). 5.3. Nematoda Taxonomie: Říše: Animalia (živočichové) Podříše: Eumetazoa Nadkmen: Bilateria (trojlistí) Kmen: Nematoda (hlístice) Obecná charakteristika: Hlístice (nematoda) jsou jednou z nejpočetnějších a nejrozšířenějších skupin živočichů. Dosud bylo popsáno téměř 20 tisíc druhů parazitujících v obratlovcích, přičemž mnoho dalších žije volným způsobem života či jako paraziti bezobratlých a rostlin. Dospělci hlístic parazitujících v obratlovcích jsou lokalizováni nejčastěji ~ 21 ~
v trávicím traktu, ale i v dalších orgánových soustavách, jako je krevní a lymfatický oběh, nervová soustava, urogenitální trakt, dýchací soustava, v tělních dutinách, kůži atd. Tělo hlístic má zpravidla kruhový průřez, bývá protáhlé, většinou niťovitého, válcovitého nebo vřetenovitého tvaru. Důležitým znakem je také pohlavní dimorfismus, kdy samička dorůstá větších rozměrů. Povrch těla tvoří několikavrstevná kutikula, jejíž stavba se může značně lišit mezi jednotlivými skupinami. V mnoha případech je to velmi složitá dynamická struktura. Lemuje všechny ektodermální části trávicího traktu. Není jen pasivní strukturou s opornou funkcí ( vnější kostra ), ale umožňuje i pohyb hlístic, tvoří ochranou bariéru, probíhá přes ni výměna látek s prostředím a účastní se interakcí s organismem hostitele. Kutikula může být utvářena do různých struktur (trny, papily, žebra, hřebeny), které jsou často využívány k odlišení druhů. Tyto struktury mohou mít příchytnou funkci, popř. u samců mohou fungovat jako přídavné kopulační orgány (Volf P., 2007; Kennedy and Harnett, 2001; Lee, 2004). Trávicí soustava: Trávicí soustava je u většiny parazitických hlístic dobře vyvinuta. Zdrojem potravy pro parazitické hlístice může být např. trávenina z trávicího traktu hostitele, buněčná drť z parazitovaných tkání, ale také tělní tekutiny včetně krve. Část živin může být i přes přítomnost kompaktní kutikuly přijímána povrchem těla. Ústní dutina je přizpůsobena přijímání daného typu potravy - na jejím počátku mohou být různé pohyblivé útvary zvané pysky (labia), někdy ozubené. Samotná ústní dutina bývá různého tvaru a velikosti (Obr. č. 7), vyústění je většinou terminální, výjimečně subterminální. U některých skupin tvoří mohutnou kapsulu, na jejímž dně mohou být zuby nebo lišty. U fytopatogenních hlístic a některých entomofágních skupin je ústní dutina přeměněna v dutou bodcovitou strukturu zvanou stomatostyl (stylet). Za ústní dutinou následuje hltan (farynx), tedy svalnatá pumpa zajišťující příjem potravy. Ten může být rozdělen na část žlaznatou a část svalnatou. V zadní části se může rozšiřovat a vytvářet kulovitý či kónický bulbus, u trichineloidních hlístic tvoří lem hltanu žlaznaté buňky, tzv. stichocyty, uspořádané do stichosomu (Obr. č. 6). Střevo bývá jednoduchá trubice, na jejímž začátku se někdy vyskytuje postranní výběžek - caecum. U samic ústí střevo análním otvorem, u samců je vyústění společné s pohlavní soustavou do kloaky (Volf P., 2007; Kennedy and Harnett, 2001; Lee, 2004). ~ 22 ~
Obrázek č. 6: Morfologie hlístic, (Courtesy C. Jasalavich, www.apsnet.org/edcenter/k12/teachersguide/nematode/articl e%20images/morphology.jpg, upraveno). Obrázek č. 7: Typy hltanů u parazitických hlístic, (Félix MA., Barriére A., 2006, upraveno). ~ 23 ~
Modelový organismus: Necator americanus Obrázek č. 8: Necator americanus, (www.phsource.us/ph/helm/helminths.htm, upraveno), Legenda: A samička, B samec, C přední konec samičky, D zádní konec samičky, E zadní konec samce. Charakteristika: Parazit, Necator americanus, z kmene nematoda se vyskytuje převážně v centrální a jižní Africe, jižní Asii, Austrálii a na ostrovech v Tichomoří. Patří mezi důležité lidské patogeny. Dospělý paraziti tohoto červa jsou malého vzrůstu s válcovitým tvarem, jejich délka se pohybuje mezi 0,5 až 1,5 mm. Zadní konec samčího těla je vybaven charakteristickou kopulační bursou, která je také využívána k přichycení a držení samičky na místě během rozmnožování. Samičky sami mají pochvu situovanou uprostřed těla. Přední konec jejich těla parazita je zformován do ústní kapsule, která je vybavena na ventrálních okrajích řezacími destičkami. Uvnitř kapsle samotné se nacházejí dorzální zuby (Division of Microbiology and Parasitology, 2010). Trávení a významné molekuly: Krev sající paraziti používají mechanicky odlišné proteázy k rozkladu hemoglobinu (Hb), často využívajíc spolupráci multienzymových kaskád. Příkladem je parazit Necator americanus, u kterého dosud byly zjištěny tři zásadní proteolytické ~ 24 ~
enzymy podílející se na degradaci hemoglobinu (hemoglobinázy). Patří mezi ně asparagová proteáza Na-APR-1, cysteinová proteáza Na-CP-3 a metalopeptidáza Na-MEP-1 (Najju Ranjit et al., 2009). K uvolnění hemoglobinu do střevní lumen parazita, dochází po hemolýze požitých erytrocytů (Don et al., 2004). Pak stejně jako u ostatních krev sajících parazitů dochází k rozkladu Hb pomocí kaskády proteolytických enzymů (Williamson, Brindley, Knox, et al., 2003). Z analýzy Na-APR-1 bylo zjištěno, že jeho rekombinantní forma je schopna štěpit lidský hemoglobin, na rozdíl od enzymů Na-CP-3 a Na-MEP-1, které nemohou štěpit Hb, ale místo toho štěpí globinové fragmenty, které byly předtím hydrolyzovány Na-APR-1. Toto naznačuje uspořádaný kaskádovitý proces degradace hemoglobinu. Všechny tři proteázy se vyznačují určitou specifičností v rámci Hb. Optimální ph pro štěpení Hb se pohybuje mezi 3,5 až 4,5, i když štěpení probíhalo i při ph 5,5, ale pomaleji (Najju Ranjit et al., 2009). V rámci studie molekul, které se podílejí na trávení, ve střevě N. americanus byly doposud zjištěny i další cysteinové proteázy, avšak doposud nebyl prokázána jejich proteolytická aktivita. Z toho vyplývá, že zatím nemůžeme určit přesný počet enzymů, které degradují Hb u parazita N. americanus (N. Ranjit et al., 2006). Jak poukazuje další studie (Williamson, Brindley, Abbenante, et al., 2003), Na-APR-1 není jedinou hemoglobinázou podílející se na degradaci neporušeného Hb ve střevě N. americanus. Na-APR-2, asparagová peptidáza z pepsinové skupiny, také štěpí neporušený Hb a je dle aminokyselinové sekvence z 85% podobná s Na-APR-1. Na-APR-2 byla detekována pouze u dospělých stádií parazita N. americanus a bylo prokázáno, že tento enzym je produková do lumen střeva, vylučovacích žláz a v chemosensorních orgánech umístěných v přední (hlava) části těla nematod, ve spodní části úst. U rekombinantní Na- APR-2 nebyla prokázána degradace kolagenu, naproti tomu byla dokázána určitá afinita k lidskému Hb a ke krevnímu séru (albuminy, fibrinogen, plazmatické proteiny). Degradace lidského Hb je skoro dvakrát efektivnější než u Hb ve zvířecích hostitelích jako je pes. Navíc proteáza Na-APR-2 sdílí pouze 25% štěpících míst uvnitř lidského hemoglobinu s peptidázou Na-APR-1 (Williamson, Brindley, Abbenante, et al., 2003). Na-CP-3 (klan CA, skupina C1) neboli katepsin B parazita N. americanus patří do skupiny cysteinových peptidáz. Enzym je lokalizován ve střevě parazita. Rozkládá globinové fragmenty, ale až po zahájení degradace Hb cysteinovou peptidázou Na-APR-1. Jako aktivní enzym obsahuje 270 aminokyselinových reziduí a jeho ~ 25 ~
molekulová hmotnost se odhaduje na 30 kda. Optimální degradace globinových fragmentů je v kyselém prostředí při ph 4 (Najju Ranjit et al., 2008). Na-MEP-1 (klan MA, skupina M13) patří mezi metalopeptidázy. Také se řadí mezi velkou skupinu endopeptidáz, které narušují peptidové vazby uvnitř molekuly. Jako samostatný enzym není schopen trávení Hb, ale po pre-fragmentaci ostatními enzymy (Na-APR-1, Na-CP-3) je schopen degradace globinových fragmentů, které jsou tvořeny z tetrameru Hb peptidázou Na-APR-1. U tohoto enzymu bylo pozorováno 16 oblastí degradace globinových fragmentů na α řetězci a dalších 8 oblastí na β řetězci. Metalopeptidáza Na-MEP-1 preferuje na P1 pozici hydrofobní zbytky aminokyselin, jako jsou například Val, Leu, Ile, Met a další (Najju Ranjit et al., 2009) 5.4. Členovci Taxonomie: Říše: Animalia (živočichové) Podříše: Eumetazoa Nadkmen: Bilateria (trojlistí) Kmen: Arthropoda (členovci) Obecná charakteristika: Členovci jsou nejpočetnější skupinou živočichů a předpokládá se, že čítají více jak 80% všech známých druhů více buněčných organismů. U členovců se setkáváme s nejširší škálou různých forem parazitismu, včetně parazitoidů (např. lumci), kleptoparazitů (mnohé brachycerní mouchy) a sociálních parazitů (mravenci). Mnoho skupin je typickými ektoparazity. Poměrně málo zástupců se přizpůsobilo životu uvnitř těl svých hostitelů, a proto o endoparazitech můžeme hovořit jen u několika skupin roztočů (přibližně 500 druhů), u jazyčnatek a u larev některých much a střečků. Parazitické členovce lze dělit na parazity dočasné (temporární), mezi které patří například vši, kloši a klíšťata, a trvalé (permanentní) kam patří komáři, glosiny, ovádi a ploštice. Tělo většiny členovců je na svém povrchu pokryté zesílenou kutikulou, která tak tvoří vnější kostru (exoskelet), na níž se upínají svaly i další vnitřní orgány. Charakteristická je segmentace těla na články z nichž každý má tergum (hřbetní část), sternum (břišní část) a končetiny. Původně nesl každý článek těla (kromě prvního ~ 26 ~
a posledního) jeden pár končetin, z nichž některé v průběhu evoluce buď zcela zmizely, zakrněly, nebo se různě pozměnily. Krev je pro hematofágní parazitické členovce zdrojem proteinů nutných pro reprodukci (např. pro vývoj vajíček) a pro některé i jediným zdrojem energie. Příjem potravy je možno rozdělit na tři hlavní fáze: vyhledání hostitele, nasátí krve a její zpracování v trávicím traktu. Členovec se za účelem nasátí snaží zvýšit pravděpodobnost kontaktu s hostitelem. Například dospělci klíšťat Ixodes ricinus se zdržují na vegetaci, kde zaujímají typickou vyčkávací polohu s roztaženým předním párem nohou. Při vyhledání hostitele využívají parazitičtí členovci především pachové a optické stimuly, a též infračervené záření. Pachové signály jsou důležité pro všechny skupiny krev sajících členovců. Univerzálním pachovým atraktantem je oxid uhličitý. V atmosféře je koncentrace tohoto plynu 0,03%, zatímco v dechu člověka asi 4,5%. Většina parazitických členovců je schopna rozpoznávat i setinové změny koncentrace oxidu uhličitého a na drobné zvýšení jeho koncentrace reaguje parazit pozitivně chemotakticky. Optické signály jsou využívány hlavně dvoukřídlým hmyzem. Který létá ve dne na otevřených prostranstvích. Infračervené záření je využíváno krev sajícími parazity zpravidla až v závěrečné fázi vyhledávání, při přímém kontaktu s hostitelem. Teplo vyzařované hostitelem či předmětem též může stimulovat bodnutí (Khanna, 2004; Zrzavý and Štys, 1997; Volf P., 2007). Trávicí soustava: Trávicí soustava je trubicovitá a má tři hlavní oddíly. Přední část nazývaná stomodeum se u hmyzu dále člení na sosák (proboscis), dutinu ústní, hltan a jícen, příp. jeho rozšířeninu esofageální divertikulum (vole). Tato část zajišťuje mechanické zpracování potravy a v případě volete i její uchovávání. Proktodeum (zadní střevo) začíná rozšířenou částí zvanou pylorus, do které ústí několik (2-6) malpighických trubic, a končí rektem či rektální ampulí. Stomodeum i proktodeum jsou ektodermálního původu, a proto jsou vystlány chitinovou kutikulou různé síly. Mesenteron (střední střevo) je entodermálního původu a není vystláno kutikulou. Je orgánem, v němž probíhá vlastní trávení přijaté potravy. U hmyzu je trávení extracelulární a hydrolytické enzymy včetně peptidáz jsou sekretovány do lumen mesenteronu. Mesenteron je tvořen jednovrstevným epitelem, který směrem do lumen střeva vytváří mikroklky (mikrovily) a na vnější straně, směrem do hemocoelu, ~ 27 ~
je ohraničen bazální membránou. Na začátku a konci mesenteronu se nacházejí stomodeální a pylorické svěrače (valvy). Kromě trávicích enzymů produkuje epitel mesenteronu i peritrofickou matrix a absorbuje vodu, ionty a živiny. U roztočů probíhá podstatná část trávení intracelulárně. Mesenteron vybíhá v množství záhybů (Obrázek č. 9) a jeho epitel není opatřen mikrovily, ale je tvořen trávicími buňkami, které pohlcují a zpracovávají potravu. Opotřebované trávicí buňky s nestrávenými zbytky potravy jsou vypuzeny do lumen střeva a nahrazeny novými. Díky tomuto intracelulárnímu trávení je v lumen mesenteronu klíšťat minimum peptidáz, což poskytuje vhodné podmínky přenášeným patogenům (Khanna, 2004; Zrzavý and Štys, 1997). Obrázek č. 9: Schéma trávicí soustavy vybraných zástupců hematofágních členovců, (Volf P. 2007), Legenda: A - klíště: ME - mesenteron, SL - slinná žláza, B - blecha: PR - proventrikulus, ME - mesenteron, C - ploštice čeledi Triatominae: ES - esofagus, SL - slinné žlázy, PM - přední (široká) část mesenteronu, ZM - zadní (tenká) část mesenteronu, D - komár: ED - esofageální divertikulum (vole), KA - kardie, SL - slinné žlázy, AM - anteriorní mesenteron, PM - posteriorní mesenteron, E - glosina: KA - kardie, ED - esofageální divertikulum, ME mesenteron. ~ 28 ~
5.4.1. Třída Chelicerata (klepítkatci) Modelový organismu: Ixodes ricinus Obrázek č. 10: Ixodes ricinus, (http://www.dama.cz/zdravi/images/kliste.jpg, upraveno). Charakteristika: Až na výjimky musí všechna vývojová stadia klíšťat sát krev a většina představitelů tohoto řádu jsou obligatorními ektoparazity. Ixodes ricinus patří do čeledi Ixodidae (klíšťatovití). Má typický tří-hostitelský cyklus. Dospělá klíšťata (Obrázek č. 11), mají na hřbetní straně těla typický tvrdý štítek (scutum), který u samců kryje téměř celé tělo, u samiček pak v nenasátém stavu zasahuje pouze do poloviny či třetiny jejich jinak velmi elastického idiosomu. Díky tomuto uspořádání může samička při sání mnohonásobně zvětšit svůj objem a získat tak dostatek potravy pro tvorbu vajíček. Gnathosoma (ústa a části podílející se na příkmu potravy) klíšťat vyčnívá z obrysu těla a je vybavena typickým ústním ústrojím, ze kterého je nejnápadnější jakýsi rypáček zvaný hypostom (Obrázek č. 11). Po přisátí setrvává klíště na svém hostiteli po řadu dní a jeho ukotvení prostřednictvím hypostomu v tkáni hostitele může být u některých druhů klíšťat posíleno ještě vyloučením zvláštní bílkovinně hmoty zvané cement. Hladová klíšťata většinou číhají na svého hostitele na vegetaci. Přítomnost hostitele zjišťují prostřednictvím citlivého Hallerova orgánu, který vnímá teplo, CO 2 a další chemické sloučeniny. Je umístěn na tarzálních článcích předního páru nohou, které mají kvůli lepší orientaci doširoka roztažené. ~ 29 ~
Obrázek č. 11: Ixodes ricinus a detail hypostoma, (www.biolib.cz/img/gal/17501.jpg, Volf P., 2007, upraveno), Legenda: A - dospělý samec, B - dospělá samice (nenasátá), C - dospělá samice (nasátá). GN - gnathosoma, SC - scutum (Štítek), ID idiosoma. Trávení a významné molekuly: Sání krve je kritickým momentem životního cyklu krev sajících členovců. Cílem parazitů skupiny Ixodidae je nasát se rychle a nepozorovaně tak, aby nevyvolali obranné chování hostitele. Přitom se musí vypořádat s několika problémy: najít cévu, poškodit ji a nasát se, aniž by došlo ke koagulaci, vazokonstrikci a zánětu. Adaptace ústního ústrojí k sání krve proběhla nezávisle u různých skupin členovců. Dva základní typy sání krve: solenofágní paraziti (sají krev přímo z cévy), thelmofágní paraziti (sají krev z drobných hematomů vytvořených krví vylitou z poškozených cév), (Volf P., 2007). Proces sání krve a její degradace se vyvinul nezávisle u obou čeledí klíšťat (Argasidae a Ixodidae) (Mans and Neitz, 2004). Na rozdíl od hematofágního hmyzu je u klíšťat proces trávení krve pomalý a probíhá pouze v kyselém prostředí v endo/lysosomálních kompartmentech střevních buněk (Sonenshine et al., 2005). Proteolytická výbava skupiny Ixodidae se skládá z cysteinových a asparagových peptidáz a podobá se trávicímu systému parazitických ploštěnců a nematod (Fogaça et al., 1999; Sonenshine et al., 2005). Trávicí soustavu lze rozdělit na tři hlavní části: foregut (přední střevo), midgut (střední střevo) a hindgut (trávicí trakt). Tyto oblasti střeva se liší jak funkčně tak i morfologicky, s tím že midgut hraje roli výkonného orgánu (Obrázek č. 12), který se ~ 30 ~
skládá z krátké centrální části, nazývané ventrikulus (žaludek) a několika párů slepých, trubkovitých a velmi rozvětvených divertikul (slepé střevo), které pronikají do celého těla a vytváří tak hlavní orgán v těle samičky Ixodes ricinus. I když žaludek a rozvětvené slepé střevo vykazují rozdílnou morfologii, jsou anatomicky konzistentní a mají identickou trávicí funkci (Amosova, Ivanov, and Leonovich, 1983). Obrázek č. 12: Midgut Ixodes ricinus, (Franta Z., 2012), Legenda: S stomach (žaludek), DV divertikula (slepá střeva). Prvním krokem v trávicím procesu krve u klíšťat je hemolýza červených krvinek, která se odehrává v lumen střeva. Později byla identifikována molekula enzymu nazývaného cubilin, který je z rodiny serinových peptidáz a lze předpokládat, že je také zodpovědný za rozklad červených krvinek, byl charakterizován jako hemolytický enzym (H1SP) u Haemaphysalis longicornis. Cubilin (H1SP) byl identifikován v lumen střeva. Rekombinantní forma tohoto enzymu vykazuje hemolýzu hostitelských erytrocytů in vitro při optimálním ph 6. Kromě toho, hemolytická role endogenního H1SP byla dokázána pomocí metody RNA interference, kde dochází k interakci určitých fragmentů dsrna s exprimovanými geny (Miyoshi et al., 2007). I přes obecně přijímaný názor, že nedochází k žádné extracelulární aktivitě ve střevě klíšťat, výše uvedené studie ukazují, že serinové peptidázy mohou hrát určitou roli v lumen střeva. Nicméně detailní molekulární podstata hemolýzy zůstává stále nezjištěna (Franta Z., 2012). Dalším krokem je intracelulární degradace neporušeného tetrameru hemoglobinu na menší fragmenty pomocí kaskády hemoglobináz. Hemoglobin tedy primárně štěpí endopeptidázy z asparagové a cysteinové skupiny (katepsin D podporuje katepsin L a ~ 31 ~
AE/legumain). V dalším kroku je tato proteolytická dráha zakončena cysteinovými peptidázy typu papain (katepsin B a katepsin L). Konečným krokem je uvolnění volných aminokyselin činností leucin amino-peptidázy a serinové karboxy-peptidázy (Horn et al., 2009). Katepsin D (klan AA, skupina A1) je vyjádřen v několika isoformách z nichž nejznámější jsou IrCD1 a IrCD2. Oba enzymy se řadí mezi endopeptidázy a patří do skupiny cysteinových peptidáz. IrCD1 byl lokalizován ve střevním epitelu, naproti tomu IrCD2 byl lokalizován v několika tkáních a to ve střevě a slinných žláz samičky I. ricinus. Exprese peptidáz je vyvolána sáním klíštěte na hostiteli. Bylo zjištěno, že enzymy jsou auto-aktivovány. Jejich optimální ph je kyselé. Obě peptidázy (IrCD1 a IrCD2) se podílejí na trávení Hb. Mimo jiné peptidáza IrCD1 při štěpení preferuje Tyr (Tyrosin) na P3 pozici a Ala (Alanin) v P2 pozici (Sojka et al., 2012). Katepsin L (klan CA, skupina C1), také známý jako IrCL1 je součástí střevní trávicí kaskády proteolytických enzymů. Řadí se mezi endopeptidázy. Jeho aktivita hraje důležitou roli v první fázi degradace Hb (rozkládá hemoglobin a albumin). Největší aktivitu vykazuje v kyselém prostředí s velmi nízkým ph 3-4. Nestabilním se stává už nad ph 5. To svědčí o endo/lysozomální lokalizaci ve váčcích střevních trávicích buněk. Nejvyšší preferenci má katepsin L k Arg (Arginin) v P1 pozici. V P2 pozici preferuje aminokyseliny s aromatickými zbytky jako Trp (Tryptofan), Phe (Fenylalanin) a Tyr (Tyrosin), či rozvětvené alifatické aminokyseliny jako Val (Valin), Leu (Leucin) a Ile (Isoleucin) (Franta et al., 2011). Katepsin B (klan CA, skupina C1) patří do skupiny nazývané longipain a jako nativní enzym byl výhradně pozorován u I. ricinus ve střevní tkáni. Během jeho degradace Hb byla pozorována jeho endopeptidázová aktivita, tak i exopeptidázová aktivita (Horn et al., 2009). Pomocí inhibitoru CA-074 (speciální inhibitor katepsinu B) bylo prokázáno, že aktivita katepsinu B je pro I. ricinus velmi zásadní peptidázou v procesu zpracování Hb (Franta et al., 2010). AE/legumin (klan CD, skupina C13) patří mezi cysteinové peptidázy. Je produkován do střeva a exprimován uvnitř i na povrchu trávicích buněk a také ve střevním epitelu. Největší aktivitu má při kyselém ph 4,5. Bylo prokázáno, že legumain se podílí na primárním štěpení molekul Hb. Odhadovaná molekulová hmotnost je 47 kda. Skládá se ze 441 aminokyselinových reziduí. Prvních 22 reziduí patří signálnímu peptidu, zbylé aminokyseliny patří propeptidu. Legumain má striktní afinitu ~ 32 ~
pro Asn (Asparagin) v P1 pozici. V pozici P2 preferuje Thr (Threonin) a Ala (Alanin) (Sojka et al., 2007). Serinová karboxy-peptidáza (H1SCP1) byla objevena u H. longicornis. Její exprese je během sání a trávení regulována. Peptidáza se nachází uvnitř trávicích buněk a na jejich povrchu. Trávení hemoglobinu probíhá v širokém rozsahu ph (Franta Z., 2012). Leucin amino-peptidáza (H1LAP) byla lokalizována v cytosolu buněk střeva a slinných žláz. Stejně jako H1SCP1 je exprese této peptidázy regulována během celého procesu trávení (Motobu et al., 2007). Rekombinantní enzym H1LAP má optimální aktivitu v alkalickém prostředí a to při ph 8. Její hydrolytická aktivita je zaměřena na N- terminální aminokyseliny (Franta Z., 2012). 5.4.2. Třída Insecta (hmyz) Taxonomie: Říše: Animalia (živočichové) Podříše: Eumetazoa Nadkmen: Bilateria (trojlistí) Kmen: Arthropoda (členovci) Třída: Insecta (hmyz) Obecná charakteristika: Hematofágní parazitický krev sající hmyz pochází většinou z řádu Hemiptera (ploštice) a Siphonaptera (blechy). Z čeledi Cimicidae (řád Hemiptera) jsou všichni členové krev sající paraziti. Většina z nich parazituje na netopýrech a/nebo ptácích, i když malá skupina se živí na větších savcích. Do této skupiny patří dva druhy běžně známé jako štěnice Cimex lectularius a Cimex hemipterus, který saje krev na lidech. Štěnice sají krev během noci na spícím hostiteli. V místě kousnutí často dochází k otokům a zánětům. Dospělé štěnice jsou bezkřídlé, dorzoventrálně sploštělé, zbarveny do hněda a mají 4 7 mm na délku. Jejich ústní ústrojí je během klidového stádia (přes den) složeno pod hlavou a hrudníkem. U řádu Cimicidae existuje 5 nymfálních stádií, z nichž každé stádium se potřebuje nakrmit 1 až 2 krát, aby mohlo pokračovat ve vývoji do dalšího stádia. Nymfy i dospělci se živí pouze krví. K získávání dalších potřebných nutrientů jim ~ 33 ~
slouží symbiotické mikroorganismy, umístěné v mycetomu (skupina specializovaných střevních a tukových buněk). Druhá skupina krev sajícího hmyzu je z čeledi Reduviidae, která zahrnuje podčeleď Triatominae, skládající se většinou z krev sajících parazitů, zahrnující 138 druhů. Tito paraziti sají krev na různých obratlovcích včetně lidí. Některé druhy, zejména Triatoma infestans a v menší míře Rhodnius prolixus, se staly úzce spojeny s domácím prostředím člověka. Dospělý jedinci podčeledi Triatominae dorůstají do délky od 0,5 cm (Alberprosenia goyovargasi) do 4,5 cm (Dipetalogaster maxima). Tito parazité jsou často výrazně zvarveni žlutými a oranžovými skvrnami na okraji jejich břicha. Stejně jako štěnice mají ústní ústrojí složeno pod hlavou a hrudníkem. Obvykle sají krev každé čtyři až devět dní, ale také dokáží hladovět až několik měsíců. Řád Siphonaptera obsahuje blechy. Bylo popsáno asi 2500 druhů, z nichž všechny jsou ektoparaziti na teplokrevných hostitelých (90% savci a 6% ptáci). Nejznámější zástupci jsou blecha kočičí (Ctenocephalides felis) a psí (Ctenocephalides canis). Blechy jsou velkou skupinou přenášející nemoci (např. Černý mor, Tularémie u savů) a také se stávají mezihostiteli nekterých helmintů (např. Dipylidium caninum - tasemnice). Dospělí jedinci jsou malého vzrůstu (<5 mm), zbarveni do hněda, bezkřídlí, zpolštělí a sají krev. Frekvence sání krve se výrazně liší mezi druhy, obecně platí, že samci sají krev častěji než samice, ale sají malé množství krve. Při nedostatku krve jsou schopny hladovět až nekolik měsíců (Lehane M. J., 2005). Trávicí soustava: Trávicí systém hmyzu je složen z trávicí trubice a příslušných žláz. Morfologie trávicího systému je extrémě různorodá, kvůli individuálním potřebám každé jednotlivé skupiny hmyzu, zvláště se liší v technikách sání krve. Při procesu sání jsou nutrienty nasávaný přes ústa, kde jsou smíchany se sekrety slinných žláz. Ty mohou nebo nemusí obsahovat trávicí enzymy. Trávicí soustava je tvořena částí foregut a hindgut. Foregut slouží převážně ke skladování krve, jeho objem může být zvětšen pomocí divertiklu, což je vychlípka stěny trávicí trubice připomínající kapsuli. Krev je pak transportována do části hindgut, kde dochází k degradaci a absorbci nutrientů (Meister Alton, 2009). ~ 34 ~
Modelový organismus: Triatoma infestans Obrázek č. 13: Triatoma infestans, (Noireau, Diosque, and Jansen, 2009) Charakteristika: Krev sající parazit z rodu Triatominae. Má žluto-hnědé charakteristické zbarvení. Můžeme také pozorovat dimorfismus, kdy samci jsou větší než samice. Dospělý jedinec dosahuje až 2,5 cm na délku. Je to noční predátor, živící se krví savců během jejich spánku. Jeho životní cyklus se skládá z pěti larválních stádií a k dosažení dalšího stupně vývoje se musí T. infestans nakrmit a pozřít 7x větší množství krve než je jeho vlastní váha. Také patří mezi hlavní přenašeče parazitického prvoka Tripanosoma cruzi, který je původcem Chagasovy choroby čili americké trypanozomiázy (Bastien JW., 1998). Trávení a významné molekuly: Zástupci z řádu Hemiptera, kam patří rod Triatominae, vykazují odlišné fyziologické adaptace od ostatního hematofágního hmyzu. Všechny postembryonální stádia jsou výhradně krev sající larvy, které navíc rozkládají krevní nutriety v průběhu několika dní (Lehane, 1991). Trávicí trakt je poměrně jednoduchá trubice se střevem, které je možno rozdělit do pěti morfologicky a funkčně odlišných částí. Nasátá krev prochází přes úzkou kardii (část kde se spojuje jícen se žaludkem), kde se mohou vyskytovat symbiotické bakterie pomáhající v trávení nutrientů, do žaludku (přední část midgut). Zde je krev uložena než dojde k jejímu zkoncentrování a částečné hemolýze erytrocytů. Poté po malých částech jsou krevní nutrienty transportovány do tenkého střeva (zadní část midgut). Tenké střevo lze rozdělit na trávicí a absorpční část (Wigglesworth, 1943; Billingsley and Downe, 1983; A. Kollien and Schaub,2000). ~ 35 ~