FARMACEUTICKÁ FAKULTA UK V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické technologie Adhezivita a viskozita větvených oligoesterů Rigorózní práce Konzultantka: PharmDr. Eva Šnejdrová, Ph.D. Hradec Králové 2010 Mgr. Anna Bacílková
Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. 2
Na tomto místě bych ráda poděkovala PharmDr. Evě Šnejdrové, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a pomoc a také velkou trpělivost při zpracování této rigorózní práce. 3
SOUHRN Teoretická část se zabývá teoriemi bioadheze, vlastnostmi používaných bioadheziv, podrobněji jsou rozebrány aplikační cesty bioadhezivních přípravků a poslední kapitola je věnována testování bioadheze. Experimentální část práce zkoumá reologické a adhezivní vlastnosti plastifikovaných oligoesterů kyseliny D,L - mléčné a glykolové, které jsou větvené pentaerythritolem nebo tripentaerythritolem. Adhezivita připravených vzorků byla měřena na materiálovém zkušebním stroji T1-FR050TH.A1K firmy Zwick/Roell jako maximální síla F max, potřebná pro odtržení vzorku od podkladu a vztažena na velikost kontaktní plochy. Viskozita vzorků byla měřena na viskozimetru Brookfield DV-E s adaptérem pro malé množství vzorku při teplotě 37 C a 50 C. Dále byl proveden statický disoluční test uvolňování acikloviru při 37 C do fosfát citrátového pufru ph 7,0 po dobu 30 dnů. Provedené experimenty prokázaly vyšší hodnoty dynamické viskozity u oligoesterů s vyšší molekulovou hmotností, zatímco oligoester s nejmenší molekulovou hmotností vykazoval nejnižší hodnotu dynamické viskozity. Nejnižší adhezivní síla byla zjištěna u vzorku 1P, který má relativně nízký stupeň větvení g = 0,59 a střední hodnotu molární hmotnosti M w = 8400 g/mol. Ostatní testované nosiče měly adhezivitu statisticky významně vyšší než nosič 1P v rozsahu od 49,26 mn/mm 2 do 65,97 mn/mm 2. Liberace acikloviru z větvených nosičů se lišila zejména počáteční fází. U nosiče 3P s nejvyšší molární hmotností byl pozorován lag-time, liberace z nosiče 5P probíhala rovnoměrně již od počátku, u nosičů 1P a 3T byl pozorován různě vysoký burst efekt. 4
SUMMARY Theoretic part deals with theories of bioadhesion, characteristics of bio- and mucoadhesives. Routs of application are analysed in more detail. Theoretic part is concluded with testing of bioadhesion. Experimental part of thesis investigates rheological and adhesive properties of plasticized oligoesters of D,L - lactic acid and glycolic acid in ratio 1:1 branched with pentaerythritol or tripentaerythritol. Adhesivity was measured on the Material testing machine T1-FR050TH.A1K Zwick/Roell as maximal force F max required to detach the polymer system from substrate. These values were converted to the size of the contact area. Viscosity of samples was measured using viscosimeter Brookfield DV-E with an adaptor for small sample amount by 37 C and 50 C temperature. From the outcomes of made experiments follow that carriers with higher molar mass possess higher dynamic viscosity, the lowest dynamic viscosity was found at carrier with the lowest molar mass. The lowest adhesive force was found at carrier 1P with relative low degree of branching g = 0,59 and middle molar mass M w = 8400 g/mol. Adhesivity of other carriers was significantly higher, in range from 49.26 mn/mm 2 to 65.97 mn/mm 2. Acyclovir release from branched carriers differs particularly at initial phase. Carrier 3P with the digest molar mass possesses lag-time, dissolution from 5P runs evenly right from the start, carriers 1P and 3T show burst effect. 5
OBSAH 1. ÚVOD... 8 2. CÍL PRÁCE... 9 3. SEZNAM ZKRATEK... 10 4. TEORETICKÁ ČÁST... 11 4.1 ZÁKLADNÍ POJMY... 11 4.2 SUBSTRÁTY PRO MUKOADHEZI... 11 4.3 MECHANISMUS BIOADHEZE... 13 4.4 TEORIE BIOADHEZE... 15 4.5 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ BIOADHEZI... 17 4.5.1 Vlastnosti polymeru... 17 4.5.2 Podmínky v místě aplikace... 17 4.5.3 Fyziologické faktory... 18 4.6 MÍSTA APLIKACE BIOADHEZIVNÍCH PŘÍPRAVKŮ... 19 4.6.1 Oční aplikace... 19 4.6.2 Nosní aplikace... 20 4.6.3 Vaginální podání... 23 4.6.4 Perorální podání... 23 4.6.4.1 Sublinguální a bukální podání... 23 4.6.4.2 Cílené podání do gastrointestinálního traktu... 24 4.6.4.3 Cílené podání do tlustého střeva... 25 4.6.5 Specifické aplikace... 25 4.6.5.1 Aplikace peptidů a proteinů... 25 4.7 MUKOADHEZIVNÍ POLYMERY... 27 4.7.1 První generace bioadhezivních polymerů... 27 4.7.2 Bioadheziva druhé generace... 27 4.7.2.1 Lektiny... 27 4.7.2.2 Aminokyselinové sekvence... 30 4.7.2.3 Protilátky... 31 4.8 METODY TESTOVÁNÍ BIOADHEZE... 34 4.8.1 Měření bioadheze in vitro... 34 4.8.2 Měření bioadheze in vivo... 40 5. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 41 5.1 POUŢITÉ SUROVINY... 41 5.2 POUŢITÉ PŘÍSTROJE... 42 5.3 CHARAKTERISTIKA TESTOVANÝCH OLIGOESTERŮ... 43 5.4 PŘÍPRAVA VZORKŮ... 45 6
5.5 MĚŘENÍ ADHEZE... 47 5.6 MĚŘENÍ VISKOZITY... 48 5.7 DISOLUCE ACIKLOVIRU... 49 5.7.1 Příprava liberačního média... 49 5.7.2 Kalibrační přímka... 49 5.7.3 Průběh disolučního testu... 50 5.7.4 Výpočet množství uvolněného léčiva... 51 6. VÝSLEDKY... 52 6.1 MĚŘENÍ VISKOZITY... 52 6.2 MĚŘENÍ ADHEZE... 56 6.3 MĚŘENÍ DISOLUCE... 61 7. DISKUZE... 74 7.1 DYNAMICKÁ VISKOZITA... 74 7.2 ADHEZIVNÍ SÍLA... 75 7.3 LIBERACE ACIKLOVIRU... 77 8. ZÁVĚR... 79 9. SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY... 80 7
1. ÚVOD Jedním z hlavních úkolů moderní farmaceutické technologie je vývoj lékových forem vyšších generací, které odráží požadavky klinické praxe na systémy s řízeným transportem a uvolňováním léčiva. Takovým systémem mohou být bioadhezivní lékové formy, které se začaly cíleně vyvíjet již od konce 70. let 20. století. 1 Bioadheze je společný pojem pro všechny druhy adhezivních jevů, u kterých je aspoň jedna ze zúčastněných fází - substrát nebo adhezivum - živá. Příkladem bioadheze je přilnavost bakterií a mořských řas na skalách nebo lodních trupech, tvorba nových tkání na povrchu umělých orgánů a implantátů nebo adheze krevních destiček na vnitřní stěně cév jako předstupeň trombózy. 2 První mukoadhezivní systém byl připraven v roce 1947, kdy se použil tragant na přípravu adhezivního prášku pro aplikaci penicilinu na orální sliznici. Následovala kombinace karmelosy sodné soli a vazelíny, později byla formulována směs Orahesive (složená z karmelosy sodné soli, pektinu a želatiny) a Orabase, která obsahovala tuto směs dispergovanou v prostředí polyethylenu a minerálního oleje. Dalším krokem byla směs karmelosy sodné soli a polyisobutylenu navrstvená na polyethylenovou folii. 3,4 Využití adheze nabízí výhody v prodloužení doby kontaktu a absorpce léčiva z místa aplikace ve srovnání s konvenčními lékovými formami (např. několik minut v oku, několik hodin v žaludku nebo tenkém střevě), ale i možnost jeho řízeného uvolňování pro lokální nebo systémový účinek. Řízeným uvolňováním léčiva lze snížit celkovou dávku podaného léčiva, prodloužit dávkovací interval a tím omezit jeho nežádoucí účinky. Výsledkem je pak zlepšení compliance pacienta a zvýšení efektivity léčby. 2,5 Tato léková forma by navíc mohla být využita pro neparenterální aplikaci peptidů a proteinů, které mohou být takovým systémem chráněny před předčasným odbouráváním luminálními nebo mukózními proteasami. Toto očekávání od mukoadhezivních lékových forem se však experimentálně ve všech případech nepotvrdilo. Hlavní problémy přitom spočívají především v malé spolehlivosti hlenu jako substrátu pro bioadhezi a v chybějící specifitě použitých mukoadhezivních polymerů. 2 8
2. CÍL PRÁCE Cílem rigorózní práce je studium reologických a adhezivních vlastností oligoesterů kyseliny D,L - mléčné a glykolové větvených penta- a tripentaerythritolem a studium liberace acikloviru z těchto systémů. Úkol této práce je možné rozdělit do několika dílčích kroků: 1. Připravit vzorky pro měření viskozity a adheze: pro plastifikaci oligoesterů použít triethylcitrát v koncentraci 30 %. 2. Na viskozimetru Brookfield DV-E s adaptérem pro malé množství vzorku měřit viskozitu plastifikovaných oligoesterů při teplotě 37 a 50 C vřetenem číslo 14. 3. Na materiálovém zkušebním stroji T1-FR050TH.A1K firmy Zwick/Roell měřit adhezivní sílu plastifikovaných oligoesterů jako maximální sílu F max v jednotkách Newton, potřebnou k odtržení vzorku od podkladu za těchto testovacích podmínek: doba kontaktu 180 s, kontaktní síla 5 N a rychlost odtržení 100 mm/min. 4. Za stejných podmínek měřit dynamickou viskozitu a adhezivní sílu plastifikovaného lineárního oligoesteru, tvořeného ekvimolárním množstvím kyseliny mléčné a glykolové. 5. Zjistit průběh liberace acikloviru z oligoesterů 1P, 3P, 5P, 1T, 3T, 5T a PLGA za statických podmínek ve fosfát citrátovém pufru ph 7,0. 9
3. SEZNAM ZKRATEK 1P oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 1 % pentaerythritolu 3P oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 3 % pentaerythritolu 5P oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 5 % pentaerythritolu 1T oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 1 % tripentaerythritolu 3T oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 3 % tripentaerythritolu 5T oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 5 % tripentaerythritolu ACV aciklovir F/S průměrná síla F max vztažená na kontaktní plochu [mn/mm 2 ] F max GA GIT LA LE M m M n M w M w /M n PLGA RPM s maximální síla potřebná k odtržení vzorku od podkladu [N] kyselina glykolová (glycolic acid) gastrointestinální trakt kyselina mléčná (lactic acid) vzdálenost mezi kontaktními plochami při testech adheze molární hmotnost [g/mol] číselně střední molární hmotnost [g/mol] hmotnostně střední molární hmotnost [g/mol] stupeň polydisperzity oligoester kyseliny D,L - mléčné a glykolové (poly (D,L)-lactic-coglycolic acid) počet otáček vřetena za minutu u rotačního viskozimetru směrodatná odchylka [N] s/s směrodatná odchylka veličiny F/S [mn/mm 2 ] TEC triethylcitrát Tg teplota skelného přechodu [ C] dynamická viskozita [Pa.s] 10
4. TEORETICKÁ ČÁST 4.1 ZÁKLADNÍ POJMY Bioadheze je definována jako schopnost makromolekuly přírodního nebo syntetického původu přilnout k biologickému substrátu po určitou dobu. Substrátem může být epiteliální či mukózní povrch. Pokud se jedná o adhezi k membráně pokrytou vrstvou hlenu, mluvíme o mukoadhezi, při buněčné specifické bioadhezi pak o cytoadhezi. 6 Hlavními výhodami bioadhezivních lékových forem jsou: zvýšená biologická dostupnost léčiva, prodloužený kontakt v místě aplikace, cílená distribuce léčiva a nižší frekvence podání vedoucí k zlepšení compliance. 7 4.2 SUBSTRÁTY PRO MUKOADHEZI MUKUS Hlen (mukus) je vysoce viskózní produkt sekretovaný pohárkovými buňkami a pokrývající epiteliální buněčný povrch v různých částech těla, jako je oko, ucho, nosní a ústní dutina, respirační, rozmnožovací a gastrointestinální trakt. Hlavní funkcí je zvlhčování a ochrana epiteliálních buněk před fyzikálním a chemickým poškozením a regulace obsahu vody ve spodní tkáni. 8 Mukus se skládá z vody (95 %), elektrolytů (1 %), proteinů (0,5-1 %), lipidů (0,5-1 %) a mucinu, což je glykoprotein, který díky propojení řetězců do polymerní sítě vytváří strukturu gelu. 9 EPITELIÁLNÍ MEMBRÁNA Membrána je tvořena bimolekulární lipidovou vrstvou a proteiny, ponořenými do ní nebo vázanými na cytoplasmatický povrch. 10 Zastoupení proteinů v membráně se liší podle typu buňky. Úlohy proteinů jsou velmi rozmanité, vytvářejí buněčné receptory, transportní a iontové kanály. Integrální proteiny prostupují lipidovou dvojvrstvou. V membráně stále probíhají aktivní procesy a této skutečnosti lépe odpovídá představa dynamické struktury membrány jako tekuté membránové mozaiky. 10 11
Převážná část lipidů je přítomna ve formě fosfolipidů, dále neutrálních lipidů a glykolipidů. Fosfolipidy se nacházejí na vnitřní straně membrány, zatímco molekuly glykolipidů, glykoproteinů a oligosacharidů tvoří vnější vrstvu membrány. Sacharidové zbytky glykolipidů a glykoproteinů pak mohou sloužit jako vazebná místa pro lektiny a cílenou distribuci léčiv. 11 Obr. 1: Model tekuté mozaiky pro membránovou strukturu. 12 12
4.3 MECHANISMUS BIOADHEZE Mukoadheze je proces probíhající ve dvou krocích. Prvním krokem je vytvoření těsného kontaktu mezi povrchem adheziva a slizniční tkání. Pro těsný kontakt je nutná vlhkost sliznice. Po zvlhčení mukoadheziva dochází k jeho bobtnání a rozprostření na povrchu sliznice. Bobtnání má význam i pro rozpletení polymerních řetězců mukoadheziva. 1 Druhý krok zahrnuje vzájemné proplétání řetězců obou fází a vytvoření slabých chemických vazeb. 11 Obr. 2: Interpenetrace a propletení řetězců obou fází. 11 K vytvoření vazby mezi adhezivem a substrátem je nutná alespoň jedna z následujících charakteristik polymeru: dostatečné množství funkčních skupin tvořících vodíkové vazby (hydroxylové, karboxylové), negativní povrchový náboj, vysoká molekulová hmotnost a dostatečný stupeň polarity a flexibility polymerního řetězce. Tyto vlastnosti podporují vytvoření vazeb buď chemického, fyzikálního nebo mechanického charakteru. 11 Chemické vazby Bioadhezivní polymery mohou tvořit jak silné kovalentní vazby, tak i slabší van der Waalsovy síly, vodíkové a iontové vazby. Ačkoliv kovalentní vazba polymerů s proteiny na povrchu epiteliálních buněk může poskytovat řadu výhod, existují faktory limitující užití těchto látek. Prvním z nich je mukózní bariéra, která může zamezit 13
přímému kontaktu tkáně a polymeru. Dalším z limitujících faktorů je skutečnost, že každé tři až čtyři dny dochází k odlupování epiteliálních buněk. Permanentní vazba může navíc způsobovat řadu závažných problémů. Naproti tomu polymery s vysokou molekulovou hmotností a vysokou koncentrací polárních skupin, které tvoří slabší vodíkové vazby a van der Waalsovy síly, mohou tvořit pevné vazby díky četným vazebným interakcím. 8 Mechanické a fyzikální vazby Tyto vazby zahrnují propletení řetězců mucinu a polymeru a/nebo prostoupení řetězců mucinu do porózní polymerní struktury. 7 Rychlost penetrace polymeru do mucinové vrstvy je závislá na flexibilitě řetězce a difúzním koeficientu. Síla adhezivní vazby je přímo úměrná míře penetrace řetězce polymeru. Dalšími faktory ovlivňující pevnost vazby je přítomnost vody, doba kontaktu mezi substráty a délka a flexibilita řetězce polymeru. 11 14
4.4 TEORIE BIOADHEZE Neexistuje úplná a komplexní bioadhezivní teorie, která by vysvětlovala průběh adheze na základě chemických a fyzikálních vlastností jednotlivých polymerů. K popisu tohoto procesu proto může sloužit několik teorií - elektronová, adsorpční, difuzní teorie a teorie smáčení, jejichž mechanismus závisí na řadě faktorů, jako je biologický substrát, prostředí a léková forma. 13 Elektronová teorie Tato teorie je založena na předpokladu, že bioadhezivní materiál a biologický substrát mají různou elektronovou strukturu. Pokud se tyto materiály dostanou do kontaktu, dochází k přenosu elektronů a vytvoření elektrické dvojvrstvy. Adheze pak nastává v důsledku přitažlivých sil, které se vytvoří na rozhraní povrchů. 13 Adsorpční teorie Podle adsorpční teorie je adheze mezi polymerem a biologickým substrátem zprostředkována slabými přitažlivými silami, zejména prostřednictvím van der Waalsových interakcí a vodíkových vazeb. 13 Difuzní teorie Adheze je podle této teorie podporována interpenetrací a propletením řetězců obou fází. Adhezivní síla se zvyšuje s mírou penetrace polymerního řetězce do mukózní vrstvy a snižuje zesítěním jednotlivých složek. Je závislá na koncentračním gradientu a difúzních koeficientech. 11 Obr. 3: Interpenetrace řetězců polymeru a biologického substrátu. 11 15
Teorie smáčení Teorie smáčení vysvětluje především adhezi kapalných přípravků a je založena na schopnosti polymeru rozprostřít se po povrchu substrátu a vytvořit těsný kontakt. Afinita kapaliny k povrchu je hodnocena měřením kontaktního úhlu α kapaliny k povrchu a platí pro ni, že je tím větší, čím je kontaktní úhel menší. 11 Obr. 4: Rozprostírání bioadhezivního polymeru po povrchu substrátu. 11 Teorie vysvětlující mechanismy bioadheze jsou shrnuty v následující tabulce: Tab. 1: Teorie vysvětlující mechanismy bioadheze. 6 Teorie Mechanismus bioadheze Elektronová teorie Přitažlivé elektrostatické síly mezi polymerní sítí mucinu a a bioadhezivním materiálem Adsorpční teorie Povrchové síly vyúsťující v chemické vazby Difuzní teorie Fyzikální propletení a interpenetrace mucinového a polymerního řetězce Teorie smáčení Schopnost rozprostření se a vytvoření bezprostředního kontaktu 16
4.5 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ BIOADHEZI 4.5.1 Vlastnosti polymeru Molekulová hmotnost a konformace polymeru Pro každý polymer existuje optimální rozmezí molekulové hmotnosti. Podmínkou interpenetrace polymeru do mukózní vrstvy je dostatečná délka řetězce s molekulovou hmotností nad 100 000. Důležitou roli hraje též jeho konformace. 6 Flexibilita polymerního řetězce Mobilita a flexibilita polymerního řetězce je nutná pro interpenetraci a propletení řetězců obou fází a může být snížena jeho zesítěním, což vede k oslabení adhezivní síly. 6 Koncentrace polymeru Koncentrace polymeru, zajišťující úspěšnou bioadhezi, se liší v závislosti na typu a skupenství adhezivního materiálu. Pevné polymery mají při vyšší koncentraci vyšší bioadhezivní vlastnosti, zatímco u tekutých látek může vyšší koncentrace způsobit stočení řetězců polymeru, snížení jeho flexibility a separaci od substrátu. 6,14 4.5.2 Podmínky v místě aplikace ph prostředí Hodnota ph má vliv na náboj povrchu mukózní vrstvy a bioadhezivního polymeru. Povrchový náboj mucinu se mění v závislosti na ph protředí díky rozdílům v disociaci funkčních skupin na cukerné a aminokyselinové části polypeptidové kostry. 15 Doba kontaktu Doba kontaktu určuje rozsah bobtnání a interpenetraci polymerního řetězce a je potřebná k vytvoření vazeb mezi polymerem a biologickým substrátem. 6 Vliv kontaktní síly Vnitřní tlak, působící na místo kontaktu, ovlivňuje hloubku interpenetrace. Vysoký tlak aplikovaný dostatečně dlouhou dobu podporuje přitažlivé síly mezi polymerem a mucinem. 6 17
Stupeň bobtnání a hydratace polymeru Stupeň bobtnání, ovlivňující proces bioadheze, závisí na koncentraci polymeru a přítomnosti vody. Přítomnost vody je navíc důležitá k hydrataci mukoadhezivní složky, vytvoření sekundární vazby a interpenetraci polymerního řetězce. Vyšší stupeň hydratace ale vede ke snížení adhezivní síly následkem vytvoření hlenu s kluzkým povrchem. 6 4.5.3 Fyziologické faktory Obměna mucinové vrstvy Tento proces limituje dobu setrvání bioadhezivního materiálu na mukózní membráně a může být ovlivněn přítomností potravy. Rychlost obměny mucinové vrstvy se pak liší podle místa měření a může se pohybovat v rozmezí několika hodin. 6 Patologické stavy Patologické stavy jako nachlazení, žaludeční vřed, ulcerativní kolitida, cystická fibróza, bakteriální, mykózní infekce a zánět, mohou měnit fyzikálně chemické vlastnosti vrstvy slizu a tím zhoršovat proces bioadheze. 6 18
4.6 MÍSTA APLIKACE BIOADHEZIVNÍCH PŘÍPRAVKŮ 4.6.1 Oční aplikace Oční lékové formy jako vodné roztoky nebo masti vykazují nízkou dostupnost (obvykle kolem 2-10 %) vzhledem k malé absorpční ploše a přítomnosti řady očních bariér. Mezi ně patří odtok aplikovaných roztoků, slzení a slzní drenáž, metabolismus léčiva, odpařování slz a možná vazba k slzným proteinům. 17 K prodloužení doby kontaktu byla vyvinuta řada lékových forem, využívajících přítomnosti mucinové vrstvy ve vnější části oka jako jsou polotuhé, viskózní inserty, bioadhezivní mikrosféry a liposomy. Výhody bioadhezivních přípravků, jako zvýšená doba setrvání léčiva a snížená frekvence podání, byly prokázány např. u chitosanových mikrosfér obsahujících aciclovir, které vykazovaly vyšší biologickou dostupnost v oku v porovnání s léčivem podaným samostatně. 6 Obr. 5: Schéma oka. 18 Příklady očních přípravků V očních přípravcích se polymery používají především jako viskozifianty a některé z nich mohou vykazovat mukoadhezivní vlastnosti. Zvýšením viskozity je prodloužena doba kontaktu a také může být ovlivněno přilnutí očního přípravku k rohovce. 19 19
19, 20 Tab. 2: Příklady očních přípravků. Název Přípravku Siccaprotect oční kapky, roztok Pilogel HS oční gel Vidisic oční gel Oftagel oční gel Sloţení přípravku dexpanthenol polyvinylalkohol Pilocarpin carbomerum 940 carbomerum 980 carbomerum 974 P Funkce Polymeru Zvyšuje viskozitu přípravku a jeho lpění na rohovce, prodlužuje jeho působení Zvyšuje viskozitu a prodlužuje setrvání přípravku v místě aplikace Po vkapání do oka vytváří ochranný film s vysokou přilnavostí a udržuje vlhkou rohovku a spojivku Zvyšuje viskozitu přípravku a vytváří na rohovce ochranný lubrikační film Indikace přípravku Stavy s vysycháním rohovky a spojivek Snížení zvýšeného nitroočního tlaku u glaukomu Náhrada slz při jejich nedostatečné produkci, léčba syndromu suchého oka Keratokonjunktivitis sicca Symptomatická léčba syndromu suchého oka 4.6.2 Nosní aplikace Nosní dutina je tvořena bohatě prokrvenou subepiteliální vrstvou s velkým povrchem pro absorpci. Krev je z nosu odváděna přímo do centrálního řečiště a díky tomu nedochází k primárnímu jaternímu odbourávání. Naproti tomu mukociliární clearance snižuje dobu setrvání léčiva na sliznici. Kontakt se sliznicí může být prodloužen užitím bioadhezivních lékových forem, čímž se zlepší vstřebávání léčiva. Předpokládaným mechanismem při aplikaci bioadhezivních mikrosfér je bobtnání při jejich kontaktu s nosní sliznicí, čímž se vytvoří gel, sníží se rychlost odstranění z nosní 20
sliznice a prodlouží čas nutný k absorpci. Touto cestou může být podán například 6, 21 kalcitonin a hormon uvolňující luteinizační hormon (LHRH). Obr. 6: Nosní dutina, zevní řez zleva. 22 Příklady nosních přípravků Přípravky určené do nosní dutiny obsahují jako pomocné látky viskozifianty, z nichž některé mohou mít mukoadhezivní vlastnosti. 21
Tab. 3: Příklady nosních přípravků. 20 Název Sloţení přípravku Přípravku Otrivin xylometazolin nosní kapky hypromellosum Nasacort triamcinolonacetonid nosní sprej, suspenze cellulosum dispersum Vibrocil fenylefrin nosní gel dimetinden hypromellosum Livostin levokabastin nosní sprej, suspenze hypromellosum Olynth HA xylometazolin nosní sprej, roztok hyaluronát sodný Funkce Polymeru Zvlhčuje nosní sliznici, zabraňuje jejímu vysušení a podráždění Celulosa bobtná v přítomnosti vody a je schopná rozprostřít se po nosní sliznici a tím napomáhat distribuci léčiva přes slizniční povrch Zvyšuje viskozitu přípravku Zvyšuje viskozitu přípravku Zvyšuje viskozitu přípravku Indikace přípravku Obnovení průchodnosti horních cest dýchacích při nachlazení, senné rýmě, alergické rhinitidě, sinusitidě, lokální dekongestant Léčba příznaků sezónní a celoroční alergické rinitidy, nasální glukokortikoid Symptomatická léčba běžného nachlazení, nazální kongesce, akutní a chronické rýmy, alergické rýmy, akutní a chronické sinusitidy Léčba příznaků alergické rinitidy Snížení otoku nosní sliznice u akutní rýmy, vasomotorické rýmy a alergické rýmy 22
4.6.3 Vaginální podání Tato aplikační cesta je často využívána k podání terapeutických a antikoncepčních látek k vyvolání místního (fungicidního a spermicidního) nebo systémového účinku a látek citlivých ke gastrointestinální degradaci či jaternímu metabolismu (např. estrogenu a progesteronu). Tento způsob podání byl rovněž zkoumán k aplikaci některých peptidů, například kalcitoninu a mikrobicidních látek 6, 23 zamezujících přenosu HIV viru a dalších sexuálně přenosných chorob. Tab. 4: Příklady vaginálních přípravků. 20 Název Sloţení přípravku Funkce Indikace přípravku přípravku Polymeru Crinone progesteron Carbomer- Doplnění vaginální gel carbomerum 974P polykarbophil- progesteronu polykarbophil uvolňovací systém se v luteální fázi cyklu váže na vaginální v rámci technik mukózu a zajišťuje asistované zpomalení uvolňování reprodukce, progesteronu sekundární amenorea a abnormální děložní krvácení 4.6.4 Perorální podání 4.6.4.1 Sublinguální a bukální podání Ústní dutina se skládá z vysoce propusné sliznice s bohatým krevním zásobením. Způsob podání touto cestou obchází jaterní cirkulaci a tím i eliminaci v gastrointestinálním traktu, proto je vhodný pro systémové podání léčiv. 24 Složení epitelu je v různých částech ústní dutiny poněkud odlišné. Plochy vystavené mechanickému namáhání (dásně, tvrdé patro) jsou na rozdíl od sliznice měkkého patra, sublinguálních a bukálních oblastí keratinizovány podobně jako epidermis. Zrohovatělý epitel obsahuje neutrální lipidy - ceramidy, které mají funkci bariéry. Odhaduje se, že 23
propustnost bukální sliznice je 4-4000 vyšší než v případě kůže. Denní vyprodukovaný objem slin se pohybuje od 0,5 do 2 l, proto je ústní dutina vhodná pro hydrofilní polymery jako nosiče léčiv. 6 Touto cestou může být podán například nitroglycerin ve formě sublinguálních tablet a aerosolu, které slouží k profylaxi záchvatů anginy pectoris před fyzickou námahou. 6 Obr. 7: Ústní dutina. 25 4.6.4.2 Cílené podání do gastrointestinálního traktu Gastrointestinální epitel se skládá z jedné vrstvy jednoduchého cylindrického epitelu uloženým nad shlukem buněk nazývaných lamina propria a podporovaných vrstvou hladkého svalstva. V zažívacím traktu se nachází soubory větších seskupení lymfatických uzlíků, tzv. Peyerovy pláty, které jsou na povrchu kryty M buňkami se schopností fagocytovat antigeny ve střevě. 26 Tyto buňky mohou rovněž pohlcovat polymerní mikrosféry, a tudíž mohou být použity pro účely očkování. 24
Dále mohou být bioadhezivní polymery využity k zvýšení dostupnosti např. dikumarolu, insulinu a byly též zkoumány pro perorální podání genů. Pravděpodobným mechanismem je vychytávání mikrosfér buňkami, které obklopují gastrointestinální epitel. Tyto aplikační cesty mohou být použity pro systémové podání látek, které vykazují slabou absorpci přes gastrointestinální epitel, pro cílenou distribuci a umístění léčiva ve specifickém místě zažívacího traktu. 6 4.6.4.3 Cílené podání do tlustého střeva Cílená distribuce do tlustého střeva se používá nejčastěji pro lokální léčbu střevních onemocnění a pro aplikaci molekul citlivých k enzymatické degradaci, např. peptidů. Slizniční povrch tlustého střeva se při narození podobá povrchu tenkého střeva, ale postupně dochází ke ztrátě klků a vzniká hladký povrch sliznice. Absorpční plocha je tedy ve srovnání s tenkým střevem mnohem menší. Slizniční vrstva poskytuje nejen stabilní ph prostředí, ale působí také jako difúzní bariéra pro vstřebávání léčiv. Bioadhezivní mikrosféry mohou být použity během počátečních stadií karcinomu tlustého střeva, pro zvýšení absorpce peptidů a očkovacích látek, pro místní působení steroidů a imunosupresivních látek jako cyclosporin a pro ochranu peptidických látek před úseky zažívacího traktu bohatými na enzymy. 6 4.6.5 Specifické aplikace 4.6.5.1 Aplikace peptidů a proteinů Bioadhezivní mikrosféry poskytují neinvazivní přístup k zlepšení absorpce léčiv složených z peptidů a proteinů vzhledem k jejich enzymatické degradaci a nízké propustnosti přes epiteliální buňky. Luminální a enzymatickou degradaci proteinů a peptidů lze účinně minimalizovat zamezením expozice s tělními tekutinami a enzymy, přičemž specifické inhibitory enzymů mohou být připojeny k povrchu mikrosfér. 28 Navíc některé polymery jako chitosan mohou mít vliv na zvýšení absorpce. Tento efekt je připisován přechodnému otevření těsných spojů (tight junctions) v buněčné membráně následkem zvýšení termodynamické aktivity penetrujících látek nebo 25
schopností chitosanu narušit uspořádání lipidů v buněčné membráně. Mikrosféry připravené z derivátů kyseliny polyakrylové mohou in vivo chelatovat extracelulární vápenaté ionty a tím snížit integritu těsných spojů, což vede ke zvýšení permeability léčiv. Polyakryláty mohou rovněž inhibovat proteolytické enzymy v trávicím traktu vazbou základních enzymatických kofaktorů - vápenatých a zinečnatých iontů, které vedou ke konformačním změnám enzymu a ztrátě jejich aktivity. 6 26
4.7 MUKOADHEZIVNÍ POLYMERY Především z hlediska snadnější registrace bioadhezivních léků byly nejdříve učiněny pokusy o využití již známých farmaceutických pomocných látek, které mají za jistých podmínek mukoadhezivní vlastnosti. Schopnost těchto látek přilnout k sliznici byla uvedena už v patentech ze 40. let (Orabase, Sqibb Co.) a ve starších učebnicích farmaceutické technologie dávno předtím, než se staly pojmy bio- a mukoadheze populárními. 2 4.7.1 První generace bioadhezivních polymerů Bioadheziva první generace vzešla ze surovin, které mají ve farmacii již tradiční využití jako různé masťové základy a jiné pomocné látky. Postrádají však schopnost vázat se k povrchu sliznic specificky a jejich využití v bioadhezivních systémech pro podání léčiv je omezené. Jedná se zejména o látky polymerní povahy, které vykazují schopnost adheze ke slizničnímu povrchu a při kontaktu s vodou vytváří hydrokoloidy, případně hydrogely. Nejčastěji používané jsou syntetické polymery, ale v mukoadhezivních lékových formách mají zastoupení i polymery přírodní a polosyntetické, u kterých se umělým zásahem do přírodních makromolekul ovlivňuje stupeň polymerizace nebo stupeň substituce s cílem překonat nedostatky přírodních polymerů. 2,29 4.7.2 Bioadheziva druhé generace Bioadheziva druhé generace dovolují na rozdíl od svých předchůdců specifitu, prolongaci a intenzifikaci adheze, ale také možnost zvýšení penetrace hlenu a inhibici proteolytických enzymů. Příkladem jsou lektiny, proteiny fibronektin a laminin, protilátky a další biologické molekuly, které se váží přímo na receptory nebo jiné struktury na povrchu buněk a umožnují tím cílenou distribuci léčiv. 30 4.7.2.1 Lektiny Lektiny jsou proteiny nebo glykoproteiny neimunního původu, které se reversibilně váží na polysacharidové komplexy, a tím dochází k vazbě nebo aglutinaci 27
buněk. Většina proteinů na buněčném povrchu a velká část lipidů v buněčné membráně je glykosylována a právě tyto povrchové struktury tvoří vazebné místo pro lektiny. 31 Kombinací relativně malého počtu sacharidů na buněčných površích může vznikat celá řada chemických struktur. Různé typy buněk tvoří rozmanitá glykanová seskupení, která jsou odlišná např. u pozměněných nebo rakovinných buněk ve srovnání se zdravými buňkami. Proto mohou být lektiny použity jako nosiče molekul pro cílenou distribuci léčiv k různým typům buněk a tkání. Lektiny byly poprvé představeny kolem roku 1888, kdy dr. Hermann Stillmark z university v Estonsku prezentoval svoji práci popisující aglutinační vlastnosti ricinu ze semen skočce obecného (Ricinus communis), nicméně tyto vlastnosti byly pozorovány už dříve, a to u běžných hadích jedů. 32 Termínem aglutinin byly obecně označovány molekuly a extrakty, které způsobují aglutinaci erytrocytů a jiných buněk. Slovo lektin sloužilo k popisu látek nacházejících se v rostlinách, které jsou schopny rozlišit krevní skupiny na základě přítomných cukerných částic. 32 Pro rozvoj vědy, zabývající se lektiny, byla klíčová práce Sharon a Lis z roku 1972. 32 Lektiny popsané a izolované v této době z rostlin byly často používány zejména v histopatologii, a to díky jejich vysoké specifitě k různým typům buněk. Od roku 1972 bylo identifikováno rovněž značné množství lektinů živočišného původu. 32 Obr. 8: Interakce lektinů s glykokalyxem enterocytů. 33 28
Lektiny lze rozdělit podle několika kritérií - podle vazebné specifity k monosacharidům, ke které vykazují nejvyšší afinitu, nebo podle jejich původu na rostlinné, živočišné, mikrobiální a virové. 34 Tab. 5: Lektiny, jejich zdroje a užití. 32 Lektin Vazebný polysacharid Cílená distribuce do: Viscum album aglutinin D-Gal; GalNac GIT Lycopersium esculentum aglutinin (GlcNAc) 3 Plíce (alveoly, I buňky) Urtica dioica aglutinin GlcNac GIT Triticum vulgaris aglutinin (D-GlcNAC) 2 ; NeuNAc Plíce Oko Hematoencefalická bariéra Galanthus nivalis aglutinin Manα3Man GIT Canavalia ensiformis aglutinin Α-D-Man; α-d-glc GIT Phaseolus vulgaris aglutinin Oligosacharid GIT Ulex europaeus aglutinin Fucα(1-2)Galβ(1-4)Fucα(1- GIT 3)-GlcNac Fucose Lotus tetragonolobus aglutinin Fucα(1-2)Galβ(1-4)Fucα(1- GIT 3)-GlcNac Fucose Bandeireae simplifolia isolectin B 4 Α-D-Gal Nosní sliznice Maclura pomifera aglutinin GalNAc Plíce (alveoly, II buňky) Ricinus communis D-Gal Plíce (alveoly, I buňky) E. coli toxin B Gal GIT Cholera toxin GM1 ganglioside GIT Rostlinné lektiny Rostlinné lektiny tvoří početnou skupinu proteinů vázajících se na různé sacharidové jednotky. Jejich funkce ještě není zcela známa, i když se vyskytují ve všech rostlinných orgánech. Jednou z možností je ochrana rostlin před infekcí, protože např. inhibují růst hub obsahujících polysacharid chitin v buněčné stěně. Ze zástupců lze jmenovat například lektin izolovaný z klíčků pšenice (WGA - wheat germ agglutinin) 29
nebo lektiny z ječmene a rýže. K široce studovaným lektinům patří rajčatový lektin, který by mohl být využit k cílenému podání některých léčiv vzhledem k jeho nízké toxicitě a vysoké specifitě - například polystyrenové částice potažené rajčatovým lektinem vykazovaly specifickou adhezivní schopnost k enterocytům. Jeho inaktivace následkem zkřížené reaktivity s hlenem však snižuje jeho využitelnost. Příkladem toxických lektinů je ricinový hemaglutinin (Ricinus communis) nebo lektin z červených fazolí (Phaseolus vulgaris). 34,35,36,37 Bakteriální lektiny (adheziny) Bakterie jsou schopné adherovat k epiteliálnímu povrchu nebo enterocytům pomocí fimbrií. Adhezivní složky na povrchu fimbrií - lektiny - hrají klíčovou roli při patogenním rozpoznávání povrchu hostitelské buňky. Bakteriální lektiny rozpoznávají sacharidové složky na povrchu hostitelské buňky a tím umožňují její adhezi. Adheze bakterie je tedy prvním krokem v rozvoji infekce v hostitelském organismu. Bakterie přichycená na povrch buňky je odolnější vůči přirozeným obranným mechanismům hostitelského organismu i vůči léčbě antibiotiky. Využití tzv. anti-adhezivních látek tak brání adhezi bakterií a tím i rozvoji infekce. Příkladem může být adheze E. coli ke kartáčovému lemu epiteliálních buněk pomocí fimbrií. Lékové formy založené na bakteriální adhezi by tak mohly být účinným prostředkem pro zvýšení přilnavosti bioadhezivních mikrosfér k epiteliálním povrchům. 38,39 4.7.2.2 Aminokyselinové sekvence Některé aminokyselinové sekvence mají komplementární části na buňkách a slizničních površích. Pokud jsou tyto sekvence připojeny k mikročásticím, mohou podporovat vazbu k specifickým glykoproteinům na povrchu buněk. Během onemocnění může docházet ke změně buněčných povrchových glykoproteinů. Tyto pozměněné proteinové sekvence mohou být cílovou strukturou komplementárních aminokyselinových sekvencí připojených k aplikačnímu systému léčiv. 6 30
4.7.2.3 Protilátky Protilátky mohou být produkovány proti vybraným molekulám přítomným na slizničních površích. Vzhledem k jejich vysoké specifitě mohou sloužit jako místně specifická mukoadheziva k vychytávání léčiv k nádorovým tkáním. 6 31
Tab. 6: Příklady bioadhezivních polymerů dle struktury a původu: PŘÍRODNÍ A POLOSYNTETICKÉ POLYMERY: deriváty celulosy: hydroxyethylcellulosum hydroxypropylcellulosum carmellosum natricum methylcelullosum methylhydroxyethylcellulosum hydroxypropylmethylcellulosum kationaktivní polysacharidy chitosan Biotechnologické polysacharidy xanthanová klovatina Polyuronidy kyselina alginová a její soli kyselina hyaluronová a její soli pektin tragant Proteiny želatina Další přírodní látky karajový sliz guar lektiny škrob tamarindový sliz ispaghula 32
SYNTETICKÉ POLYMERY Polyakryláty karbomer: poly(akrylová) kyselina větvená pomocí allylsacharózy polykarbophil: poly(akrylová) kyselina větvená pomocí divinylglykolu poly(akrylová) kyselina poly(methylvinylether-methakrylová) kyselina poly(2-hydroxyethylmethakrylát) poly(methylmethakrylát) poly(methakrylát) poly(alkylkyanoakrylát) poly(isohexylkyanoakrylát) poly(isobutylkyanoakrylát) Polyvinylové sloučeniny polyvinylalkohol povidon 33
4.8 METODY TESTOVÁNÍ BIOADHEZE Při formulaci bioadhezivního přípravku je nutné s ohledem na způsob aplikace a použití testovat adhezivní vlastnosti použitých polymerů, proto je v literatuře popsáno mnoho metod, které můžeme rozdělit na in vitro/in situ a in vivo techniky. 7 Pro měření bioadheze nicméně neexistuje univerzální testovací metoda, která by umožňovala porovnávat jednotlivé polymery navzájem. 4.8.1 Měření bioadheze in vitro Nejpoužívanější in vitro metodou pro měření bioadhezivní síly jsou tahové zkoušky, které jsou založené na měření síly nebo práce potřebné k přerušení adhezivní vazby. Obvykle se k měření tažné síly používají upravené váhy, tenziometry nebo tahové testery. 41,42 Průtok adheziva trubicí potaženou střevní sliznicí (Falling liquid film method) Tato jednoduchá, kvantitativní in situ metoda se provádí v nakloněné plastové trubici, která je částečně pokryta vzorkem střevní sliznice. Suspenze bioadhezivních mikrosfér se pak nechá stékat po této nakloněné rovině. Koncentrace částic opouštějících střevní segment lze určit pomocí Coulterova počítače, který slouží ke kvantifikaci frakce částic adherovaných ke střevní sliznici. Procento zadržených částic je potom vyjádřeno jako index bioadheze. 43 Obr. 9.: Schéma přístroje pro měření adheze metodou falling liquid film. 43 34
Metoda Wilhelmovy desky (Wilhelmy plate technique) Podle této metody je skleněná deska, která je zavěšená na mikrovahách, potažena bioadhezivním polymerem a sušena při 60 stupních do konstantní hmotnosti. Poté je deska ponořena do kádinky s roztokem hlenu. Kontakt je udržován několik minut, přičemž základna je pomalu snižována ve svislém směru, dokud nedojde k úplnému vynoření desky s polymerem. Maximální síla zaznamenaná mikrovahami 6, 8, 44 pak závisí na adhezivní síle mezi polymerem a hlenem. Obr. 10: Schéma přístroje pro měření adheze metodou Wilhelmovy desky. 45 Metoda invertního střeva (Everted sac technique) Tato metoda je založena na odebrání části střevní tkáně potkana, jeho převrácení naruby, podvázání na koncích a naplnění fyziologickým roztokem o ph 7,2 obsahující 200 mg/dl glukózy. Segment je poté zaveden do 15 ml zkumavky obsahující známé množství mikrosfér (60 mg) a fyziologického roztoku (5ml), dále se nechá třepat po dobu 30 minut. Střevní vak je odstraněn, mikrosféry jsou promyty a lyofilizovány a procento navázaných částic je vypočítáno z rozdílu hmotnosti zbývajících částic od původní hmotnosti mikrosfér. 46 Postup metody invertního střeva uvádí obrázek 11. 35
Obr. 11: Metoda invertního střeva. 46 Metoda průtokového kanálu (Flow channel method) Tato metoda vyvinutá Mikosem a Peppasem využívá plochý kanál vyrobený ze skla či plexiskla s dutinou hlubokou 0,5 cm, která je naplněna 2 % vodným roztokem bovinního podčelistního hlenu, temperovaného na 37 C. Kanál je spojen s plynovým válcem, který umožňuje proudění vzduchu. Částice bioadhezivního polymeru o velikosti 10-200 µm jsou umístěny na tenké vrstvě hlenu. Snímáním pohybu částic je studováno statické a dynamické chování bioadhezivních částic. Průtok je pomalu zvyšován regulačním ventilem. Biodhezivní síla je pak rovna hydrodynamické síle, která je potřebná k odtržení částic od gelové vrstvy hlenu. 47 36
Obr. 12: Schéma přístroje pro měření adheze metodou průtokového kanálu. 47 Měření intenzity zbarvení konjugátu koloidního zlata s mucinem (Colloidal gold staining method) Tato široce užívaná metoda objasňuje interakce protein - protein či protein - polymer a byla též použita ke studiu adheze. Nejprve byly připraveny částice koloidního zlata o průměru 18 nm povařením kyseliny tetrachlorozlatité (HAuCl 4 ) v přítomnosti citronanu sodného. Tvorba monodisperzních částic byla indikována změnou barvy z tmavě modré na červenou. Koncentrace částic koloidního zlata byla vypočítána měřením absorbance při 525 nm. Roztok byl poté ochlazen a centrifugován. Částice byly znovu suspendovány v roztoku pufru o požadovaném ph a byl přidán roztok bovinního podčelistního mucinu. Molekuly mucinu byly naadsorbovány na částice koloidního zlata a stabilizovány. Konjugát byl stabilní, pokud bylo přidáno 0,2 ml mucinu (alespoň v koncentraci 0,112 mg/ml) k 2 ml roztoku koloidního zlata (7,7 10 11 částic/ml nebo absorbance 0,9 při 525 nm) při ph 1,3. Částice koloidního zlata a mucinu byly zvolna mixovány rotačním mixérem 15 minut při 10 rpm. Směs byla centrifugována 45 minut za účelem odstranění molekul mucinu, které nebyly adsorbovány. Sedimentované konjugáty mucinu a koloidních částic byly znovu suspendovány v roztoku pufru a byl přidán bioadhezivní hydrogel. Bioadhezivní síla byla kvantifikována měřením intenzity 37
červeného zbarvení, které se vytvoří na povrchu hydrogelu interakcí s konjugátem. 48,49,50 Metoda fluorescenčního značení (Fluorescent probe method) Robinson a kol. vyvinuli fluorescenční metodu k měření bioadheze lidských epiteliálních buněk označených fluorescenčním činidlem (pyren či fluorescein isothiokyanát). Buňky jsou mixovány s bioadhezivními polymery a poté jsou monitorovány změny fluorescenčních spekter. Tato metoda umožňuje sledovat vazby polymerů a jeho vlivy na adhezi. 16 Přímé barvící techniky (Direct staining method) Tato poměrně nová metoda byla vyvinuta k hodnocení adheze polymerů k lidským bukálním buňkám po jejich expozici s vodnou disperzí polymeru jak v podmínkách in vitro, tak in vivo. Z polymerů byl testován carbopol 974 P, polycarbophil a chitosan. Byla připravena jejich vodná disperze v koncentraci 0,1 % (w/w). Adsorbovaný polymer byl vizualizován barvením roztoku eozinu (0,1 % w/v) v případě chitosanu a roztokem barviva alcian blue u carbopolu a polycarbophilu. Nezreagované barvivo bylo odstraněno promytím roztokem sacharózy (0,25M). Rozsah adheze pak byl kvantifikován měřením relativní intenzity zbarvení kontrolních a s polymerem interagujících bukálních buněk světelnou mikroskopií. Tato metoda je vhodná k hodnocení tekutých lékových forem, které jsou využívány k místní léčbě dutiny ústní. 51 38
Obr. 13: Světelná mikroskopie ukazuje intenzitu zbarvení bukálních buněk před a po jejich kontaktu s disperzí polymeru. 51 (A) Kontrolní buňky bez polymeru ( 1000) obarvené 0,1 % alcian blue (B) Buňky s karbopolem ( 200) barvené 0,1 % alcian blue. Bukální buňky nejsou viditelné protože karbopol pokrývá jejich povrch a způsobuje aglutinaci. (C) Kontrolní buňky bez polymeru ( 200) barvené 0,1 % roztokem eosinu (D) Buňky s chitosanem ( 400) barvené 0,1 % roztokem eosinu Metoda inhibice vazby lektinů na bukální buňky (Lectin binding inhibition technique) Metoda zkoumá vazebné interakce bioadhezivních polymerů k bukálním epiteliálním buňkám kolorimetrickým detekčním systémem bez nutnosti přidání markerů. Lektin cancanavalian A se váže na cukerné zbytky na povrchu epiteliálních 39
buněk. Pokud se bukální buňky dostanou do kontaktu s biodhezivním polymerem, dojde k maskování povrchových skupin a to vede k redukci nebo inhibici vazby cancanavalianu A. 52 Reologická měření Konformační změny, chemické interakce a interpenetrace mezi řetězci polymeru a mucinu v procesu bioadheze mají za následek změny v reologickém chování těchto makromolekul. Reologické studie proto poskytují vhodný in vitro model znázorňující chování mukoadhezivních polymerů. 53 4.8.2 Měření bioadheze in vivo K monitorování bioadhezivních vlastností se nejčastěji používá gamma scintigrafie, pomocí níž lze studovat distribuci a retenční čas podáním radioaktivně značených bioadhezivních mikrosfér. Mezi další metody patří rentgenové kontrastní techniky, které využívají rentgen kontrastních látek (např. síran barnatý enkapsulovaný v bioadhezivních mikrosférách) k určení doby setrvání mukoadhezivní látky v gastrointestinálním traktu. 11 V některých případech je možné přímé pozorování pomocí endoskopie. 6 40
5. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5.1 POUŢITÉ SUROVINY 1P - oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 1 % pentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící složky (FaF UK HK) 3P - oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 3 % pentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící složky (FaF UK HK) 5P - oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 5 % pentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící složky (FaF UK HK) 1T - oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 1 % tripentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící složky (FaF UK HK) 3T - oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 3 % tripentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící složky (FaF UK HK) 5T - oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové s 5 % tripentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící složky (FaF UK HK) Aceton čistý (Penta, ČR) Aciklovir (Pliva Lachema) Azid sodný (Fluka) Čištěná voda (FaF UK HK) Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát (Lach-Ner, ČR) Kyselina citronová bezvodá p.a (Lach-Ner, ČR) Mucin z prasečích žaludků, typ III (Sigma-Aldrich, USA) PLGA - Oligoester kys. D,L - mléčné a glykolové v poměru 50:50 (Faf UK HK) Triethylcitrát (Merck, Německo) 41
5.2 POUŢITÉ PŘÍSTROJE Analytické váhy KERN ABS 220-4, max. 220 g, d = 0,0001 g Biologický termostat BT 120 Brookfieldův digitální viskozimetr model DV-E Digitální ph-metr HANNA ph 221 Digitální váhy KERN 440-33, max. 200 g, d = 0,01 g Digitální váhy KERN 440-35, max. 400 g, d = 0,01 g Horkovzdušná sušárna ULE 400, Memmert Materiálový zkušební stroj T1-FR050TH.A1K, Zwick/Roell Spektrofotometr HELIOS GAMA (UV/VIS), Unicam 42
5.3 CHARAKTERISTIKA TESTOVANÝCH OLIGOESTERŮ Testované větvené oligoestery byly syntetizovány na katedře farmaceutické technologie stupňovou kopolymerací ternární směsi složené z ekvimolárního podílu kyseliny glykolové a kyseliny D,L - mléčné, doplněné pentaerythritolem nebo tripentaerythritolem v koncentraci 1 %, 3 % nebo 5 %. V důsledku různého typu a koncentrace větvící složky mají jednotlivé polymery různý stupeň větvení, různou molární hmotnost a tedy odlišnou hydrofilitu, stupeň bobtnání a eroze. Charakteristiky testovaných nosičů jsou uvedeny v tabulce 7. Tab. 7: Charakteristika testovaných nosičů: Označení polymeru Poměr LA/GA/P(T) [%] M n [g/mol] M w [g/mol] T g ( C) 1P 49,5/49,5/1,0 4 200 8 400 26,6 0,59 3P 48,5/48,5/3,0 8 700 12 700 22,2 0,33 5P 47,5/47,5/5,0 2 200 2 700 12,7 0,61 1T 49,5/49,5/1,0 3 800 15 200 25,3 0,42 3T 48,5/48,5/3,0 7 900 20 600 21,7 0,31 5T 47,5/47,5/5,0 5 800 11 900 17,2 0,34 PLGA 50,0/50,0/0 1 833 4 086 17,0 1,00 g M n M w T g číselný průměr molární hmotnosti hmotnostní průměr molární hmotnosti teplota skelného přechodu [ C] br g větvící poměr g = lin kde je vnitřní viskozita lineárního (lin) a větveného (br) polymeru při shodné molární hmotnosti M Pro lineární polymery dosahuje g hodnoty 1,0 a klesá směrem k nule s rostoucím stupněm větvení. V tabulce 7 jsou uvedeny průměrné hodnoty g počítané z experimentálně stanovené hodnoty vnitřní viskozity a hodnoty vnitřní viskozity počítané z hodnoty Mw a Markovy-Houwinkovy (MH) rovnice pro lineární 43
poly(dl-mléčnou) kyselinu. Ta byla stanovena čtyřnásobnou analýzou vzorku poly(dl-mléčné) kyseliny: = 5,22 x 10-2 M 0,629 [ml/g]. 54 44
5.4 PŘÍPRAVA VZORKŮ Oligoesterové nosiče byly z důvodu snížení viskozity plastifikovány 30 % triethylcitrátu (TEC). Bylo připraveno 10,0 g plastifikovaného oligoesteru. Oligoester (1,3,5P;1,3,5T) Triethylcitrát 7,00 g 3,00 g Oligoestery byly nejprve desintegrovány na menší kousky. Do malé kádinky (25 ml) bylo naváženo 7,00 g oligoesteru. Oligoester byl roztaven v horkovzdušné sušárně při teplotě 70-80 C. K tavenině bylo přidáno 3,00 g triethylcitrátu a směs byla důkladně homogenizována kovovou kopistkou. Pokud bylo třeba oligoester během homogenizace znovu natavit, kádinka byla na krátkou dobu umístěna do horkovzdušné sušárny. Po ukončení homogenizace byla kádinka označena, zakryta alobalem a dána do exsikátoru. Stejným způsobem byl připraven vzorek tvořený lineárním oligoesterem kyseliny D,L - mléčné a glykolové (PLGA) se zastoupením kyseliny mléčné a kyseliny glykolové v poměru 50:50. Tento nosič byl plastifikován rovněž 30 % TEC a sloužil pro porovnání adhezivních a reologických vlastností s větvenými nosiči. Pro stanovení disoluce modelové léčivé látky z větvených nosičů byly připraveny vzorky se 4 % acikloviru. Aciklovir byl inkorporován do předem připravených plastifikovaných oligoesterů (1P, 3P, 5P, 1T, 3T, 5T). Z toho byly formovány na dno scintilačních lahviček matrice o hmotnosti 150,0 mg. Plastifikovaný oligoester byl roztaven v sušárně při 70-80 C. Do malé kádinky (10 ml) byl navážen roztavený oligoester a přidán mikronizovaný aciklovir předem navážený na analytických vahách. Směs oligoesteru a acikloviru byla důkladně homogenizována kovovou kopistkou. Pokud bylo třeba oligoester během homogenizace znovu natavit, kádinka byla na krátkou dobu umístěna do horkovzdušné sušárny při 60 C. Z připraveného vzorku s aciklovirem bylo naváženo po 150 mg do dvou scintilačních lahviček, do třetí scintilační lahvičky bylo naváženo 150 mg oligoesteru bez acikloviru sloužící jako kontrolní vzorek. Vzorek byl rovnoměrně rozprostřen po dně scintilační lahvičky. 45
Modelový podklad pro měření bioadheze byl připraven navážením 1,0 g mucinu, který byl přenesen do třenky, a přikapáváním 9 ml fosfát citrátového pufru ph 7,0. Směs byla pomalu roztírána pomocí těrky, aby nedošlo ke vzniku aglomerátů. Dále byla směs uchovávána v uzavřené nádobě. 46
5.5 MĚŘENÍ ADHEZE Adheze byla měřena na materiálovén zkušebním stroji firmy Zwick/Roell. Pro hodnocení adhezivních vlastností oligoesterů byla zaznamenána síla F max potřebná pro odtržení horní mobilní kontaktní plochy se vzorkem od dolní fixní kontaktní plochy. Pro vyjádření adhezivity oligoesterů byla průměrná síla ØF max přepočítána na velikost kontaktní plochy: průměr d = 20,11 mm, S = 317,62 mm 2 - hodnota F/S. Byly proměřeny oligoestery 1P, 3P, 5P, 1T, 3T, 5T plastifikované 30 % TEC a lineární PLGA plastifikovaný 30 % TEC. POSTUP: 1. Nejprve byl zapnut zkušební stroj, poté počítač a byly zkontrolovány nastavené parametry. 2. Na horní kontaktní plochu byla rovnoměrně nanesena kovovou kopistkou tenká vrstva vzorku. Na dolní kontaktní plochu byla nanesena tenká vrstva hydratovaného mucinu z prasečích žaludků. Byla nastavena vzdálenost horní čelisti (pozice LE) na 25 mm, vynulována síla a spuštěn test. 3. Horní plocha se pohybovala směrem dolů rychlostí 25 mm/min do okamžiku, kdy se přiblížila k dolní ploše na zkušební vzdálenost 5 mm. Poté se rychlost snížila na 10 mm/min a klesání pokračovalo, dokud se plochy nedostaly do kontaktu. 4. Doba kontaktu byla 180 sekund při zatížení 5 N. 5. Po této době se horní plocha se vzorkem odtrhla rychlostí 100 mm/min a snímač síly zaznamenal sílu F max. 6. Po ukončení testu byly kontaktní plochy důkladně vyčištěny, nejprve setřeny kopistkou, potom otřeny acetonem. 7. Od každého oligoesteru bylo provedeno 10 měření při nastavení stejných parametrů. 47