Protilátky třídy IgG proti EBNA-1 Návod na použití ELISA testu Objednací číslo Protilátky proti Třída Ig Substrát Formát EI 2793-9601 G Virus Epstein- Barrové Jaderný antigen 1 (EBNA-1) IgG Ag-potažené mikrotitrační jamky 96 x 01 (96). Princip testu: ELISA test umožňuje kvantitativní in-vitro stanovení lidských protilátek třídy IgG proti EBNA-1 antigenu. Diagnostický kit (souprava) obsahuje oddělené proužky mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou potaženy EBNA-1. V prvním reakčním kroku se v jamce inkubují ředěné vzorky séra pacientů. V případě pozitivních vzorků, se specifické IgG (také IgA a IgM) protilátky navážou na antigeny. K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s protilátkou proti lidským IgG značenou enzymem (enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci. Intenzita vzniklé barevné reakce je úměrná koncentraci protilátek proti antigenům EBNA-1. Obsah kitu: - Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky, každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití) - Kalibrační sérum 1; 200 RU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno tmavě červeně. - Kalibrační sérum 2; 20 RU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno červeně. - Kalibrační sérum 3; 2 RU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno světle červeně. - Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgG): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno modře. - Negativní kontrolní sérum (lidské IgG): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno zeleně. - Enzymový konjugát: peroxidasou značené králičí protilátky proti lidským IgG: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Značeno zeleně. - Vzorkový pufr: 1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno světle modře. - Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný) - Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen: tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku. - Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití. 1 N kyselina fosforečná. - Návod k provedení testů - Protokol s kalibračními hodnotami. Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až + 8 o C, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HBsAG, anti-hcv, anti- HIV-1 a anti-hiv-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně 1
infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody. Příprava a stabilita reagencií Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu. Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a trhnutím otevřete lepící ochranný obal. Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska vytemperovaná na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 o C až + 8 o C, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. Kalibrace a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat. Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat. Vzorkový pufr: Připraven k použití Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou. Například, zřeďte 5 ml pufru pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě skladování +2 o C až + 8 o C. Poznámka. Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 o C a před ředěním ho promíchejte. Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Zastavovací roztok: Připravený pro užití Ředění séra a vzorků plasmy Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například, přidejte 10 µl séra k 1,0 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. Poznámka: Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je znovu. Inkubace Inkubace vzorku: 1. Krok. Podle pipetovacího protokolu naneste 100µl kalibračního séra, pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých mikrotitračních jamek a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě. Promývání: Vyprázdněte jamky a následně každou jamku promyjte třikrát pomocí 300µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechejte pufr 2
v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu, teprve potom jamky vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů (provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky otočené dnem vzhůru na filtrační papír. Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou značené anti-lidské IgG) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Promývaní: Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační desky, a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový roztok. Měření: Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce větší než 620 nm do 30 minut od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku. Pipetovací protokol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C1 P4 P12 P20 B C2 P5 P13 P21 C C3 P6 P14 P22 D Poz. P7 P15 P23 E Neg. P8 P16 P24 F P1 P9 P17 G P2 P10 P18 H P3 P11 P19 Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem kvantitativní analýzy sér 24 pacientů (P1 až P24). Kalibrační séra (C1 až C3), pozitivní a negativní kontrolní séra (poz. a neg.) a všechny vzorky sér od pacientů byly inkubovány jednotlivě v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií. Výpočet výsledků: Horní hranice referenčního rozsahu u neinfikovaných osob (cut-off value ) je podle doporučení EUROIMMUN 20 relativních jednotek na mililitr (RU/ml). Hodnoty vyšší, než je tato hranice, se považují za pozitivní, pod touto hranicí za negativní. Jak pozitivní, tak negativní kontrolní sérum, slouží jako vnitřní kontrola pro provedení testu, musí být proto zařazeny v každém prováděném testu. Kvalitativní nebo semikvantitativní vyhodnocení: Hodnoty extinkce vzorků sér dosahujících maximálních hodnot séra 2 (20 RU/ml) se považují za pozitivní, séra s hodnotami pod touto hranicí jako negativní. Vedle této kvalitativní interpretace je možné také přesnější (semikvantitativní) vyhodnocení výsledků. Poměry > 1,0 se považují jako pozitivní, poměry < 1,0 jako negativní. Poměry se vypočítají z následujícího vztahu: 3
Extinkce vzorku séra Extinkce kalibračního séra 2 = Poměr Kvantifikace: Standardní křivka, ze které se odečítá koncentrace protilátek ve vzorcích sér, se sestrojí vynesením hodnot extinkce získaných z měření 3 kalibračních sér, bod po bodu, proti odpovídajícím jednotkám (lineární/lineární). Následující vynesení je příkladem typické kalibrační křivky. Prosím, neužívejte tuto kalibrační křivku k určení koncentrací protilátek v sérech pacientů. Jestliže hodnoty extinkce vzorku leží nad hodnotami standardní křivky, doporučujeme, aby byl vzorek znovu otestován při ředění 1:400. Výsledek v RU/ml získaný ze standardní křivky pro tento vzorek se potom musí vynásobit faktorem 4. Charakteristiky testu Kalibrace: Jelikož neexistuje referenční sérum pro protilátky proti EBNA-1, vyjadřuje se kalibrace v relativních jednotkách (RU). Pro všechny skupiny prováděných testů musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a relativní jednotky určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v hranicích určených pro tyto důležité hodnoty pro každý kit. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a musel by se opakovat. Aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Kalibrační séra se vystaví stejnému vlivu, a proto nastalé změny jsou povětšinou kompenzovány ve 4
výpočtu výsledků. Tyto situace se berou následně do úvahy a přizpůsobují se časy inkubace substrátu vzhledem k pokojové teplotě: Pokojová teplota 14 o C 18 o C Pokojová teplota 19 o C 23 o C Pokojová teplota 24 o C - 30 o C doba inkubace substrátu 18 min doba inkubace substrátu 15 min doba inkubace substrátu 12 min Antigen: Jamky mikrotitrační destičky jsou potaženy rekombinantním EBNA-1 antigenem viru Epstein-Barrové. V infikovaných buňkách se protilátky proti EBNA-1 projeví typickým granulárním zbarvením jádra při provedení nepřímého komplement amplifikujícího imunofluorescenčního testu. Linearita: Linearita testu byla zkoumána pomocí série ředění sér pacientů s vysokými hladinami koncentrací protilátek. Následující obrázek ukazuje typickou linearitu vzorků zjištěnou na základě 4 sér pacientů. ELISA anti EBNA-1 (IgG) vykazuje linearitu měření v oblasti 2 až 200 RU/ml. Detekční limit: Detekční limit pro anti-ebna-1 ELISA (IgG) je přibližně 1 RU/ml. Reprodukovatelnost: Reprodukovatelnost testu byla zkoumána určením koeficientů rozptylu (CV) uvnitř jednoho a mezi jednotlivými měřeními za užití tří sér, jejichž hodnoty ležely v různých bodech kalibrační křivky. Koeficienty rozptylu uvnitř bloku byly stanoveny z 20 měření a koeficienty rozptylu mezi bloky ze 4 měření provedených v šesti různých dnech. Koeficienty rozptylu uvnitř jednoho měření, n=20 sérum Průměrná hodnota (extinkce) CV (%) 1 0,425 6,2 2 0,912 7,2 3 1,266 4,3 5
Koeficienty rozptylu mezi jednotlivými měřeními, n=4 x 6 sérum Průměrná hodnota (RU/ml) CV (%) 1 53 10,0 2 154 8,2 3 177 8,2 Specifita: Předkládaný ELISA test detekuje protilátky třídy IgG proti EBNA-1. Nebyly nalezeny žádné křížové reakce. Referenční rozsah: Hladiny protilátek (IgG) proti EBNA-1 byly analyzovány testem Euroimmun ELISA ve skupině 176 zdravých dárců krve. Horní hranice 20 RU/ml, dosáhlo 95,5 % dárců krve, kteří byly tedy anti-ebna-1 (IgG) pozitivní, což odráží známou procentuální hodnotu pro hodnotu infekce mezi dospělými. Korelace mezi ELISA testem a testem založeným na měření nepřímé imunofluorecscence (IIFT): Séra 238 pacientů trpících různými chorobami byla analyzována pomocí testu EUROIMMUN anti EBNA-1 ELISA a EUROIMMUN IIFT. Korelace mezi těmito dvěma testy vychází velmi vysoká. Citlivost ELISA ve srovnání s IIFT je 99,5%. Specifita ELISA ve srovnání s IIFT je 100%. Testovaný soubor IIFT (n = 238) pozitivní negativní ELISA pozitivní 189 0 negativní 1 48 Klinické studie: Séra 14 pacientů ve stadiu akutní mononukleosy byla testována pomocí dostupných EUROIMMUN anti- ELISA testů: 6
Akutní infekční mononukleosa n Prevalence CA (IgA) CA (IgG) CA (IgM) EA (IgA) EA (IgG) EA (IgM) EBNA- 1 (IgG) 14 50% 86% 86% 14% 43% 64% 0% V sérologické diagnostice infekční mononukleosy se obvykle určují protilátky proti CA (IgG a IgM třídy), stejně tak protilátky proti EBNA-1 (IgG). V provedené studii byly protilátky proti CA přítomny ve všech 14 vzorcích sér, a to buď IgG, nebo IgM třídy. Kromě toho, všech 14 sér bylo negativních v anti- EBNA-1 ELISA (IgG). Dvě séra byla v anti-ca ELISA pouze IgG pozitivní. Avidita těchto IgG protilátek byla zkoumána na definitivní určení akutní infekční mononukleosy. V obou případech měly protilátky pouze nízkou aviditu, což indikovalo časné stadium infekce. Klinický význam: Virus Epstein-Barrové je kauzativním agens vyvolávajícím infekční mononukleosu, horečnaté onemocnění se zánětem hltanu a lymfadenopatií (zvětšením lymfatických uzlin), které je často doprovázeno hepatosplenomegalií a řidčeji s exanthemem. Kromě toho jsou infekce EBV často spojovány také s Burkitovým lymfomem a rakovinou nosohltanu. Infekční mononukleosa musí být odlišována od cytomegalie a toxoplasmosy a v případě netypického průběhu nemoci také od HIV a dalších infekcí. Imunitní odpověď zprostředkovaná IgM proti CA, která se projeví v heterofilních protilátkách nejdříve a zvýšení titru protilátek třídy IgG, indikuje přítomnost nedávno proběhlé infekce EBV. Jsou-li přítomny protilátky proti jadernému antigenu viru Epstein- Barrové (EBNA), jedná se o pozdní stadium infekce. Ačkoli se EBNA antigeny označené 1 až 6 syntetizují dříve, než další EBV antigeny ( časné antigeny a antigeny virového obalu) v průběhu infekce, jsou prezentovány imunitnímu systému až po destrukci B buněk. Chronologický sled událostí tedy potom je takový, že se protilátky proti obalovým virovým antigenům a časným antigenům objeví dříve, než protilátky proti EBNA. Protilátky proti časnému EBV antigenu (EA) se vyskytují u 70 až 80 % pacientů s infekční mononukleosou, i když jen dočasně v akutní fázi. Vysoké titry protilátek proti EA indikují chronické stadium, či reaktivaci nemoci. Nalézáme je ale také ve spojení s Burkitovým lymfomem a rakovinou nosohltanu. Sérologická diferenciace mezi primární infekcí EBV a reaktivací nemoci není vždy zcela možná. Jsou-li v séru přítomny pouze protilátky proti EA a nikoli proti CA a EBNA, předpokládáme výskyt primární infekce. Jsou-li současně detekovány protilátky proti EBNA, jedná se o reaktivaci infekce. Diferenciace mezi právě probíhající infekcí a infekcí, která již po určitou dobu probíhala, je pro sérologii největší výzvou. Dnes se nejvíce používá diferenciace založená na určení specifických protilátek třídy IgM, které se obecně projevují pouze během počátečních stadií infekce, ale jejichž určení je nejisté a problematické. Interferujícím faktorem může být přetrvávající imunitní odpověď protilátek IgM, nedetekovatelná nebo zpožděná tvorba IgM, či tvorba nespecifických IgM způsobená polyklonální stimulací B buněk. Ve 20 % všech případů právě probíhající infekce EBV nebyly nalezeny protilátky IgM proti EBV obalovému proteinu (CA), u 15 % případů byla tvorba těchto púrotilátek zpožděna, na druhé straně u 4 % pacientů protilátky třídy IgM přetrvávaly. V posledních letech se pro bezpečné určení 7
právě probíhající infekce provádí určení avidity protilátek třídy IgG: první reakcí imunitního systému na právě probíhající infekci je tvorba protilátek s nízkou aviditou. Jak infekce postupuje, dochází k tvorbě protilátek IgG, které jsou již více přizpůsobeny danému antigenu a avidita roste. Pokud nejsou v séru detekovány protilátky s vysokou aviditou, můžeme předpokládat, že infekce je doposud v ranném stadiu. (EUROIMMUN testovací systém pro určení avidity protilátek IgG proti CA, objednací číslo EI 2791-9601 G). Literární odkazy: 1. Koch H.G.: Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Deutsches Arzteblatt 7: 140 144 (1995). 2. Dopakte H.D., Schuy W.: Compact Epstein-Barr virus diagnosis based on defined antigen mix and specific IgA. Res.Virol. 147: 53-66 (1996). 3. Selgneurin J.-M.: Diagnostik von Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Diagnose und Labor 42: 83 89 (1992). 4. Dolken G., Weitzmann U., Boldt C., Bitzer M., Brugger, Lohr W.: Enzyme-Linked Assay for IgG Antiboduies to Epstein-Barr-Virus Associated Early Antigens and Viral Capsid Antigen. J. Immunol.Meth. 67: 225-233 (1984). 5. Porstmann T.: Epstein-Barr-Virus. Diagnostische Bibliothek 6/7 (1992). Lennette E.T.: Epstein-Barr-Virus. Virology 8