Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Změny hodnot rutinních koagulačních testů v závislosti na času a teplotě BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Zpracovala: Jana Kahounová, Studentka 3. ročníku studijního programu Zdravotnická bioanalytika, obor Zdravotní laborant Vedoucí práce: Mgr. Petr Sadílek Česká Lípa, 2010 1
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a všechny použité prameny jsem uvedla v seznamu literatury. V České Lípě 30. Dubna 2010 2
Poděkování Děkuji prim. MUDr. Jindřišce Maškové a celému hematologicko-transfuznímu oddělení NsP Česká Lípa za umožnění realizace mé bakalářské práce; personálu hematologické a interní ambulance při NsP Česká Lípa za poskytnutí vzorků biologického materiálu. Dále děkuji Mgr. Petru Sadílkovi za cenné rady a připomínky při zpracování mé bakalářské práce. V České Lípě 30. Dubna 2010 3
OBSAH 1. Úvod.. 6 2. Cíl práce.. 7 3. Teoretická část...8 3.1. Současné poznatky..8 3.2. Preanalytická fáze.12 3.2.1. Příprava pacienta na odběr.13 3.2.1.1. Biologické vlivy ovlivňující výsledky v preanalytické fázi 13 3.2.1.1.1. Vliv léků. 13 3.2.1.1.2. Fyziologické stavy 13 3.2.2. Odběr krve 14 3.2.3. Označení vzorku a žádanky 15 3.2.4. Transport biologického materiálu 16 3.2.5. Uchování biologického materiálu před analýzou..16 3.3. Chyby v preanalytické fázi.17 3.3.1. Chyby v přípravě pacienta. 17 3.3.2. Chyby v odběru vzorku 18 3.3.3. Chyby v označení biologického materiálu či žádanky 18 3.3.4. Chyby při transportu vzorku 19 3.3.5. Chyby při uchovávání vzorku před analýzou 19 4. Materiál, metody a přístrojové vybavení 20 4.1. Hemokoagulační laboratorní metody..20 4.1.1. Protrombinový test 20 4.1.2. Aktivovaný parciální tromboplastinový test.22 4.2. Přístrojové vybavení v hemokoagulační laboratoři.23 4.2.1. SYSMEX CA 1 500.23 5. Praktická část. 27 5.1. Pracovní postup 29 4
5.2. Grafické znázornění ných odchylek..30 6. Diskuse 38 7. Závěr.39 8. Seznam použité literatury. 40 9. Seznam zkratek. 44 10. Příloha..45 10.1. Tabulky naměřených hodnot..45 10.2. Grafy vypočtených hodnot 49 5
1. Úvod Rutinní koagulační testy jsou důležitou součástí hematologického vyšetření odhalující řadu fyziologických a patologických stavů organismu. Protrombinový test a aktivovaný parciální tromboplastinový test jsou nejvíce využívaná koagulační stanovení. Patří mezi základní předoperační vyšetření a také slouží k monitoringu antikoagulační léčby. Protože jednotlivé komponenty koagulačního systému jsou málo stabilní, je velmi důležité striktně dodržovat preanalytické a analytické postupy, zajišťující správné vyhodnocení testu. Výsledky měření obou testů (koagulačních testů obecně) ovlivňuje přesné množství odebraného vzorku, homogenizace, doba transportu do laboratoře a samozřejmě i samotné zpracování vzorku. 6
2. Cíl práce Cílem mé práce bylo ověřit stabilitu koagulačního systému in vitro pomocí skupinových testů protrombinového testu a aktivovaného parciálního tromboplastinového testu. Zabývala jsem se porovnáváním změn hodnot měřených vzorků v závislosti na čase měření testů od odběru (a zpracování) vzorku a v závislosti na teplotě uchování vzorku před analýzou. 7
3. Teoretická část 3.1. Současné poznatky Hemokoagulační testy se zabývají stanovením nestabilních komponent koagulačního systému, proto je důležité zpracovat vzorek v předepsaném časovém horizontu. Obecně platí, že krevní vzorky odebrané na koagulační vyšetření musí být zpracovány (centrifugovány) do dvou hodin po odběru. V roce 2007 byl na Oddělení klinické hematologie KN Liberec proveden výzkum stability koagulačních testů v závislosti na čase uplynulém od odběru biologického materiálu a jeho následného zpracování. Hrdinová a kol. provedly testy zahrnující tato koagulační vyšetření: protrombinový test, aktivovaný parciální tromboplastinový test, trombinový test, vyšetření aktivity antitrombinu, FVIII a hladiny fibrinogenu. Celkem bylo vyšetřeno 180 osob (1340 testů). V první fázi testu byly měřeny vzorky zpracované do dvou hodin po odběru. V další fázi byly vzorky zpracovány s časovým odstupem 4, 6 a 8 hodin. U každého z koagulačních testů byl použit soubor 90 osob, rozdělený na tři části. Nejprve byly všechny vzorky zpracovány a měřeny do dvou hodin po odběru. Poté bylo 30 vzorků zpracováno a změřeno po 4 hodinách, dalších 30 po 6 hodinách a zbývajících 30 po 8 hodinách po odběru. U vyšetření protrombinového testu a aktivovaného parciálního tromboplastinového testu byly použity dva soubory vyšetřovaných osob zdravé osoby (dárci krve) a pacienti s perorální antikoagulační léčbou. Pro ostatní parametry byl použit jeden soubor vyšetřovaných osob. (1) Z výsledků testů je patrné, že koagulační testy jsou ovlivněny dobou od odběru vzorku do jeho zpracování. U všech testů se s prodlužující dobou od odběru zvětšovala odchylka od prvního referenčního vyšetření. Hodnoty protrombinového času byly u 8
zdravé populace poměrně stálé. U pacientů s perorální antikoagulační léčbou byly hodnoty protrombinového času po 4 a 6 hodinách zhruba u 80 % pacientů stálé. Po 8 hodinách však měření vykazovalo systematickou odchylku ke kratším časům u všech vzorků. U aktivovaného parciálního tromboplastinového testu se hodnoty u zdravých osob i hodnoty u pacientů s antikoagulační léčbou prodlužovaly již po 4 hodinách od odběru vzorku. (1) Tato studie potvrzuje důležitost správného dodržení preanalytické fáze hemokoagulačního vyšetření a nutnost zpracovat vzorky biologického materiálu do dvou hodin po odběru. O rok později provedli Bartek a kol. z Hematologického a transfuziologického oddělení KLM TU, Onkologického ústavu sv. Alžběty v Bratislavě podobnou studii. (2) Testováno bylo 80 vzorků monitorovaných od odběru až po jednotlivá vyšetření, která byla provedena ihned po odběru (do 1 hodiny od odběru), dále pak v časovém úseku 4 a 8 hodin po odběru. Byly použity metody: protrombinový test, aktivovaný parciální tromboplastinový test, trombinový test a stanovení hladiny fibrinogenu v plazmě. (2) Výsledky stanovení protrombinového testu vykazují nou odchylku od referenční hodnoty (výsledek vyšetření do 1 hodiny po odběru) v rozmezí -4,63;0,21%. Výsledky stanovení trombinového testu vykazovaly nou odchylku od referenční hodnoty v rozmezí -3,56;0,83%. Při stanovení aktivovaného parciálního tromboplastinového testu byla ná odchylka od referenční hodnoty +0,79;13,20% a při stanovení hladiny fibrinogenu v plazmě byla ná odchylka od referenční hodnoty v rozmezí -2,67;1,93%. (2) Z těchto údajů vyplynulo, že se striktním dodržením času vyšetření je možné při některých parametrech polemizovat a že vyšetření vzorků, které není možné zpracovat do dvou hodin po odběru, lze považovat za dostatečně správné. (2) Podobná studie proběhla také v témže roce ve švýcarském Bernu. V Ústavu hematologie University Hospital Inselspital testovali Zürcher a kol. stabilitu 9
koagulačních testů v různých časových intervalech. Celkem bylo vyšetřeno 59 pacientů. Všechny vzorky byly po odběru skladovány při laboratorní teplotě a zpracovány v období do 1 hodiny po odběru, dále 4-6 hodin po odběru, 8-12, 24-28 a 48-52 hodin po odběru vzorku. Kromě protrombinového testu a aktivovaného parciálního tromboplastinového testu byla ověřována stabilita mnoha dalších testů; např. hladina fibrinogenu, koncentrace koagulačních faktorů II, V, VII, VIII, IX, X, XI, či aktivita proteinů C a S. (3) Výsledky studie poukazují na různý vliv doby skladování vzorku před zpracováním pro jednotlivé testy. Zatímco hladina fibrinogenu či vyšetření antitrombinu nevykazovala výrazné odchylky (více než 10% z původní hodnoty) ani po 48 hodinách, stanovení koncentrace faktoru V a VIII vykazovalo významnou odchylku již po 24 hodinách. V případě stanovení protrombinového testu a aktivovaného parciálního tromboplastinového testu vznikala v měření významná odchylka až po 48 hodinách po odběru vzorku. (3) Test ověření stability koagulačních komponent v čase (od odběru vzorku po následné zpracování) pomocí protrombinového testu a aktivovaného parciálního tromboplastinového testu proběhl také v roce 1998 na Ústavu patologie, Northwestern University School of Medicine v Chicagu. Neofotistos a kol. zde provedli vyšetření souboru 80ti vzorků, přičemž 20 vzorků pocházelo od zdravých dobrovolníků, 30 od pacientů léčených heparinem a dalších 30 od pacientů užívajících warfarin. Všechny vzorky byly ihned po odběru centrifugovány a měřeny, dále byly uchovávány při pokojové teplotě a následně měřeny v časovém odstupu 2, 4 a 8 hodin po odběru vzorku. (4) Hodnoty protrombinového času u zdravých dobrovolníků, ale i u pacientů užívajících warfarin, se s rostoucím časem zkracovaly, ale rozdíl v těchto hodnotách nebyl příliš velký a proto lze říct, že nemá klinický význam. (4) Hodnoty aktivovaného parciálního tromboplastinového testu se naopak s rostoucím časem zvyšovaly, přičemž u pacientů užívajících heparin byly rozdíly mezi počátečním a následujícími měřeními vyšší než u zdravých dobrovolníků. (4) 10
Tyto výsledky vedly k domněnce, že po prvotním zpracování vzorku (centrifugace do dvou hodin od odběru) je vzorek stabilní i po 8 hodinách po odběru a hodnoty protrombinového testu a aktivovaného parciálního tromboplastinového testu se významně nemění. (4) Se čtyřmi různými skupinami dobrovolníků proběhl v témže roce podobný test stability koagulačních vyšetření na Ústavu patologie, University of Coloredo Health Sciences Center v Denveru. Adcock a kol. zde testovali vliv času a teploty při skladování vzorku před vlastním vyšetřením protrombinového testu a aktivovaného parciálního tromboplastinového testu. Testovány byly vzorky zdravých dárců, dále hospitalizovaných pacientů bez jakékoliv antikoagulační léčby, pacientů užívajících perorální antikoagulační léčbu a vzorky pacientů užívajících heparinové preparáty. Od každého jedince byly vzorky skladovány čtyřmi způsoby. Polovina byla odstředěna a uchovávána při 20 C a 4 C, druhá polovina nebyla ihned po odběru podrobena centrifugaci a dále byla (jako plná krev) skladována při 20 C a 4 C. Koagulační testy byly měřeny po dvouhodinových časových intervalech až do času 24 hodin po odběru. (5) Výsledná data ukazují, že protrombinový čas je stabilní po 24 hodin od odběru vzorku, bez ohledu na podmínky skladování. Naproti tomu aktivovaný parciální tromboplastinový test vykazuje stabilitu pouze 8 hodin po odběru vzorku a u heparinizovaných vzorků skladovaných při pokojové teplotě ve formě plné krve se doba stability zkracuje na 4 hodiny. (5) Tyto studie se zabývají stabilitou vzorků pro koagulační vyšetření, která se mění v závislosti na čase (uběhlého od odběru vzorku, či od odběru a prvotního zpracování vzorku) a v závislosti na podmínkách zpracování vzorku (teplota). Avšak výsledek laboratorního vyšetření zde může být ovlivněn řadou dalších faktorů. Protože většina laboratorních chyb vzniká v preanalytické fázi vyšetření, je nutné tyto vlivy eliovat, nebo, není-li to možné, počítat s nimi při posuzování výsledků. (6) 11
3.2. Preanalytická fáze Laboratorní vyšetření slouží zejména k diagnostickým účelům, ale svůj význam mají též při monitorování průběhu nemoci, určování prognózy onemocnění, ale též při preventivních vyšetřeních nebo při screeningových programech. (7) Laboratorní vyšetření se rozděluje do tří fází: preanalytické, analytické a postanalytické. Nejdůležitější fází je fáze preanalytická, neboť neodhalené chyby v této fázi ovlivní negativně analytickou i postanalytickou fázi, a tím v konečném důsledku i pacienta. Preanalytická fáze zahrnuje odběr, přípravu a zpracování vzorku biologického materiálu před zahájením vlastního laboratorního vyšetření. Variabilita jednotlivých vyšetřovaných analytů ve vzorku je kromě vlastní biologické variability daná klinickým stavem pacienta (či vyšetřovaného jedince) ovlivněna i jeho situací před odběrem biologického materiálu, metodikou odběru a dále i všemi operacemi mezi odběrem a analýzou (uskladnění vzorku, transport, centrifugace atd.) (8) V preanalytické fázi vyniká až 2/3 chyb celého laboratorního procesu a tyto chyby mohou vést k mylným závěrům jak falešně pozitivním, tak falešně negativním. (7) Je proto nutné, aby pacient byl před odběrem řádně informován, dále aby vlastní odběr byl proveden dle doporučení pro jednotlivé stanovované látky a aby byl řádně zajištěn transport vzorků. (8) 12
3.2.1. Příprava pacienta na odběr Odběry biologického materiálu by se měly provádět po předchozím poučení pacienta. Ačkoli pro hematologické vyšetření je možné odebírat krevní vzorky po celý den, provádí se odběr většinou ráno. Před odběrem žilní krve je vhodné vypít alespoň 0,25 l neslazeného nápoje, neboť dehydratace může zhoršit, případně i znemožnit vlastní odběr, navíc výsledky laboratorních testů mohou být výrazně zkresleny. (9) 3.2.1.1. Biologické vlivy ovlivňující výsledky v preanalytické fázi 3.2.1.1.1. Vliv léků Vliv léků má velký podíl při hodnocení laboratorních výsledků. Vždy je nutné přesně specifikovat typ odběru a podle toho pak eventuelně vyloučit na určitou dobu lék, který konkrétní laboratorní nález může ovlivnit. Mezi léky ovlivňující hemokoagulační testy patří hlavně kumarinové preparáty, kde se s výjimkou sledování léčby doporučuje provést odběry 6-8 týdnů po vysazení léčby (Odběry ProCglobal, Protein C, Protein S, lupus antikoagulans, všechny K dependentní faktory), hormonální antikoncepce, kde platí podobná pravidla pro odběr vzorků jako u pacientů léčených kumarinovými preparáty a nízkomolekulární a nefrakciované hepariny, jejichž přítomnost může zkreslovat výsledky vyšetření lupus antikoagulans, či hladinu antitrombinu v plazmě. (10) 3.2.1.1.2. Fyziologické stavy Mezi fyziologické stavy ovlivňující hodnoty hemokoagulačních testů patří například gravidita a šestinedělí, kdy dochází ke změnám hemokoagulačních poměrů a některé testy mohou být ovlivněny (zejména test ProCglobal, ProteinS, vwf, FVIII, 13
euglobulinová lýza). Dalším fyziologickým stavem, který může ovlivnit výsledné hodnoty hemokoagulačních testů, je menstruační cyklus, kdy se doporučuje provádět testy na von Willebrandovu chorobu 4. - 10. den cyklu. Do této skupiny patří také věk nebo současně probíhající jiná nemoc. (10) 3.2.2. Odběr krve Vlastní odběr může být ovlivněn polohou pacienta při odběru, typem a pořadím odběrových zkumavek a technikou odběru. (11) Poloha pacienta při odběru je významná a může ovlivnit řadu stanovovaných analýz. Standardní poloha pro odběr pacienta je vsedě, přičemž je důležité, aby pacient před odběrem byl imálně 15 ut v klidu. Rozdíl mezi polohou vstoje a vleže znamená 10 20% redukci krevního objemu a vzestup koncentrace plazmatických proteinů. (11) K odběru se používá kubitální žíla ve fossa antebrachii nebo žíly v loketním ohbí. Žíly na hřbetu ruky je možné využít, ovšem je třeba si uvědomit rizika u diabetiků a osob s horší cirkulací (vznik možných trofických defektů). (7) Po dezinfekci loketní jamky je provedena šetrná venepunkce. Turniket přitom nesmí být zatažen déle jak jednu utu. Jakmile krev začne stékat do zkumavky, musí se turniket okamžitě povolit. (8) V současné době jsou využívány odběrové systémy využívající vakua, což při správném použití umožňuje odběr přesného množství venózní krve potřebné pro analýzu. Během odběru je dodržováno standardní pořadí odebíraných zkumavek. A to: 1. Zkumavka pro hemokultury 2. Zkumavka bez přísad 14
3. Zkumavka s K 3 EDTA 4. Zkumavka s citrátem sodným 5. Zkumavka s pufrovaným citrátem sodným 6. Zkumavka s heparinem (13) Pokud je pacient odebírán pouze na koagulační vyšetření, první 2ml odebrané krve se nepoužívají, jelikož hrozí kontaace vzorku tkáňovým faktorem a aktivace destiček na vnitřním plášti jehly. (14) Při odběru nesrážlivé krve je nutno krev dobře promíchat kývavým pohybem. Při třepání by mohlo docházet ke vzniku vzduchových bublin a mikrosraženin, které znemožňují vyšetření. Při odběrech na hemokoagulační vyšetření je nutné striktně dodržovat předepsaný objem odebírané krve. Při nedodržení daného poměru citrátu sodného a odebíraného vzorku dochází ke zkreslení výsledků vyšetření. 3.2.3. Označení vzorku a žádanky Každý vzorek biologického materiálu přijímaný do laboratoře musí být označen základními údaji pacienta a musí být opatřen odpovídající a řádně vyplněnou žádankou. Identifikace pacienta na zkumavce (nebo jiné odběrové nádobě) musí obsahovat: jméno, příjmení, rodné číslo (číslo pojištěnce), kód pojišťovny, zkratku oddělení nebo zdravotního zařízení, jež si vyšetření žádá. (13) Žádanka na vyšetření obsahuje kromě údajů totožných s údaji na zkumavce ještě razítko a telefonní kontakt na oddělení, žádající dané vyšetření; kód diagnózy, datum a čas odběru a označení, zda jde o vyšetření rutinní či statimové. (13) 15
Pokud některý z údajů chybí, neměl by být vzorek biologického materiálu zpracován. Výjimkou jsou pacienti v bezvědomí, u kterých není identifikace možná. V tomto případě musí být biologický materiál i příslušná žádanka označeny jiným nezaměnitelným způsobem (např. identifikačním číslem). 3.2.4. Transport biologického materiálu Transport biologického materiálu by měl být rychlý a šetrný. Pro okamžitý transport biologického materiálu je postačující laboratorní teplota. Extrémní teplota je příčinou inaktivace enzymů. (12) Vzorek biologického materiálu musí být dobře uzavřen, aby bylo zabráněno jeho zahuštění odpařováním, mikrobiální kontaaci, vlivu světla, tepla či metabolismu krevních elementů. (15) Pro koagulační stanovení platí transport a zpracování odebraného materiálu nejdéle do dvou hodin po odběru. Citrát sodný vyvazuje kalciové ionty potřebné pro vznik fibrinového vlákna, nezastavuje tím však koagulační děj ve všech krocích. Dochází tak ke spotřebě některých koagulačních faktorů a tím i ke zkreslení výsledků koagulačních testů. 3.2.5. Uchování biologického materiálu před analýzou Po přijmutí biologického materiálu do laboratoře jsou vzorky zpracovány dle požadovaných metod. V případě hemokoagulačních metod se zpracováním vzorku rozumí odstranění krevních buněk, které interferují ve většině koagulačních testů, vhodnou centrifugací 16
umožňující získání plazmy bohaté na destičky, chudé na destičky, nebo v případě speciálních koagulačních metod (vyšetření lupus antikoagulans) plazmy bezdestičkové. Pro rutinní koagulační testy používáme plazmu chudou na destičky. Ve většině případů se ihned po zpracování biologického materiálu provádí požadovaná analýza. Po získání plazmy zůstává vzorek při pokojové teplotě stabilní jednu až čtyři hodiny (záleží na typu požadované analýzy). (11) 3.3. Chyby v preanalytické fázi Až k 70% všech laboratorních chyb dochází v průběhu preanalytické fáze a až 12,5% chyb v preanalytické fázi může být příčinou chybného lékařského rozhodnutí. (6) K dosažení co nejpřesnějších výsledků vyšetření a pro imalizaci nutnosti opakovaných odběrů je důležité vyvarovat se odchylek plynoucích z nestandardních postupů v preanalytické fázi. (6) 3.3.1. Chyby v přípravě pacienta Načasování odběru krve při monitorování léků je nutné určit čas odběru s ohledem na poločas eliace léků (např. vyšetření anti Xa) (10); pro vyšetření agregace trombocytů je nutné, aby pacient vysadil 14 dní před odběrem preparáty s kyselinou acetylsalicylovou a nesteroidní antiflogistika. (16) 17
3.3.2. Chyby v odběru vzorku Výběr místa vpichu nevhodná je například strana, kde byla provedena mastektomie (lymfostáza), místo s hematomem, jizvami nebo paže se zavedenou infúzí. (10) Vliv protisrážlivých činidel zásadní chybou je volba nevhodného protisrážlivého činidla, nebo nedodržení poměru mezi krví a protisrážlivým činidlem; zvláště nedodržení poměru krve a citrátu sodného u koagulačních testů vede ke značnému zkreslení výsledných hodnot. (10) Kontaace dezinfekčním činidlem místo vpichu musí být dokonale suché; vlhká kůže po dezinfekci může způsobit hemolýzu erytrocytů. Nevhodné je dlouhé zatažení turniketem nebo přílišné cvičení paží. V obou případech může vzniknout hemolýza erytrocytů, která je při analýze nežádoucí. (10) Kontaace infúzí vzorek krve se odebírá z opačné končetiny, než je zaveden katétr infuze; nikdy se neodebírá krev ze žíly nad místem, kde je aplikována infuze ani přímo z katétru (i po odstranění prvních 10 ml krve vznikají chybné výsledky hlavně aptt a TT). (10) 3.3.3. Chyby v označení biologického materiálu či žádanky Neoznačený nebo nečitelně označený vzorek biologického materiálu požadovanou analýzu nelze provést; nutno zažádat o nový, správně označený odběr. (13) Neshoda v označení vzorku a příslušné žádanky požadované vyšetření nemůže být provedeno; nutno zažádat o nový odběr, žádanku či obojí. (13) Nekompletní údaje na žádance dle povahy chybějících údajů se materiál k analýze znehodnotí, nebo se potřebné údaje doplní (např. telefonicky). (13) 18
Biologický materiál bez příslušné žádanky Požadované vyšetření lze provést po dodání žádanky; vzorek biologického materiálu je zpracován a uchováván tak, aby mohl být použit k pozdější analýze. (13) Žádanka bez příslušného biologického materiálu žádanka se zadá pod pořadovým číslem do laboratorního informačního systému s poznámkou vzorek nedodán. (13) 3.3.4. Chyby při transportu vzorku Transport vzorku za vysoké nebo nízké teploty. Časový interval mezi odběrem a dodáním vzorku do laboratoře překračuje dobu stability vzorku. Poškození odběrové nádobky s rizikem kontaace vzorku. (16) 3.3.5. Chyby při uchování vzorku před vlastní analýzou v laboratoři Znehodnocení vzorku poškození vzorku při centrifugaci, vystavení vzorku extrémním teplotám. Záměna vzorku např. chybným zařazením zkumavek v průběhu analýzy. 19
4. Materiál, metody a přístrojové vybavení 4.1. Hemokoagulační laboratorní metody Hemokoagulační laboratorní metody se v zásadě rozdělují na testy globální, skupinové a specifické. Zatímco testy globální popisují srážecí proces jako celek a jsou hrubě orientační, skupinové testy popisují určitou část koagulačního děje a v hemokoagulační laboratoři jsou využívány nejvíce (protrombinový test, aktivovaný parciální tromboplastinový test, trombinový test). Specifické testy se již zabývají jen jedním z koagulačních činitelů a patří sem například stanovení fibrinogenu, jednotlivých koagulačních faktorů, inhibitorů atd. (17) Mezi rutinní hemokoagulační metody, prováděné ve většině laboratoří, patří: protrombinový test, aktivovaný parciální tromboplastinový test, trombinový test, stanovení aktivity antitrombinu, stanovení hladiny fibrinogenu a D-dimerů. Protrombinový test a aktivovaný parciální tromboplastinový test jsou nejfrekventovanějšími testy v hemokoagulační laboratoři, proto jsem si je zvolila pro svou práci. 4.1.1. Protrombinový test Protrombinový test (Tromboplastinový test, Quickův test) sleduje vnější cestu aktivace přeměny protrombinu na trombin a zachycuje aktivitu faktorů II, V, VII, X a fibrinogenu. (17) Je to rychlý, citlivý screeningový test vhodný pro monitoring orální antikoagulační terapie kumarinovými preparáty, pro diagnostiku získaných či geneticky podmíněných onemocnění (např. absence koagulačních faktorů). 20
Principem této metody je měření koagulačního času od přidání startovací reagencie (tromboplastin s přídavkem CaCl 2 ) k vyšetřované plazmě po vytvoření prvního detekovatelného fibrinového vlákna. (14) Před vlastní analýzou je nutné vzorek upravit centrifugací, čímž se získá plazma chudá na trombocyty. Takto upravený vzorek je stabilní až 8 hodin při laboratorní teplotě a 24 hodin při teplotě 4-8 C. (18) V případě ponechání vzorku ve formě plné krve dochází k aktivaci faktoru VIII a V, čímž dochází ke zkreslení konečného výsledku. Primární veličinou je čas. Použitím přístrojů s různými principy měření a použitím reagencií různých výrobců a šarží vznikají různé hodnoty. Pro pacienty bez léčby se pro vyjádření výsledků používá ratio (R), což je poměr časů pacientovy plazmy a plazmy normální, jejíž čas si každá laboratoř stanoví opakovaným měřením vhodného referenčního materiálu. Pro pacienty na antikoagulační léčbě se od roku 1982 stanovuje INR, což je poměr času pacientovy a normální plazmy umocněný na ISI (mezinárodní index citlivosti) použité reagencie. Jelikož jde o normalizovaný poměr, je získaný výsledek porovnatelný mezi různými laboratořemi. (19) Fyziologické rozmezí R (INR): neléčení pacienti 0,8 1,2 (14) INR: terapeutický rozsah při léčbě kumariny 2,0 4,0 (14) Abnormální hodnoty nacházíme u orální antikoagulační léčby, při nedostatku vitamínu K, u jaterních onemocnění a v přítomnosti autoprotilátek proti koagulačním faktorům. (14) 21
4.1.2. Aktivovaný parciální tromboplastinový test Aktivovaný parciální tromboplastinový test sleduje vnitřní cestu aktivace přeměny protrombinu na trombin a zachycuje složky koagulačního systému jako je faktor II, V, VIII, IX, X, XI, XII, fibrinogen, HMWK a prekalikrein. Využívá se pro monitorování heparinové terapie a je důležitým testem pro diagnostiku krvácivých a trombotických stavů. (17) U aktivovaného parciálního tromboplastinového testu je též nutné primární vzorek upravit centrifugací. Stabilita takto upraveného vzorku je 4 hodiny při laboratorní teplotě. Při heparinové léčbě je však stabilita plazmy pouze 1 hodina. (20) Měří se čas od přidání startovací reagencie (chlorid vápenatý) do reakční směsi (vyšetřovaná plazma, směs fosfolipidů, aktivátor) po vytvoření prvního detekovatelného fibrinového vlákna. (14) Jako výsledek vydáváme jednak koagulační čas, jednak poměr koagulačního času vyšetřované plazmy s hodnotou koagulačního času plazmy normální. Zkrácené časy aktivovaného parciálního tromboplastinového testu nacházíme u trombotických stavů, prodloužené časy pak u vrozené nebo získané nedostatečnosti faktorů vnitřní koagulační cesty, u heparinové terapie, dysfibrinogenémie nebo afibrinogenémie. (17) Fyziologické rozmezí aptt-r: 0,8 1,2 (14) 22
4.2. Přístrojové vybavení v hemokoagulační laboratoři Pro stanovení koagulačních testů jsou nezbytné kvalitní přístroje koagulometry. Koagulometry mohou být buď optické (např. SYSMEX CA 1 500, ACL 200, BCS Koagulometr, ) nebo elektromechanické (např. BEHNK CL4, Diagnostica Stago a další). Optické koagulometry využívají principů nefelometrie nebo turbidimetrie, kde se měří snížení optické hustoty po vytvoření koagula nebo fibrinové struktury. Výhodou těchto koagulometrů je detekce velmi časných koagulačních změn, nevýhodou pak bývá obtížné stanovení hemolytických, ikterických nebo chylózních vzorků. (14) Elektromechanické koagulometry se rozdělují na koagulometry kuličkové a háčkové. Kuličkové koagulometry využívají pohybu kovové kuličky v magnetickém poli, která se při změně viskozity prostředí zbrzdí, čímž dojde k vychýlení z jejího původního směru. Tato změna je převedena na elektrický impulz, který zastaví ukazatel času. Háčkové koagulometry obsahují dvě elektrody, mezi nimiž při vytvoření prvního fibrinového vlákna proběhne elektrický impulz, který zastaví ukazatel času. (17) 4.2.1. SYSMEX CA 1 500 Jediným koagulometrem na hematologicko-transfuzním oddělení v NsP Česká Lípa je SYSMEX CA 1 500 od firmy DADE-BEHRING. Slouží pro stanovení všech statimových i rutinních koagulačních testů. Analyzátor Sysmex CA-1500 je plně automatizovaný optický koagulometr pro stanovování koagulačních vyšetření plazmy v In Vitro diagnostice, který provádí analýzu rychle a ve velkém objemu vzorků s vysokým stupněm přesnosti. Analýza vzorků je prováděna s použitím koagulačních, chromogenních a imunochemických metod. (21) 23
Protrombinový test i aktivovaný parciální tromboplastinový test jsou na našem oddělení měřeny koagulační metodou (bodovou detekční metodou). princip analýzy: Koagulační metoda - Koagulační bodová detekční metoda: Reakční směsí vyšetřované krevní plazmy a použité reagencie prochází světelný paprsek. Koagulační čas se stanoví pomocí množství rozptylu světla, které je nastaveno pro bod detekce koagulace. Jako start detekce je považováno množství rozptylu světla 0% a jako kompletní koagulace je považováno množství rozptylu světla 100%. (21) Specifika analyzátoru - Kapacita: imální (cca 120 testů/hodinu) Průměrná (během simultánní analýzy 2 parametrů PT a aptt cca 80 testů/hodinu) - Reprodukovatelnost: Protrombinový test C.V. 2% nebo méně Aktivovaný parciální tromboplastinový test C.V. 2% nebo méně - Detektor: Optický detektor - Protokol testů: PT objem vyšetřované plazmy - 50 µl objem reagencie (Thromborel S) 100 µl APTT objem vyšetřované plazmy 50 µl objem první reagencie (Actin FS) 50 µl (inkubace 60 sec) objem druhé reagencie (CaCl 2 ) 50 µl (21) 24
4.3. Použité reagencie Protrombinový test: Thromborel S (DADE BEHRING) složení: lyofilizovaný lidský tromboplastin, CaCl 2, stabilizátory ředění: lyofilizovaný tromboplastin + 10 ml redestilované vody Inkubace 1hod./laboratorní teplota stabilita: 8 hod / 37 C 2 dny / 15 25 C 5 dní / 2-8 C Hodnota ISI: 0,99 Aktivovaný parciální tromboplastinový test: Dade Actin FS Activated PTT Reagent (DADE BEHRING) složení: směs fosfolipidů, pufr, stabilizátory, aktivátor ředění: neředí se, dodáváno od výrobce ihned k použití stabilita: 7 dní/ 2 15 C (po otevření) Calcium Chloride Solution (DADE BEHRING) složení: 0,025M CaCl 2 25
ředění: neředí se, dodává se od výrobce přímo k použití stabilita: 8 týdnů / 2 25 C (po otevření) Kontrolní materiál: Control plazma N rozmezí pro dané testy: Protrombinový čas 10,0 13,6 sek. Aktivovaný parciální tromboplastinový test 23,0-31,2 sek. ředění: lyofilizovaná Control Plazma N + 1,0 ml redestilované vody Inkubace 15 ut / laboratorní teplota stabilita: 4 hod / 15-25 C 4 týdny / -20 C Control plazma P rozmezí pro dané testy: Protrombinový čas 19,4 29,2 sek. Aktivovaný parciální tromboplastinový test 47,4 71,2 sek. ředění: lyofilizovaná Control Plazma P + 1,0 ml redestilované vody Inkubace 15 ut / laboratorní teplota stabilita: 4 hod / 15 25 C 4 týdny / -20 C (21) 26
5. Praktická část Během dvouměsíčního měření bylo vyšetřeno 60 osob (1080 testů). Polovina vyšetřených osob byly zdraví dárci, druhou polovinu tvořili pacienti s perorální antikoagulační léčbou. Krev byla odebírána do zkumavek s citrátem sodným (VACUTAINER). Každé osobě byly odebrány dvě zkumavky a byl přesně zaznamenán čas odběru. Ihned po odběru byly obě zkumavky centrifugovány (5./5600 ot.). Jedna zkumavka posloužila k prvnímu měření testů aptt a PT (měření bezprostředně po odběru a centrifugaci), poté byla uchovávána při laboratorní teplotě a použita k následnému měření. Druhá zkumavka byla uložena do lednice a mezi jednotlivými měřeními byla tak uchovávána při 4 C. Dále byly oba vzorky testovány po 2, 4, 8 a 24 hodinách po odběru. Jednotlivá data byla zapsána do tabulky a následně zanesena do grafu. Všechny vzorky byly změřeny na analyzátoru Sysmex CA-1500 od firmy Dade Behring. Všechny naměřené údaje byly zpracovány jednotným způsobem. Nejprve jsem vypočítala rozdíly naměřených hodnot INR, aptt-r každého vyšetřovaného pacienta v čase 2, 4, 8, 24 hod. po odběru od příslušných hodnot naměřených hned po odběru. Poté jsem pro každý měřený časový interval vypočítala z těchto rozdílů, směrodatnou odchylku a hodnoty ima a ima pro Bland-Altmanův graf. V našem případě jsem použila modifikaci Bland-Altmanova grafu, kde na osu X jsem místo u vynášela hodnoty získané v čase 0. Na osu Y Bland-Altmanova grafu jsem nanášela rozdíl hodnot INR, aptt-r, získaných referenční a srovnávací metodou (v našem případě rozdíl hodnot INR, aptt-r v daném čase a čase 0). Graf je doplněn o tři kontrolní čáry, jež reprezentují rozdílů, od něhož jsou ještě zakresleny přímky ve vzdálenosti 1,96 s d na obě strany. (22) 27
Pro lepší znázornění vývoje né odchylky v závislosti na čase skladování vzorku jsem v kapitole 5.2. sestavila osm přehledných souhrnných grafů, kde osa X nese hodnoty časových intervalů měřených vzorků, osa Y pak né odchylky hodnot pro daný čas. Dále jsou grafy opatřeny dvěma kontrolními čarami, znázorňující imum a imum hodnot (+/-1,96s d ) pro každou nou odchylku vypočtenou z rozdílu hodnot v příslušném čase. Použité vzorce: výpočet aritmetického u: výpočet směrodatné odchylky: výpočet ima a ima: Min () = x ± 1,96 s 28
5.1. Pracovní postup 1) Odběr vzorků krve zdravých dárců a pacientů s antikoagulační léčbou 2) Vzorky jsem označila pořadovým číslem a indexem: a vzorky skladované při laboratorní teplotě; b vzorky skladované při 4 C 3) Ihned po odběru jsem vzorky centrifugovala (5./5600 ot.; centrifuga StatSpin Express 3, MEDISTA) 4) Naředila jsem příslušné reagencie a kontrolní materiál dle informací výrobce (viz. Kapitola 4.3.) 5) Na přístroji Sysmex CA-1 500 jsem změřila PT a aptt u kontrolního materiálu a všech testovaných vzorků vždy přesně v čase 2, 4, 8 a 24 hodin po odběru vzorku. 6) Naměřené hodnoty jsem vynesla do tabulky (viz. Příloha) 7) Výsledky jsem statisticky vyhodnotila výpočtem rozdílů všech naměřených hodnot v čase 2, 4, 8 a 24 hodin po odběru od příslušných hodnot v čase 0 (ihned po odběru), výpočtem ů vypočtených rozdílů pro každý měřený časový interval, výpočtem směrodatné odchylky pro každý měřený časový interval, výpočtem ima a ima pro Bland-Altmanův graf. 8) Z vypočtených hodnot jsem sestavila 32 dílčích Bland-Altmanových grafů znázorňujících rozptyl vypočtených odchylek naměřených hodnot vždy pro daný čas, teplotu skladování vzorku před analýzou a pro danou skupinu vyšetřovaných osob. 9) Dále jsem vytvořila 8 souhrnných Bland-Altmanových grafů popisujících vývoj naměřených odchylek v čase od odběru vzorku vždy pro daný test, teplotu skladování vzorku před analýzou a pro danou skupinu vyšetřovaných osob. 10) Z hodnot odečtených z grafů jsem vyvodila závěr. 29
vypočítané odchylky 5.2. Grafické znázornění vypočítaných odchylek Při měření INR u zdravých dárců nevznikaly mezi prvním a následujícím měřením významné statistické rozdíly. Graf č.1 zobrazuje vývoj né odchylky naměřených hodnot v příslušných časech po odběru vzorku skladovaném při laboratorní teplotě. Průměrné odchylky se zde nacházejí v intervalu 0,02;0,01. Jak je také patrné z grafů č.1a, 1b a 1c (viz příloha: grafy vypočtených hodnot), rozdíly hodnot INR v daných časech a čase 0 se převážně nacházejí v intervalu - 0,04;0,01, což odpovídá odchylce (odchylka od u rozdílu hodnot v příslušném čase a čase 0 hodin od odběru) +/-0,02. Po 24 hodinách od odběru se však interval trojnásobně rozšíří a odchylky dosahují hodnot +/-0,09. Dochází k posunu hodnot INR k vyšším hodnotám. Znázorněním kontrolních čar ( +/- 1,96 s d ) lze i z grafu č.1 odečíst velký rozptyl rozdílů hodnot naměřených 24 hodin po odběru. 0,14 0,10 0,06 INR zdraví dárci (20 C) 0,02-0,02-0,06-0,10 0 4 8 12 16 20 24 čas od odběru vzorku v hodinách Graf č.1 INR-zdraví dárci; vývoj odchylky naměřených hodnot odečtených z Bland- Altmanových grafů v závislosti na čase od odběru vzorku skladovaném při 20 C 30
vypočítané odchylky Měření INR u vzorků zdravých dárců skladovaných při 4 C vykazovala podobné hodnoty jako měření vzorků při laboratorní teplotě (20 C). Z grafu č.2 lze vyčíst podobný vývoj né odchylky pro jednotlivé časy měření jako v grafu č.1, avšak intervaly vymezené kontrolními čarami ima a ima jsou širší než u grafu č.1. Tzn. že odchylky mezi měřeními jsou větší. Tento rozdíl je převážně způsoben odchylkami vznikajícími při měření INR po 8 hodinách po odběru vzorku. Což je znázorněné v grafu č.2c (viz příloha: grafy vypočtených hodnot), kde interval dosahuje hodnot -0,03;0,04, což je dvojnásobek intervalu grafu č.1c. Největší rozptyl hodnot pak v grafu č.2 vykazují vypočtené odchylky vzorků měřených 24 hodin po odběru vzorku skladovaném při 4 C. INR zdraví dárci (4 C) 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00-0,04-0,08-0,12-0,16 0 4 8 12 16 20 24 čas od odběru vzorku v hodinách Graf č.2 INR zdraví dárci; vývoj odchylky naměřených hodnot odečtených z Bland- Altmanových grafů v závislosti na čase od odběru vzorku skladovaném při 4 C 31
vypočítané odchylky Oproti tomu, při měření INR u pacientů s antikoagulační léčbou dochází již po dvou hodinách ke značnému rozptylu hodnot v intervalu od -0,2;0,01 (viz příloha: graf č.3a). V následujících měřeních se interval dále rozšiřuje až na hodnoty od -0,05 do 0,3. Po 24 hodinách od odběru vzorku dosahují měření odchylky +/-0,17 (viz příloha: graf č.3d). I zde je vidět nárůst hodnoty INR ve skupině vyšetřovaných vzorků 24 hodin po odběru. Taktéž na grafu č.3 je patrný velký rozptyl hodnot a to hlavně při měření v čase 4 a 24 hodin od odběru vzorků, čemuž odpovídají i intervaly vyznačené pomocí křivek ima a ima (ný rozdíl hodnot +/-1,96s d ) INR pacienti s léčbou (20 C) 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10-0,20-0,30-0,40 0 4 8 12 16 20 24 čas od odběru vzorku v hodinách Graf č.3 INR pacienti s antikoagulační léčbou; vývoj odchylky naměřených hodnot odečtených z Blan-Altmanových grafů v závislosti na čase od odběru vzorku skladovaném při 20 C 32
vypočítané odchylky Také hodnoty INR vzorků pacientů s antikoagulační léčbou skladovaných při 4 C vykazují podobné hodnoty jako vzorky skladované při 20 C. Výjimkou je graf č.4a (viz příloha: grafy vypočtených hodnot), kde rozdíly hodnot v čase 0 a 2 hodiny po odběru dosahují velkého rozptylu a to v intervalu -0,3; 0,3. Ačkoliv v grafu č.4 nenalézáme velké rozdíly mezi nými naměřenými hodnotami, interval -0,30;0,35 vyznačený pomocí kontrolních čar ima a ima vypovídá o velkém rozptylu hodnot právě v čase 2 hodiny po odběru vzorku. Při následném měření těchto vzorků v čase 4, 8 a 24 hodin po odběru nevznikal již tak značný rozptyl vypočtených rozdílů hodnot jako v čase 2 hodiny po odběru. Je to dáno hlavně tím, že v tomto čase byla u jednoho vzorku vypočtena extrémně velká odchylka (-0,79), jejíž přítomnost v hodnoceném souboru způsobuje značné rozšíření intervalu. Pokud by se tato hodnota ze souboru zpracovaných dat vynechala, zužil by se interval hodnot na -0,08;0,16. Jelikož není jisté, co způsobilo toto vychýlení, ponechala jsem ve vyhodnocení i tento bod. Avšak jak ukazují grafy 4b, 4c, 4d (viz příloha: grafy vypočtených hodnot) rozdíly hodnot v těchto časech i tak poukazují na rozptyl hodnot, který by už neměl být akceptován. INR pacienti s léčbou (4 C) 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10-0,20-0,30-0,40 0 4 8 12 16 20 24 čas od odběru vzorku v hodinách Graf č.4 INR pacienti s antikoagulační léčbou; vývoj odchylky naměřených hodnot odečtených z Bland-Altmanových grafů v závislosti na čase od odběru vzorku skladovaném při 4 C 33
vypočítané odchylky Graf č.5, znázorňující né odchylky (odchylky od u rozdílu hodnot v příslušném čase a čase 0) naměřených hodnot aptt-r u zdravých dárců, vykazuje značnou nou odchylku vypočtenou z hodnot rozdílů aptt-r naměřených po 24 hodinách od odběru vzorku. Také interval vyznačený pomocí kontrolních čar ima a ima poukazuje na velký rozptyl vypočtených rozdílů hodnot aptt-r zdravých dárců právě v čase 24 hodin po odběru vzorků skladovaných při 20 C. Dílčí měření ukazují, že rozdíly hodnot aptt-r měřených v čase 0 a 2 hodiny po odběru se u zdravých dárců nacházejí v rozmezí -0,04; 0,01 (viz příloha: graf č. 5a) s rostoucím časem se interval rozdílu hodnot rozšiřuje. Po 4 a 8 hodinách po odběru se odchylky měření zvýší až trojnásobně. Po 24 hodinách po odběru dosahuje interval hodnot od 0 do 0,15. Šíře těchto intervalů poukazuje na velké rozdíly naměřených hodnot od hodnot v čase 0 již po 4 hodinách po odběru. I zde dochází vlivem několika odlehlých hodnot k rozšíření intervalu, než by bylo pro ostatní odchylky nutné. Rozšíření intervalu není již tak značné jako u grafu č.4. 0,15 0,10 APTT-R zdraví dárci (20 C) 0,05 0,00-0,05-0,10 0 4 8 12 16 20 24 čas od odběru vzorku v hodinách Graf č.5 aptt-r zdraví dárci; vývoj odchylky naměřených hodnot odečtených z Bland- Altmanových grafů v závislosti na čase od odběru vzorku skladovaném při 20 C 34
vypočítané odchylky Podobně je zatížen i graf č.6, který znázorňuje změnu ných odchylek na měřených hodnot aptt-r vzorků zdravých dárců skladovaných při 4 C v čase 2, 4, 8 a 24 hodin po odběru vzorku. Zatímco po 2 hodinách po odběru vzorku je ná odchylka naměřených hodnot aptt-r -0,02, po 24 hodinách od odběru vzorku je to již 0,08. To poukazuje na fakt, že s rostoucím časem se aptt-r zvyšuje. Z dílčích grafů (6a, 6b, 6c, 6d) vyplývá, že u aptt-r vzorků zdravých dárců skladovaných při 4 C vzniká značná odchylka od u rozdílu hodnot v čase (+/- 0,05) již po 2 hodinách po odběru (viz příloha: graf č.6a). Po 24 hodinách od odběru vzorku dostáváme interval rozdílů hodnot aptt-r -0,18;0,19, což odpovídá odchylce +/- 0,19. Takto široký interval poukazuje na velký rozptyl hodnot vypočtených rozdílů a proto lze říci, že aptt-r měřené v tomto čase ve vzorku skladovaném při 4 C bude zatíženo velkou chybou. 0,20 0,15 0,10 APTT-R zdraví dárci (4 C) 0,05 0,00-0,05-0,10 0 4 8 12 16 20 24 čas od odběru vzorku v hodinách Graf č.6 aptt-r zdraví dárci, vývoj odchylky naměřených hodnot odečtených z Bland- Altmanových grafů v závislosti na čase od odběru vzorku skladovaném při 4 C 35
vypočítané odchylky Graf č.7 zobrazuje vývoj v čase ných odchylek naměřených hodnot aptt-r vzorků pacientů s antikoagulační léčbou, kdy v čase 2 hodiny po odběru vzorku dosahuje odchylka od u rozdílů hodnot v čase -0,05. S rostoucím časem se tato odchylka zvyšuje, a v čase 24 hodin po odběru dosahuje hodnot 0,15. V tomto čase je opět z grafu č.7 pomocí kontrolních čar patrný velký rozptyl hodnot. APTT-R u pacientů s antikoagulační léčbou dosahuje už po 4 hodinách po odběru značných rozdílů (viz příloha: graf č.7b). Rozdíly hodnot v čase 0 a po 4 hodinách se pohybují v intervalu -0,13; 0,05, což poukazuje na odchylku od u rozdílů hodnot v čase +/-0,07. S rostoucím časem se odchylka zvyšuje, až dosahuje po 24 hodinách od odběru hodnot +/-0,15 (viz příloha: graf č.7d). I tomto případě lze z dílčích grafů (7b, 7c, 7d) odečíst odlehlé hodnoty. Tyto body nejsou však tvořeny jen jednou hodnotou vypočtených rozdílů hodnot aptt-r v daném čase a čase 0 po odběru vzorku, nýbrž několika rozdíly stejné hodnoty. Proto považuji vzniklý interval rozdílů hodnot za správný. APTT-R pacienti s léčbou (20 C) 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00-0,05-0,10-0,15 0 4 8 12 16 20 24 čas od odběru vzorku v hodinách Graf č. 7 aptt-r pacienti s antikoagulační léčbou; vývoj odchylky naměřených hodnot odečtených z Bland-Altmanových grafů v závislosti na čase od odběru vzorku skladovaném při 20 C 36
vypočítané hodnoty Graf č.8 znázorňuje změnu ných odchylek naměřených hodnot aptt-r vzorků pacientů s antikoagulační léčbou skladovaných při 4 C v čase 2, 4, 8 a 24 hodin po odběru vzorku. Na rozdíl od dílčích grafů (viz příloha: graf č 8a, 8b, 8c, 8d), zde znázorněné né odchylky nevykazují značných rozdílů, vyjma né odchylky vypočtené z naměřených hodnot v čase 24 hodin po odběru vzorku. Avšak intervaly vymezené kontrolními čarami znázorňujícími imum a imum vypočtených odchylek poukazují na velký rozptyl naměřených hodnot v čase 2, 4, 8 a 24 hodin od odběru vzorku, kdy největšího rozptylu hodnot dosahujeme v čase 8 hodin po odběru vzorku. Při měření aptt-r u vzorků pacientů s antikoagulační léčbou skladovaných při 4 C vznikaly značné odchylky (+/-0,15) už po 2 hodinách po odběru. Z grafu č. 8c lze vyčíst nejširší interval rozdílů naměřených hodnot aptt-r (-0,24;0,28). I zde v dílčích grafech 8a, 8c, 8d nalézáme odlehlé hodnoty, které značně ovlivňují šíři intervalů vypočtených rozdílů hodnot. Zajímavé je, počet odlehlých hodnot se zvyšuje s rostoucím časem. Pokud bych tyto odlehlé hodnoty při hodnocení vynechala, získala bych užší intervaly vypočtených rozdílů hodnot a to pro čas 2 hodiny od odběru vzorku -0,05;0,17 (nyní -0,09;0,20), pro čas 8 hodin od odběru vzorku -0,05;0,15 (nyní - 0,23;0,28) a pro čas 24 hodin od odběru vzorku 0,08;0,25 (nyní 0,01;0,34). 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10-0,20-0,30 APTT-R pacienti s léčbou (4 C) 0 4 8 12 16 20 24 čas od odběru vzorku v hodinách Graf č.8 aptt-r pacienti s antikoagulační léčbou; vývoj odchylky naměřených hodnot odečtených z Bland-Altmanových grafů v závislosti na čase od odběru skladovaném při 4 C 37
6. Diskuse Studie zabývající se stabilitou koagulačního systému in vitro se převážně zaměřují na stabilitu jednotlivých koagulačních komponent, či celých systémů v době od odběru vzorku k jeho prvotnímu zpracování. Jak z výsledků jednotlivých studií vyplývá, právě v tomto období dochází ke změnám stability koagulačních složek v závislosti na čase uplynulém od odběru vzorku a způsobu skladování vzorků před vlastní analýzou. Stejně jako Adcock a kol. či Neofotistos a kol. jsem se i já ve své studii zaměřila na stabilitu koagulačního systému ve vzorcích již prvotně zpracovaných, kdy jsou z vyšetřované plazmy odstraněny krevní elementy, tudíž nedochází k tak značným interferencím způsobeným právě krevními elementy. Zatímco Adcock a kol. na základě své studie poukazují na stabilitu vzorků použitých pro vyšetření protrombinového testu až 24 hodin po odběru a u vyšetření aktivovaného parciálního tromboplastinového testu až 8 hodin po odběru a centrifugaci vzorku (u pacientů léčených heparinovými preparáty se stabilita vzorku zkracuje na 4 hodiny), Neofotistos a kol. považuje vzorek za stabilní pouze po 8 hodin od odběru a zpracování vzorku, nehledě na to, zda jde o vyšetření protrombinového testu nebo aktivovaného parciálního tromboplastinového testu. Ze studie, kterou jsem provedla v loňském roce na našem pracovišti si dovoluji vyvodit mnohem přísnější závěr než je uveden v předchozích dvou případech. Výsledky obou testů koagulačního systému u zdravých dárců vykazovaly celkem dobrou stabilitu, avšak u pacientů s antikoagulační léčbou docházelo při měření k značným odchylkám již po 2 či 4 hodinách po odběru vzorku. Proto považuji za stabilní vzorek uchovávaný ve vhodném prostředí (20 C) imálně dvě hodiny od odběru a centrifugace vzorku. 38
7. Závěr Při použití hemokoagulačních testů je třeba zpracovat vzorek v předepsaném časovém horizontu. Všechny vzorky byly zpracovány (centrifugovány) do dvou hodin po odběru, čímž se doba, po kterou zůstávají jednotlivé komponenty koagulačního systému stabilní, prodlužuje. Z výsledků měření je patrné, že hodnoty INR u zdravých dárců jsou poměrně stálé i po 8 hodinách po odběru. U pacientů s antikoagulační léčbou se protrombinový test zkracuje již po 2 hodinách od odběru, INR se snižuje, rozptyl intervalů roste. Protože před vlastní analýzou není možné určit, zda je pacient léčen či nikoliv (není-li uvedeno na žádance), považuji, na základě provedeného testu, za vhodné po uplynutí 2 hodin od prvotního zpracování (centrifugace) zažádat o nový vzorek. APTT-R je jak u zdravých dárců, tak i u pacientů s antikoagulační léčbou stálý po 2 hodinách po odběru. V dalších časových úsecích se aptt prodlužuje. I zde bych volila stejný postup jako u stanovení INR a po uplynutí delšího časového intervalu než 2 hodiny od prvotního zpracování bych zažádala o nový vzorek. Skladování vzorků při 4 C nemá žádný význam. Získané hodnoty INR i aptt-r u obou skupin vyšetřovaných osob jsou většinou srovnatelné (u aptt-r vykazují větší odchylku) s naměřenými hodnotami při 20 C. Pro prodloužení stability bych tedy tento postup nepoužila. Protože protrombinový test a aktivovaný parciální tromboplastinový test patří mezi nejčastěji využívané hemokoagulační testy, je důležité dbát na jejich pečlivé provedení, správnou interpretaci výsledků a zejména na přesné dodržení daných postupů preanalytické fáze. 39
8. Seznam použitých zdrojů 1) HRDINOVÁ, M. - LALOVÁ, M. - PFLÉGROVÁ, V., Vyšetření v hemokoagulační laboratoři jaký vzorek lze ještě zpracovat? Oddělení klinické hematologie KN Liberec, 1.11.2007 2) BARTEK, P. a kol. Aká je stabilita vzorek pre in vitro stanovenie niektorých koagulačných parametrov?. Transfuze a hematologie dnes., 2008, č.14 3) ZÜRCHER, M. SULZER,I. BARIZZI, G. LÄMLE, B. ALBERIO, L. Stability of koagulation assai performed in plasma from citrated whole blood transported et ambient temperature. Thromb Haemost., červen 2008, č. 99 (6), s.1122-1123 Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18278194 (25.4.2010) 4) NEOFOTISTOS, D. OROPEZA, M. TS AO, Ch. Stability of plazm proud-on PT a APTT testy., Am. J. Clin. Pathol. 1998; 109 (6): 758 763). Chicago, USA, Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9620036 (9.4.2010) 5) ADCOCK, D. KRESSIN, D. MARLAR, R. A., The effect of time and temperature variables on routine coagulation tests., Am. J. Clin. Pathol. 1998; 109 (5): 595 599). Denver, USA Dostupné z: http://journals./www.com/bloodcoagulation/abstract/1998/0900 (25.4.2010) 6) BD Diagnostic. Variabilita preanalytické fáze. 2008 Dostupné z: http://www.schubert24.cz/files/bd/bd/_02.pdf (13.2.2010) 7) ZIMA, T. Mezioborové přehledy. Zásady přípravy pacienta k odběru krve a preanalytická část laboratorního vyšetření. 2008; 5(9): 335-338 Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN Praha 40
8) IMALAB s.r.o., Labortorní příručka, Laboratoř imunodiagnostiky, biochemie, molekulární biologie a cytogenetiky, Zlín Dostupné z: http://www.imalab.cz/kategorie/odběr-vzorku.aspx (14.2.2010) 9) IDL s.r.o., Preanalytická fáze, 2008, Praha Dostupné z: http://www.idl.cz/cs/preanalyticka-faze.html (14.2.2010) 10) GÁLIKOVÁ. Laboratorní příručka HTO, Nemocnice Jihlava, příspěvková organizace, 2008. Poslední aktualizace 31. 12. 2008. Dostupné z: http://www.nemji.cz./vismoonline_actionscripts/file.aspx?id_org=427000 id_doku menty=2236 (8.5.2009) 11) BOŘIL, P. FENCLOVÁ, E. JABOR, A. PAVLISOVÁ, M. SEDLÁKOVÁ, J. SKROVNÁ, A. SOUKENÍKOVÁ, A. Laboratorní příručka. Oblastní nemocnice Kladno, a.s., Oddělení klinické biochemie a hematologie, 2006. (8.5.2009) 12) FEITOVÁ, S. Laboratorní příručka pro odběr primárního vzorku, Biochemickohematologická laboratoř Laboma Písek, Verze 01. Poslední aktualizace 26.9.2009. Dostupné z: http://laboma.cz/prirucka_opm.doc (14.4.2009) 13) Laboratorní příručka HTO, NsP Česká Lípa a.s. Hematologicko-transfuzní oddělení. 2008. Dostupné z: http://www.nemcl.cz/files/laboratorni-prirucka.pdf 14) HRACHOVINOVÁ, I. MATÝŠKOVÁ, M. ZAVŘELOVÁ, J., Hematologie pro zdravotní laboranty. 1.vyd. Brno: Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 1999. ISBN 80-7013-278-7 41
15) Laboratoře AescuLab a.s., Laboratorní příručka, 2009 Dostupné z: http://www.aesculab.cz/preanalyticka-faze.php (14.2.2009) 16) FÁTOROVÁ, I., Zásady odběru biologického materiálu v hematologické laboratoři., Výukový materiál Univerzity Karlovy předmětu Praktická hematologie studia na FaF 17) PECKA, M., Laboratorní hematologie v přehledu. Fyziologie a patofyziologie hemostázy. Český Těšín, 2004. ISBN 80-86682-03-X 18) Ministerstvo zdravotnictví, Národní číselník laboratorních položek MZČR NČPL 02.28.01 Dostupné z: http://www.ciselniky.dasta.mzcr.cz/cd_d53/hypertext/_komp_pt.htm (14.4.2010) 19) HRABCOVÁ, R., Laboratorní monitorování antikoagulační léčby., Laboratoř hematologie, Onkologické centrum J. G. Mendela, Nový Jičín, Noviny č. IX, str. 3, 2008 20) Ministerstvo zdravotnictví, Národní číselník laboratorních položek MZČR NČPL 02.28.01 Dostupné z: http://www.ciselniky.dasta.mzcr.cz/cd_d53/hypertext/_komp_aptt.htm (14.4.2010) 21) Dade Behring, uživatelský manuál Sysmex CA-1500 System, 2004 22) HENDL, J., Přehled statistických metod zpracování dat. Praha: Portál, 2004. 42