ELEKTROCHEMICKÉ STANOVENÍ cis-pt V KOMPLEXECH S DNA Dana Dospivova 1, Kristyna Smerkova 1, Soňa Křížková 1,2, Marketa Ryvolova 1,2, David Hynek 1,2, Vojtech Adam 1,2, Pavel Kopel 1,2, Marie Stiborova 3, Tomas Eckschalager 4, Jaromir Hubalek 1,2, Rene Kizek* 1,2 1 Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, CZ-613 00 Brno, Česká republika, 2 Středoevropský technologický institut, VUT v Brně, Technická 3058/10, CZ-616 00 Brno, Česká republika, Evropská unie, 3 Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, CZ-128 40 Praha 2, Česká republika, Evropská unie, 4 Klinika dětské hematologie a onkologie, 2. LF UK, V Úvalu 84, CZ-150 06 Praha 5, Česká republika, Evropská unie *Korespondenčníautor: kizek@sci.muni.cz Klíčováslova:cis-platina; square wave voltametrie; diferenčnípulsnívoltametrie; DNA; ÚVOD Onkologická onemocnění jsou jednou z nejčastějších příčin úmrtí v rozvinutých zemích. (Fuertes, et al.) Jednou z možností léčby zhoubných nádorů je chemoterapie (van Zutphen, et al.). Efekt použitých léčiv spočívá především v omezení růstu tkání s vysokou proliferační schopností. Účinky nejsou pouze inhibiční, ale také cytocidní, kdy působení cytostatik může indukovat apoptózu nebo jiné druhy buněčné smrti. Účinek cytostatik není omezen jen na nádorové buňky, ale působí i na zdravou tkáň, zvláště postihuje buňky s vysokou frekvencí dělení a vznikají tak nežádoucí vedlejší účinky. Cytostatika na bázi platiny jsou dnes jedny z nejčastěji používaných protinádorových léčiv. Nejběžnějšími léčivy této skupiny jsou cisplatina, karboplatina a oxaliplatina. Cisplatina je velmi účinná u celé řady lidských maligních onemocnění. Využívá se především v léčbě nádorů varlat, vaječníků a močového měchýře (Kaneko, et al.). Cílovým místem protinádorového působení cisplatiny v buňce je molekula DNA. Platinové léčivo se do buňky dostává pasivním nebo aktivním buněčným transportem, následuje akumulace léčiva v buňce. V intracelulárním prostředí dochází k aktivaci platinového komplexu (hydrolýzou)a k vazbě na nukleové kyseliny za vzniku Pt- DNA aduktů. Kovalentní vazba cisplatiny způsobuje poškození ovlivňující funkci buňky. (Monjardet-Bas, et al.) Tyto změny jsou identifikovány řadou proteinů (Jamieson, et al.), které se váží k DNA modifikované cisplatinou, a tím zprostředkovávají protinádorový efekt léčiva.
Cílem této práce bylo studium in vitro interakce cisplatiny s DNA pomocí elektrochemické instrumentace a následná optimalizace a automatizace těchto elektrochemických metod. Square-wave volatmetrie a diferenční pulsní voltametrie byly zvoleny jako nejvhodnější elektrochemické techniky. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Materiál a metody V prvním kroku experimentu byly připraveny vzorky cisplatiny s DNA. Do 1.5 ml mikrozkumavky (Eppendorf, Německo) byla napipetována směs dsdna (100 µg/ml) a cisplatiny (100µg/ml) ve fosfátovém pufru o ph 7,5. Mikrozkumavka byla umístěna do termostatu, kde probíhala inkubace 24 hod. při teplotě 37 C. Po této době byla provedena dialýza komplexu DNA+cis-Pt oproti Tris-HCl o ph 7,5, s cílem odstranit nenavázanou cisplatinu, která nevytvořila s DNA adukt. K dialýze byl použit membránový filtr (Filter type 0.025µm, VSWP, Irsko). Dialýza probíhala za stálého mírného míchání na magnetické míchačce (Maneko, ČR) při teplotě 6 C a po dobu 24 hod. Po ukončení dialýzy byl vzorek odebrán a byla stanovena výsledná koncentrace DNA. Ke stanovení DNA byla využita metoda square-wave voltametrie (SWV) ve spojení s adsorpční přenosovou technikou. Tato metoda je založena na akumulaci vzorku na povrchu pracovní elektrody a následném měření. Doba akumulace byla pro naše stanovení 120 s, všechny experimenty byly prováděny při teplotě 25 C. SWV měření probíhalo za přítomnosti acetátového pufru o ph 5,0. Všechna naměřená data byla vyhodnocena v programu GPES (EcoChemie). Koncentrace cisplatiny byla stanovena pomocí metody diferenční pulsní voltametrie (DPV). K měření byla využita následující instrumentace: AUTOLAB PGS30 (EcoChemie, Nizozemí) vespojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko) s klasickým tříelektrodovým zapojením. Visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) byla použita jako pracovní, Ag/AgCl/3M KCl elektroda sloužila jako referenční a Pt elektroda jako pomocná. Měření probíhalo v objemu 2 ml, byl použit elektrolyt o složení 0,36 mol/l H 2 SO 4, obsahující 0,24 ml hydrazinu (10 mmol/l), 0,01 ml formaldehydu (37% vodný roztok). Z analyzovaných vzorků byl vždy před měřením odstraněn kyslík probubláváním argonem (99,999%) po dobu 120 s. Zvolené rozmezí potenciálu bylo od -0,5 V do -1,2 V s rychlostí skenu 10 mv/s, charakteristický signál platiny byl zaznamenán při -0,85 V. Další parametry metody byly: modulační čas 0,057 s, časový interval 0,1 s, potenciálový krok 1,95 mv s rychlostí skenu 10,5 mv/s a modulační amplitudou 49,5 mv. Po odstranění kyslíku následovala akumulacena HMDE po dobu 15 s. (-0,7 V vs. Ag/AgCl, zastálého míchání). Koncentrace platiny byla stanovena ze tří standardních přídavků. Navržený metodický postup byl optimalizován a podařilo se nám plně
automatizovat metodu pro detekci iontů platiny i cisplatiny. Pro plně automatickou detekci byl využíván elektrochemický analyzátor Metrohm 797 VA Computrace ve spojení s 813 Compact Autosampler. Pro přidávání standardních roztoků a činidel, byly využívány dva automaty (765Dosimat) a peristaltické pumpy (772Pump Unit, ovládané RelayBox731). VÝSLEDKY A DISKUSE Katalytické vylučování vodíku je v elektrochemii jedním z nejsenzitivnějších elektroanalytických způsobů detekce biomolekul (Arjmand, et al., Kizek, et al., Palecek, et al., Palecek, et al.). V naší práci jsme se na počátku experimentu zaměřili na provedení elektrochemické detekce iontů platiny ve stacionárním uspořádání na základě literárně dostupných dat (Zimmermann, et al., Zimmermann, et al.). Nejvhodnější doba prekoncetrace iontů platiny na HMDE byla15 s. Při použití těchto parametrů jsme získali dobré katalytické signály a nedocházelo k poklesu citlivosti metody. Lineární závislost koncentrace Pt na katalytickém signálu byla stanovena až do 25 ng/ml (y = 1,6808x+1,2224, R 2 = 0,9909). Kalibrační křivka platiny je na obrázku 1, část A a příslušné katalytické signály, které platina vykazuje při potenciálu -0,9V je možné pozorovat na voltamogramech viz obrázek 1, část C. Limit detekce byl stanoven na 16 pm. Při detekci cisplatiny bylo chování katalytického signalu podobné jako u iontů platiny. Souměrnost píku byla jen nepatrně odlišná. Maximum píku se v závislosti na koncentraci posouvalo od -0.8 do -0.95 V. Pozorované změny souvisely s tvorbou složitějších aqua komplexů cisplatiny. Linearita byla pozorována do koncentrace 3 mg/ml. Limit detekce byl určen na 32 nm. Optimalizovanou metodiku pro automatizovanou detekci bylo možné aplikovat pro analýzu obsahu vázané platiny do struktury DNA. DNA izolovaná z ptačích erytrocytů byla modifikována cisplatinou po dobu 24 a 72 hodin. Vliv délky inkubace na koncentraci cis-pt je znázorněn na obrázku 1, část B. Pro obě inkubace byla zvolena následná dialýza 24 hodin. Molekuly cisplatiny, které se nenavázaly, byly odstraněny pomocí dialýzy (24 hod, 6 C). Při následné detekci byl zjištěn nejvýraznější nárůst signálu při použití nízkých množství platiny (do 200 ng/ml). Zjistili jsme, že cisplatina v DNA ovlivňuje tvar i průběh voltamogramů. V katodické oblasti docházelo k dřívějšímu uvolnění vodíku ze základního elektrolytu. K těmto změnám docházelo již mezi potenciály -1,1až -1,3V. Tyto změny měly vliv i na redoxní signály adeninu a cytosinu. ZÁVĚR
Metodiku, kterou jsme optimalizovali pro automatizovanou detekci bylo možné aplikovat pro analýzu obsahu vázané platiny do struktury DNA. Technika adsorptivního přenosu umožnila selektivní studium interakce DNA na povrchu pracovní elektrody a odstranění nespecificky vázaných molekul, včetně malých molekul, jak z povrchu elektrody, tak z biomolekuly. Díky tomuto principu lze využít navržené metody pro sledování interakce cis-pt s DNA. Automatizace a optimalizace použitých elektrochemických metod nám dovoluje zrychlit a zjednodušit studium interakce Pt komplexů s DNA. Díky naší technice je možné studovat mechanismus působení a určit výslednou protinádorovou účinost sledovaného léčiva. Poděkování Práce byla finančně podpořena projekty CYTORES GAČR P301/10/0356, NANIMEL GAČR 102/08/1546, Liga proti rakovině Praha 2011 a CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068. Popisky k obrázkům Obr. 1 A - Kalibrační křivka platiny (PtCl 2 rozpuštěno v roztoku KOH) naměřená pomocí diferenční pulzní voltametrie. B - Vliv doby modifikace DNA cis-pt na koncentraci cis- Pt v komplexu. C naměřené voltamogramy Pt, z nichž byla vytvořena kalibrační závislost (viz A). LITERATURA 1. Fuertes, M. A., et al., (2003): Biochemical modulation of cisplatin mechanisms of action: Enhancement of antitumor activity and circumvention of drug resistance, Chemical Reviews, 103: 645-662. 2. van Zutphen, S., et al., (2005): Targeting platinum anti-tumour drugs: Overview of strategies employed to reduce systemic toxicity, Coordination Chemistry Reviews, 249: 2845-2853. 3. Kaneko, G., et al., (2011): Neoadjuvant Gemcitabine Plus Cisplatin for Muscle-invasive Bladder Cancer, Japanese Journal of Clinical Oncology, 41: 908-914. 4. Monjardet-Bas, W., et al., (2002): Fast interstrand cross-linking of Cisplatin-DNA monoadducts compared with intrastrand chelation: A kinetic study using hairpin-stabilized duplex oligonucleotides, Chemistry-a European Journal, 8: 1144-1150. 5. Jamieson, E. R., et al., (1999): Structure, recognition, and processing of cisplatin-dna adducts, Chemical Reviews, 99: 2467-2498. 6. Arjmand, F., et al., (2011): Cyclic Voltammetry-An Electrochemical Approach to Study Metal-based Potential Antitumor Drug-DNA Interaction, Current Analytical Chemistry, 7: 71-79. 7. Kizek, R., et al., (2002): Determination of nanogram quantities of osmium-labeled single stranded DNA by differential pulse stripping voltammetry, Bioelectrochemistry, 55: 119-121.
8. Palecek, E., et al., (2002): DNA hybridization at microbeads with cathodic stripping voltammetric detection, Talanta, 56: 919-930. 9. Palecek, E., et al., (2002): Electrochemical enzyme-linked immunoassay in a DNA hybridization sensor, Analytica Chimica Acta, 469: 73-83. 10. Zimmermann, S., et al., (2001): Trace analysis of platinum in biological samples: a comparison between sector field ICP-MS and adsorptive cathodic stripping voltammetry following different digestion procedures, Analytica Chimica Acta, 439: 203-209. 11. Zimmermann, S., et al., (2003): Determination of Pt, Pd and Rh in biological samples by electrothermal atomic absorption spectrometry as compared with adsorptive cathodic stripping voltammetry and total-reflection X-ray fluorescence analysis, Analytica Chimica Acta, 498: 93-104.