Před spuštěním eseje si prosím pečlivě přečtěte návod k použití

8 C 2 C Před spuštěním eseje si prosím pečlivě přečtěte návod k použití REAST specifické IgE Jamky mikrotitrační destičky naplněné alergeny pro metodu REAST Reverzní enzymová imunoesej ke kvantitativnímu určení specifických IgE v lidském séru nebo plazmě s biotinylovanými alergeny POZADÍ Během posledních desetiletí se četnost alergií na světě podstatně zvýšila. Výraz alergie se často používá v souvislosti s hypersenzitivními reakcemi typu I (reakcemi okamžitého typu), jejichž symptomy se obvykle projeví během 30-60 minut po kontaktu s alergenem. Nejčastější symptomy jsou: senná rýma (rinitida), zánět spojivek, kopřivka (urtikárie), alergické astma, a ten nejnebezpečnější projev anafylaxe (anafylaktický šok). Alergeny způsobující hypersenzitivní reakce Typu I jsou většinou bílkoviny pocházející z přirozeného prostředí, např. rostlinný pyl, zvířecí chlupy, jídlo, roztoči a hmyzí jedy. Příznačné pro alergie typu I je účast imunoglobulinů (protilátek) třídy E (sige) specifických pro alergeny. Proto je detekce sige důležitým nástrojem moderní diagnózy alergických onemocnění. ÚČEL Účelem REAST specifických IgE je kvantitativní stanovení sige v lidském séru či plazmě. Výsledky přispívají k diagnóze alergií typu I. PRINCIP 0520960.FL 0524800.FL 96 Stanovení 480 Stanovení REAST specifických IgE ke kvantitativnímu měření IgE je založen na Sandwich ELISA. Během prvního kroku inkubace je anti-human IgE navázaným v mikrojamkách zachyceno veškeré IgE z pacientova vzorku. Mycí procedurou jsou odstraněny přebytečné složky séra z jamky, zatímco IgE zůstává navázáno na pevný povrch fáze. Během dalšího inkubačního kroku je do mikrojamek přidán a inkubován biotinylovaný alergen. Po dalším mycím kroku se konjugátem streptavidin/peroxidáza (HRP) vytvářejícím komplexy sestávající z konjugátu specifické IgE/ biotinylovaný alergen/hrp provede detekce navázaného alergenu. Jamky se poté znovu promyjí a přidá se roztok substrátu 3,3',5,5'-tetrametylbenzidinu (TMB). Následně se inkubuje, až roztok v jamkách zmodrá. Po zastavení enzymatické reakce kyselinou se barva změní na žlutou. Optická hustota (OD) produktu se spektrofotometricky změří při 450 nm (referenční vlnová délka je 620 nm). Koncentrace sige v pacientově vzorku je úměrný optické denzitě. SLOŽKY SOUPRAVY Souprava enzymů Mikrotitrační stripy, potažené anti-ige Streptavidin HRP konjugát Koncentrát mycího pufru (25 x) TMB Substrát Ukončovací roztok (9.5% H 3PO 4) 0520960.FL 0524800.FL 1 Destička 5 Destiček 1 x 50 ml 1 x 110 ml POTŘEBNÉ LÁTKY, KTERÉ NEJSOU ZAHRNUTY V TÉTO SOUPRAVĚ 1. Referenční jednotka Anti-IgE biotinový konjugát Kalibrátory (0.35, 0.7, 3.5, 17.5, 50, 100 MJ/ml) 2. Biotinylované alergeny 3. Kontroly Pozitivní kontrola Negativní kontrola 07050FL 1 x 10 ml (1-6) 6 x 1.5 ml Kód alergenu + FL 07005/ 07006 1 x 1 ml 1 x 1 ml Kalibrátory s definovanými koncentracemi IgE (kalibrované na standard WHO 75/502) jsou testovány současně s pacientskými vzorky za účelem vytvoření kalibrační křivky. Neznámé IgE koncentrace testovaných vzorků jsou z této křivky vypočítány. Datum vydání: 2016-11 REV1

OSTATNÍ 10-100 µl a 200-1000 µl pipety, Multipette, pipetovací špičky, lahvičky na ředění vzorku, odměrný válec se stupnicí, reader mikrodestiček, krycí fólie, myčku mikrodestiček (volitelné), laboratorní stopky, destilovaná voda. ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ V tomto testu může být použito buď sérum nebo plazma. K zachování integrity vzorku není nutné použít žádná aditiva ani konzervační prostředky. Při teplotě 2-8 C jsou vzorky stabilní po dobu jednoho týdne. Pro dlouhodobé uchovávání musejí být vzorky zmraženy. Je třeba se vyhnout opakovanému zmrazování a rozmrazování. Zmražené vzorky by měly být rozmraženy při pokojové teplotě (PT, 20-25 C) a před esejí důkladně smíchány mírnou inverzí. Použití hemolyzovaných nebo lipemických vzorků se nedoporučuje. 7. Opakujte mycí proceduru popsanou v kroku 5. 8. Napipetujte 100 µl konjugátu streptavidinu HRP do každé jamky, mikrodestičku přikryjte a při RT inkubujte 30 minut. 9. Opakujte mycí proceduru popsanou v kroku 5. 10. Přidejte 100 µl substrátu TMB do každé jamky, destičku přikryjte a při RT inkubujte ve tmě 30 minut. 11. Napipetujte 100 µl stop roztoku do každé jamky ve stejném pořadí jako substrát. Doporučujeme smíchat roztok v jamkách opatrným poklepáním na rámeček. Po 5 minutách při 450 nm (referenční vlnová délka je 620 nm) si pomocí vhodného readru mikrodestiček přečtěte hodnoty OD a vypočítejte koncentrace kontrol a vzorků dle popisu na straně 3. TESTOVACÍ SCHÉMA REAST SPECIFICKÝCH IgE Ruční zpracování PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Před použitím nechte všechny reagencie ohřát na pokojovou teplotu. Nepotřebné mikrotitrační stripy musí být znovu pečlivě uzavřeny v dodaném hliníkovém sáčku, který obsahuje vysoušecí prostředek. Roztok substrátu: Stop roztok: Kalibrátory a kontroly: připraveny k použití Enzymový konjugát: Anti-IgE Biotin Koncentrovaný mycí pufr: Koncentrovaný mycí pufr musí být zředěn v destilované vodě v poměru 1:25 (Příklad: 2 stripy budou vyžadovat 50 ml mycího pufru. Tudíž 2 ml koncentrovaného mycího pufru musí být zředěny destilovanou vodou na konečný objem 50 ml). Výsledný mycí pufr je při pokojové teplotě použitelný po dobu jednoho týdne. POSTUP ESEJE 1. Vytvořte pipetovací plán. Důrazně doporučujeme otestovat jak kalibrátory a kontroly, tak pacientské vzorky dvakrát. 2. Umístěte požadované potažené jamky do rámu a znovu pečlivě uzavřete hliníkový sáček se zbývajícími stripy a vysoušecím prostředkem. 3. Napipetujte 50 µl nezředěných kalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků do příslušných jamek. 4. Překryjte destičku a inkubujte po dobu 60 minut při pokojové teplotě (20-25 C). 5. Každou destičku promyjte třikrát ručně nebo ve vhodné myčce ELISA destiček za použití 500 µl promývacího pufru na každou jamku. Zbytkovou tekutinu odstraňte zabalením do papírového filtru. 6. Přidejte 100 µl roztoku příslušného alergenu (pro pacienty a kontroly) a konjugátu IgE biotinu (pro standardy) v souladu s pipetovacím schématem, destičku přikryjte a při RT inkubujte 60 minut. 50 µl Kalibrátory / Kontroly / Vzorky (nezředěné) 100 µl Biotinylovaný alergen / Anti-IgE Biotin 100 µl Streptavidin HRP 100 µl TMB Substrát 100 µl Stop roztok Měření při 450 nm proti 620 nm po 5 min Datum vydání: 2016-11 REV1 Strana 2 ze 5 Specific IgE REAST_REV1_22.11.16 60 min při RT 60 min při RT 30 min při RT 30 min při RT ve tmě Pro plně automatizované zpracování je třeba použít nastavení specifické pro určité zařízení. DYNEX LABORATORIES, s.r.o. Praha, Nové Město, Vodičkova791/41, 110 00 Provozovna: Lidická 977, Buštěhrad, 273 43 Tel. +420 220 303 600 mail: office@dynex.cz web: www.dynex.cz fax: 224 320 133

VÝPOČET VÝSLEDKŮ Průměrná hodnoty optické hustoty (OD) [ 450 nm - 620 nm] se vypočítají z kalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků. Z průměrných hodnot OD šesti kalibrátorů vytvořte graf na polologaritmickém papíře (Úsečka: log MJ IgE/Ml; Ordináta: lineární optická hustota 450 nm - 620 nm). Koncentraci sige v pacientském vzorku lze určit na základě standardní křivky. Průměrná optická hustota je zobrazena na Ordinátě a výsledek v MJ/ml lze zjistit na Úsečce. Kalibrační křivka a kontroly by měly být v přijatelném rozmezí dle Certifikátů kontroly kvality dodaných se soupravou. V opačném případě by podmínky testu měly být ověřeny a test by měl pravděpodobně být zopakován. PŘÍKLAD KALIBRAČNÍ KŘIVKY Koncentrace kalibrátoru (MJ/ml) OD 450 nm hodnota (n=22) Přijatelné rozmezí OD 450 nm 0.35 0.106 0.074-0.138 0.7 0.161 0.113-0.209 3.5 0.568 0.398-0.738 17.5 1.619 1.133-2.105 50.0 2.558 1.791-3.325 100.0 3.015 2.111-3.920 VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Použitím kalibrační křivky se koncentrace sige vzorků vypočítají buď v třídách REAST a/nebo v mezinárodních jednotkách na mililitr (MJ/ml) a vyhodnotí se následovně: Třída MJ/ml spec. koncentr. IgE 6 > 100 velmi silně pozitivní 5 50-100 velmi silně pozitivní 4 17.5-50 silně pozitivní 3 3.5-17.5 pozitivní 2 0.7 3.5 slabě pozitivní 1 0.35-0.7 hraniční 0 < 0.35 negativní. OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY Klinická důležitost pozitivního protokolu o zkoušce se mezi jednotlivými alergeny podstatně liší. Proto se doporučuje, aby před přiřazením klinické důležitosti výsledkům eseje byly předpokládané hodnoty pro dané populace každou laboratoří určovány po určitý časový úsek a statisticky významným počtem esejí. Hodnoty uvedeny níže lze použít jako vodítko pro vlastní výsledky. ROZSAH MĚŘENÍ Tato ELISA zjišťuje koncentrace sige mezi 0.35 MJ/ml and 100 MJ/ml. Vzorky s vyššími koncentracemi sige by pro zjištění přesného obsahu sige měly být zředěny a znovu otestovány. PŘESNOST Variabilita a Reprodukovatelnost 1. Variabilita v rámci eseje Vzorek hodnota CV (%) MJ/ml 1 (n=10) 8.6 2.0 2 (n=7) 94.6 6.6 2. Variabilita mezi esejemi Vzorek hodnota CV (%) MJ/ml 1 (n=20) 8.5 3.8 2 (n=16) 95.8 6.7 LINEARITA 5 náhodně zvolených pacientských sér vykázalo lineární chování ve třech postupných krocích ředění (< 20%). Vzhledem k heterogenitě vzorků lidského séra či plazmy může dojít k různým výsledkům. SPECIFIČNOST REAST specifických IgE detekuje výhradně lidské molekuly sige. Ve fyziologických koncentracích nebyla zkřížená reaktivita s jinými imunoglobuliny jako IgA, IgD, IgM a IgG pozorována. OMEZENÍ METODY REAST specifických IgE má následující omezení: Negativní výsledek testu nevylučuje alergii typu I Výsledek testu musí být zvážen s ohledem na pacientův chorobopis U testovaných vzorků s vysokým obsahem celkového počtu IgE ((> 1000 MJ/ml) mohou být změřené koncentrace sige nižší než skutečné hodnoty Používáním směsí alergenů lze dojít pouze k semikvantitativnímu určení LITERATURA 1. Johansson S, Bennich H and Berg T: The Clinical Significance of IgE. Progress in Clin Immunol, 1972, 1. 2. Kjellman M: Immunoglobulin IgE and Atopic Allergy in Childhood. Linkpoing University Medical Dissertations No 36 (1976). 3. Kleine-Tebbe J, Breuer K, Lepp U, Vieths S, Worm M, Kunkel G, Wahn U und Lau S: Spezifische IgE-Werte gegen Aero- und Nahrungsmittelallergene im Vergleich: Dr. Fooke ALLERG-O- LIQ und Pharmacia CAP-System. Allergologie 2004, 4:129-134. 4. Arbeitsgruppe der Deutschen Diagnostika Gruppe e.v. (DDG): Gute Labordiagnostische Praxis GLDP, Konzept einer Guten Labordiganostischen Praxis. Clin Lab 1999, 45:569-580. 5. Sun B, Mahler M, Mei J, Jing L, Zhong N: Allergen-specific IgE to inhalant and food allergens and total IgE values in China Comparison between two commercial immunoassays: Dr. Fooke ALLERG-O-LIQ versus Phadia ImmunoCAP System. J Invest All Clin Immunol 2008, 18:319-321. Datum vydání: 2016-11 REV1 Strana 3 ze 5 Specific IgE REAST_REV1_22.11.16

OPATŘENÍ PRO UŽIVATELE 1. V souladu s článkem 1, paragrafem 2b evropské směrnice 98/79/EC je používání in vitro diagnostických lékařských zařízení určeno k zajištění vhodnosti, výkonu a bezpečnosti výrobcova produktu. Proto je nutné technický postup, informace, bezpečnostní opatření a varování uvedená v návodu k použití striktně dodržovat. Soupravu lze používat pouze dle pokynů na straně 1 (účel použití). 2. Test musí být proveden v souladu s tímto návodem, který obsahuje všechny nezbytné informace, bezpečnostní opatření a varování. Použití této testovací soupravy s analyzátory a podobným vybavením musí být validováno. Jakákoli změna v návrhu nebo testovacím postupu, stejně jako použití v kombinaci s jinými výrobky, které nebyly schváleny výrobcem, nejsou povoleny; za takovéto změny, které mají za následek chybné výsledky, a jiné případy je zodpovědný uživatel. Výrobce neručí za jakékoli výsledky získanými vizuální analýzou pacientských vzorků. 3. Tato souprava je určena k používání pouze vyškolenými a kvalifikovanými profesionály provádějícími výzkumnou nebo diagnostickou činnost. Test by neměl být prováděn těhotnými ženami. 4. U laboratorního vybavení je nutno provádět údržbu v souladu s pokyny výrobce a před jeho použitím musí být proveden test pro zjištění jeho správného fungování. 5. Pouze k použití in vitro. Pouze na jedno použití. Nepoužívejte komponenty přesahující datum použitelnosti. Nekombinujte reagencie od jiných dodavatelů, ani komponenty ze souprav jiných šarží (není-li tak stanoveno na straně 1) s touto soupravou. Pokud je balení komponent poškozeno, komponenty nepoužívejte. Před použitím zkontrolujte všechny roztoky, abyste se ujistili, že nejsou mikrobiologicky kontaminovány. Abyste zabránili odpařování a mikrobiologické kontaminaci, neprodleně po použití lahvičky uzavřete. Šroubovací víčka lahviček s reagenciemi nezaměňujte. Souprava byla vyhodnocena k použití při teplotách stanovených v Testovacím schématu (viz stranu 2). Vyšší nebo nižší teploty mohou vést k tomu, že se hodnoty nebudou nacházet v rámci rozsahů kontrol kvality. 6. Mycí procedura je velice důležitá. Nevhodné mytí způsobí chybné výsledky. Doporučujeme používat multikanálovou pipetu a automatizovanou myčku. Abyste se vyhnuli křížové kontaminaci a falešně pozitivním výsledkům, doporučujeme náležitě provést veškeré pipetovací kroky. Používejte pouze čisté pipetovací špičky, dávkovače a laboratorní sklo. 7. Testovací komponenty na bázi lidského séra byly testovány za použití metody s označením CE na přítomnost protilátek proti HIV 1/HIV 2, Anti-HBc, a Anti-HCV, stejně jako na protilátku proti hepatitidě HBsAg, a byly shledány jako negativní. I přesto by se s materiálem na bázi lidského séra mělo zacházet jako s potenciálně infekčním (biologické riziko). 8. Některé komponenty soupravy mohou obsahovat hovězí sérový albumin, o kterém dle výrobce není známo, že by byl infekční. Vzhledem k možnosti výskytu nezjistitelných infekčních látek doporučujeme zacházet s každým výrobkem zvířecího původu jako s potenciálně infekčním. 9. Následující bezpečnostní pravidla je třeba dodržovat u všech reagencií: - Zamezte kontaktu s očima, kůží nebo oblečením (P262). Sprej nevdechujte (P260). Pipetování by se nikdy nemělo provádět pusou, ale za použití vhodných pipetovacích nástrojů. - PŘI SPOLKNUTÍ: vypláchněte ústa. NEvyvolávejte zvracení (P301/330/331). - PŘI KONTAKTU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Odstraňte/Svlékněte si všechno kontaminované oblečení. Kůži opláchněte vodou/osprchujte (P303/361/353). - PŘI VDECHNUTÍ: Přeneste postiženého člověka na čerstvý vzduch a ponechte jej v klidu v poloze usnadňující dýchání (P303/340). - PŘI KONTAKTU S OČIMA: Po dobu několika minut opatrně oplachujte vodou. Pokud jsou nasazené a lze to snadno provést, sejměte kontaktní čočky. Pokračujte v oplachu (P305/351/338). - Při provádění tohoto testu nejezte, nepijte ani nekuřte. Držte odděleně od potravin, krmiva a nápojů. - Používejte ochranné rukavice/ochranný oděv/ochranné brýle (P280). Po manipulaci si důkladně umyjte ruce (P264) a pečujte o svou kůži. - Bezpečnostní list je k dispozici na vyžádání. 10. Ukončovací roztok může způsobit podráždění kůže (H315) a vážné podráždění očí (H319). 11. TMB ve vysokých koncentracích může být potenciálně mutagenní. Při správném použití může být mutagenní efekt vzhledem k nízké koncentraci TMB v tomto roztoku substrátu vyloučen. 12. Konzervační látky (Bronidix, Thimerosal, Azid) působí škodlivě na vodní život, ale jejich koncentrace již není nebezpečná životnímu prostředí. Při likvidaci oplachujte velká množství reagencií s velkým množstvím vody. Thimerosal (WashBuf B) může při delším nebo opakovaném vystavení způsobit poškození orgánů (H373). 13. Odpad obsahující sérum musí být soustřeďován v oddělených nádobách obsahujících vhodný dezinfekční prostředek v dostatečném množství. S tímto materiálem se musí nakládat v souladu s národními směrnicemi nebo předpisy o bezpečnosti nebo o biologickém riziku. 14. Odkazujeme na národní předpisy o zdravotnických zařízeních týkající se in vitro diagnostických testovacích souprav. Datum vydání: 2016-11 REV1 Strana 4 ze 5 Specific IgE REAST_REV1_22.11.16

8 C Číslo šarže Označení CE Pro in-vitro diagnostiku 2 C Teplotní hranice Použitelné do Katalogov é číslo Poraďte se s příručkou Viz průvodní dokumenty Nepoužívejte, pokud je obal poškozen Nepoužívejte opakovaně Dostačující pro <n> testů Vyrobeno Biologické riziko Datum vydání: 2016-11 REV1 Strana 5 ze 5 Specific IgE REAST_REV1_22.11.16