Mendelova univerzita v Brně

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Explantátová kultivace bezsemenných odrůd révy vinné Disertační práce Vedoucí disertační práce Vypracoval Prof. RNDr. Jan Hradilík, CSc. Ing. Ondrej Korpás Lednice 2010

Prohlášení Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Explantátová kultivace bezsemenných odrůd révy vinné vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty v Lednici Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici, dne 30.04.2010 Ing. Ondrej Korpás

PODĚKOVÁNÍ Tato práce je věnována všem našim poctivě pracujícím předkům, kteří přispěli k rozvoji zpracované tematiky. Osobitý dík patří příslušníkům mé rodiny: mému otci, mé matce a mým bratrům za jejich výdrž a pomoc při tvorbě. Velký dík patří mému školiteli, panu prof. Hradilíkovi za povzbudivý přístup při práci, časný návod k zapojení se do řešení interního projektu IGA MZLU v Brně pod číslem IGA 22/2005, výsledkem kterého byl vytvořen atlas bezsemenných odrůd, dále za pevné vedení, ale současně i volnou ruku v rozhodování a při analýze dané tematiky, aktualizaci dané problematiky. Komplexní pohled na danou tematiku je nejzřetelnějším příkladem tohoto přístupu. Velký dík patří i ostatním kolegům, spolupracovníkům a odborníkům, kteří pomáhali při realizaci této práce. Děkuji (v abecedním pořadí, bez titulů) Petrovi Ackermannovi, Károly Bakonyi, Miroslavu Baránkovi, Katce Baránkové, Lence Bláhové, Heleně Fišerové, Lubomíru Glosovi, Janu Goliášovi, Edit Hajdu, Patricio Hinrichsen, Františkovi Kobzovi, László Kocsis, Pál Kozma, Břetislavovi Křižanovi, firmě Lajkó&Lajkó, Milošovi Michlovskému, Petrovi Němcovi, Tomáši Nečasovi, Ivanu Oukrupcovi, Pavlu Pavlouškovi, Miroslavovi Petrechovi, Miroslavovi Pidrovi, Eduardovi Postbieglovi, Janě Raddové, David Ramming, Lajos Sipos, Radkovi Sotolářovi, Michael Striem, Jiřímu Uhrovi, Miroslavu Vachůnovi, Miroslavu Veverkovi a dalším nejmenovaným pomocníkům.

OBSAH 1. ÚVOD...16 2. CÍL PRÁCE...18 3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY...20 3.1 Aspekty pěstování a sortiment stolních odrůd révy v našich podmínkách...20 3.2 Vlastnosti hroznů určených na přímý konzum...21 3.2.1 Morfologie hroznů a bobulí...22 3.2.1.1 Velikost bobulí...23 3.2.1.2 Tvar bobulí...24 3.2.1.3 Hustota hroznů...24 3.2.1.4 Velikost a tvar hroznů...26 3.2.2 Ostatní požadavky pro odrůdy určené na přímý konzum...26 3.3 Bezsemennost révy vinné a její konfrontace s bezsemenností u modelových rostlin 26 3.3.1 Partenokarpie u révy vinné...28 3.3.2 Stenospermokarpie u révy vinné...29 3.3.3 Triploidní a geneticky modifikované odrůdy révy vinné...29 3.3.4 Bezsemennost u modelových rostlin...29 3.4 Stenospermokarpie a její využití ve šlechtění révy na bezsemennost...30 3.5 Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění révy na bezsemennost...33 3.5.1 Fyziologická charakteristika explantátových kultur...35 4. ATLAS BEZSEMENNÝCH STOLNÍCH ODRŮD RÉVY VINNÉ...40 4.1 Úvod...40 4.2 Materiál a metody...40 4.2.1 Lokality průzkumu...40 4.2.2 Popis pokusného stanoviště...41 4.2.2.1 Popis klimatických poměrů, půdních podmínek a odrůdové skladby v Južnoslovenskej vinohradníckej oblasti...42 4.2.2.2 Popis výsadby stolních odrůd v trati Pántyú...42 4.2.3 Rostlinný materiál...43 4.2.4 Zpracování položek atlasu...45 4.2.4.1 Hrozny...45

4.2.4.2 Velikost a hmotnost bobulí...46 4.2.4.3 Struktura bobulí...46 4.2.4.4 Semena...47 4.3 Výsledky...47 4.4 Diskuse...60 4.5 Závěr...62 5. POLNÍ POKUSY S ANTIGIBERELINY...63 5.1 Úvod...63 5.2 Materiál a metody...63 5.2.1 Popis pokusného stanoviště...63 5.2.2 Rostlinný materiál...63 5.2.2.1 Původ genotypů...64 5.2.2.2 Morfologický opis genotypů...64 5.2.2.3 Fenologická charakteristika genotypů...67 5.2.2.4 Hospodářské vlastnosti genotypů...67 5.2.2.5 Agrotechnické požadavky genotypů...68 5.2.2.6 Využitelnost genotypů...68 5.2.3 Použité antigibereliny...69 5.2.3.1 Typy...69 5.2.3.2 Koncentrace...70 5.2.3.3 Způsob aplikace...70 5.2.4 Sledované charakteristiky...71 5.3 Výsledky...71 5.4 Diskuse...73 5.5 Závěr...74 6. ZYGOTICKÁ EMBRYOGENEZE...75 6.1 Úvod...75 6.2 Materiál a metody...75 6.3 Výsledky...76 6.4 Diskuse...96 6.5 Závěr...100 7. SOMATICKÁ EMBRYOGENEZE Z ENDOSPERMU A OSEMENÍ...102 7.1 Úvod...102

7.2 Materiál a metody...102 7.3 Výsledky...102 7.4 Diskuse...105 7.5 Závěr...106 8. CHOVÁNÍ DVOU MOLEKULÁRNÍCH MARKRŮ SCAR PRO BEZSEMENNOST U STŘEDOEVROPSKÝCH ODRŮD...107 8.1 Úvod...107 8.2 Materiál a metody...108 8.2.1 Rostlinný materiál...108 8.2.2 Extrakce DNA...109 8.2.3 Analýza SCAR...109 8.2.4 Statistické hodnocení...109 8.3 Výsledky...110 8.3.1 Alelové rozdělení u lokusů SCC8 a SCF27 u vybrané skupiny stolních odrůd révy vinné...110 8.3.2 Analýza pomocí molekulárních markrů SCC8 a SCF27 v sesterských potomstvech NKL, NSD a JKL, jako i u jedinců z dalších křížení...113 8.3.3 Ověření spojení genotypu s fenotypem u dvou semenáčů NKL...117 8.4 Diskuse...117 8.5 Závěr...122 9. O MIMOŘÁDNÉ VELIKOSTI PARTENOKARPICKÝCH BOBULÍ ODRŮDY TALISMAN...123 9.1 Úvod...123 9.2 Materiál a metody...124 9.2.1 Původ a popis rostlinného materiálu...124 9.2.2 Zjištění typu květů odrůdy Talisman podle pohlavnosti...124 9.2.3 Popis pokusných variant...125 9.2.4 Sledované znaky...126 9.2.5 Statistické hodnocení...126 9.3 Výsledky...126 9.3.1 Talisman při nízkém počtu semen vykazuje velmi velkou hmotnost bobulí 126

9.3.2 Z funkčně samičích květů Talismanu mohou vzniknout partenokarpické bobule o mimořádné hmotnosti...128 9.3.3 Čím později nastane kvetení, hrozny a partenokarpické bobule Talismanu jsou tím menší...128 9.3.4 Partenokarpické bobule po odstranění velkých, semenných bobulí zůstanou malé 130 9.3.5 Talisman při samoopylení vedle tvorby partenokarpických bobulí vykazuje i opad květů...130 9.3.6 Partenokarpické bobule u Talismanu se vyvinou jen v přítomnosti pylu..131 9.3.7 Tvorba semen u Talismanu není vyrovnaná...131 9.4 Diskuse...131 9.5 Závěr...135 10. O ZÁLISTKOVÝCH HROZNECH, PLODÍCÍCH ŘÍZCÍCH A SMĚRU ŠLECHTĚNÍ STOLNÍCH ODRŮD RÉVY VINNÉ...137 10.1 Úvod...137 10.2 Materiál a metody...137 10.3 Výsledky...137 10.4 Diskuse...139 10.5 Závěr...144 11. ZÁVĚR...145 12. SOUHRN A RESUME...147 13. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...149 14. PŘÍLOHY...vlastní číslování

SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ CÍL PRÁCE Obrázek 1: Celkový pohled na činnost realizovanou v pokusném období, vedoucí k tvorbě raných a bezsemenných genotypů s velkými bobulemi SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY Tabulka I: Srovnání úspěšnosti explantátové kultivace stenospermických semen u révy vinné ATLAS BEZSEMENNÝCH STOLNÍCH ODRŮD RÉVY VINNÉ Tabulka I: Sledované genotypy podle jednotlivých lokalit a odrůdy zimního trhu Tabulka II: Hmotnost jednotlivých bobulí, počet semen v bobuli a hmotnost jednotlivých semen u zkoumaných odrůd Tabulka III: Celková hmotnost semen v bobuli u zkoumaných odrůd Tabulka IV: Třídění odrůd atlasu Tabulka V: Srovnání koeficientů a indexů korelace u korelačních závislostí mezi celkovou hmotností semen / hmotností semen a hmotností bobulí, včetně srovnání významu semenné odrůdy Red Globe Obrázek 1: Závislost mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí u zkoumaných odrůd; elipsy tvoří směrodatné odchylky od průměrů; pro číslování odrůd viz Tab. II a III Obrázek 2: Zvětšení závislosti mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí u zkoumaných odrůd, uváděné na Obr. 1; elipsy tvoří směrodatné odchylky od průměrů; pro číslování odrůd viz Tab. II a III Obrázek 3: Jednoduché lineární a nelineární korelační závislosti mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí, zde včetně semenné odrůdy Red Globe Obrázek 4: Jednoduché lineární a nelineární korelační závislosti mezi hmotností semen a hmotností bobulí, zde včetně semenné odrůdy Red Globe Obrázek 5: Jednoduché lineární a nelineární korelační závislosti mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí, zde bez semenné odrůdy Red Globe Obrázek 6: Jednoduché lineární a nelineární korelační závislosti mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí, zde bez semenné odrůdy Red Globe

POLNÍ POKUSY S ANTIGIBERELINY Tabulka I: Morfologické vlastnosti Jupiteru a Neptúnu (podle POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998, upraveno) Tabulka II: Použité antigibereliny a jejich koncentrace Tabulka III: Hmotnost vysušených semen u jednotlivých ošetření antigibereliny Obrázek 1: Procentuální obsah endospermu při jednotlivých ošetřeních antigibereliny u odrůdy Neptún; sloupce označené stejnými písmeny se neliší od sebe (Tukeyův test HSD, α = 0,05) Obrázek 2: Procentuální obsah endospermu při jednotlivých ošetřeních antigibereliny u odrůdy Jupiter; sloupce označené stejnými písmeny se neliší od sebe (Tukeyův test HSD, α = 0,05) ZYGOTICKÁ EMBRYOGENEZE Tabulka I: Celková charakteristika explantátových kultur založených v pokusném období 2004-2006 Tabulka II: Přímé klíčení explantátových kultur založených v pokusném období 2004-2006 Tabulka III: Počet všech kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2004 dle křížení Tabulka IV: Počet úspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2004 dle křížení Tabulka V: Počet neúspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2004 dle křížení Tabulka VI: Procentuální úspěšnost kultivace stenospermických semen in vitro v roce 2004 dle křížení Tabulka VII: Počet všech kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2005 dle křížení Tabulka VIII: Počet úspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2005 dle křížení Tabulka IX: Počet neúspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2005 dle křížení Tabulka X: Procentuální úspěšnost kultivace stenospermických semen in vitro v roce 2005 dle křížení

Tabulka XI: Počet všech kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2006 dle křížení Tabulka XII: Počet úspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2006 dle křížení Tabulka XIII: Počet neúspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2006 dle křížení Tabulka XIV: Procentuální úspěšnost kultivace stenospermických semen in vitro v roce 2006 dle křížení Tabulka XV: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2004, zde tříděno dle ošetřených keřů Tabulka XVI: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2004, zde tříděno dle procentuálního obsahu embryí Tabulka XVII: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2005, zde tříděno dle procentuálního obsahu embryí Tabulka XVIII: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2005, zde tříděno dle procentuálně získaných jednotlivých genotypů in vitro Tabulka XIX: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2006, zde tříděno dle procentuálního obsahu embryí Tabulka XX: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2006, zde tříděno dle procentuálně získaných jednotlivých genotypů in vitro Tabulka XXI: Absolutní a procentuální hodnoty přímo vyklíčených semen u nosných genotypů pokusů (Jupiter a Neptún) v jednotlivých letech pokusů Obrázek 1: Stoprocentní skládaný pruhový graf porovnávající procentuální příspěvek NE1 až NEMB k celkovému součtu N (v závorce) pro různá křížení v roce 2005, sestupně řazeno dle absolutního počtu NE1 Obrázek 2: Stoprocentní skládaný pruhový graf porovnávající procentuální příspěvek NE1 až NEMB k celkovému součtu N (v závorce) pro různá křížení v roce 2006, sestupně řazeno dle absolutního počtu NE1 SOMATICKÁ EMBRYOGENEZE Z ENDOSPERMU A OSEMENÍ Tabulka I: Přítomnost a nepřítomnost neembryogenního kalusu u vybraných půlených semen s endospermem, tříděno dle použitých médií

Tabulka II: Směrodatné výsledky kvalitativního mikropokusu somatické embryogeneze u stenospermických semen CHOVÁNÍ DVOU MOLEKULÁRNÍCH MARKRŮ SCAR PRO BEZSEMENNOST U STŘEDOEVROPSKÝCH ODRŮD Tabulka I: Původ a genotypy u lokusů SCC8 a SCF27 zkoumaných stenospermokarpicky bezsemenných a semenných odrůd Tabulka II: Rozdělení genotypových tříd u lokusu SCC8 v dílčích skupinách stenospermokarpicky bezsemenných a semenných odrůd, popsaných v Tab. I a v ADAM- BLONDON et al. (2001), test χ 2 (α = 0.05) shody mezi pozorovaným a očekávaným štěpným poměrem 3:3:2:1 (χ 2 D) a test χ 2 (α = 0.05) odlišnosti genotypového rozdělení mezi dvěma dílčími skupinami (χ 2 R) Tabulka III: Rodokmen, segregace (S) molekulárních markrů SCAR a test χ 2 (α = 0.05) shody mezi pozorovaným a očekávaným štěpným poměrem 1:1:1:1 (A, B) ve třech analyzovaných sesterských potomstvech (A, B, C) a u několika jedinců z jiných různých křížení (D), všech získaných in vitro Tabulka IV: Segregace, možnost výskytu bezsemenného fenotypu a chování nulových alel ve kříženích mezi dvěma semennými (A), semenným a bezsemenným (B) a dvěma bezsemennými (C, D) jedinci, kteří jsou heterozygotní pro nulovou alelu u lokusu SCC8 O MIMOŘÁDNÉ VELIKOSTI PARTENOKARPICKÝCH BOBULÍ ODRŮDY TALISMAN Obrázek 1: Původ odrůdy Talisman Obrázek 2: A. Závislost hmotnosti bobulí u hroznů se semennými ( ) nebo partenokarpickými ( ) bobulemi a hmotnosti partenokarpických bobulí u hroznů se smíšenými bobulemi ( ) na datu výběru / izolace květenství. B. Vliv semenných bobulí na hmotnost partenokarpických bobulí u hroznů se smíšenými bobulemi ( ), u hroznů s partenokarpickými bobulemi od začátku ( ) a u hroznů získaných úplným ( ) nebo částečným ( ) odstraněním semenných bobulí. Sloupce značené stejnými písmeny se neliší průkazně při hladině významnosti 5%

O ZÁLISTKOVÝCH HROZNECH, PLODÍCÍCH ŘÍZCÍCH A SMĚRU ŠLECHTĚNÍ STOLNÍCH ODRŮD RÉVY VINNÉ Tabulka I: Srovnání hmotností jednotlivých stenospermických semen u odrůdy Jupiter dle roku a typu hroznů Obrázek 1: Jednoduché lineární a nelineární korelační závislosti mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí, zde včetně semenných odrůd Red Globe a Talisman

SEZNAM ZKRATEK Explantátová kultivace: K tvorba kalusu DG přímé klíčení ( direct germination ) END přítomnost endospermu E počet embryí D počet deformovaných jedinců EO počet odumřelých embryí EK počet dále kultivovaných embryí po mikroskopování nebo přemnožení SE počet somatických embryí, či polyembryí SEK počet dále kultivovaných somatických embryí, či polyembryí po mikroskopování NE1 počet celistvých rostlin, které byly získány z přímo vyklíčených semen před mikroskopováním, chápaný jako dílčí část N NE2 počet celistvých rostlin, které byly získány z právě při mikroskopování normálně klíčících genotypů, chápaný jako dílčí část N NDEF počet celistvých rostlin, které byly získány z deformovaných genotypů, které přímo vyklíčily před mikroskopováním, chápaný jako dílčí část N NEMB počet celistvých rostlin, které byly získány z nevyklíčených embryí, která byla preparována pod mikroskopem ( embryo rescue ), chápaný jako dílčí část N N počet celistvých rostlin, které byly získány in vitro, chápaný jako součet NE1 + NE2 + NDEF + NEMB N počet celistvých rostlin, které byly převedeny do nesterilních podmínek a současně byly vysazeny ve vinohradu n počet úspěšně kultivovaných semen BSA CSS IGA LG LRO NEK analýza segregujících skupin ( bulked segregant analysis ) celé, nepůlené stenospermické semeno Interní grantová agentura vazebná skupina ( linkage group ) Listina registrovaných odrôd neembryogenní kalus

OP volné opylení ( open pollination ) pk pravokořenný semenáč PSS půlené stenospermické semeno QTL lokus kvantitativního znaku ( quantitative trait locus ) RAPD molekulární marker založený na náhodně amplifikované polymorfní DNA ( random amplified polymorphic DNA marker) roub roubovaný semenáč SCAR molekulární marker založený na amplifikovaném úseku charakterizovaném sekvencí ( sequence-characterised amplified region marker) SP samoopylení ( self pollination ) SS stenospermické semeno SSR molekulární marker založený na opakování jednoduchých sekvencí ( simple sequence repeat marker) Odrůdy: AA Afus Ali; AL Alphonse Lavallée; AR Arkadija; B Bicane; B2 BV 16-20-2; B3 BV 16-16-3; B6 BV 47-1-6; BA Binova; BK Boskolena; BO Bellino; C Carina; CL Cardinal; CR Chaouch rose ( = Ceaus roz, Damascenka růžová); D Dawn seedless; DL Datal; DT Delight; E Elma; EB Edro bezseme; ER Emperor; F Flame seedless; G Gold; H Helios; HP Heliotrop; IA Ilonka; J Jupiter; K Karneol; KK Katta kurgan; KL Kišmiš lučistyj; KM Kišmiš moldavskij; KOL Kossuth Lajos; KR Kišmiš rozovyj ( = Pink Sultana); L Luna; LDS Lady Downes seedling; M Merkúr; MA Muscat of Alexandria ( = Muškát alexandrijský); MI Mirnyj; MO Marroo seedless; MR Moscato rosa; MS Mars; N Neptún; O Olšava; P Pobeda; PA Perletta; PC Pearl of Csaba ( = Csabagyöngye, Čabaňská perla); PI Picurka; PL Palatina; PN Perlon; QV Queen of Vineyards ( = Szőlőskertek királynője muskotály, Královná vinic); R3 Rusalka 3; RA Rosina; RE Rusensko edro; RL Regal seedless; RM Red Malaga; RO Rózsika; RS Remaily seedless; RY Ruby seedless; S Sultana; SA Slavjanka; SD Sunred seedless; SM Sultana moscata; SQE Souvenir of Queen Elisabeth; SS Superior seedless; TA Tifafihi Ahmer; U Urán; UM Urkim; V Venuša; V6 Chibrid bezsemen V-6; VI Victoria; VI4 Chibrid bezsemen VI-4, VS Venus; Chemické látky: 2,4-D kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová

BAP 6-benzylaminopurin CCC chlorcholinchlorid ch-cpn21 chloroplastový chaperonin 21 DNA kyselina deoxyribonukleová GA 3 kyselina giberelová Média: BD, BD1, BD2 agarové médium dle BOUQUET a DAVIS (1989) a jeho modifikace pro zygotickou embryogenezi BD24 modifikace agarového média dle BOUQUET a DAVIS (1989) pro somatickou embryogenezi DAS agarové médium dle DAS et al. (2002) pro somatickou embryogenezi GR2 médium bez agaru dle MURASHIGE a SKOOG (1962) pro zakořeňování MS1, MS2, MS3 modifikace agarového média dle MURASHIGE a SKOOG (1962) PR, PR1 agarové médium dle THOMAS et al. (2000) a jeho modifikace pro iniciaci prýtů z kalusu TU agarové médium Tukay pro zygotickou embryogenezi W agarové médium White BM pro somatickou embryogenezi

1. ÚVOD Stolní hrozny jsou velmi oblíbeným ovocem a na trzích i mezi pěstitely jsou všeobecně vyhledávány buď semenné odrůdy s velkými bobulemi, nebo a to stále častěji odrůdy bezsemenné (PIVA et al., 2006). Získání bezsemenných plodů je jednoznačně fyziologickou výzvou (VAROQUAUX et al., 2000). Tvorba plodů bez semen se nejeví logickým krokem pro daný druh či danou rostlinu, nicméně není neznámá mezi divokými druhy: např. u pastináku bylo poukázáno na fakt, že právě partenokarpické plody jsou u tohoto druhu přednostně vyhledávány vysoce specializovanými škůdci (ZANGERL et al., 1991). Jakožto velikost bobule je ovlivněna i přítomností a počtem semen, případné bezsemenné bobule u dané odrůdy jsou vždy menší než bobule semenné (PRATT, 1971). U révy vinné známe bezsemennost dvojího typu: partenokarpii a stenospermokarpii. Ryze partenokarpické bobule jsou známy u skupiny Korintských odrůd, kdežto stenospermokarpie byla popsána u skupiny odrůd Sultanina. Stenospermokarpické bobule vznikají aborcí již vyvíjejících se semen, velikostně jsou tedy u dané odrůdy mezi partenokarpickými a semennými bobulemi. Stenospermokarpické bobule obsahují zakrnělá semena, rudimenty, které se z hlediska jejich hmotnosti a vývinu chovají kvantitativně (STOUT, 1936; PRATT, 1971; COLOVA-TSOLOVA et al., 2003). Bobule stenospermokarpických odrůd sice obsahují jen zakrnělá semena, neztratily však schopnost reakce na fytohormony, pocházející z těchto semen. Po aplikaci giberelinů v době kvetení odrůda Sultanina dává vznik několikanásobně větším bobulím a stala se oblíbeným objektem pěstování zejména v Americe (WEAVER, 1958). Gibereliny však mohou negativně ovlivnit diferenciaci květenství (COELHO DE SOUZA LEÃO, 2003) zejména v našich okrajových podmínkách pěstování révy vinné, byla tedy snaha získat velké stenospermokarpické bobule šlechtěním, a to křížením semenných odrůd s odrůdami ze skupiny odrůd Sultanina. Tato cesta je však poněkud zdlouhavá, neumožňuje totiž přímou kombinaci dvou stenospermokarpicky bezsemenných odrůd (PERL et al., 2000). Teprve explantátová kultivace stenospermických semen umožnila získání potomků z křížení mezi dvěmi stenospermokarpicky bezsemennými odrůdami (CAIN et al., 1983). Explantátová kultivace je však časově náročnou, pracnou metodou a hledaly se různé alternativy jak in vitro (směřování preparace embrya vyžadující mikroskopování 16

k přímému klíčení kultivovaných semen) (BURGER a TRAUTMANN, 2000), tak in vivo ( antigibereliny ) (LEDBETTER a SHONNARD, 1990; BORDELON a MOORE, 1994). Jakožto explantátová kultivace pro získání celistvých rostlin z křížených stenospermických semen ještě u nás nebyla použita přitom explantátové kultury mají u nás dlouhověkou historii (HRADILÍK, 2003), pokusil jsem se o zavedení této techniky v našich podmínkách. A skutečně, celosvětová popularita bezsemenných odrůd a s tím spojená rozsáhlá kultivace stenospermických semen ve světě poukázaly na fakt, že odrůdy a podmínky pěstování i kultivace hrají klíčovou roli při úspěšné kultivaci (BOUQUET a DAVIS, 1989; PONCE et al., 2000). Náročnost preparace embrya usměrnila pozornost k řadě otázek, týkajících se možností prozkoumání interakce mezi révou a svým okolím s větší přesností, s cílem dosáhnout vyšší úspěšnost v oblasti přímého klíčení stenospermických semen. Mezi faktory ovlivňujícími explantátovou kultivaci značnou roli hraje genetický faktor, mající vliv na úspěšnost kultivace. Toto naznačuje, že je potřebné porozumět potenciálu jednotlivých odrůd z hlediska chování se jejich stenospermických semen v podmínkách in vitro. Vycházejíc z toho, že vyšlechtění jedné odrůdy je dlouhodobý proces spočívající v důkladném výběru matečných rostlin a následném prozkoumání potomstva, náplní této disertační práce je především tvorba nových stenospermokarpických genotypů ve formě celistvých semenáčů. Co se vlastní práce týká, dnešní komplexní pohled na bezsemennost vyžaduje výzkum v široké oblasti s následnou syntézou výsledků. Jelikož takovéto zkoumání skládající se hlavně z ampelometrické, ampelografické, genové, agrotechnické, ekologické, chemické, jakož i ekonomické a marketingové analýzy přesahuje rámec disertační práce, je tato zaměřena na tvorbu stenospermokarpických genotypů s uvážením i jiných typů bezsemennosti: triploidních rostlin a partenokarpie, které ještě nemají tradici v naší vinohradnické šlechtitelské praxi. Vzrůstající konzum bezsemenných hroznů, posun našeho vinohradnictví směrem ke kvalitě a globální oteplování, resp. skutečnost, že poslední desetiletí bylo z klimatologického hlediska nejteplejším obdobím od počátku měření klimatologických charakteristik, dělají z explantátové kultivace stenospermokarpických odrůd aktuální metodiku, významnou především v tom, že dochází ke křížení bezsemenných odrůd selektovaných v našich podmínkách. 17

2. CÍL PRÁCE Cíl mé disertační práce jednoznačně vyžaduje složitější vysvětlení, nápodobně k dané složitější problematice. Hned na začátku musím konstatovat, že naším cílem byla tvorba genetického materiálu pomocí explantátových kultur z již existujících, stenospermokarpicky bezsemenných stolních odrůd révy vinné. Nešlo však o rozsáhlé přemnožení již existujících odrůd v podmínkách in vitro, nýbrž o složitější a naléhavější věc: o tvorbu nových genotypů vycházejíc ze dvou stenospermokarpicky bezsemenných odrůd. Tato technika u nás (ČR, SR, MR) ještě nezpracovaná a nevyzkoušená, přesto slibující nadějné výsledky byla tedy poprvé úspěšně použita v ČR na naší fakultě v Lednici Mendelovy univerzity v Brně. Cílem bylo adaptovat tuto techniku na naše lokální odrůdy; na révu vinnou byla adaptována již v roce 1983 autory CAIN et al., s cílem získání co největšího počtu elitních semenáčů, ale také s cílem adaptace této kultury na poměry révy vinné. Postupně se ukázalo, že vedle složení kultivačního média (přítomnost či nepřítomnost rostlinných hormonů, aktivního uhlí i jiných organických látek jakými jsou kasein hydrolyzát, kokosové mléko atd.) a manipulace stenospermokarpickými semeny, nejvíce rozhodujícími faktory jsou mateřský genotyp a doba založení kultury. Je to tedy časový okamžik, kdy embrya v nezralých stenospermických semenech již nepotřebují komplexní výživu, víceméně jim postačí i úplně základní (třeba lépe i poloviční) MS (MURASHIGE a SKOOG, 1962) médium, ale jsou ještě před aborcí a jsou zachována v těchto nezralých stenospermických semenech a vesměs připravena na klíčení. Naším cílem byla snaha o co největší jednoduchost, snažili jsme se vyhnout komplikovaným manipulacím se semeny, složitému dávkování fytohormonů i jiných přídavků do médií atd. Místo náročného mikroskopování, nutného k preparaci embryí jsme se soustředili na přímé klíčení semenáčů z intaktních stenospermických semen, přesněji řečeno náš pokus jsme podrobili časovému i metodickému sledu v jednotlivých ročnících. Nevyhýbali jsme se však netradičním možnostem a skutečně jsme se pokusili o rozšíření našich možností s cílem efektivně vytvořit bezsemenné genotypy či plody u jednotlivých odrůd révy vinné. Cílem bylo také vyzkoušet antigibereliny v době kvetení, somatickou embryogenezi z endospermu i osemení stenospermických semen a zvážit partenokarpickou tvorbu bobulí. Plán pokusů a celkový pohled na činnost realizovanou v pokusném období, vedoucí k tvorbě raných a bezsemenných genotypů s velkými bobulemi ukazuje Obr. 1. 18

Obrázek 1: Celkový pohled na činnost realizovanou v pokusném období, vedoucí k tvorbě raných a bezsemenných genotypů s velkými bobulemi 19

3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 3.1 Aspekty pěstování a sortiment stolních odrůd révy v našich podmínkách Vysoký obsah zdraví prospěšných látek v čerstvých hroznech a doporučení jejich každodenního konzumu v celosvětovém měřítku přispěly k zvýšení poptávky po tomto ovoci. Produkce stolních hroznů však byla na území dnešního Slovenska jen doplňkovou činností při výrobě vín vyznačujících se v našich oblastech jemnou souhrou kyselin a aromatických látek, tedy všeobecně vysokou kvalitou a nepřevyšovala obvykle několik málo % celkové výrobní kapacity. Tomu zodpovídal i nevelký počet pěstovaných, vyloženě stolních odrůd a k přímému konzumu byly použity i hrozny některých moštových odrůd. V současnosti do Listiny registrovaných odrôd je zapsaných 16 stolních odrůd, a to včetně nových tuzemských odrůd Diamant, Dora a Opál uznaných v roce 1997 a Ametyst, Negra, Onyx, Pastel a Rubanka uznaných v roce 2002, ze kterých zatím neexitují rozsáhlejší výsadby. Ze 3 zahraničních odrůd, uznaných v sedmdesátých a osmdesátých letech 20. století obstojí Pannónia kincse a Guzal kara, které jsou typickými stolními odrůdami pro velkovýrobní pěstování. Jedinou pozitivní vlastností bulharské odrůdy Julski biser je její ranost a z důvodu vzniku tolerantních odrůd ze kterých zatím ani jedna není zapsaná v LRO nelze v budoucnu významněji počítat s rozšířením této odrůdy nejen ve velkovýrobních podmínkách, ale ani u zahrádkářů, pro které je spíše určená, stejně jako Olšava a Vitra, které vznikly v období bývalého Československa a lze je považovat za odrůdy domácí. Totéž platí i pro Chrupky (Chrupka bílá, Chrupka červená, Chrupka Jalabertova), které lze u nás považovat za tradiční. Nelze však opomenout historii a přítomnost vyloženě stolních odrůd v našich zemích běhěm osmanské nadvlády, tedy již v 16. století, období které lze z hlediska pěstování révy vinné považovat za stejně důležitou jako příchod Římanů v 1. století. Odrůdy jako Halhólyag, Kecskecsöcsű, Rosa menna di vacca a Rozaki byly až po révokazovou kalamitu široce rozšířené a z důvodu jejich pozdějšího období zrání pěstované hlavně pro zimní skladování. 20

Období zrání bylo v našich podmínkách vždy klíčovým faktorem úspěšného pěstování révy vinné. Nejistota dozrávání pozdních odrůd vedla nejen k šíření ranějších odrůd, ale i k šlechtění raně až velmi raně zrajících odrůd. Dobře je to patrné z činnosti významného šlechtitele Jánosa Mathiásze, který po té, co přeměnil všeobecně vyhledávané Chrupky do témeř nekonečné řady variací, rozpoznal důležitost typických morfologických znaků pozdě zrajících stolních odrůd i pro rané stolní odrůdy a použitím tehdy nejranější odrůdy na světě, Csabagyöngye od svého současníka Adolfa Starka vyšlechtil později svetoznámou odrůdu Szőlőskertek királynője muskotály. Stolní odrůdy mají zvýšené nároky na pěstitelské prostředí. Pro jejich velkovýrobu platí, že by měly být pěstovány jen v nejteplejších vinohradnických rajonech, v hlubokých, vlhkostí dobře zásobených půdách, na vysokém vedení. Tyto odrůdy totiž pocházejí z teplých oblastí Asie, případně Černomoří a jejich genotypovou podstatou je náročnost na teplo, a to bez ohledu na to, či se jedná o rané nebo pozdní typy (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998). Obzvláště to platí pro bezsemenné odrůdy. Nelze se proto divit, že dosud v LRO nejsou zapsané žádné bezsemenné odrůdy. Jsou však vyhledávané konzumenty a uvažujeme-li trend v uznávacím procesu který směřuje od raných a relativně méně náročných odrůd k odrůdám relativně náročnějším i pozdnějším jako výsledek globálného oteplování, nepřekvapí, že momentálně probíhá zkoušení 2 bezsemenných kandivarů v Štátnych odrodových skúškach. Přitom je žádoucí porozumět, jak se projevuje bezsemennost v našich podmínkách a určit vhodnost jednotlivých bezsemenných odrůd pro šlechtění. Tato skupina stolních odrůd je dnes o to zajímavější, že v sobě skrývá odrůdu Kišmiš vatkana, která přes její řazení do druhu révy vinné (Vitis vinifera L.) vykazuje vysokou odolnost k padlí révy (Erysiphe necator Schwein.) (HOFFMANN et al., 2008). 3.2 Vlastnosti hroznů určených na přímý konzum Poznání odrůd révy vinné, které jsou pěstované s účelem přímého konzumu jejich hroznů, lze získat kompletním a precizním studiem vlastností jednotlivých odrůd. Toto vyžaduje pozorování a hodnocení jednotlivých odrůd v rozličných podmínkách a na různých způsobech vedení, zahrnující i technologické pokusy a hospodářské studie. 21

Z důvodu nedostatku prostoru i času však ampelografické opisy, které rozebírají vlastnosti odrůd, nutně obsahují nedostatky i odhady. Místo této metody se však jeví výhodnějším určení významnosti jednotlivých odrůdových vlastností, což umožňuje vyhýbat se unáhleným rozhodnutím nebo přílišnému přihlédnutí k vedlejším vlastnostem. Ačkoliv každá odrůda révy vinné může být konzumována jako čerstvé ovoce, jejich konzum je příjemný jen v případě, když jejich hrozny a bobule vykazují vhodné morfologické a strukturální vlastnosti. Na základě těchto vlastností lze vytvořit pořadí odrůd, a to od odrůd s velmi příznivými vlastnostmi až po odrůdy s hrozny, jejichž konzum nevyvolává žádný příjemný pocit. Porovnání, která vedou k sestavení pořadí, by neměla být založená na celém sortimentu odrůd, ale na odrůdách, které jsou vzájemně porovnatelné v jedné nebo několika vlastnostech, např. v době zrání: rané a pozdní odrůdy; v barvě slupky bobulí: modré, bílé, červené odrůdy; v chuti bobulí: muškátové odrůdy a odrůdy jednoduché chuti; v bezsemennosti: semenné a bezsemenné odrůdy; atd. Dobu zrání lze považovat za nejdůležitější vlastnost, protože významně určuje geografické rozšíření či pěstitelskou technologii odrůd na daném místě. Ostatní vlastnosti přitom slouží k řazení odrůd do skupin, v rámci kterých je možné za určitých podmínek realizovat srovnávání odrůd. Výsledky těchto srovnávání by měly být porovnány s pěstitelskou hodnotou i technologickými parametry odrůd. Toto porovnání, které může vyrovnat nebo naopak zvýraznit morfologické pořadí odrůd, většinou předchází volbu, která nakonec téměř vždy je charakteru kompromisu (BRANAS a TRUEL, 1965). 3.2.1 Morfologie hroznů a bobulí Při konzumu hroznů révy vinné zpravidla je za třapinu bereme do rukou a postupně je prsty konzumujeme po jednotlivých bobulích; toto je možné jen v případě, že hrozny i bobule disponují příznivými morfologickými vlastnostmi. Bez těchto vhodných vlastností, které se vztahují na velikost bobulí, na hustotu jako i na velikost hroznů, odrůdy révy vinné nevyhovují konzumu jako ovoce a jsou lisovány tyto jsou pak zpracovány jako moštové odrůdy révy vinné (BRANAS a TRUEL, 1965, upraveno). 22

3.2.1.1 Velikost bobulí Jednou z nejdůležitějších vlastností stolních hroznů je velikost bobulí. Odrůdy s malými bobulemi nemají hospodářský význam. Odrůdy se středně velkými bobulemi jsou vyhledávané jen tehdy, když není možné porovnání s odrůdami s většími bobulemi, a to jejich velmi raným nebo velmi pozdním zráním, jejich vhodností pro zimní skladování nebo vykazují vzácné, hodnotné vlastnosti jako bezsemennost, odolnost vůči chorobám atd. Tedy odrůdy s velkými bobulemi jsou přednostně vyhledávané. Zralé bobule podle jejich většího rozměru, což může být průměr nebo délka, lze seskupit do 4 tříd: malé bobule, <12 mm; středně veliké bobule, 12-18 mm; veliké bobule, 18-24 mm; velmi veliké bobule, >24 mm. Danou odrůdu lze charakterizovat jednou z výše uvedených tříd, pokud každá bobule jejího hroznu odpovídá danému velikostnímu rozsahu, nebo dvěmi sousedícími třídami, pokud bobule v tomtéž roce nebo na základě víceletého pozorování spadají do dvou velikostních rozsahů. Protože tato měření se vztahují na největší rozměr a ne na objem, podlouhlé bobule hodnotíme jako větší než jsou v realitě. Z praktického hlediska se určení hmotnosti bobulí jeví jako vhodnější. Při měření třeba zohlednit normální bobule a třeba se vyhnout největším, sprchlým a abnormálně malým bobulím. Co se týká faktorů, které ovlivňují velikost bobulí, nejdůležitějšími se jeví vzrůstnost keřů a proces oplození či jeho výsledek. Díky vzrůstnosti, kterou lze charakterizovat intenzivním dýcháním a vysokým příjmem vody a dusíkatých látek, se bobule zvětšují společně; následně na silně rostoucích keřích (mladé keře, krátký řez, na minerální látky bohaté a těžké půdy atd.) dojde k nadhodnocení velikosti bobulí a na slabě rostoucích keřích k její podhodnocení. V důsledku oplození se v každé bobuli mění počet semen a jejich uspořádání a tím i velikost a tvar hroznů. Proces oplození je pod vlivem jednak vzrůstnosti, která určuje frekvenci a míru poruch v oplození, jednak vnějších podmínek (průběhu počasí). Závisle na odrůdě je ještě velikost bobulí víceméně ovlivněna polohou hroznů na letorostech a polohou letorostů na keřích. 23

3.2.1.2 Tvar bobulí Protože nejdelší bobule od začátku disponují nejdelším semeníkem, tvar bobulí závisí na tvaru semeníku, dále pak na oplození 4 vajíček nacházejících se v semeníku. Průřez bobulí s nejméně 2 normálními semeny je víceméně okrouhlý, ale vyskytneli se vedle normálního semene jedno stenospermické semeno, na jeho straně v první fázi růstu bobulí dojde k prohloubenině v průřezu bobulí. Tato prohloubenina zmizne u šťavnatých bobulí během zrání, ale zůstává přítomna u masitých bobulí. Následně u bobulí s masitou dužninou se podlouhlé bobule ohnou do oblouku a kulaté bobule se stanou vypouklými. Ačkoliv vyvolávají pozornost, neobvyklé tvary bobulí nejsou vyhledávány, ba konzumenti je často přijímají s výhradou. Obvyklé tvary bobulí kulaté, ale ne zploštělé, oválné nebo vejčité, lehce eliptické jsou víceméně ceněny rovnou měrou. 3.2.1.3 Hustota hroznů Bobule musí být od sebe oddělené. U hustých hroznů je to jen u malého podílu bobulí. Hustota hroznů je tedy jednou z nejvýznamnějších parametrů stolních hroznů. S její vyšší intenzitou klesá přitažlivost hroznů, protože jejich bobule se stávají stlačenými a nemohou si získat ani jejich přirozený tvar, ani jejich jednotné vybarvení; přitom se zvyšuje jejich citlivost na hnilobu a snižuje se jejich vhodnost pro transport. Mezi faktory hustoty hroznů patří délka hroznu a stopky bobule, jako i počet a velikost bobulí. Zatímco husté hrozny většinou disponují třapinou s krátkými postrannými osami, krátkou stopkou bobulí a četnými bobulemi, řídké hrozny lze řadit do 2 typů. Dlouhými a pružnými prostrannými osami a dlouhou stopkou bobulí se vyznačující první typ, kterého lze lépe zabalit a transportovat, se stane disharmonickým jen tehdy, když jejich osy jsou příliš dlouhé nebo jejich bobule jsou příliš podlouhlé. U druhého typu, který se vyznačuje krátkou stopkou bobulí a silnou a nepružnou třapinou, řídká struktura hroznů vzniká v důsledku sprchávání a je-li toto příliš intenzivní, hrozen se stane disharmonickým. 24

Hustota hroznů je tedy komplexním znakem a takto lze hrozny rozdělit do 3 tříd: husté, středně husté a řídké hrozny. Přechodné třídy tvoří odrůdy, jejichž hrozny lze přiřadit do 2 tříd: husté / středně husté hrozny a středně husté / řídké hrozny. Máme-li na mysli určitou odrůdu, pak hustota hroznů se mění v závislosti na počtu a velikosti bobulí. Hlavní důvody kolísání hustoty jsou ve sprchávání bobulí a vzrůstnosti keřů révy vinné. Počet bobulí je výsledkem sprchávání a úspěšnosti oplození. Úspěšnost oplození je vždy větší v experimentálních podmínkách než ve vinicích osázených jedinou odrůdou. Se vzrůstností keřů roste i velikost bobulí a tato dává vznik hustším hroznům s různými následky u jednotlivých odrůd. Vzrůstnost keřů souvisí s jejich věkem a zpravidla mladé keře vykazují nejintenzivnější růst. Posouzení odrůd ve fázi mladých keřů je potřebné korigovat oslabením růstu v pokročilejším věku. U odrůd se středně hustými nebo hustými / středně hustými hrozny, jako např. u skupiny odrůd Chrupka, velká vzrůstnost keře dělá hrozny nevhodnými na přímý konzum, protože se bobule nacházejí těsně vedle sebe. Tyto odrůdy lze pěstovat na přímý konzum jen tam, kde keře zůstanou relativně slabě rostoucími. Toto je charakteristické i pro Chrupku: odrůda chovající se na neúrodných a spíše sušších půdách a na nejvýše středně produktivních podnožích jako stolní typ se na bohatých a hlubokých půdách, na vysoce produktivních podnožích s účinným a silným hnojením přemění v moštový typ. Nejpodstatnějším důvodem snížení kvality u odrůd s hustými / středně hustými a středně hustými hrozny se jeví velká vzrůstnost keřů. Následně, protože se pěstování těchto odrůd omezuje na lokality, kde keře mohou být jen středně produktivní, u těchto odrůd se velkovýrobní pěstování musí vyloučit. U odrůd s řídkými nebo středně hustými / řídkými hrozny velká vzrůstnost keřů není nevýhodná a tyto odrůdy jsou vhodné na vysoce produkční intenzivní pěstování, které lze realizovat jen na vysoce produkčních keřích. Celosvětově rozšířené odrůdy jako Afus Ali, Italia, Red Globe a Alphonse Lavallée se přizpůsobily k těmto podmínkám. Naopak nedostatečná vzrůstnost, která souvisí s malými bobulemi, nepříznivě ovlivňuje charakter těchto odrůd a mnohem zřetelněji charakter jejich hroznů. Hustota hroznů je ještě ovlivněna pěstitelskou technologií a technikami určujícími vzrůstnost keřů, a to přes jejich vliv na sprchávání nebo i jiným způsobem. 25

3.2.1.4 Velikost a tvar hroznů Příliš malé hrozny nejsou atraktivní a jejich sklizeň je málo produktivní. Příliš objemné hrozny taktéž nevyhovují, protože nelze je náležitě zabalit a pro distribuci je nevyhnutné je rozdělit na menší části. Následující délky jsou směrodatné při velikosti hroznů: nejvýše 12 cm u malých hroznů, 12-18 cm u středně velkých hroznů a nejméně 18 cm u velikých hroznů. Tvar hroznů většinou není rozhodující, ale přitažlivost hroznů klesá při nedostatečném vzhledu (BRANAS a TRUEL, 1965). 3.2.2 Ostatní požadavky pro odrůdy určené na přímý konzum Barva bobulí je rozhodující, žluté, šarlatově červené a modré odstíny působí atraktivněji než odstíny zelené a fialové, které vyvolají pocit nezralosti. Hrozen by měl mít delší stopku a bobule by neměly opadávat z třapiny. Chuť má být harmonická s vyváženým poměrem mezi obsahem cukrů a kyselin. Muškátová aroma rozšiřuje různorodost chutí, přitom její obliba značně závisí na preferencích konzumentů. Pevná, šťavnatá dužnina se upřednostňuje před tekutou a rosolovitou. Slupka (exokarp) musí být dostatečně pevná, aby snesla transport, nesmí však být hrubá. Nejvhodnější je slupka srostlá s dužninou (mesokarpem). Nižší počet semen a jejich menší velikost jsou výhodné. Upřednostňují se bezsemenné bobule, ale rudimenty nesmí být hořké chuti (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998, upraveno). 3.3 Bezsemennost révy vinné a její konfrontace s bezsemenností u modelových rostlin Získání bezsemenných plodů je fyziologicky ovlivnitelný proces. Vývin plodů se skládá z raného vývinu a zrání. Normální raný vývin plodu u většiny rostlin zahrnuje 3 fáze: nasazení plodu, dělení buněk a zvětšování se buněk (GILLASPY et al., 1993). 26

První fáze je rozhodující pro další vývin semeníku, který buď abortuje nebo pokračuje ve vývinu. Druhou fázi představuje růst plodu v důsledku dělení buněk. Počet buněk je rozhodující pro konečnou velikost plodu a protože dělící se buňky jsou malé a nacházejí se těsně vedle sebe, zvětšování se plodu v této fázi je malé. Třetí fáze se začíná po skončení dělení buněk a růst plodu je výsledkem zvětšování se buněk, který takto dosahuje svoji konečnou velikost. V této fázi většinou dochází až k stonásobnému zvětšení se velikosti plodu a tato fáze nejvíce ovlivňuje konečnou velikost plodu. Výsledkem raného vývinu u většiny druhů je zelený plod, který vykazuje velikost zralého plodu a jeho vývoj dále pokračuje do fáze zrání. Bobule révy vinné částečně narůstá i po raném vývinu, po zaměkání bobulí (BÉNYEI et al., 1999). Během raného vývinu plodu existuje mnoho signálních drah mezi sporofytem a gametofytem a všeobecně je známé, že nasazení plodu závisí od úspěšného opylení a oplození. Pyl produkuje gibereliny a je známé, že aplikace exogenních giberelinů u neopylených květů rajčete může vyvolat nárůst obsahu auxinu v semeníku (SASTRY a MUIR, 1963) a tím vést k nasazení plodů bez oplození. Vyvíjející se embryo dále kontroluje buněčné dělení v pletivu plodu (GILLASPY et al., 1993) a je známé, že počet vyvíjejících se semen ovlivňuje konečnou velikost a hmotnost plodu, a to prostřednictvím podpory zvětšování se buněk plodu produkcí auxinu a jiných neznámých látek. Vývíjející se semeno je tedy velmi důležitým komponentem raného vývinu plodu a produkce bezsemenných plodů je velmi komplikovanou záležitostí. Nicméně bezsemennost není neznámým jevem mezi kulturními druhy a u vybraných druhů existuje již několik tisíciletí (MÜLLER-THURGAU, 1898). Bezsemenné hrozny jsou vyhledávaným ovocem mezi konzumenty (PIVA et al., 2006). Šlechtění na bezsemenné stolní odrůdy s velkými bobulemi bylo započato na začátku 20. století, a to využitím bezsemenných nebo zakrnělá semena tvořících (a tímto malé bobule vykazujících) odrůd, které byly pěstovány od pradávných časů a byly určeny na výrobu rozinek (SLATE et al., 1962). Od té doby bezsemenné stolní odrůdy celosvětově tvoří významnou část sortimentu stolních odrůd (PERL et al., 2000). Tyto odrůdy disponují většinou středně velkými bobulemi a postupně vystřídají semenné odrůdy o středně velké velikosti bobulí. A skutečně, na trzích se stolními hrozny ze semenných odrůd jsou 27

všeobecně uznanými a vyhledávanými jen ty, které jsou úhledné a mají velmi veliké bobule a řídké hrozny (Red Globe, Afus Ali, Italia) (KORPÁS, 2006, 2007). Mnoho bezsemenných stolních odrůd o malé i středné velikosti bobulí velmi dobře reaguje na postřik giberelinem při kvetení a takto získá velikou hmotnost bobulí (PERL et al., 2003). Ošetření giberelinem dává dále vznik řidším hroznům i velmi zakrnělým semenům, která jsou také žádoucí. Ošetření giberelinem v nesprávné době nebo o nevhodnou koncentraci naproti tomu způsobuje sprchávání květenství nebo naopak příliš husté hrozny, tedy netržní produkty (MAVRIKIOS, 1977). Ošetření giberelinem dále představuje postřik(y) navíc. Dokonce v případě ošetření celé listové plochy keře z důvodu posunu diferenciace květenství směrem k tvorbě úponků (BOSS a THOMAS, 2002) významně může poklesnout výška úrody v následujícím roku (COELHO DE SOUZA LEÃO, 2003). Majíc toto na zřeteli, na četných místech světa vznikly důležité šlechtitelské programy, které si vytyčily za cíl vyšlechtění bezsemenných stolních odrůd disponujících velkými bobulemi i bez aplikace giberelinu (BRANAS a TRUEL, 1965; PERL et al., 2000; KORPÁS, 2006). Toto se jevilo tím spíš pravděpodobným, protože réva vinná in natura disponuje bezsemenností dvojího typu, partenokarpií a stenospermokarpií (STOUT, 1936; PRATT, 1971; COLOVA-TSOLOVA et al., 2003). S pokrokem v oblasti molekulární biologie se pak naskytly i jiné přístupy ve šlechtění na bezsemennost, a to triploidní odrůdy (YAMASHITA et al., 1998; MORINAGA, 2001; ZHAO a GUO, 2004) a odrůdy geneticky modifikované (PERL et al., 2000; COLOVA-TSOLOVA et al., 2003; PERL et al., 2003). 3.3.1 Partenokarpie u révy vinné Tvorba partenokarpických bobulí u révy vinné, která je charakteristická pro skupinu Korintských odrůd, je známým a popsaným jevem, během kterého úplně bezsemenné bobule vznikají po opylení, ale bez oplození (COLOVA-TSOLOVA et al., 2003). Z důvodu jejich malé velikosti bobulí, ale hlavně proto, že se v jejich křížení ani v první, ani v druhé generaci nevyskytli bezsemenní jedinci (SLATE et al., 1962), odrůdy mající výlučně partenokarpické bobule nebyly použity ve šlechtění stolních odrůd na bezsemennost. 28

3.3.2 Stenospermokarpie u révy vinné Tvorba stenospermokarpických bobulí u révy vinné ve srovnání s partenokarpickými bobulemi vykazuje větší velikost bobulí. Zde po normálním dvojitém oplození dojde k odumření embrya nebo/i endospermu a v důsledku toho vyvíjející se semena zůstanou zakrnělá (STOUT, 1936; PRATT, 1971; COLOVA-TSOLOVA et al., 2003). Stenospermokarpie je charakteristická pro (z hlediska vlastností bobulí) barevně i tvarově rozmanitou skupinu odrůd Sultaniny (např. Kišmiš rozovyj (=Pink Sultana), Kišmiš čornyj (=Black Monukka) a Thompson seedless). Protože skupina odrůd Sultaniny disponuje větší velikostí bobulí, stala se předmětem intenzivního šlechtění založeného na křížení (BRANAS a TRUEL, 1965; PERL et al., 2000; KORPÁS, 2006). 3.3.3 Triploidní a geneticky modifikované odrůdy révy vinné Z důvodu výše uvedené komplexity tvorby stenospermokarpických bobulí se s pokrokem v oblasti molekulární biologie naskytly i jiné přístupy ve šlechtění na bezsemennost, a to triploidní odrůdy (YAMASHITA et al., 1998; MORINAGA, 2001; ZHAO a GUO, 2004) a odrůdy geneticky modifikované (PERL et al., 2000; COLOVA-TSOLOVA et al., 2003; PERL et al., 2003). Z těchto pak triploidní odrůdy získané z recipročních křížení tetraploidních odrůd s odrůdami diploidními jsou preferovány. 3.3.4 Bezsemennost u modelových rostlin Vývin semen krytosemenných rostlin je komplexním procesem skládajícím se z mnoha regulovaných kroků. Ačkoliv stenospermokarpické bezsemenné bobule révy vinné díky jejich lepší konzumní kvalitě jsou ceněny konzumenty, málo je známo o vývinu semen na molekulární úrovni. Nedávno však bylo identifikovaných několik genů ovlivňujících vývin semen u modelových druhů jako Arabidopsis (RUUSKA et al., 2002; FAIT et al., 2006) a kukuřice (CONSONNI et al., 2005). 29

3.4 Stenospermokarpie a její využití ve šlechtění révy na bezsemennost Stenospermokarpie je nejvýznamnější formou bezsemennosti u révy vinné, která dává vznik komerčně i šlechtitelsky úspěšným odrůdám. Ale sladění bezsemennosti s velkými bobulemi není jednoduchým úkolem. Vlastnosti stenospermokarpických, zakrnělých semen: hmotnost semen, přítomnost endospermu, tvrdost testy se projevují jako kvantitativní znaky (STRIEM et al., 1992; DOLIGEZ et al., 2002; MEJÍA et al., 2007). Mezi semenáči lze očekávat výskyt četných typů, a to od jedinců s měkkými semeny o mizivé hmotnosti, bez endospermu a se zelenou testou, která nejsou odpuzující pro konzumenty až po jedince s tvrdými semeny o hmotnosti přibližně 40-50 mg, bez endospermu a s hnědou testou, která v normálních podmínkách nejsou schopna klíčení, ale jsou registrována konzumenty. Z důvodu jejich trpké chuti pro konzumenty jsou zvláště nepříjemná jen trochu sklerifikovaná semena, která lze lehce rozkousnout a která tím dále znesnadňují selekční proces (KORPÁS, 2006, 2007). Co se týká genetického pozadí tvorby stenospermokarpických bobulí, podle aktuálně přijatého modelu při vzniku tohoto znaku mohou účinkovat 3 na sobě nezávisle se dědící recesivní geny, regulované jedním dominantním genem sdi (seed development Inhibitor (inhibitor vývinu semen)) (BOUQUET a DANGLOT, 1996). Tento model nejen bere v úvahu fakt, že díky mutacím se bezsemennost může přeměnit v semennost i opačně (KRIMBAS, 1933; LOOMIS a WEINBERGER, 1979), ale vysvětluje i případy, u kterých dřívější modely založené buď na recesivních (WEINBERGER a HARMON, 1964; CONSTANTINESCU et al., 1972; DUDNIK a MOLIVER, 1976; BOZHINOVA-BONEVA 1978; LOOMIS a WEINBERGER, 1979; POSPÍŠILOVÁ a PÁLENÍK, 1988; SPIEGEL-ROY et al., 1990a) nebo dominantních genech (STOUT, 1937, 1939; KHACHATRYAN a MARTIROSYAN, 1971; LEDBETTER a BURGOS, 1994; SATO et al., 1994) selhávaly. Dědičnost založená na recesivních genech totiž nevysvětluje přítomnost semenných fenotypů v potomstvech z křížení 2 bezsemenných odrůd nebo ze samoopylení bezsemenných odrůd (BARLASS et al., 1988; RAMMING et al., 1990; SPIEGEL-ROY et al., 1990b), ani nepřítomnost bezsemenných fenotypů v potomstvech pocházejících ze samoopylení nebo křížení 2 semenných odrůd, které nemají bezsemenné rodiče. Dědičnost založená na dominantních genech zase nevysvětluje velmi nízká procenta bezsemenných fenotypů z křížení mezi semennými a bezsemennými odrůdami (WEINBERGER a HARMON, 30

1964), ani přítomnost bezsemenných fenotypů v potomstvech pocházejících ze samoopylení semenných odrůd, majících bezsemenné odrůdy ve svým rodokmenu (LOOMIS a WEINBERGER, 1979). Přitom rozmnožování krytosemenných rostlin lze charakterizovat 5 etapami vývoje, a to diploidním sporofytem, haploidním samičím gametofytem, haploidním samčím gametofytem, vyvíjejícím se diploidním embryem a vyvíjejícím se triploidním endospermem a je potřebné si uvědomit, že vývoj zárodečného vaku i semene je pod vlivem jak sporofytu, tak i samičího gametofytu (ZHANG et al., 2004). Toto komplexní genetické pozadí, které usměrňuje vývoj semene je dále rozšiřováno o vliv samčího gametofytu i sporofytické vlivy působící po oplození (EVANS a KERMICLE, 2001). Molekulární a buněčné mechanismy dávající vznik stenospermokarpické bezsemennosti u révy vinné nejsou známé. Teprve nedávno se uskutečnila identifikace rozdílně regulovaných genů během vývinu květenství mezi odrůdami Thompson seedless a jejím semenným mutantem Thompson seeded, a to subtraktivní hybridizací (DIATCHENKO et al., 1996) (HANANIA et al., 2007). Jedným z genů, které byly rozdílně exprimovány mezi 2 odrůdami byl chloroplastový chaperonin 21 (ch-cpn21). ch-cpn21 je kochaperoninovým polypeptidem o 21 kda a skládá se ze 2 vedle sebe uspořádaných, GroES připomínajících domén. Inaktivace ch-cpn21 v tabáku Nicotiana benthamiana Domin vedla k zaostávání listů v růstu, chlorozi a nekrogenezi semeníku a následně k zastavení vývinu semen. Dále, specifická inaktivace ch-cpn21 jen v plodech rajčete Lycopersicon esculentum Mill. dávala vznik bezsemenným rajčetům. Toto naznačuje, že ch-cpn21 může hrát významnou roli v stenospermokarpické bezsemennosti révy vinné (HANANIA et al., 2007). Protože bezsemennost je pozdě exprimovaným znakem v životném cyklu rostliny, značná úsilí byla vložena do identifikace molekulárních markrů vázaných na geny zodpovědné za bezsemennost. Tři molekulární markry založené na amplifikovaném úseku charakterizovaném sekvencí (sequence-characterised amplified region (SCAR) markers), odvozené od molekulárních markrů RAPD, SCC8 (LAHOGUE et al., 1998), SCP18 (ADAM-BLONDON et al., 2001) a SCF27 (MEJÍA a HINRICHSEN, 2003), vázané na předpokládaný major lokus, sdi, byly publikovány. Tyto molekulární markry byly získány pomocí analýz segregujících skupin (bulked segregant analysis (BSA) (MICHELMORE et al., 1991)) u potomstev z křížení dvou částečně bezsemenných genotypů. Širší genetické pozadí tvořené několika světoznámými a nově vyšlechtěnými odrůdami však udělalo z 31

SCP18 nepoužitelný molekulární marker a naproti tomu ověřil použitelnost SCC8 alespoň v kříženích mezi dvěmi bezsemennými genotypy (ADAM-BLONDON et al. 2001). SCF27 nebyl testován v širším genetickém pozadí. Genetické studie kvantitativních znaků u révy vinné byly nedávo značně usnadněny pokrokem v oblasti molekulárních markrů a genetických map. Byly vytvořeny předběžné výsledky detekce lokusů kvantitativních znaků (quantitative trait locus (QTL)) pro velikost bobulí a bezsemennost (DOLIGEZ et al., 2002; FISCHER et al., 2004; FANIZZA et al., 2005; CABEZAS et al., 2006; MEJÍA et al., 2007; COSTANTINI et al., 2008). Všechny studie zabývající se bezsemenností (DOLIGEZ et al. 2002; CABEZAS et al. 2006; MEJÍA et al. 2007; COSTANTINI et al. 2008) potvrdily existenci jednoho QTL s velikým efektem, ovlivňujícího hmotnost jak semen, tak i bobulí na vazebné skupině 18 (linkage group 18 (LG18)) (definovaná v RIAZ et al., 2004; ADAM-BLONDON et al., 2004), který je shodný s genem sdi pro bezsemennost (COSTANTINI et al., 2008). CABEZAS et al. (2006) podal zprávu o dvou mikrosatelitních lokusech, VMC7f2 (PELLERONE et al., 2001) a VMC6F11 (ARROYO-GARCÍA a MARTÍNEZ-ZAPATER, 2004), které jsou v těsné vazbě s týmto QTL s velikým efektem. VMC7f2 byl identifikován jako užitečný molekulární marker pro selekci na bezsemennost. Teprve zcela nedávno identifikoval COSTANTINI et al. (2008) genomické styčníky (genomic contigs) odrůdy Pinot noir (VELASCO et al., 2007) s molekulárními markry založenými na opakování jednoduchých sekvencí (simple sequence repeat (SSR) markers) a vázanými na QTL-y pro znaky spojené s bobulí a fenologií. Dva geny byly předpovězeny v blízkosti VMC7f2, ten bližší kódující pro MADSbox protein 5 (Vitis vinifera, AAM21345). Je zajímavé, že tento byl nejmenším proteinem, který byl identifikován v této studii a skládal se jen z 85 aminokyselin. Dále, v souladu s ranějšími studiemi (DOLIGEZ et al., 2002; CABEZAS et al., 2006; MEJÍA et al., 2007) a posilujíc model od BOUQUET a DANGLOT (1996), byla podána zpráva o několika jiných QTL s malým efektem pro dílčí znaky bezsemennosti (COSTANTINI et al., 2008). Přes skutečnost, že identita těchto QTL s malým efektem je značně ovlivněna nízkými počty jedinců v potomstvech a omezeními dvoucestní pseudo-testcross mapovací strategie (twoway pseudo-testcross mapping strategy) (GRATTAPAGLIA a SEDEROFF, 1994), zdá se, že další lokusy na LG 2, 10 a 15 (definované v RIAZ et al., 2004; ADAM-BLONDON et al., 2004) jsou zapojené do kontroly bezsemennosti (COSTANTINI et al., 2008). Počet bezsemenných jedinců v potomstvech pocházejících z tradičních křížení semenných mateřských odrůd s bezsemennými odrůdami je nízký, většinou se pohybuje 32

mezi 10-30% (LOOMIS a WEINBERGER, 1979). Protože bezsemennost je jen jediným sice na předním místě se nacházejícím znakem pro novou odrůdu (PERL et al., 2000; PIVA et al., 2006), k tvorbě semenáčů, vynikajících ve více znacích, jsou k zapotřebí potomstva o veliké počty semenáčů. Největší nevýhodou těchto křížení však lze označit nemožnost přímé kombinace dvou bezsemenných genotypů. Získání rostlin z křížení dvou bezsemenných odrůd se povedlo v podmínkách in vitro až v 80-tých letech 20. století, a to buď přímým klíčením zakrnělých, nezralých semen, anebo následnou kultivací nevyvinutých embryí (CAIN et al., 1983; EMERSHAD a RAMMING, 1984; SPIEGEL-ROY et al., 1985; GOLDY a AMBORN, 1987; GRAY et al., 1987; BOUQUET a DAVIS, 1989). Úspěšnost explantátové kultury závisí hlavně na typu bezsemennosti mateřské odrůdy, jako i na správném termínu založení kultury (BOUQUET a DAVIS, 1989; PONCE et al., 2000). Ačkoli explantátové kultury jsou časově i pracovně velmi náročné, počet bezsemenných jedinců v takto získaných potomstvech vzrostl na 70-80% (BOUQUET a DANGLOT, 1996). 3.5 Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění révy na bezsemennost Historie explantátových kultur u rostlin bude brzy stoletá. Rané pokusy o založení kultury byly neúspěšné: izolovaná pletiva nepřežila více než několik týdnů (HABERLANDT, 1902). Zatímco Haberlandtovy techniky byly úspěšně použity u živočišných tkání (CARREL, 1912), na úspěch u rostlin se muselo počkat více než 30 let (GAUTHERET, 1934; WHITE, 1934). V druhé polovině 20. století pak došlo k výrazné intenzifikaci výzkumu v oblasti explantátových kultur u rostlin. Byla demonstrována důležitá role rostlinných hormonů, hlavně však vztah mezi morfogenezí a rovnováhou dvou klíčových fytohormonů, auxinu a cytokininu (SKOOG a MILLER, 1957), byla popsána tvorba somatických embryí z protoplastů mrkve (Daucus carota L.) (STEWARD et al., 1958) a konečně, úspěšnou regenerací rostlin ze suspenzí buněk tabáku (Nicotiana tabacum L.) byl prokázán fenomén totipotence rostlinné buňky (VASIL a HILDEBRANDT, 1965). Explantátové kultury významně obohatily naše základné znalosti v oblasti rostlinné biologie od úrovně buněčné (např. metabolismus, diferenciace) až po úroveň rostlinnou 33

(např. organogeneze, hostitelsko-parazitické vztahy) a poskytly důležité základy pro výzkum v mnoha směrech. Z prvních agronomicky významných využití lze vzpomenout ozdravení viry infikovaných rostlin (MOREL a MARTIN, 1952), technika která je dnes všeobecně užívána při mikropropagaci zahradnických plodin. Úspěšné explantátové kultury také dávaly vznik nekonvenčním metodám ve šlechtění. Byly získány geneticky čisté linie dihaploidních rostlin z pylu datury (GUHA a MAHESHWARI, 1964), povedlo se regenerace rostlin tabáku (Nicotiana tabacum L.) z protoplastů (TAKEBE et al., 1971) a na základě manipulace DNA in vitro byly na světě geneticky modifikované rostliny (HERRERA-ESTRELLA et al., 1983). První úspěšný pokus o kultivaci pletiv révy vinné (Vitis vinifera L.) nastal ve čtyřicátých letech 20. století při hledání metody společné kultivace révy s plísní révovou (Plasmopara viticola) (MOREL, 1941). K použití termoterapie v podmínkách in vitro s účelem eliminace roncetu révy, nejzávažnějšího virového onemocnění u révy došlo v šedesátých letech 20. století (GALZY, 1961; GIFFORD a HEWITT, 1961). Později tato metoda byla vylepšena zavedením mikroroubování in vitro (BASS et al., 1978). Od začátku šedesátých let 20. století réva byla předmětem výzkumu s cílem určení nejlepších metod pro mikropropagaci. První metodu představovala nodální kultura, která byla založena na produkci jedné zakořeněné rostliny z jednoho nodálního explantátu (GALZY, 1969). Zvýšení efektivnosti mikropropagace bylo později docíleno stimulací proliferace axilárních pupenů, a to vyššími dávkami cytokininů (JONA a WEBB, 1978). Po úspěšném získání rostlin z diferencovaných i nediferencovaných pletiv formou somatické embryogeneze i adventivní organogeneze v sedmdesátých letech 20. století (MULLINS a SRINIVASAN, 1976; FAVRE, 1977), v devadesátých letech 20. století použitím transformace pomocí baktérie Agrobacterium tumefaciens Smith a Townsend byly získány nechimérické transgenní rostliny exprimující reportérový gen GUS (MULLINS et al., 1990) a následně pak rostliny exprimující gen agronomického významu (LE GALL et al., 1994). Přesto, že první úspěšná izolace protoplastů u révy byla publikována v sedmdesátých letech 20. století (BENBADIS a BAUMANN, 1973), révové protoplasty až na některé výjimky (REUSTLE et al., 1995; ZHU et al., 1997) zůstávají stále rekalcitrantní, tj. chybí u nich buď proliferace buněk nebo jejich morfogenická odpověď. Technika preparace embryí, poprvé použitá v osmdesátých letech 20. století (CAIN et al., 1983), byla postupně zdokonalována a nyní slouží k získání vylepšených odrůd (TORREGROSA et al., 2001) (Tab. I). 34

Tabulka I: Srovnání úspěšnosti explantátové kultivace stenospermických semen u révy vinné Autoři Rok publikace Způsob kultivace / místo / nejúspěšnější křížení Klíčení [%] Cain et al. 1983 C35-33 38,0 Získané rostliny [%] Thompson seedless SP 0* Black Monukka SP 0* Arkansas 1105 OP 45,7* Emershad a Ramming 1984 Thompson seedless 0,28*** Goldy a Amborn 1987 jako Emershad a Ramming (1984) / Venus OP 45,0 Gray et al. 1987 tuhé médium / Orlando seedless SP 27,9 22,8 tekuté médium / Orlando seedless Arkansas 1105 2,5 1,7 Bouquet a Davis 1989 Perlette? 6,8* 71,4** INRA Mpt 2223-8? 34,6* 25,9** Montpellier 8,1*** 36,7** Fresno (BARLASS et al., 1988) 7,2*** 31,0** Merbein 5,8*** 34,8** Emershad et al. 1989 Thompson seedless? 5,0*** 89,4** Fernandez et al. 1991 preparace embryí / Venus Saturn 67,0 33,0 PSS 15,0 0,0 CSS 0,0 0,0 Gribaudo et al. 1993 médium A / Carina OP 15,3 médium B / Carina OP 13,4 Burger a Trautmann 2000 PSS / Flame seedless > 50* > 70**** * preparace embryí, % embryí; ** preparace embryí, % klíčení z embryí; *** preparace embryí, % klíčení z kultivovaných semen; **** přímé klíčení, % klíčení z embryí 3.5.1 Fyziologická charakteristika explantátových kultur Ačkoliv záměrem výzkumu v oblasti explantátových kultur je napodobení přirozených růstových podmínek, je potřebné zvažovat mnoho faktorů, výsledkem kterých 35

v porovnání s podmínkami ex vitro explantáty vykazují radikálně odlišné formy vývinu (TORREGROSA et al., 2001): - Explantátové kultury často představují redukci genotypu na jednotlivé orgány nebo pletiva, u kterých, aby přežily a tvořily nová pletiva, musí docházet k množení buněk. Následně v explantátu jsou značně modifikované buněčné a orgánové interakce, které normálně mají pod kontrolou růst a morfogenezi celistvého organizmu. - Tradiční signální dráhy i dráhy látkové výměny jsou pozměněny, což vede k novým chemickým i fyzikálním tokům jednak v explantátu, jednak mezi explantátem a jeho okolím. - Redukovaný prostor představuje nové environmentální podmínky, hlavně z hlediska intenzity světla. Vysoká vzdušná vlhkost kombinovaná s abnormalitou stomat má za následek omezení toku rostlinné šťávy. Protože nízká intenzita světla a nízká přístupnost oxidu uhličitého omezuje fotosyntézu a pozměňuje různé aspekty metabolizmu, je nutné pro explantáty dávkovat sacharidy a jiné organické sloučeniny (vitamíny, aminokyseliny). - Aby izolované orgány a buňky zůstaly při životě, kultivační médium musí vykazovat speciální hormonální profily. Vývin explantátu a kontrola morfogeneze vyžadují modifikace hormonální rovnováhy pomocí syntetických i nativních regulátorů rostlinného růstu. Reorientace pletiv ústí ve fyziologické i morfologické změny (miniaturizace, obnova juvenility), při kterých některé vlastnosti, když už jednou zakotvené, jsou téměř irreverzibilní. - Striktní podmínky fyziologického reprogramování kombinované s absencí nebo redukcí interakcí mezi jednotlivými orgány představují příznivé podmínky pro vznik genotypových nebo fenotypových změn. Z důvodu vysokého stupně proliferace u explantátových kultur tyto odchylky se mohou objevit ve významné míře. Axilární pupeny u révy se skládají ze dvou typů laterálních meristémových struktur: z letního a zimního pupenu a shodně s podmínkami ex vitro, i v podmínkách in vitro vyrůstá dormanci nevyžadující letní pupen jako první (FOURNIOUX, 1995). Přestože tyto letní pupeny nevyžadují dormanci, u určitého procenta explantátů dochází ke stagnaci vývinu, což vyžaduje větší počet explantátů v kultivaci. Tato stagnace vývinu přitom není 36

vnitřní vlastností pupenů, spíš je výsledkem nedostatku translokace sacharidů a vody uvnitř explantátu (GUERRIER-JULIEN et al., 1996). Užitečným se jevil přídavek sacharidů s účelem stimulace vývinu rostlin pěstovaných v omezených podmínkách (GALZY, 1969). Sacharidy jsou všeobecně použity jako sacharosa, ale i ostatné formy mohou být užitečné. Většina sacharosy je během kultivace hydrolyzována na fruktosu a glukosu. Spotřeba sacharidů rostlinami je ale nezávislá na počáteční koncentraci sacharosy (3, 8, nebo 15 g.l -1 ) a ve všech případech po čtyřměsíční kultivaci představuje méně než 2 g.l -1 (GALZY et al., 1990). Počáteční koncentrace sacharosy je však v pozitivní korelaci s celkovým množstvím sušiny i růstem kořenů. V podmínkách volné výměny plynů jsou in vitro fotosyntéza i dýchání významné a odpovídají hladinám oxidu uhličitého (LIMA DA SILVA et al., 1996). Přitom, ačkoliv sacharosa média je kompletně hydrolyzována, nedochází k metabolizaci sacharidů z média rostlinami. Co se vlivu intenzity světla a koncentrace oxidu uhličitého na fungování stomat, fixaci oxidu uhličitého i fotorespiraci dotýká, lze konstatovat, že stomata vykazují schopnost přizpůsobit jejich otevírání ke změnám v intenzitě světla, ale nejsou schopny úplného zavírání za tmy (DÜRING a HARST, 1996). Nicméně fotosyntetická produkce je pozitivně ovlivněna intenzitou světla i koncentrací oxidu uhličitého a intenzita fotorespirace je v záporné korelaci s koncentrací oxidu uhličitého. Tyto poznatky jasně naznačují, že slabá úroveň fotosyntézy rostlin je výsledkem nedostatku světla a/nebo oxidu uhličitého. Shodně s výše uvedenými, dávkování oxidu uhličitého za nízké intenzity světla vede ke snížení intenzity růstu, a to díky inhibici fotorespirace a snížení přísunu energie (FOURNIOUX a BESSIS, 1986). Závisle na kultivačních podmínkách, významná část energie má tedy být zajištěna přídavkem sacharidů do kultivačního média. Tato mixotrofická forma uhlíkové výživy však vyžaduje adekvátní přísun kyslíku (GALZY a COMPAN, 1992). Následně vlastnosti výměny kyslíku a oxidu uhličitého mohou významně ovlivnit růst a vývin kultivovaných rostlin. Pro udržení růstu v podmínkách, ve kterých není možné kontrolovat složení plynů a intenzitu světla, nejlepší volbou se jeví podpora výměny vzduchu uvnitř kultivační nádoby, a to zvýšením prosakování vzduchu uzávěru (THOMAS, 1999). Mezi plynnými složkami kultivační nádoby etylen zaujímá důležité postavení. Jako regulátor rostlinného růstu a diferenciace, v závislosti na rostlinném druhu, buď stimuluje nebo inhibuje morfogenezi (BIDDINGTONN, 1992). Ačkoliv vliv etylenu na révu je málo 37

prostudovaný, spíše se uvažuje o negativní korelaci mezi jeho hladinou uvnitř kultivační nádoby a vývinem explantátů (SOULIÉ et al., 1994). Rovněž málo se ví o účinku ostatných složek kultivačního média. Jelikož vitaminy mají významnou roli v metabolizmu, mají být součástí kultivačního média. Hlavně při vyšších teplotách a vyšší intenzitě růstu jsou nezbytnými komponenty (GALZY, 1969). Požadavky na anorganické sloučeniny jsou závislé na žádaném morfogenetickém účinku: silné koncentrace draslíku i dusíku podpoří růst nadzemních částí rostlin při současném brzdění růstu kořenů. Explantátové kultury u explantátů vyvolají určité anatomické i morfologické adaptace, ze kterých nejzřejmější je silná redukce velikosti jednotlivých orgánů. Redukce v diferenciaci pletiv je méně významná a nejzřetelněji se projevuje ve snížení tvrdosti orgánů díky nízké úrovni lignifikace. Explantáty vykazují vysoce pozměněné histologické uspořádání: ve srovnání s listy pocházejícími ze skleníkových prostorů, in vitro listy obsahují větší mezofylní buňky, větší mezibuněčné póry, méně chloroplastů a schází u nich tvorba normální palisádové vrstvy (DAMI a HUGHES, 1995). Pravděpodobně tato netypická anatomie listu je příčinou velké ztráty vody u listů odebraných z rostlin kultivovaných in vitro, a to při jejich vystavení suchému vzduchu. Co se stomatální a kutikulární transpirace týká, in vivo i in vitro rostliny vykazují podobné fyziologické charakteristiky (IACONO a MARTINELLI, 1998). Explantátové kultury vedou k modifikaci adultních charakteristik, tj. fylotaxe, uspořádání apikálních pupenů a morfologie listů (NOZERAN et al., 1983; GRENAN, 1984; FOURNIOUX, 1995). Hlavním rysem obnovené juvenility je snížení frekvence úponků a jejich atypické rozložení. Tvorba úponků, květenství a hroznů v podmínkách in vitro je extrémně zřídkavá a odrůdově specifická (FAVRE a GRENAN, 1979), což je významným omezením pro šlechtitelské aktivity. Stabilita adultních charakteristik je přitom závislá na trvání explantátové kultury: tvorba úponků, která je obvykle udržetelná během prvního roku kultury, druhým a třetím rokem kultury postupně klesá a naznačuje postupné obnovení juvenility (THOMAS, 1999). Za příčinu obnovení juvenility se považuje miniaturizace stonkových meristémů (NOZERAN a BANCILHON, 1972) nebo snížení vzdálenosti mezi apikálními pupeny a kořeny (MULLINS et al., 1979). Účast na obnovení juvenility mohou mít i endogenní polyaminy (MARTIN-TANGUY a CARRE, 1993; HELOIR et al., 1998). 38

Ačkoliv molekulární základ obnovení juvenility v podmínkách in vitro je málo vysvětlený, významné změny mohou nastat v metylaci DNA při založení a průběhu stonkové i kalusové kultury révy, s trváním některých metylačních značek přes jeden rok (HARDING et al., 1996). Tyto změny naznačují, že metylace DNA hraje významnou roli v modifikaci genové exprese během explantátové kultury a může souviset s obnovením juvenility. Přechod z juvenilního do adultního stádia po výsadbě není stejnoměrný. Morfologické změny vyvolané juvenilitou mohou být eliminovány použitím terminálních pupenů vykazujících určitý zpětný přechod do adultního stádia (GRENAN, 1984). Tato technika vyžaduje skleníkové prostory, kde rostliny vykazují vysokou intenzitu růstu. Zatímco obnovení juvenility je opakujícího se charakteru, somaklonální variabilitu (LARKIN a SCOWCROFT, 1981) lze charakterizovat nepředvídatelními modifikacemi. Výskyt somaklonálních variant je nižší mezi rostlinami pocházejícími z organizovaných meristémů než mezi rostlinami z regeneračních procesů. Neoformace skutečně zahrnuje stádia, ve kterých buňky jsou vysoce dediferencované, vykazují aktivní proliferaci a interakce mezi nimi jsou značně pozměněné. S účelem přesměřování buněčných programů dále kultivační média obsahují vysoké koncentrace regulátorů rostlinného růstu, hlavně 2,4-D, která může vyvolat genetické abnormality (VARGA et al., 1988; MURATA, 1989). Regulátory rostlinného růstu přímo mohou blokovat organizaci pletiv i jejich morfogenetické schopnosti. Výskyt vitrifikace, anomálie spojené s hyperhydricitou a nedostatkem lignifikace je všeobecně považovaný za nejzávažnější problém explantátových kultur (PHAN, 1991), i když odkazy na vitrifikaci u révy jsou zřídkavé. Vitrifikace révy se objevuje po několika cyklech axilárního rozvětvování, což naznačuje, že může být vyvolána vysokým obsahem cytokininů. Dále kultury kořenových vlásků častěji vykazují vitrifikaci, když kultivační médium je bohaté na minerály, které podněcují vysokou úroveň multiplikace buněk a zřejmě potlačují diferenciaci (TORREGROSA, 1994) (TORREGROSA et al., 2001). 39

4. ATLAS BEZSEMENNÝCH STOLNÍCH ODRŮD RÉVY VINNÉ 4.1 Úvod Bezsemenné hrozny jsou všeobecně oblíbeny mezi konzumenty. Tyto odrůdy však nelze najít v Listinách registrovaných odrůd jak ČR, tak SR. Lze to přisoudit teprve nedávné introdukci bezsemenných genotypů do sbírek střední Evropy. Pro srovnání: odrůda Sultanina pod synonymem Thompson seedless byla žádána v USA již koncem osmdesátých let 19. století, o prastaré kultivaci těchto odrůd v zemích Malé Asie ani nemluvě. Myšlenku využití stenospermokarpických odrůd pro přímý konzum však lze odvodit právě z obliby odrůdy Sultanina koncem 19. století v Americe a tady vznikly i první kříženci mezi semennými odrůdami jako mateřskými a odrůdou Sultanina jako otcovskou odrůdou. Došlo k definování stenospermokarpické bezsemennosti a k zjištění její chování z dnešního pohledu jako kvantitativního znaku. Práce STOUT-a (1936) je v tomto směru všeobecně platným základním dílem. Tato kapitola disertační práce se zabývá průzkumem bezsemenných odrůd, přitom přednost byla dána odrůdám, které jsou dostupné v našich sbírkách a osvědčily se z hlediska širokého pěstování či dalšího křížení. 4.2 Materiál a metody 4.2.1 Lokality průzkumu Atlas bezsemenných stolních odrůd révy vinné byl připraven na základě průzkumu odrůd nacházejících se na 8 lokalitách. Jedná se o následující výsadby stolních odrůd sbírkového a šlechtitelského charakteru, řazené podle počtu studovaných genotypů: - Ampelografická sbírka pod vedením Ing. Ondreje Korpáse, CSc. na PD Strekov na jižním Slovensku (Lokalita č. 1: 25 genotypů); - Ampelografické sbírky Dr. Lajose Sipose nedaleko města Pécs v jižním Maďarsku (Lokalita č. 2: 7 genotypů) a v Érd v severním Maďarsku (Lokalita č. 3: 2 genotypy); 40

- Ampelografická sbírka Výzkumného ústavu vinohradnického a vinařského v Pécs pod vedením Dr. Pála Kozmy v jižním Maďarsku (Lokalita č. 4: 7 genotypů); - Ampelografická sbírka Zahradnické fakulty v Lednici Mendelovy univerzity v Brně pod vedením Doc. Ing. Pavla Pavlouška, Ph.D. na jižní Moravě (Lokalita č. 5: 5 genotypů); - Ampelografická sbírka pod vedením Lubomíra Glose v Břeclavi na jižní Moravě (Lokalita č. 6: 4 genotypy); - Ampelografická sbírka Agronomické fakulty Georgikon Panónské univerzity v Keszthely, nacházející se v Cserszegtomaj pod vedením Dr. Lászla Kocsise v středním Maďarsku (Lokalita č. 7: 2 genotypy, včetně 1 nového šlechtění od Dr. Károlya Bakonyiho, jehož hrozen autor genotypu přenechal k rozboru při jiné příležitosti než při návštěvě sbírky); - Ampelografická sbírka firmy Lajkó&Lajkó v Dunaföldvár v středním Maďarsku (Lokalita č. 8: 1 genotyp). Atlas byl dále doplněn o odrůdy dostupné na našem trhu v zimním období (6 genotypů). Jak z výše uvedených vyplývá, nejvýznamnější lokalitou byla ampelografická sbírka pod vedením Ing. Ondreje Korpáse, CSc. na PD Strekov na jižním Slovensku. Níže je uveden její popis, který při zohlednění jejich geografické polohy je směrodatný i pro ostatní lokality. 4.2.2 Popis pokusného stanoviště Vinohradnické oblasti Slovenské republiky leží v jižní části jejího území v páse o délce téměř 500 km mezi 47 o 55 a 48 o 50 severní zeměpisné šířky a zabírají klimaticky nejteplejší oblasti Slovenska. Maximum ploch se nachází v regiónu západního Slovenska ca. 80 %, 13 % ploch v středoslovenském a zbytek necelých 8 % ve východoslovenském regiónu. Zákonem NR SR č. 332/1996 Z. z. o vinohradníctve a vinárstve bylo stanovených 6 vinohradnických oblastí s 40 vinohradnickými rajony. Jejich podrobnou charakteristiku včetně zatřídění vinohradnických obcí a vinohradnických tratí v nich v smysle platné 41

legislativy v EU (Nařízení Rady (ES) č. 1493/1999 o společné organizaci trhu s vínem) do B zóny kategorií B 1, B 2 a B 3 řeší Vyhláška MP SR č. 153/1998 Z. z. (ANONYMUS, 2003) (Tab. I v Příloze). 4.2.2.1 Popis klimatických poměrů, půdních podmínek a odrůdové skladby v Južnoslovenskej vinohradníckej oblasti Po klimatické stránce nejteplejší vinohradnickou oblastí Slovenska je Južnoslovenská vinohradnícka oblasť s průměrnou nadmořskou výškou 140 m nad mořem. Dlouhodobá průměrná teplota vzduchu je 9,9 o C za rok a 16,9 o C za vegetaci; v posledním desetiletí však tyto hodnoty pohybují kolem 10,35 o C, resp. 17,5 o C. Suma aktivních teplot 3100 o C a srážky 325 mm za vegetační období, tzn. 57 % celkových srážek za rok se slunečným svitem 1550 h za vegetaci tvoří kukuřičnou výrobní oblast, ve které je soustředěná převážná část produkce vín s přívlastkem (Tab. I, II a III v Příloze). Južnoslovenská vinohradnícka oblasť je založená na neogenních říčních usazeninách, které v okrajových oblastech Podunajské nížiny vytváří vyvýšené mírně zvlněné polohy říční terasy, na kterých se rozvíjí vinohradnická výroba. Půdy jsou lehké až středně těžké, bez skeletu, hluboké a výživné. Na nich je soustředěná téměř celá produkce stolních hroznů ve Slovenské republice. Pro pěstování révy se využívají chráněné svahové polohy, od vinohradnictví na rovinách se upouští. V regionu je jen málo ucelených vinohradnických tratí, využívají se vhodné polohy jednotlivě. Nejvíc pěstované a doporučené moštové odrůdy jsou Ryzlink vlašský, Veltlínské zelené, Ryzlink rýnský, Rulandské bílé, Chardonnay, Tramín červený, Rulandské modré, Cabernet Sauvignon a Frankovka; ze stolních odrůd se pěstuje hlavně Pannónia kincse, Guzal kara, Diamant, Dora, Opál, Rubanka a Onyx. 4.2.2.2 Popis výsadby stolních odrůd v trati Pántyú Výsadba stolních odrůd byla založena na tehdejším vysunutém pracovišti VÚVV v Bratislavě, na PD Strekov nacházejícím se v Južnoslovenskej vinohradníckej oblasti, Strekovskom vinohradníckom rajóne, vinohradnické obci Strekov / Kürt, v trati Pántyú, 42

a to na jaře v roce 1996 ve sponu 3 x 1,2 m, v různém počtu podle významnosti jednotlivých odrůd, většinou bez opakování odrůd. Byly zvoleny kvalitativní charakteristiky podporující podnož SO 4 a střední pěstitelský tvar rýnsko-hessenského vedení s jednotným řezem na jeden tažen a 1-2 zásobné čípky (Obr. 4 a 5 v Příloze), tj. zatížení 4-5 oček na m 2. Některé novější odrůdy byly namnoženy přeroubováním. Vinohrad je udržen včas provedenými agrotechnickými zásahy, a to podle principů integrované produkce s trvalou populací dravého roztoče Typhlodromus pyri, běžnou preventivní ochranou v oblasti houbových chorob, resp. škůdců a s přirozenou vegetací v každém druhém meziřadí, resp. herbicidním pásem pod keři, bez závlahy. Kondice vinohradu je na výborné úrovni. Sklizeň zdravých hroznů každoročně umožňuje posoudit odrůdový charakter hroznů, které vykazují vhodný poměr obsahových látek. Po klimatické stránce, v nadmořské výšce 220 m se nacházející trať Pántyú celkově odpovídá výše uvedenému popisu pro Južnoslovenskú vinohradnícku oblasť s tým, že se vyznačuje pro celý Strekovský vinohradnícky rajón charakteristickou vyšší roční průměrnou teplotou vzduchu a vyšší ariditou. Co se půdních podmínek týká, půda v trati Pántyú patří k typu středoevropské hnědozemi s dobrou úrodností půdy; převládají zde spraše na jílovitých a písčitých sedimentech neogénu s obsahem CaCO 3 do 5 %. V zemědělsky obdělávané půdě je svrchní vrstva tvořena ornicí, která vznikla ze dvou až tří horizontů bývalých lesních půd převážně hnědozemního typu. Ornice a zpravidla i podložní horizont (podorničí) má v tomto případě dalekosáhle pozměněné vlastnosti fyzikální i chemické, biochemické a mikrobiální. Je to vlastně antropogenně změněná půda druhotná. Vlivem obdělávání má orniční vrstva mírně zásaditou až neutrální reakci, zvýšené obsahy minerálních živin (CaO, K 2 O a P 2 O 5 ), snížený obsah humusu v rozmezí 1-2 %. Sorpční komplex je nasycen kationty Ca a Mg, humifikace probíhá velmi dobře. 4.2.3 Rostlinný materiál Vzhledem k tomu, že bezsemenné odrůdy u nás neuspokojovaly hlavně z důvodu jejich zvýšené citlivosti na pěstitelské prostředí, ale i malé velikosti bobulí a nízké úrodnosti v našich podmínkách jakými byly např. původní stenospermokarpický okruh odrůd Sultanina, Thompson seedless, Kišmiš rozovyj, Black Monukka, jako i 43

interspecifické odrůdy s malými bobulemi jako Interlaken, Remaily seedless atd., Ing. Ondrej Korpás, CSc. započal se shromážděním a výběrem bezsemenných odrůd vhodných pro naše ekologické podmínky s účelem jejich pěstování i dalšího šlechtění. Spolupráce hlavně s VÚVV v Bratislavě a Dr. Lajosem Siposem z Budapesti umožnila získání slibných genotypů, pro naše podmínky v relativně velkém počtu. Tato ampelografická sbírka od roku 2000 slouží i k tvorbě nových bezsemenných genotypů, a to na základě klasického křížení semenných genotypů s bezsemennými genotypy (KORPÁS, 2004, ústní sdělení). Tabulka I: Sledované genotypy podle jednotlivých lokalit a odrůdy zimního trhu Číslo lokality Sledované genotypy Carina, Dawn seedless, Edro bezseme, Elma, Flame seedless, Helios, Interlaken, Jupiter, Kišmiš lučistyj, Kišmiš moldavskij, Luna*, 1 Mars*, Merkúr, Neptún, Perletta, Picurka, Rosina, Rusalka 3, Slavjanka, Sunred seedless, Thompson seedless, Urán*, Urkim, Venus, Venuša 2 1/n, 2/m, 12/5, 12/6, Ilonka, T I/80, T II/70 3 Black Monukka, Reliance Beauty seedless, Centennial seedless, Helios, King's Ruby, Kišmiš 4 lučistyj, Kišmiš vatkana, Rusbol 5 Glenora, Interlaken, Perlon, Remaily seedless, Talisman* 6 BV-16-16-3, BV-16-17-4, BV-16-19-8, BV-16-20-2 7 Carolus, Sába királynője 8 Beogradska besemena Imperial seedless, Prime seedless + GIB, Red Globe*, Regal seedless, Zimní trh Sugraone, Thompson seedless + GIB Genotypy označené * obsahují při konzumu citelná semena. Tučně zvýrazněné genotypy byly kompletně zpracovány. Podobná motivace vedla i ostatních vinohradníků-pěstitelů-šlechtitelů při shromáždění a tvorbě bezsemenných genotypů, nicméně křížení 2 bezsemenných genotypů, vyžadující explantátovou laboratoř nebylo použito ani na jedné lokalitě. Místo hodnocení bezsemennosti jako speciálního znaku se soustředilo na pěstitelské hodnocení 44

odrůd, které po doplnění o poznatky o bezsemennosti, získané dle níže uvedených postupů, vytváří efektivní nástroj pro tvorbu nových bezsemenných genotypů pomocí explantátových kultur. Sledované genotypy podle jednotlivých lokalit a odrůdy zimního trhu uvádí Tabulka I. Pro srovnání vedle bezsemenných genotypů byly studovány i genotypy, které při konzumu obsahují citelná semena, a to buď z důvodu, že jsou semennými odrůdami (ve svém rodokmenu vykazujícími jen semenné odrůdy: Red Globe, Talisman, ale i odrůdy bezsemenné: Luna, Urán) anebo jsou stenospermokarpickými odrůdami s tvrdou testou semen, tedy jen fyziologicky bezsemennými odrůdami: Mars. 4.2.4 Zpracování položek atlasu Zpracování položek atlasu proběhlo hodnocením vybraných vlastností hroznů u jednotlivých genotypů: vlastních hroznů, velikosti bobulí, struktury bobulí a stenospermických semen, a to fotografováním, vážením, počítáním a statistickou analýzou. Většina genotypů byla zpracována v roce 2005; některé novější genotypy byly přidány v roce 2006, případně 2007. Jednotlivé ampelografické charakteristiky byly hodnoceny v době sklizně, při konzumní zralosti a vztahují se k 1 hroznu, který byl vybrán jako odrůdově typický pro daný genotyp. Každý genotyp byl zpracovaný jen jednou a nebyla sledována dynamika vybraných ampelografických charakteristik v jednotlivých ročnících. Vedle kompletně zpracovaných genotypů se vyskytly i genotypy, které z časových důvodů byly zpracovány jen částečně, a to hlavně u vzdálenějších lokalit. Byla snaha kompletně zpracovat genotypy z lokality č. 1, které z důvodu většího počtu keřů (desítky až stovky keřů) a tím s roztaženější dobou kvetení významně mohou posloužit v kříženích jako mateřské genotypy. 4.2.4.1 Hrozny Odrůdově typické hrozny byly fotografovány na jednotlivých lokalitách přímo ve vinicích. Potom hrozny byly zpracovány v laboratoři. V laboratoři byly fotografovány i hrozny dostupné na zimním trhu. 45

Hrozny 3 genotypů (Helios, Interlaken a Kišmiš lučistyj) byly fotografovány na jiných lokalitách (lokality č. 4, 5 a 4 v pořadí), než lokalita poskytující materiál pro ostatní vlastnosti (lokalita č. 1), což je patrné i z dvojího uvedení těchto genotypů v Tabulce I. Hustota a tvar hroznů nebyly bezprostředně zaznamenány, ale jsou dobře patrné z fotografií. 4.2.4.2 Velikost a hmotnost bobulí Z důvodu známé souvislosti mezi počtem semen a velikostí bobulí, největší bobule, které obsahují nejvíce semen a umožňují posoudit charakter bezsemennosti genotypu (RAMMING et al., 1990) nebyly vyloučeny z hodnocení, ale bylo dbáno i na normální rozdělění velikosti bobulí, což má velmi významný vliv při kříženích. Odrůdově typické bobule pocházející z jednoho hroznu byly fotografovány začátkem v terénu, pak v laboratoři, a to ve všech případech pokud to bylo možné a estetické 15 bobulí. Velikost bobulí nebyla bezprostředně měřena, ale k usnadnění jejího posoudění při fotografování bylo použito pravítko s přesností 0,5 mm. Výhoda fotografií spočívá i v tom, že vedle velikosti bobulí dobře zachycují i tvar a barvu bobulí. Jako mnohem použitelnější se jevilo vážení bobulí. Hmotnost bobulí byla získána v laboratoři použitím většinou 25 bobulí, které byly váženy jednotlivě s přesností 0,01 g. Pod pojmem hmotnost bobulí se rozumí průměrná hmotnost bobulí, vztahující se k 1 bobuli. 4.2.4.3 Struktura bobulí Odrůdově typické půlené bobule pocházející z jednoho hroznu byly fotografovány začátkem v terénu, pak v laboratoři, a to ve všech případech pokud to bylo možné a estetické 10 bobulí, uspořádaných po 2 jako 2 půlky vedle sebe v 5-ti řadách, bez pravítka. 46

4.2.4.4 Semena Odrůdově typická semena pocházející z bobulí z jednoho hroznu byly fotografovány začátkem v terénu, pak v laboratoři, a to většinou 15-20 semen. Velikost semen nebyla bezprostředně měřena, ale k usnadnění jejího posoudění při fotografování bylo použito pravítko s přesností 0,5 mm. Výhoda fotografií spočívá i v tom, že vedle velikosti semen dobře zachycují i tvar, barvu a vyzrálost semen. Jako mnohem použitelnější se jevilo vážení semen. Hmotnost semen byla získána v laboratoři použitím většinou 15-20, ale i méně i více semen, které byly váženy hromadně s přesností 0,01 mg. Pod pojmem hmotnost semen se rozumí průměrná hmotnost semen použitelných pro explantátové kultury, vztahující se k 1 semenu. Počet semen byl zjištěn počítáním semen v 1 bobuli (použitelných pro explantátové kultury), a to většinou u 10, ale i méně i více bobulí. Pod pojmem počet semen se rozumí průměrný počet semen v 1 bobuli, použitelných pro explantátové kultury, který je vyjádřen s přesností 0,1 semen. Pod pojmem celková hmotnost semen se rozumí násobek hmotnosti semen a počtu semen, která se tedy vztahuje k 1 bobuli. U některých odrůd se vyskytly i semena méně vhodná nebo nevhodná pro explantátové kultury, s výrazně nižží hmotností než hmotnost semen vhodných pro explantátové kultury. Protože tato semena také přispívají k velikosti bobule, na základě výše popsaných byl stanoven jejich počet v bobulích a jejich hmotnost, násobkem kterých pak jejich celková hmotnost a u těchto odrůd celková hmotnost semen byla navýšena o tuto hmotnost. 4.3 Výsledky Atlas bezsemenných stolních odrůd révy vinné byl připraven na základě průzkumu odrůd pro explantátové kultury. Jako specifický nástroj sloužící k usnadnění zygotické embryogeneze z nezralých stenospermických semen stolních odrůd révy vinné, obsahuje vyobrazení hroznů, velikosti a struktury bobulí a stenospermických semen, tedy nejdůležitějších vlastností stolních odrůd révy vinné. Pro vlastní zygotickou embryogenezi poslouží hlavně hmotnost semen, která významně ovlivňuje úspěšnost kultury. 47

Atlas byl připraven v jazycích HTML a Javascript, testován pro prohlížeč Internet Explorer a je přístupný na kompaktním disku nebo na internetu na stránkách Ústavu vinohradnictví a vinařství Zahradnické fakulty v Lednici Mendelovy univerzity v Brně na adrese: http://tilia.zf.mendelu.cz/ustavy/556/ustav_556/atlas_bezsem_reva. Vedle této elektronické verze, která je přiložena k disertační práci na kompaktním disku, v Příloze A lze najít i tištěnou podobu atlasu, sestavenou na základě elektronické verze. Níže jsou uvedeny statisticky zpracované vlastnosti zkoumaných odrůd. Tabulka II uvádí hmotnost jednotlivých bobulí, počet semen v bobuli a hmotnost jednotlivých semen u zkoumaných odrůd. Tabulka III uvádí celkovou hmotnost semen v bobuli u zkoumaných odrůd. Jak je to patrné z Obrázků 1 a 2, sestavených na základě Tabulek II a III a ukazujících závislost mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí u zkoumaných odrůd, zkoumaný soubor odrůd je značně heterogenní. 48

Tabulka II: Hmotnost jednotlivých bobulí, počet semen v bobuli a hmotnost jednotlivých semen u zkoumaných odrůd No. Odrůda Hmotnost bobulí* Počet semen v bobuli* Hmotnost semen* n m b [g] s b [g] v b [%] n n s1 s s1 v s1 [%] n s2 s s2 v s2 [%] n' m s1 [mg] n' m s2 [mg] 1 1/n 4 4,71 0,39 8 7 2,4 1,0 42 17 10,09 2 2/m 4 3,51 0,14 4 4 4,0 0,0 0 16 22,05 3 12/5 4 5,16 0,93 18 4 2,0 0,0 0 8 45,91 4 12/6 4 4,75 0,58 12 4 4,0 0,0 0 16 22,19 5 Black Monukka 25 2,35 0,40 17 6 2,5 0,5 20 14 3,64 6 BV 16-16-3 25 4,07 0,90 22 10 0,8 0,4 50 0,4 0,5 125 10 17,09 5 2,36 7 BV 16-20-2 25 2,62 0,43 16 10 0,8 0,4 53 0,9 0,4 47 7 6,24 8 1,05 8 Carina 20 1,57 0,20 13 9 3,0 0,9 30 15 2,75 9 Carolus 20 1,90 0,21 11 5 4,0 0,0 0 15 0,88 10 Dawn seedless 25 4,81 0,76 16 15 2,7 0,9 33 18 8,57 11 Edro bezseme 25 6,17 0,99 16 11 2,5 0,7 28 27 6,36 12 Elma 25 3,74 0,56 15 6 2,1 0,9 43 10 0,75 13 Flame seedless 25 2,11 0,37 18 10 1,5 0,5 33 15 4,53 14 Helios 25 3,60 0,57 16 7 2,6 0,5 19 15 31,31 15 Ilonka 4 4,66 0,59 13 5 3,2 0,4 13 16 13,28 16 Imperial seedless 25 5,55 0,55 10 10 3,5 0,7 20 24 11,71 17 Interlaken 25 1,14 0,27 24 10 1,2 0,4 33 15 1,73 18 Jupiter 25 6,87 1,12 16 5 3,0 1,4 47 15 19,73 19 Kišmiš lučistyj 25 4,74 0,65 14 7 2,3 1,4 61 19 24,65 20 Kišmiš moldavskij 25 5,05 0,69 14 9 3,4 0,7 21 31 8,24 21 Luna 25 4,57 0,72 16 5 2,8 0,8 29 0,6 0,9 150 12 32,07 3 3,70 49

22 Mars 25 7,28 1,47 20 8 1,9 0,6 32 15 38,95 23 Merkúr 17 4,61 1,18 26 17 1,2 0,5 42 16 39,78 24 Neptún 25 4,14 0,85 21 8 1,9 1,1 58 15 40,09 25 Perlette 25 2,50 0,49 20 9 1,7 0,7 41 15 5,80 26 Perlon 25 4,08 0,69 17 15 1,7 0,6 35 15 11,13 27 Picurka 20 2,03 0,28 14 5 3,4 0,5 15 15 9,33 28 Red Globe 15 11,13 0,98 9 10 3,0 0,7 23 30 62,89 29 Regal seedless 25 7,60 1,01 13 11 2,8 0,6 21 28 14,95 30 Reliance 25 2,36 0,37 16 5 2,1 0,4 19 1,9 0,4 21 8 3,00 7 0,19 31 Remaily seedless 25 1,85 0,43 23 6 0,8 1,0 125 1,8 1,0 56 5 9,52 10 1,01 32 Rusalka 3 25 4,97 1,27 26 8 1,9 0,8 42 15 16,47 33 Sába királynője 25 2,95 0,89 30 7 1,6 0,5 31 0,8 0,4 50 10 6,49 5 1,72 34 Slavjanka 25 3,12 0,52 17 12 1,2 0,4 33 1,9 0,5 26 9 12,88 15 0,79 35 Sugraone 25 7,52 1,37 18 10 3,1 0,9 29 24 18,08 36 Sunred seedless 25 5,94 0,99 17 5 3,4 0,5 15 14 11,61 37 T I/80 4 4,35 0,83 19 9 1,2 0,4 33 11 33,83 38 T II/70 4 4,18 0,70 17 8 1,8 0,7 39 14 45,91 39 Thompson seedless 25 1,72 0,25 15 10 2,5 0,7 28 25 4,40 40 Thompson seedless + GIB 25 5,37 0,61 11 18 1,7 0,6 35 24 1,50 41 Urán 25 4,42 1,04 24 6 3,3 0,8 24 20 26,86 42 Venus 20 4,00 0,86 22 12 1,5 0,7 47 15 9,75 43 Venuša 25 7,03 1,21 17 7 2,1 0,4 19 15 29,76 * n a n' jsou počty měřených bobulí, resp. semen; m b je průměrná hmotnost bobulí; n si a m si jsou průměrný počet semen v bobuli, resp. průměrná hmotnost jednotlivých semen, vhodných (i=1), resp. méně až nevhodných (i=2) pro kultury in vitro; s x je příslušná směrodatná odchylka; v x je příslušný variační koeficient. 50

Tabulka III: Celková hmotnost semen v bobuli u zkoumaných odrůd No. Odrůda Celková hmotnost semen v bobuli* M s1 [mg] s s1 [mg] M s2 [mg] s s2 [mg] M s [mg] s s [mg] v s [%] 1 1/n 24,2 10,1 24,2 10,1 42 2 2/m 88,2 0,0 88,2 0,0 0 3 12/5 91,8 0,0 91,8 0,0 0 4 12/6 88,8 0,0 88,8 0,0 0 5 Black Monukka 9,1 1,8 9,1 1,8 20 6 BV 16-16-3 13,7 6,8 0,9 1,2 14,6 8,0 55 7 BV 16-20-2 4,7 2,5 0,9 0,4 5,6 2,9 52 8 Carina 8,3 2,5 8,3 2,5 30 9 Carolus 3,5 0,0 3,5 0,0 0 10 Dawn seedless 23,1 7,7 23,1 7,7 33 11 Edro bezseme 15,9 4,5 15,9 4,5 28 12 Elma 1,6 0,7 1,6 0,7 43 13 Flame seedless 6,8 2,3 6,8 2,3 33 14 Helios 81,4 15,7 81,4 15,7 19 15 Ilonka 42,5 5,3 42,5 5,3 13 16 Imperial seedless 41,0 8,2 41,0 8,2 20 17 Interlaken 2,1 0,7 2,1 0,7 33 18 Jupiter 59,2 27,6 59,2 27,6 47 19 Kišmiš lučistyj 56,7 34,5 56,7 34,5 61 20 Kišmiš moldavskij 28,0 5,8 28,0 5,8 21 21 Luna 89,8 25,7 2,2 3,3 92,0 29,0 32 51

22 Mars 74,0 23,4 74,0 23,4 32 23 Merkúr 47,7 19,9 47,7 19,9 42 24 Neptún 76,2 44,1 76,2 44,1 58 25 Perlette 9,9 4,1 9,9 4,1 41 26 Perlon 18,9 6,7 18,9 6,7 35 27 Picurka 31,7 4,7 31,7 4,7 15 28 Red Globe 188,7 44,0 188,7 44,0 23 29 Regal seedless 41,9 9,0 41,9 9,0 21 30 Reliance 6,3 1,2 0,4 0,1 6,7 1,3 19 31 Remaily seedless 7,6 9,5 1,8 1,0 9,4 10,5 112 32 Rusalka 3 31,3 13,2 31,3 13,2 42 33 Sába királynője 10,4 3,2 1,4 0,7 11,8 3,9 33 34 Slavjanka 15,5 5,2 1,5 0,4 17,0 5,5 33 35 Sugraone 56,0 16,3 56,0 16,3 29 36 Sunred seedless 39,5 5,8 39,5 5,8 15 37 T I/80 40,6 13,5 40,6 13,5 33 38 T II/70 82,6 32,1 82,6 32,1 39 39 Thompson seedless 11,0 3,1 11,0 3,1 28 40 Thompson seedless + GIB 2,6 0,9 2,6 0,9 35 41 Urán 88,6 21,5 88,6 21,5 24 42 Venus 14,6 6,8 14,6 6,8 47 43 Venuša 62,5 11,9 62,5 11,9 19 * M s je průměrná celková hmotnost semen v jednotlivých bobulích, počítaná jako součet průměrných celkových hmotností semen M si, vhodných (i=1), resp. méně až nevhodných (i=2) pro kultury in vitro; M si =m si n si (viz Tab. II); s x je příslušná směrodatná odchylka; v x je příslušný variační koeficient. 52

15 12 28 Hmotnost bobulí [g] 9 6 3 0 0 50 100 150 200 Celková hmotnost semen [mg] Obrázek 1: Závislost mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí u zkoumaných odrůd; elipsy tvoří směrodatné odchylky od průměrů; pro číslování odrůd viz Tab. II a III 53

10 9 8 29 35 22 Hmotnost bobulí [g] 7 6 5 4 3 2 40 6 12 7 30 13 9 42 5 8 11 32 1 26 25 33 34 31 39 20 10 36 27 16 37 15 38 23 19 43 18 4 2 3 14 41 21 24 1 17 0 0 20 40 60 80 100 120 Celková hmotnost semen [mg] Obrázek 2: Zvětšení závislosti mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí u zkoumaných odrůd, uváděné na Obr. 1; elipsy tvoří směrodatné odchylky od průměrů; pro číslování odrůd viz Tab. II a III 54

Tabulka IV uvádí třídění odrůd atlasu, jak je to zpracované v elektronické verzi atlasu, v části HODNOCENÍ. Bezsemenné odrůdy jsou tříděny jednak podle hmotnosti jejich semen a bobulí, jednak podle jejich původu, barvy bobulí a doby zrání. Tabulka IV: Třídění odrůd atlasu Typy Třídění Limity, podmínky a Skupiny b Představitelé s jen semenné odrůdy v rodokmenu I. Red Globe e m e n n é b e z s e m dle původu a kvality semen dle hmotnosti bobulí a semen (fotografie v pořadí nejméně jedna stenospermokarpická odrůda v rodokmenu, tvrdá testa, endosperm II. Luna, Urán nejméně jedna stenospermokarpická odrůda v rodokmenu, tvrdá testa, bez III. Mars endospermu Interlaken, Carina, Thompson seedless, Remaily seedless, Carolus, m b = (0-3> g a m s = <0-10> mg 1A Picurka, Flame seedless, Black Monukka, Reliance, Perlette, BV 16-20-2 m b = (3-6> g a m s = <0-10> mg 2A Elma, Venus, Dawn seedless, Kišmiš moldavskij, Thompson seedless + GIB Slavjanka, 2/m, BV 16-16-3, Perlon, Ilonka, 1/n, Kišmiš lučistyj, m b = (3-6> g a m s = (10-25> mg 2B 12/6, Rusalka 3, Imperial seedless, Sunred seedless e dle m b = (3-6> g a m s = (25-50> mg 2C Helios, Neptún, T II/70, T I/80, Merkúr, 12/5 n hmotnosti m b = (6-9> g a m s = <0-10> mg 3A Edro bezseme n bobulí) m b = (6-9> g a m s = (10-25> mg 3B Jupiter, Sugraone, Regal seedless é m b = (6-9> g a m s = (25-50> mg 3C Venuša 55

Vitis labrusca v rodokmenu s udržením IS I. Interlaken, Glenora, Reliance, Venus její specifické chutě Vitis labrusca v rodokmenu s dle IS II. Remaily seedless b neudržením její specifické chutě původu, e Vitis amurensis v rodokmenu IS III. BV 16-20-2, BV 16-19-8, BV 16-17-4, BV 16-16-3 barvy z Franko-americké hybridy, zpětně bobulí IS IV. T I/80, Ilonka, 12/6, Rusbol, 12/5, T II/70, Rosina, 2/m s křížené s druhem Vitis vinifera a doby e Odrůdy druhu Vitis vinifera, vysoce zrání VV I. Kišmiš vatkana m odolné proti padlí révovému (fotografie e Carolus, Helios, Perlette, Picurka, Carina, Dawn seedless, v pořadí n Centennial seedless, Thompson seedless, Beogradska besemena, dle barvy n Odrůdy druhu Vitis vinifera, náchylné Slavjanka, Edro bezseme, Venuša, Urkim, Neptún, Jupiter, Merkúr, bobulí, VV II. é k houbovým chorobám Flame seedless, 1/n, Kišmiš lučistyj, Perlon, Elma, Kišmiš pak doby moldavskij, Sunred seedless, King's Ruby, Beauty seedless, Black zrání) Monukka, Rusalka 3 Odrůdy druhu Vitis vinifera, dostupné Prime seedless + GIB, Sugraone, Thompson seedless + GIB, Zimní trh u nás na zimním trhu Imperial seedless, Regal seedless, Sunred seedless a m b je hmotnost bobulí, m s je hmotnost semen; b IS znamená Interspecifické odrůdy, VV znamená odrůdy druhu Vitis vinifera. Tabulka V a Obrázky 3 až 6 se vztahují k jednoduchým lineárním i nelineárním korelačním závislostem mezi celkovou hmotností semen / hmotností semen a hmotností bobulí. S cílem najít co nejspolehlivější popis zkoumané závislosti, jednak byly použity různé typy korelace (lineární typ, polynomický typ nižšího stupně, polynomický typ vyššího stupně), jednak byla testována vhodnost zařazení semenné 56

odrůdy Red Globe do zkoumaného souboru odrůd, skládajícího se hlavně z bezsemenných odrůd, ale i odrůd semenných (Luna, Mars, Urán), vzniklých však z křížení semenných odrůd s odrůdami bezsemennými. Srovnání koeficientů a indexů korelace u korelačních závislostí mezi celkovou hmotností semen / hmotností semen a hmotností bobulí, s přihlížením i na přítomnost semenné odrůdy Red Globe, uvádí Tab. V. U všech korelací mezi vybranými hmotnostmi lze pozorovat nejvyšší těsnost u vyššího stupně polynomického typu korelace a vyjma korelace mezi hmotností semen a hmotností bobulí, kde nebyla zvažována odrůda Red Globe (označme tuto korelaci číslem 4, Obr. 6) u všech korelací mezi vybranými hmotnostmi lze pozorovat nejnižší těsnost u lineárního typu korelace. Tabulka V: Srovnání koeficientů a indexů korelace u korelačních závislostí mezi celkovou hmotností semen / hmotností semen a hmotností bobulí, včetně srovnání významu semenné odrůdy Red Globe Typ korelace Průměr ± Korelace Přítomnost semenné polynomický směrodatná mezi* odrůdy Red Globe lineární (r) nižšího stupně (I yx ) vyššího stupně (I yx ) odchylka** M s a m b ano 0,6519 0,7842 0,8073 0,7478 ± 0,0839 a m s a m b ano 0,5768 0,7167 0,7317 0,6751 ± 0,0854 a M s a m b ne 0,4880 0,7065 0,7212 0,6386 ± 0,1306 ab m s a m b ne 0,4332 0,3217 0,5407 0,4319 ± 0,1095 b Průměr ± směrodatná odchylka** 0,5375 ± 0,0965 b 0,6323 ± 0,2099 ab 0,7002 ± 0,1131 a Významnost hodnoty F Významnost hodnoty F * M s je celková hmotnost semen, m s je hmotnost semen, m b je hmotnost bobulí; ** průměry značené stejnými písmeny se na základě Tukeyova testu HSD neliší průkazně při hladině významnosti α = 0,05. 0,0488 0,0082 0,0275 _ 57

14,00 Hmotnost bobulí [g] 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 I yx = 0,8073 r = 0,6519 I yx = 0,7842 0,00 0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 Celková hmotnost semen [mg] Obrázek 3: Jednoduché lineární a nelineární korelační závislosti mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí, zde včetně semenné odrůdy Red Globe 14,00 Hmotnost bobulí [g] 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 I yx = 0,7317 r = 0,5768 I yx = 0,7167 0 10 20 30 40 50 60 70 Hmotnost semen [mg] Obrázek 4: Jednoduché lineární a nelineární korelační závislosti mezi hmotností semen a hmotností bobulí, zde včetně semenné odrůdy Red Globe Mezi těmito dvěma typy korelace na základě Tukeyova HSD testu existuje i průkazný rozdíl při hladině významnosti α = 0,05 (Tab. V). Lineární typ korelace dosahuje nejvyšší hodnotu koeficientu korelace r = 0,6519, což odpovídá význačné těsnosti, avšak zaostává jak za nejvyšší hodnotou indexu korelace polynomického typu, nižšího stupně (I yx = 0,7842, což odpovídá velké těsnosti), tak za nejvyšší hodnotou indexu korelace polynomického typu, vyššího stupně (I yx = 0,8073, což také odpovídá velké těsnosti). 58

Všechny typy korelace mají společného, že jejich koeficient a indexy korelace dosahují svého maxima u korelace mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí, v přítomnosti semenné odrůdy Red Globe (označme tuto korelaci číslem 1, Obr. 3). Zařazení této semenné odrůdy do zkoumaného souboru má tedy plné opodstatnění. Vyplývá to i z toho, že existuje statisticky vysoce průkazný rozdíl (Tukeyův HSD test, α = 0,01) mezi korelacemi s čísly 1 (Obr. 3) a 4 (Obr. 6) (Tab. V). Tento rozdíl zřejmě tkví jednak v přítomnosti odrůdy Red Globe (Obr. 3-4), ale i ve skutečnosti, že byly analyzovány odlišné hmotnosti: celková hmotnost semen (Obr. 3), resp. hmotnost semen (Obr. 6). Celková hmotnost semen je jednoznačně správnější: více vyjádřuje celistvost bobule, což je patrné i z toho, že rozdíl mezi korelacemi mezi hmotností semen a hmotností bobulí (Obr. 4 a 6), lišícími se jen přítomností (Obr. 4) a nepřítomností (Obr. 6) semenné odrůdy Red Globe, je jen statisticky průkazný při hladině významnosti α = 0,05 (Tab. V). 9,00 Hmotnost bobulí [g] 6,00 3,00 I yx = 0,7212 r = 0,4880 I yx = 0,7065 0,00 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 Celková hmotnost semen [mg] Obrázek 5: Jednoduché lineární a nelineární korelační závislosti mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí, zde bez semenné odrůdy Red Globe 59

9,00 Hmotnost bobulí [g] 6,00 3,00 r = 0,4332 I yx = 0,3217 I yx = 0,5407 0,00 0 10 20 30 40 50 Hmotnost semen [mg] Obrázek 6: Jednoduché lineární a nelineární korelační závislosti mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí, zde bez semenné odrůdy Red Globe 4.4 Diskuse Prvotní verze atlasu je jeho elektronická verze, umožňující hlavně interaktivní propojení mezi jednotlivými odrůdami či znaky dané odrůdy. A skutečně, ani sebelepší a nejpromyšlenější sestavení tištěné verze nenahradí tuto interaktivitu počínaje rychlým vyhledáváním a konče identifikací umístěním kurzoru nad obrázek či bod. Jelikož elektronická verze uložením jednotlivých obrázků jen jednou tedy úsporným způsobem umožňuje jejich mnohonásobné použití a vzájemnou kombinaci, tato originální verze obsahuje několik galerií a třídění podle různých kritérií: galerie hroznů, velikosti bobulí, struktury bobulí a semen založené na všech odrůdách atlasu, dále profily jednotlivých odrůd založené na výše zmíněných galeriích i měřeních hmotností semen a bobulí, jako i třídění odrůd atlasu na odrůdy semenné (5 odrůd pro srovnání a pochopení stenospermokarpické bezsemennosti) i bezsemenné (51 odrůd) a jejich dílčí třídění jednak podle hmotnosti jejich semen a bobulí, jednak podle jejich původu, barvy bobulí a doby zrání. Seznamy odrůd tříděné a sestavené podle jednotlivých faktorů lze ve srovnání s odrůdovými profily, obvykle řazenými v abecedním pořadí a uvádějícími jednotlivé vlastnosti dané odrůdy dle několika faktorů, považovat za účinnější. Majíc toto na zřeteli, do tištěné verze byla začleněna všechna třídění elektronické verze, kde odrůdy byly řazeny dle jednotlivých faktorů (tj. kompletní bod HODNOCENÍ). 60

Z prostorových důvodů však tištěná verze neobsahuje čtyři galerie, kde odrůdy jsou řazeny dle abecedy, nebo přesněji řečeno, obsahuje je v pozměněné formě jako výsledek sledu jednotlivých odrůdových profilů na jednotlivých stránkách Přílohy A: stejné pozice obrázků v těchto profilech při listování dávají vznik i těmto galeriím, a to u úplně zpracovaných odrůd (celkem 42 odrůd). Částečně zpracované odrůdy (celkem 14 odrůd) v tištěné verzi lze pak najít po profilech úplně zpracovaných odrůd. Co se týká položek zpracovaných v profilech jednotlivých odrůd, atlas se nesnaží být ampelografií a neobsahuje ani vyčerpávající popisy, ani celková hodnocení jednotlivých odrůd. Tyto lze ostatně najít v již existujících ampelografických dílech, i když je pravdou, že ampelografie vzdálených krajin často jsou jen stěží dostupné. Důraz byl však kladen na odrůdy vyšlechtěné ve středoevropských podmínkách jednak z důvodu vyšší předpokládané adaptability pro naše podmínky, jednak z důvodu vyššího zastoupení těchto odrůd v našich sbírkách a tím i lepšího přístupu pro křížení a zejména polní pokusy, jejichž vlastnosti byly podrobně zpracovány v široce dostupných dílech (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998; POSPÍŠILOVÁ et al., 2005). V těchto dílech však chybí zpracování bezsemennosti jako speciálního znaku. Důraz byl tedy kladen na kvalitní obrazový materiál a přesná měření. Tím došlo k přesnému určení hmotnosti jednotlivých stenospermických semen, jako i celkové hmotnosti stenospermických semen v jednotlivých bobulích. Na základě hmotnosti jednoho stenospermického semene a současně i hmotnosti jedné bobule vytvořené skupiny 1A až 4C podávají mnohem exaktnější a komplexnější pohled na bezsemennost u nás, ale i v jiných státech vyšlechtěných odrůd než dosavadní určení: odrůda nemá semena, je stenospermokarpicky bezsemenná. Sice procentuální vyjádření hmotnosti stenospermických semen, vztažené k hmotnosti bobule, lze najít u některých stenospermokarpických odrůd i v POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS (1998), tento údaj není dostupný u všech popsaných odrůd, navíc nevyjádřuje absolutní míru. Dále, mezi bezsemenné odrůdy jsou zde řazeny i odrůdy s tvrdým osemením: je to případ odrůd Luna a Urán, což je v rozporu se všeobecným očekáváním konzumentů i šlechtitelů. Sice mezi stenospermokarpické odrůdy lze řadit i odrůdy s dutými semeny, kde ze všech stenospermokarpických typů dochází k víceméně nejdelšímu vývinu semen a tím k sklerifikaci integumentů vajíček vedoucí k tvrdému osemení, typický představitel této skupiny, Damascenka či Čauš je všeobecně řazen mezi semenné odrůdy. Odrůda Damascenka většinou v omezené míře tvoří i klíčivá semena, o čem svědčí i její široké použití ve šlechtitelském programu VÚVV v Bratislavě 61

v šedesátých letech 20. století. To samé platí i pro Urán (KORPÁS, 2004, ústní sdělení). Jak je to patrné z atlasu, Urán skutečně někdy obsahuje i zelená semena, ale i taková, která v klasických podmínkách bez problémů klíčí. Tímto chováním se podobá na svou matku, Damascenku růžovou. Odrůdy s dutými semeny jsou jen fyziologicky bezsemennými, neschopnými klíčení v klasických podmínkách, přitom pro konzumenty obsahují citelná semena s tvrdou testou. Atlas je řadí do třetí skupiny semenných odrůd a za představitele uvádí odrůdu Mars. Podle RAMMING et al. (1990) za bezsemenné lze považovat bobule se stenospermickými semeny do 25 mg, přitom konzumenti u bezsemennosti očekávají hmotnost stenospermických semen do 10 mg. Exaktní měření a organoleptická analýza jednoznačně řadí odrůdy Luna a Urán mezi odrůdy semenné s endospermem, podle atlasu patří do druhé skupiny semenných odrůd. To však nesnižuje jejich hodnotu, ale má pro konzumenta i šlechtitele některé významné následky. 4.5 Závěr Tato kapitola disertační práce podává podrobný přehled o 56 odrůdách, z toho 51 bezsemenných a 5 semenných. Počet úplně zpracovaných odrůd je 43; u těchto odrůd lze najít kompletní vyobrazení jejich hroznů, velikosti a struktury bobulí a jejich semen. Profily jednotlivých úplně zpracovaných odrůd jsou dále doplněny o hmotnosti jednotlivých semen i bobulí, jako i celkovou hmotnost semen jednotlivých bobulí. Na základě těchto parametrů odrůdy mohly být tříděny do sice uměle vytvořených skupin 1A až 3C a mohly být vybrány nejvhodnější genotypy pro další křížení. Na základě vykonaných analýz lze doporučit především odrůdy Jupiter, Rusalka 3 a Neptún jako mateřské genotypy a odrůdy Edro bezseme, Elma, Kišmiš lučistyj, Kišmiš moldavskij a Dawn seedless jako otcovské genotypy. Dále byly zkoumány korelační závislosti mezi jak hmotností semen, tak celkovou hmotností semen a hmotností bobulí a byla prokázána vazba mezi bezsemennými odrůdami s velkými bobulemi a semennými odrůdami s velmi velkými bobulemi, a to nejvýrazněji v korelaci mezi celkovou hmotností semen a hmotností bobulí, v přítomnosti semenné odrůdy Red Globe. Je potřeba ještě zmínit interaktivitu elektronické verze atlasu, která může být významná při osvojení dané problematiky. 62

5. POLNÍ POKUSY S ANTIGIBERELINY 5.1 Úvod Stenospermická semena mohou být kultivována in vitro a tím je umožněno křížení dvou stenospermokarpicky bezsemenných odrůd, ale uspokojivé výsledky většinou dávají až po preparaci embrya. Preparace embryí je však časově náročnou, pracnou záležitostí a přímé klíčení semen by tvořilo vhodnou alternativu. Použití giberelinů vede k bezsemenným plodům a od antigiberelinů lze teoreticky očekávat opačný účinek (AGÜERO et al., 2000). S cílem otestovat různé antigibereliny u středoevropských odrůd a získání normálních semen u nich byly vykonány pokusy ve dvou letech 2004 a 2005 (KORPÁS a HRADILÍK, 2009). 5.2 Materiál a metody V jednotlivých letech období 2004 2005 byly použity antigibereliny s cílem získání normálně vyvinutých semen u stenospermokarpických genotypů. Níže jsou uvedeny faktory těchto pokusů počínaje popisem pokusného stanoviště, rostlinného materiálu, použitých antigiberelinů a sledovaných charakteristik. 5.2.1 Popis pokusného stanoviště Pokusné stanoviště tvořilo ampelografická sbírka pod vedením Ing. Ondreje Korpáse, CSc. na PD Strekov na jižním Slovensku, tedy lokalita č. 1 uváděná v části 4.1 a popsaná v části 4.1.1. Na dané lokalitě nebyly dřívě použity žádné antigibereliny. 5.2.2 Rostlinný materiál 63

Rostlinný materiál tvořily 2 genotypy, a to velmi dobré uvologické i pěstitelské vlastnosti vykazující Jupiter, který na začátku pokusu byl zvolen nosným genotypem a byl použit v obou letech pokusu a genotyp Neptún, který byl zvolen na základě vykonaných rozborů popsaných v části 4.1, ale i pro jeho funkcionálně samičí květ a byl použit v roce 2005. Z důvodu možné vazby chování stenospermokarpické bezsemennosti na některé charakteristiky uvedených genotypů, níže je uveden upravený popis obou genotypů, sestavený podle POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS (1998). 5.2.2.1 Původ genotypů Oba genotypy vznikly v roce 1969 v KVÚVV v Bratislavě. Jupiter vznikl křížením odrůd Ceaus roz s funkcionálně samičími květy a Chibrid bezsemen V-6 pocházejícího z křížení Italia Sultanina (POSPÍŠILOVÁ, 1981). Neptún vznikl křížením odrůd Ceaus roz s funkcionálně samičími květy a Perletta pocházející z křížení Szőlőskertek királynője muskotály Sultanina (POSPÍŠILOVÁ, 1981). 5.2.2.2 Morfologický opis genotypů Morfologické vlastnosti obou použitých genotypů, Jupiteru a Neptúnu, uvádí Tabulka I. Tabulka I: Morfologické vlastnosti Jupiteru a Neptúnu (podle POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998, upraveno) Genotyp Jupiter Neptún Vrchol letorostu bělavě plstnatý hladký Mladé lístky bělavě zelenobronzové světlozelené Líce husto ochlupené hladké Rub plstnatý hladký 64

Dospělý list Velikost velký až velmi velký velký Tvar do délky protáhnutý vejcovitý až 5-tiúhelníkový 5-tiúhelníkový široce trychtýřovitý široce trychtýřovitý Líce hluboce vrásčité plytce vrásčité Rub husto štětinatý, jemně hladký ochlupený Laloky 5-7 5 Vrchol středního laloku ostroúhlý ostroúhlý Horní výkrojky uzavřené uzavřené s vejcovitým průsvitem s vejcovitým průsvitem s okrouhlým spodkem Dolní výkrojky otevřené otevřené lýrovité lýrovité nebo klenuté s okrouhlým spodkem s okrouhlým spodkem Řapíkový výkrojek lýrovitý s okrouhlým spodkem lemovaný žilkami Okraj čepele hluboce vykrajovaný středně hluboce vykrajovaný Vrcholové zoubky šídlovité šídlovité dlhé Boční zoubky ostroúhlé ostroúhlé s rovnými stranami s mírně vypuklými stranami některé i jednostranně vypuklé větší Řapík středně dlouhý až kratší středně dlouhý jemně štětinatý i ochlupený fialový Úponky krátké středně dlouhé 65

Květ oboupohlavní funkčně samičí Hrozen Velikost velký velký 18-19 13-14 cm 21 11 cm Tvar kuželovitý kuželovitý při základě se větví při základě s křidélkem Hustota řidší při řádném opylení hustý Průměrná hmotnost 415 g 356 g Třapina 3% 3% Výlisnost moštu 722 ml z 1 kg hroznů 700 ml z 1 kg hroznů Barva moštu žlutozelená olivovozelená Bobule Velikost velmi veliká středně veliká i veliká 25-30 18-21 mm 19-23 17-20 mm Průměrná hmotnost 6,15 g 4,10 g Slupka 13,80% 8,50% Tvar vejcovitý, symetrický kulovitý, symetrický se zašpičatelým, ale i zaokrouhleným vrcholem se zaokrouhleným vrcholem Barva ružovozelená šarlatově červená nevyrovnaná ve velikosti i barvě Chuť výrazná, po Ceaus roz po Ceaus roz Slupka středně pevná málo pevná přirostlá k masité dužnině přirostlá k masité - šťavnaté dužnině Pevnost snese zatížení 1226 g snese zatížení 862 g Odtržení od stopky je potřebná zátěž 687 g je potřebná zátěž 338 g 66

Semena stenospermokarpická stenospermokarpická ca. 20 mg, rudimentární ca. 40 mg, rudimentární zelená až červěnavá, měkká zelená, měkká Partenokarpie u opylených, ale neoplozených květů 5.2.2.3 Fenologická charakteristika genotypů Jupiter má do všech fenologických stádií pozdní vstupy: pozdě na jaře raší, středně pozdě kvete, pozdě zaměká a hrozny dozrávají na konci září. Neptún začíná rašit středně pozdě, zavčasu kvete, zaměkáním bobulí se posouvá mezi středně dozrávající odrůdy a konzumná zralost hroznů se dostaví kolem 20. září. 5.2.2.4 Hospodářské vlastnosti genotypů Jupiter má silný růst letorostů, jednoročné dřevo vyzrává dobře. Růst letorostů u Neptúnu je velmi silný, jednoročné dřevo vyzrává středně dobře, ale lépe než u její otcovské bezsemenné odrůdy Perlette. Už od mládí jsou keře mohutné s hrubými kmínky. Úrodnost Jupiteru je dobrá, pohybuje se v rozmezí 10-14 t.ha -1, z toho je 94% tržní produkce hroznů, což je v průměru 1,10 kg.m -2. Cukernatost moštu bývá v rozmezí 12-14 kg.hl -1, obsah kyselin kolem 7,3 g.l -1. Úrodnost Neptúnu je střední, pohybuje se v rozmezí 9-12 t.ha -1, z toho je 89% tržní produkce hroznů, což je v průměru 0,93 kg.m -2. Cukernatost moštu je velmi dobrá, pohybuje se v rozmezí 14-17 kg.hl -1, obsah kyselin je 6,5-7 g.l -1. V některých letech při nepříznivém počasí v období kvetení u Jupiteru může docházet k částečnému sprchávání květenství, vůbec ne však do té míry, jak je to běžné u Neptúnu. Biologickým nedostatkem Neptúnu je totiž funkcionálně samičí květ, což zejména v klimaticky nepříznivých ročnících způsobuje nevyrovnanost bobulí v hroznech. Při hezkých šarlatově červených velikých bobulích se v hroznu nacházejí i zelené 67

nevyvinuté bobule. Jeho velikým kladem je bezsemennost, velikost a atraktívnost dobře vyvinutých bobulí i hroznů. Jarným mrazům Jupiter uniká pozdním rašením a zatím se nepozorovalo ani poškození zimnými mrazy. To však neznamená, že silné mrazy odrodu nepoškozují. Není citlivá ani na déletrvající suché letné počasí. Jarní mrazy Neptún obvykle nepoškozují, ale na zimné mrazy je dost citlivý. Mimořádnou citlivost ani Jupiter, ani Neptún nevykazuje na některou ze závažných houbových chorob, které se při normální preventivní ochraně udržují pod kontrolou. 5.2.2.5 Agrotechnické požadavky genotypů Oba genotypy představují typy pro nejteplejší vinohradnické rajony, ve kterých hrozny dobře vyzrávají a hezky se vybarvují. Bezmrazové polohy jsou výhodnější, protože je v nich větší koncentrace tepla. Jupiter nemá veliké nároky na půdy, zavděčí se však za vododržné, středně těžké půdy. Neptún patří do půd středně těžkých, ne však suchých, ale vododržných. Vyhýbáme se velmi výživným půdám a zejména přehnojeným dusíkem. Oba genotypy vyžadují veliké tvary keřů na vysokém vedení. U Jupiteru nařezáváme raději polotažně než dlouhé plodonosné dřevo, na kterém květenství v některých ročnících více sprchávají a volíme zatížení 6-8 oček na m 2. U Neptúnu nařezáváme delší tažně a zatěžujeme ho 10-12 očky na m 2. U obou genotypů dbáme zejména na zelené práce. Ještě před kvetením vylamujeme všechny neplodné letorosty a prosvětlujeme zelené stěny v zóně květenství. Již při výsadbě dbáme na to, aby se řady Neptúnu střídaly s jinou odrůdou se stejným termínem kvetení a s dobrou schopností opylování. V čistých výsadbách se Neptún z důvodu sprchávání nemůže pěstovat. Podnože vyberáme podle půdního druhu, ale i takové, které částečně brání proředění hroznů. Vyhneme se proto podnoži K 5BB, který ve svém vyživovacím metabolismu přednostně přijímá z půdy dusík, čímž se podpoří vegetativní růst před generativními procesy. Vhodné podnože jsou SO4 a T 5C. 5.2.2.6 Využitelnost genotypů 68

Jupiter je cenný zejména pro svoji bezsemennost a veliké bobule. Vytváří veliké, nepříliš husté hrozny s velikými bobulemi atraktivní barvy s růžovým líčkem na slunečné straně. Dozrává ještě před celkem pozdními odrůdami, ale již po skupině zářijových odrůd. Je vhodné i na zimné skladování, o čemž svědčí i parametry pevnosti bobule. Je mimořádně vhodný na výrobu kompótů, které jsou dieteticky i chuťově vysoko hodnocené. Čerstvé hrozny jsou na degustacích hodnocené vysoko. Jupiter je vhodný malovýrobní typ, do kterého se řadí zejména pro částečné sprchávání hroznů. Při dobrém opylení není vylúčená ani jeho velkovýrobná hodnota v kategórii doplnkové stolní bezsemenné odrůdy s možností zimného skladování. Je i vhodnou skleníkovou odrůdou. Neptún je výlučně zahrádkářským typem. Při splnění uvedených agrotechnických zásahů se odvděčí krásnými hrozny s chuťově zajímavými bezsemennými bobulemi, které při degustacích dosahují vysoké hodnocení. Jeho pěstování v malém je méně rizikové, protože na zahrádce lze keře vysadit roztroušeně mezi ostatnými odrůdami, čímž se zabezpečí dobré opylení. Neptún je potřebné uchovat jako genetický zdroj na další šlechtění, protože vzhledných, červených a bezsemenných odrůd s velkými bobulemi a dobrými chuťovými vlastnostmi je ve světovém sortimentě révy vinné jako šafránu. Navyše je tento typ již odzkoušený v našich klimatických podmínkách. 5.2.3 Použité antigibereliny Dle literárních pramenů (LEDBETTER a SHONNARD, 1990; BORDELON a MOORE, 1994) byly zvoleny 3 chemické látky s antigiberelinovým účinkem. Níže jsou uvedeny jejich specifikace. 5.2.3.1 Typy Prvním antigiberelinem byl přípravek Alar 85 (Uniroyal Chemicals Company Ltd., Middlebury, USA) s účinnou látkou daminozidem. 69

Druhým antigiberelinem byl přípravek Cycocel Stefes (Bayer CropScience GmbH, Frankfurt am Main, Německo) s účinnou látkou chlormequatem. Třetím antigiberelinem byl paclobutrazol (DUCHEFA Biochemie B.V., Haarlem, Nizozemí), který je přímo účinnou látkou. 5.2.3.2 Koncentrace Dle literárních pramenů (LEDBETTER a SHONNARD, 1990; BORDELON a MOORE, 1994) byly zvoleny 2 koncentrace pro všechny antigibereliny jedna nízká a jedna vysoká (Tab. II). Tabulka II: Použité antigibereliny a jejich koncentrace Antigiberelin Koncentrace [ppm] nízká vysoká Daminozid 425 1700 Chlormequat 360 1440 Paclobutrazol 50 100 5.2.3.3 Způsob aplikace Pro chemické ošetření byly náhodně vybrány keře uvedených odrůd. Před ošetřením na jednotlivých keřích byly vybrány letorosty s květenstvím a současně byly odstraněny letorosty bez květenství. V roce 2004, kdy byl ošetřen pouze Jupiter, antigibereliny se aplikovaly na květenství spolu s jejich letorostem. V roce 2005, kdy tento způsob ošetření byl opakován u Jupiteru a poprvé uskutečněn u Neptúnu, byl zvolen další způsob ošetření, u které se antigibereliny aplikovaly jen na květenství, a to jen u Neptúnu. Jednotlivé keře byly ošetřeny pouze jedným antigiberelinem s danou koncentrací. Pro každý antigiberelin s danou koncentrací byl vybrán 1 keř a byla ošetřena všechna jeho květenství (s jejich letorostem nebo bez něj dle varianty), která takhle tvořila opakování pokusu. Následně u variant s ošetřením květenství spolu s jeho 70

letorostem došlo k ošetření celkové listové plochy keře. Jako kontrola byl vybrán 1 keř u každé odrůdy, květenství kterého nebyla ošetřena antigibereliny. Všechny antigibereliny byly aplikovány jako vodné roztoky, zhruba tři týdny před kvetením. 5.2.4 Sledované charakteristiky Semena byla hodnocena vizuálně, a to v obou letech, či se podobají normálně vyvinutým semenům. Dále v roce 2005 u 24 bobulí u každé varianty (4 hrozny po 6-ti bobulích) byly stanoveny: počet semen v bobulích, přítomnost endospermu v semenech a u některých variant hmotnost vysušených semen. 5.3 Výsledky Použití antigiberelinů nevedlo k normálním semenům, tedy semenům s tvrdou testou. Ze zkoumaných znaků u počtu semen u jednotlivých odrůd nebyly zjištěny statisticky průkazné rozdíly při hladině významnosti α = 0,05. U procentuálního obsahu endospermu v jednotlivých bobulích byly zjištěny vysoce průkazné rozdíly při hladině významnosti α = 0,01 mezi jednotlivými ošetřeními antigibereliny u Neptúnu, ale ne u Jupiteru. Mnohonásobným porovnáváním (Tukeyův test HSD) se však zjistilo, že tyto rozdíly u Neptúnu jsou mezi jednotlivými ošetřeními a žádné ošetření se neliší průkazně od kontroly (Obr. 1). Statisticky vysoce průkazné rozdíly při hladině významnosti α = 0,01 byly zjištěny mezi jednotlivými odrůdami, a to jak u počtu semen (ve prospěch odrůdy Jupiter), tak u procentuálního obsahu endospermu v jednotlivých bobulích (ve prospěch odrůdy Neptún), což je patrné i z procentuálního zastoupení endospermu na obr. 1 a 2. Genotyp je tedy vysoce významným faktorem při těchto experimentech. Co se týká hmotnosti vysušených semen, byly zjištěny rozdíly mezi hromadně váženými semeny. Nejnižší hodnota jednoho vysušeného semene byla zjištěna u křížení NSD, kde byly ošetřeny jen hrozny paclobutrazolem při 50 ppm. Nejvyšší hodnota přesahovala nejnižší hodnotu více než třikrát a byla zjištěna u křížení NCL, kde byly ošetřeny jen hrozny daminozidem při 1700 ppm. 71

80% 70% abc a ab Semena s endospermem [%] 60% 50% 40% 30% 20% abcd abcd bcd d abcd abcd cd abcd abcd abcd 10% 0% Daminozid při 425 ppm Daminozid při 1700 ppm Paclobutrazol při 50 ppm Paclobutrazol při 100 ppm Ošetření antigibereliny Chlormequat při 360 ppm Chlormequat při 1440 ppm Kontrola Jen hrozny Celý keř Obrázek 1: Procentuální obsah endospermu při jednotlivých ošetřeních antigibereliny u odrůdy Neptún; sloupce označené stejnými písmeny se neliší od sebe (Tukeyův test HSD, α = 0,05) 20% 18% a a 16% Semena s endospermem [%] 14% 12% 10% 8% 6% 4% a a a a a 2% 0% Daminozid při 425 ppm Daminozid při 1700 ppm Paclobutrazol při 50 ppm Paclobutrazol při 100 ppm Chlormequat při 360 ppm Chlormequat při 1440 ppm Kontrola Ošetření antigibereliny Celý keř Obrázek 2: Procentuální obsah endospermu při jednotlivých ošetřeních antigibereliny u odrůdy Jupiter; sloupce označené stejnými písmeny se neliší od sebe (Tukeyův test HSD, α = 0,05) Tabulka III: Hmotnost vysušených semen u jednotlivých ošetření antigibereliny Křížení Ošetření antigibereliny Způsob ošetření Počet semen Hmotnost 1 semene [mg] NKL Daminozid při 425 ppm Celý keř 16 8,7 NCL Daminozid při 1700 ppm Jen hrozny 1 14,3 72

NKL Daminozid při 1700 ppm Jen hrozny 7 8,5 NKL Daminozid při 1700 ppm Celý keř 18 6,8 NSD Paclobutrazol při 50 ppm Jen hrozny 112 4,7 NKL Paclobutrazol při 50 ppm Celý keř 14 7,4 NKL Paclobutrazol při 50 ppm Celý keř 3 10,4 NSD Paclobutrazol při 100 ppm Jen hrozny 43 5,2 NKL Chlormequat při 360 ppm Jen hrozny 14 8,3 NKL Chlormequat při 1440 ppm Jen hrozny 22 13,6 NKL Chlormequat při 1440 ppm Jen hrozny 68 8,7 NR3 Chlormequat při 1440 ppm Jen hrozny 38 10,0 5.4 Diskuse Je nespornou skutečností, že odrůda sehrává velmi významnou roli při realizaci uvedených pokusů a její maskovací efekt u zkoumaných znaků se projevuje velmi výrazně. Rozdíl mezi odrůdami plně dává smysl předchozí kapitole, kde se hledaly nejvhodnější genotypy pro explantátovou kultivaci. Ačkoliv ošetření antigibereliny nevedlo k normálním semenům s tvrdým osemením, byla získána i semena s endospermem s měkkým osemením, která až na jejich osemení lze považovat za taková, která jsou blízká normálním semenům. Z důvodu měkkého osemení však nesnášejí vysušení: jsou-li vysušeny a vysety, klíčí jen velmi pozvolna, z více než 300 (Tab. III) takhle in vivo vysetých semen jsme získali jen jednu rostlinu (data neuvedena). Nejvýznamnějším sledovaným znakem se jeví procentuální obsah endospermu, ale hmotnost jednoho semene u jednotlivých variant je také proměnlivá (Tab. III). Co se týká procentuálního obsahu endospermu, lze konstatovat, že hodnoty u Neptúnu jsou značně vysoké, dosahují až 70% a absolutní hodnotou v několika případech převyšují i kontrolu (Obr. 1). U Jupiteru zase kontrole patří nejvyšší hodnota (Obr. 2). Je otázkou, do jaké míry se vyplatí používat silný Tukeyův test HSD: faktem je, že rozdíly určené týmto testem je možné považovat za pevně potvrzené. Fisherův test LSD by určitě rozpoznal více rozdílů, ale tyto rozdíly lze spíše považovat za takové, které jsou vhodné pro další ověření. Dále je otázkou, do jaké míry lze považovat antigibereliny za užitečné, protože je známé, že gibereliny také hrají důležitou roli před a po opylení. V případě odrůdy Jupiter 73

většinou měly negativní vliv, ale bylo by vhodné analyzovat a hlavně vysledovat chování jednotlivých květenství. Načasování postřiku je totiž velmi složitým úkolem, protože jednotlivá květenství se nacházejí v různých fenologických stádiích a kvetení v rámci jednotlivých květenství také není jednotné, zvláště ve středoevropských podmínkách. Ošetření celého keře chlormequatem při obou koncentracích a ošetření hroznů paclobutrazolem při 50 ppm u Neptúnu lze doporučit, ale zde také platí nutnost vysledování vhodného okamžiku ošetření. 5.5 Závěr Ve dvou letech 2004 a 2005 byly vykonány pokusy s aplikací antigiberelinů s neprůkaznými výsledky. Tři typy antigiberelinů ve dvou koncentracích, aplikované zhruba tři týdny před kvetením jako vodné roztoky nevedly k tvorbě normálních semen u sledovaných odrůd Jupiter a Neptún. Ze zkoumaných znaků přítomnost endospermu lze označit za nejdůležitější, který významně může usnadnit následnou explantátovou kultivaci. Takto vypěstovaná semena lze označit za semena, která nesnáší vysušení. Otázkou zůstává, jak by klíčila tato semena v podmínkách in vivo hned po preparaci z bobulí. V rámci tohoto pokusu byl zaznamenán důležitý poznatek, že Neptún lze považovat za slibnou odrůdu, která dost často obsahuje endosperm v semenech. 74

6. ZYGOTICKÁ EMBRYOGENEZE 6.1 Úvod Zygotická embryogeneze umožňuje získání celistvých rostlin z kultivovaných stenospermických semen révy vinné v podmínkách in vitro. V podmínkách, kde nejdůležitější roli hraje genotyp, období založení explantátové kultury, tj. fyziologický stav kultivovaných semen a kultivační médium, kultivovaná semena buď klíčí přímo, anebo jen po preparaci embryí vyžadující časově i pracovně náročné práce pod mikroskopem. Šlechtění na bezsemennost u révy vinné má u nás bohatou tradici, ale explantátové kultury stenospermických semen nebyly u nás použity. Explantátové kultury byly založeny s cílem otestovat lokální odrůdy a získat potomstva z křížení dvou stenospermokarpicky bezsemenných odrůd v období 2004 2006. 6.2 Materiál a metody Explantátová kultivace probíhala dle standardních postupů. Explantátové kultury byly založeny do předem připravených, autoklávovaných médií, která byla buď ve zkumavkách, anebo v baňkách. Během autoklávování laboratorní sklo bylo uzavřeno alobalem nebo víčky, po použití pro kultivaci potravinářskou fólií. Kultivace probíhala v temperované místnosti zhruba při 26 o C při umělém osvětlení zářivkami. Sterilizace povrchu bobulí probíhala nejprve pomocí HgCl 2 (0,1%, 5 min) pak nad plamenem. Byla snaha minimalizovat jednotlivé zákroky a podle tohoto principu se zkoušelo nasledovně: v prvním pokusném roku 2004 se vybraly 2 odrůdy: Jupiter cílevědomě a Carina pokusně, u Jupiteru byly použity 3 antigibereliny ve 2 koncentracích, explantátové kultury byly založeny zhruba těsně po zaměkání bobulí a bylo použito jednoduché médium Tukay, po mikroskopování pak zejména složitější médium BD, ale bez fytohormonů. V druhém pokusném roku 2005 se vybralo 7 odrůd, Jupiter a Neptún (na základě kladné odpovědi semen pocházejících z volného opylení v roku 2004) cílevedomě a Cardinal, Mars, Rusalka 3, Sugraone a Venuša pokusně, u Jupiteru a Neptúnu byly použity 75

3 antigibereliny ve 2 koncentracích, u Neptúnu byly také testovány 2 způsoby ošetření, explantátové kultury byly založeny zhruba těsně po zaměkání bobulí a bylo použito složitější médium BD s aktivním uhlím, ale bez fytohormonů, po mikroskopování pak zejména média MS3 bez aktivního uhlí a BD s aktivním uhlím i bez něj, ojediněle médium PR s 1 mg.l -1 BAP. Ve třetím pokusném roku 2006 se vybraly 4 odrůdy, Jupiter, Kišmiš lučistyj, Neptún a Rusalka 3, všechny cílevedomě, nebyly použity antigibereliny, ale byla snaha vybírat slabě rostoucí letorosty včetně zálistkových letorostů, explantátové kultury byly založeny zhruba těsně po zaměkání bobulí a bylo použito složitější médium BD1 s aktivním uhlím i fytohormony, médium BD s aktivním uhlím, ale i bez něj, pokusně pak médium PR1, po mikroskopování pak BD2 a MS3 (pro složení a citace použitých kultivačních médií viz Tab. IV až XVI v Příloze). 6.3 Výsledky Celková charakteristika explantátových kultur založených v pokusném období 2004-2006 je shrnuta v Tab. I, kde lze nalézt data jak za celé pokusné období, tak za jednotlivé pokusné roky. Jsou zde zahrnuty plánované pokusy většinou podle plánovaných křížení, ale nejsou zde zahrnuty stenospermická (SS) i normální semena, která byla použita s testovacím účelem v prvním roku pokusů (např. volné opylení z odrůdy Neptún v roce 2004 atd.) Celkový počet plánovitě kultivovaných semen v pokusném období činí 2146 semen, ze kterých úspěšně bylo kultivováno 1446 semen, tj. 67,4%. Zbylých 700 semen padly za oběť různým infekcím, zejména plísním a bakteriím, výjimečně neinvazivním saprofytům (v roce 2005). Explantátové kultury byly založeny buď ve zkumavkách, anebo v baňkách. Zkumavky jsou z hlediska infekcí při založení bezpečnější, práce s nimi je však pomalejší. Baňky skýtají rychlejší práci při založení, ale často jsou ohroženy infekcemi, které se většinou týkají jen jednoho semene v baňce, ale ohrožují celý její obsah. Toto lze vyčíst i z Tab. I, kde zkumavkám v obou ročnících, kdy byly použity, patří vyšší úspěšnost při založení (80,5% u zkumavek vs. 69,2% u baněk v roce 2004 a 93,1% u zkumavek vs. 55,8% u baněk v roce 2006). 76

Jsou-li úspěšně založeny, explantátové kultury nevyžadují manuální péči, čeká se na klíčení kultivovaných semen. S cílem minimalizovat manuální práce a navodit přímé klíčení ( direct germination, DG) byly zkoušeny různé metody, počínaje výběrem vhodných genotypů (viz kapitolu 4: Atlas bezsemenných stolních odrůd révy), přes ošetření antigibereliny (viz kapitolu 5: Polní pokusy s antigibereliny ) a konče výběrem vhodného kultivačního média (tato kapitola). Počet všech, úspěšně i neúspěšně založených stenospermických semen kultivovaných in vitro v období 2004 2006 dle křížení, jako i procentuální úspěšnost kultivace stenospermických semen in vitro v jednotlivých letech pokusů dle křížení uvádí Tab. IV až XX. Přímé klíčení v jednotlivých pokusných letech nabylo různé procentuální hodnoty (Tab. II). Zatímco v pokusném ročníku 2004 přímo vyklíčilo jen 3,6% / 12,1% (DG/n = 12/334, DG/E = 12/99) semen, v dalších letech došlo k výraznému povýšení této hodnoty: k 41,9% / 63,3% (DG/n=338/806, DG/E = 338/534) v roce 2005 a k 41,8% / 68,0% (DG/n = 115/275, DG/E = 115/169) v roce 2006. Celkově za pokusné období 2004-2006 přímo vyklíčilo 465 z 1415 úspěšně kultivovaných semen, tj. 32,9% a 465 z 802 semen obsahujících embryo, tj. 58,0% (Tab. II), přitom za směrodatné by se měl považovat údaj DG/E, v souladu s dosud publikovanými pracemi (např. BURGER a TRAUTMANN, 2000). Porovnáme-li procenta patřící k nosným genotypům (Jupiter a Neptún) v jednotlivých letech, zjistíme, že se postupně povedlo povýšit procento přímého klíčení u Jupiteru, při zachování vysoké hodnoty u Neptúnu (Tab. XXI). Nutno poznamenat, že v roce 2005 byla převážně použita půlená semena a v letech 2004 a 2006 převážně semena celá. V roce 2005 u odrůdy Neptún většinou byla použita jen semena s endospermem. Přímé klíčení stenospermických semen je tedy realizovatelné dokonce ve vysokých procentech, nicméně neznamená automatickou cestu vytvoření celistvých rostlin. Jak je to patrné z Obr. 1 a 2, které poukazují na původ celistvých rostlin, v některých případech cesta vede přes deformované stádium budoucích rostlin. Téměř ve všech případech pak jsou semena, která neklíčí ani po delším období kultivace a vyžadují preparaci embrya. U dvou (všech) hroznů z odrůdy Kišmiš lučistyj (KLSPA a KLSPB) a u jednoho hroznu z odrůdy Jupiter (JB3) se povedlo získat celistvé rostliny jen cestou preparace embrya. V prvním roce pokusů (rok 2004) se testovalo, jak účinná je aplikace antigiberelinů. Poté, co ani jedna z použitých kombinací nevedla k normálním semenům 77

u odrůdy Jupiter, byla použita explantátová kultivace takto vypěstovaných semen. S cílem testování účinnosti antigiberelinů bylo vybráno jednoduché médium Tukay. Tato sestava však nevedla k žádaným výsledkům: úspěšně kultivovaná semena klíčila jen velmi neochotně a sporadicky (Tab. II). Následovala preparace embryí pod mikroskopem, která však z důvodu nerutinnosti většinou byla infikována. Takto v prvním roce pokusů se podařilo vypěstovat skutečně málo rostlin, které byly celistvé, celkem 4 z plánovaného křížení JKM, JR3, JSD a JCL, ze kterých zatím JKM_85 vstoupil do plodnosti (Obr. 6.55 a 6.56 v Příloze) a JCL vykazoval panašování listů. Pokusně kultivovaná semena z volného opylení u odrůdy Neptún klíčila většinou do 3 týdnů a dost razantně i přímo (data neuvedená). Toto bylo důvodem začlenění odrůdy Neptún do plánovitých křížení v dalších letech 2005 a 2006. V roce 2005 se podařilo vypěstovat 142 rostlin (Tab. XVII a XVIII), v roce 2006 pak 53 rostlin (Tab. XIX a XX). Za pokusné období 2004 2006 tedy bylo získáno celkem 4 + 142 + 53 = 199 rostlin, které mohly být vysazeny do vinohradu. Je potřeba ještě poukázat na výrazný rozdíl v počtu mezi semeny embryo obsahujícími (99) a semeny s embryem, která mohla být kultivována po mikroskopování (68) v roce 2004 u odrůdy Jupiter. Lze to jednoznačně přičíst příliš dlouhé době intaktní kultivace před mikroskopováním: a skutečně, hodně embryí odumřelo z toho důvodu, že nemohla prorazit osemení. Určitě to také souvisí s nízkým počtem semen s endospermem (18,8%), alespoň ve srovnání s následujícími ročníky: 47,5% v roce 2005 a 17,8 57,1% (minimální a maximální hodnota u CSS s uvážením, že přímo vyklíčená semena obsahovala i endosperm) v roce 2006. Je potřebné zmínit ještě pokus s BAP, ke kterému došlo v roce 2006. Na médiu PR1 s 1 mg.l -1 BAP kultivovaná semena ze samoopylení Jupiteru (JSPA) v počtu 50 semen tvořila intenzivní kalus z osemení, ale ke klíčení embryí došlo jen velmi sporadicky. Dlouhodobá kultivace na tomto médiu pak vedla k inhibici tvorby kořenů (Obr. 6.44 v Příloze). Tato semena byla mikroskopována jen částečně (19 semen), proto ten rozdíl v počtu semen (306 vs. 275 semen) v Tab. I a II. 78

Tabulka I: Celková charakteristika explantátových kultur založených v pokusném období 2004-2006 Rok Počet všech Počet úspěšně Počet neúspěšně kultivovaných SS z důvodu Úspěšnost kultivace kultivovaných SS kultivovaných SS saprofytů bakterií plísní Celkem Kvasinky SS [%] 2004 424 (= 359 + 65) 334 (= 289 + 45) 0 0 90 90 ano 78,8 (80,5 vs. 69,2) 2005 1289 (= 0 + 1289) 806 (= 0 + 806) 24 327 132 483 ne 62,5 2006 433 (= 173 + 260) 306 (= 161 + 145) 0 21 106 127 ne 70,7 (93,1 vs. 55,8) Celkem 2146 (532 + 1614) 1446 (450 + 996) 24 348 328 700 67,4 (84,6 vs. 61,7) *SS znamená stenospermická semena, včetně semen odrůdy Cardinal se sklerifikovaným osemením (tzv. dutá semena); zkumavky jsou tučně zvýrazněny, nezvýrazněná čísla patří baňkám Tabulka II: Přímé klíčení explantátových kultur založených v pokusném období 2004-2006 Rok DG Mikroskopovaná SS n DG/n [%] E DG/E [%] 2004 12 322 334 3,6 99 12,1 2005 338 468 806 41,9 534 63,3 2006 115 160 275 41,8 169 68,0 Celkem 465 950 1415 32,9 802 58,0 79

Tabulka III: Počet všech kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2004 dle křížení J* CL D KM L R3 SD Σ 8/12 15 34 33 14 39 135 8/18 17 15 10 11 8 61 8/23 10 7 20 37 8/39 4 10 9 11 34 8/51 3 3 25 1 7 39 8/57 6 7 7 4 6 30 8/64 14 64 78 Σ 32 28 78 139 46 91 414 C 10 10 * 8/n představují jednotlivé keře ošetřené různými antigibereliny Σ 424 Tabulka IV: Počet úspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2004 dle křížení J* CL D KM L R3 SD Σ 8/12 15 24 32 13 36 120 8/18 16 0 9 10 7 42 8/23 10 7 16 33 8/39 4 10 9 11 34 8/51 2 3 20 1 7 33 8/57 6 7 4 4 6 27 8/64 12 23 35 Σ 31 12 65 89 44 83 324 C 10 10 * 8/n představují jednotlivé keře ošetřené různými antigibereliny Σ 334 Tabulka V: Počet neúspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2004 dle křížení J* CL D KM L R3 SD Σ 8/12 0 10 1 1 3 15 8/18 1 15 1 1 1 19 8/23 0 0 4 4 8/39 0 0 0 0 0 8/51 1 0 5 0 0 6 8/57 0 0 3 0 0 3 8/64 2 41 43 80

Σ 1 16 13 50 2 8 90 C 0 0 * 8/n představují jednotlivé keře ošetřené různými antigibereliny Tabulka VI: Procentuální úspěšnost kultivace stenospermických semen in vitro v roce 2004 dle křížení J* CL D KM L R3 SD Průměr [%] 8/12 100 71 97 93 92 89 8/18 94 0 90 91 88 69 8/23 100 100 80 89 8/39 100 100 100 100 100 8/51 67 100 80 100 100 85 8/57 100 100 57 100 100 90 8/64 86 36 45 Průměr [%] 97 43 83 64 96 91 78 C 100 100 * 8/n představují jednotlivé keře ošetřené různými antigibereliny Tabulka VII: Počet všech kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2005 dle křížení J* 12/5 IA KL MO PA PN VS OP Σ 8/12 17 8 25 8/18 28 4 101 133 8/23 17 171 16 21 225 8/28 10 10 8/39 34 46 80 8/51 24 24 8/57 30 30 8/74 66 66 8/78 7 7 Σ 54 51 338 20 8 21 7 101 600 N* BA CL KL MO R3HP SD OP Σ 37/4 13 13 37/16 2 13 8 23 37/19 8 13 12 33 37/23 75 75 37/27 9 9 37/32 8 8 37/40 7 7 37/44 2 2 81

37/47 135 135 37/55 54 54 37/62 30 30 37/62II 49 49 Σ 2 13 302 8 13 87 13 438 PN SP OP Σ CL 3 82 85 J 27 27 MS 14 14 R3 82 82 SS 19 19 V 24 24 Σ 3 82 166 251 * 8/n a 37/n představují jednotlivé keře ošetřené různými antigibereliny Σ 1289 Tabulka VIII: Počet úspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2005 dle křížení J* 12/5 IA KL MO PA PN VS OP Σ 8/12 17 8 25 8/18 8 4 30 42 8/23 15 96 11 21 143 8/28 0 0 8/39 15 28 43 8/51 24 24 8/57 19 19 8/74 39 39 8/78 0 0 Σ 43 30 188 15 8 21 0 30 335 % 80 59 56 75 100 100 0 30 56 N* BA CL KL MO R3HP SD OP Σ 37/4 11 11 37/16 2 13 8 23 37/19 8 1 4 13 37/23 68 68 37/27 9 9 37/32 5 5 37/40 7 7 37/44 0 0 82

37/47 76 76 37/55 38 38 37/62 10 10 37/62II 31 31 Σ 2 13 187 5 1 72 11 291 % 100 100 62 63 8 83 85 66 PN SP OP Σ CL 3 61 64 J 26 26 MS 14 14 R3 52 52 SS 5 5 V 19 19 Σ 3 61 116 180 % 100 74 70 72 * 8/n a 37/n představují jednotlivé keře ošetřené různými antigibereliny Σ 806 Tabulka IX: Počet neúspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2005 dle křížení J* 12/5 IA KL MO PA PN VS OP Σ 8/12 0 0 0 8/18 20 0 71 91 8/23 2 75 5 0 82 8/28 10 10 8/39 19 18 37 8/51 0 0 8/57 11 11 8/74 27 27 8/78 7 7 Σ 11 21 150 5 0 0 7 71 265 N* BA CL KL MO R3HP SD OP Σ 37/4 2 2 37/16 0 0 0 0 37/19 0 12 8 20 37/23 7 7 37/27 0 0 37/32 3 3 37/40 0 0 37/44 2 2 83

37/47 59 59 37/55 16 16 37/62 20 20 37/62II 18 18 Σ 0 0 115 3 12 15 2 147 PN SP OP Σ CL 0 21 21 J 1 1 MS 0 0 R3 30 30 SS 14 14 V 5 5 Σ 0 21 50 71 483 * 8/n a 37/n představují jednotlivé keře ošetřené různými antigibereliny Tabulka X: Procentuální úspěšnost kultivace stenospermických semen in vitro v roce 2005 dle křížení J 12/5 IA KL MO PA PN VS OP Průměr [%] 8/12 100 100 100 8/18 29 100 30 32 8/23 88 56 69 100 64 8/28 0 0 8/39 44 61 54 8/51 100 100 8/57 63 63 8/74 59 59 8/78 0 0 Průměr [%] 80 59 56 75 100 100 0 30 56 N BA CL KL MO R3HP SD OP % 37/4 85 85 37/16 100 100 100 100 37/19 100 8 33 39 37/23 91 91 37/27 100 100 37/32 63 63 37/40 100 100 37/44 0 0 37/47 56 56 37/55 70 70 37/62 33 33 37/62II 63 63 84

Průměr [%] 100 100 62 63 8 83 85 66 PN SP OP % CL 100 74 75 J 96 96 MS 100 100 R3 63 63 SS 26 26 V 79 79 % Průměr [%] 100 74 70 72 63 * 8/n a 37/n představují jednotlivé keře ošetřené různými antigibereliny Tabulka XI: Počet všech kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2006 dle křížení 2006* B2 B3 EB KL R3 SP Σ J 2 1 20 23 A 59 28 87 B 84 84 C 51 51 D 30 30 KL A 33 33 B 34 34 N 46 20 66 R3 25 25 Σ 2 1 46 20 20 84 260 433 *A-D značí jednotlivé hrozny, SP znamená self pollination (samoopylení) Tabulka XII: Počet úspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2006 dle křížení 2006* B2 B3 EB KL R3 SP Σ J 2 1 20 23 A 59 0 59 B 55 55 C 25 25 D 30 30 85

KL A 11 11 B 24 24 N 39 19 58 R3 21 21 Σ 2 1 39 20 19 80 145 306 *A-D značí jednotlivé hrozny, SP znamená self pollination (samoopylení) Tabulka XIII: Počet neúspěšně kultivovaných stenospermických semen in vitro v roce 2006 dle křížení 2006* B2 B3 EB KL R3 SP Σ J 0 0 0 0 A 0 28 28 B 29 29 C 26 26 D 0 0 KL A 22 22 B 10 10 N 7 1 8 R3 4 4 Σ 0 0 7 0 1 4 115 127 *A-D značí jednotlivé hrozny, SP znamená self pollination (samoopylení) Tabulka XIV: Procentuální úspěšnost kultivace stenospermických semen in vitro v roce 2006 dle křížení 2006* B2 B3 EB KL R3 SP Průměr [%] J 100 100 100 100 A 100 0 68 B 65 65 C 49 49 D 100 100 KL A 33 33 86

B 71 71 N 85 95 88 R3 84 84 Průměr [%] 100 100 85 100 95 95 56 71 *A-D značí jednotlivé hrozny, SP znamená self pollination (samoopylení) Tabulka XV: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2004, zde tříděno dle ošetřených keřů Keř J K DG END E EK SE SEK n E/n [%] 8/12 CL 0 0 0 3 1 0 0 15 20,0 8/12 KM 5 0 2 9 4 2 1 24 37,5 8/12 L 2 0 0 1 1 0 0 32 3,1 8/12 R3 1 0 1 2 1 0 0 13 15,4 8/12 SD 6 2 17 12 10 2 2 36 33,3 8/18 CL 5 0 5 5 4 0 0 16 31,3 8/18 KM 2 0 3 3 3 0 0 9 33,3 8/18 R3 0 1 1 4 2 1 1 10 40,0 8/18 SD 0 0 1 4 2 0 0 7 57,1 8/23 KM 2 1 1 4 3 0 0 10 40,0 8/23 R3 1 0 1 2 1 0 0 7 28,6 8/23 SD 8 1 3 11 9 1 1 16 68,8 8/39 D 0 0 1 2 2 0 0 4 50,0 8/39 L 1 1 2 3 3 0 0 10 30,0 8/39 R3 1 0 1 2 1 0 0 9 22,2 8/39 SD 3 1 1 6 2 0 0 11 54,5 8/51 D 0 0 0 1 1 0 0 2 50,0 8/51 KM 0 0 0 2 1 0 0 3 66,7 8/51 L 5 0 5 11 9 0 0 20 55,0 8/51 R3 0 0 0 0 0 0 0 1 0,0 8/51 SD 4 1 1 1 1 0 0 7 14,3 8/57 D 0 0 1 0 0 0 0 6 0,0 8/57 KM 1 1 2 1 1 0 0 7 14,3 8/57 L 1 1 3 1 1 0 0 4 25,0 8/57 R3 0 0 0 0 0 0 0 4 0,0 8/57 SD 1 1 2 4 2 1 1 6 66,7 8/64 KM 3 0 6 4 2 0 0 12 33,3 8/64 L 0 1 1 1 1 1 0 23 4,3 Σ 52 12 61 99 68 8 6 324 30,6 % 16,0 3,7 18,8 30,6 21,0 2,5 1,9 C R3 0 0 0 0 0 0 0 10 0,0 87

Tabulka XVI: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2004, zde tříděno dle procentuálního obsahu embryí Keř J K DG END E EK SE SEK n E/n [%] 8/51 R3 0 0 0 0 0 0 0 1 0,0 8/57 D 0 0 1 0 0 0 0 6 0,0 8/57 R3 0 0 0 0 0 0 0 4 0,0 8/12 L 2 0 0 1 1 0 0 32 3,1 8/64 L 0 1 1 1 1 1 0 23 4,3 8/51 SD 4 1 1 1 1 0 0 7 14,3 8/57 KM 1 1 2 1 1 0 0 7 14,3 8/12 R3 1 0 1 2 1 0 0 13 15,4 8/12 CL 0 0 0 3 1 0 0 15 20,0 8/39 R3 1 0 1 2 1 0 0 9 22,2 8/57 L 1 1 3 1 1 0 0 4 25,0 8/23 R3 1 0 1 2 1 0 0 7 28,6 8/39 L 1 1 2 3 3 0 0 10 30,0 8/18 CL 5 0 5 5 4 0 0 16 31,3 8/12 SD 6 2 17 12 10 2 2 36 33,3 8/18 KM 2 0 3 3 3 0 0 9 33,3 8/64 KM 3 0 6 4 2 0 0 12 33,3 8/12 KM 5 0 2 9 4 2 1 24 37,5 8/18 R3 0 1 1 4 2 1 1 10 40,0 8/23 KM 2 1 1 4 3 0 0 10 40,0 8/39 D 0 0 1 2 2 0 0 4 50,0 8/51 D 0 0 0 1 1 0 0 2 50,0 8/39 SD 3 1 1 6 2 0 0 11 54,5 8/51 L 5 0 5 11 9 0 0 20 55,0 8/18 SD 0 0 1 4 2 0 0 7 57,1 8/51 KM 0 0 0 2 1 0 0 3 66,7 8/57 SD 1 1 2 4 2 1 1 6 66,7 8/23 SD 8 1 3 11 9 1 1 16 68,8 Σ 52 12 61 99 68 8 6 324 30,6 % 16,0 3,7 18,8 30,6 21,0 2,5 1,9 C R3 0 0 0 0 0 0 0 10 0,0 88

Tabulka XVII: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2005, zde tříděno dle procentuálního obsahu embryí Keř K DG END E D EO EK SE SEK NE1 NE2 NDEF NEMB N N n E/n [%] N/n [%] MS OP 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0,0 0,0 CL SP 0 0 5* 5* 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 61 8,2 0,0 V OP 0 2 1 2 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 19 10,5 0,0 J MO 8/18 3 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 4 25,0 0,0 J 12/5 8/57 0* 0 0 6 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 19 31,6 0,0 J PN 8/23 21 4 1 7 2 0 7 2 2 1 0 1 1 3 1 21 33,3 14,3 J IA 8/39 13 0 4 6 0 0 6 2 2 0 0 0 1 1 1 15 40,0 6,7 J KL 8/12 12* 1 4 7 0 1 6 0 0 0 0 0 2 2 1 17 41,2 11,8 J 12/5 8/51 21 6 2 10 5 0 10 2 2 0 0 0 0 0 0 24 41,7 0,0 J PA 8/12 7 0 1 4 0 0 3 1 1 0 0 0 1 1 1 8 50,0 12,5 J KL 8/39 25 7 8 14 7 0 14 2 2 0 0 4 1 5 4 28 50,0 17,9 J MO 8/23 0* 1 1 6 1 0 5 0 0 0 0 0 1 1 1 11 54,5 9,1 SS OP 0 0 0 3 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 5 60,0 0,0 J KL 8/23 27* 45 2 62 43 0 62 8 8 1 0 10 4 15 3 96 64,6 15,6 J IA 8/23 6* 1 0 10 0 0 8 0 0 0 1 0 1 2 1 15 66,7 13,3 J KL 8/74 21* 14 4 26 13 0 26 3 3 0 0 4 2 6 2 39 66,7 15,4 N SD 37/19 4 2 4 3 1 0 3 0 0 1 0 0 0 1 1 4 75,0 25,0 N KL 37/16 6 2 8 6 0 0 6 2 2 2 0 0 2 4 4 8 75,0 50,0 J KL 8/18 7 2 6 6 0 0 6 1 1 0 1 0 3 4 3 8 75,0 50,0 J OP 0* 17 8* 20 17 0 20 7 7 0 0 3,5 1,5 5 0 26 76,9 19,2 N KL 37/27 0 4 9 7 1 0 7 0 0 3 0 0 2 5 5 9 77,8 55,6 N MO 37/32 0 2 5 4 2 0 4 1 1 0 0 1 2 3 3 5 80,0 60,0 N KL 37/62 7 4 10 8 1 0 8 1 1 2 1 1 4 8 6 10 80,0 80,0 N KL 37/62II 22 18 31 26 11 0 26 3 3 5 0 1 3 9 4 31 83,9 29,0 R3 OP 0 44 36* 44 35 0 44 13 13 6 1 10,5 1,5 19 5 52 84,6 36,5 89

N OP 37/4 0* 8 8* 10 1 0 10 2 2 5 0,66 0,66 0,68 7 0 11 90,9 63,6 N SD 37/23 8 40 67 62 10 0 59 2 2 26 3 7 10 46 25 68 91,2 67,6 N KL 37/47 14 51 72* 70 20 0 70 5 5 29 1,5 10,5 14 55 40 76 92,1 72,4 N CL 37/16 6 8 13 12 0 0 12 0 0 5 0 0 3 8 1 13 92,3 61,5 J OP 8/18 0* 22 6* 28 22 0 27 0 0 0 0 1,5 1,5 3 1 30 93,3 10,0 CL PN 0 0 3 3 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 3 100,0 0,0 N KL 37/40 3 7 7 7 0 0 7 2 2 3 1 0 0 4 4 7 100,0 57,1 N KL 37/19 4 6 8 8 0 0 8 1 1 4 0,5 0 0,5 5 5 8 100,0 62,5 N KL 37/55 17 18 38 38 8 1 36 1 1 7 2 4 13 26 18 38 100,0 68,4 N BA 37/16 0 1 2 2 0 0 2 0 0 1 0 0 1 2 2 2 100,0 100,0 N R3+HP 37/19 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 100,0 100,0 Σ 254* 338 383* 534 204 2 520 61 61 102 12,66 59,66 76,68 251 142 806 66,3 31,1 * značí minimální počet Tabulka XVIII: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2005, zde tříděno dle procentuálně získaných jednotlivých genotypů in vitro Keř K DG END E D EO EK SE SEK NE1 NE2 NDEF NEMB N N n E/n [%] N/n [%] J MO 8/18 3 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 4 25,0 0,0 J 12/5 8/51 21 6 2 10 5 0 10 2 2 0 0 0 0 0 0 24 41,7 0,0 J 12/5 8/57 0* 0 0 6 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 19 31,6 0,0 CL PN 0 0 3 3 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 3 100,0 0,0 CL SP 0 0 5* 5* 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 61 8,2 0,0 MS OP 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0,0 0,0 SS OP 0 0 0 3 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 5 60,0 0,0 V OP 0 2 1 2 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 19 10,5 0,0 J IA 8/39 13 0 4 6 0 0 6 2 2 0 0 0 1 1 1 15 40,0 6,7 90

J MO 8/23 0* 1 1 6 1 0 5 0 0 0 0 0 1 1 1 11 54,5 9,1 J OP 8/18 0* 22 6* 28 22 0 27 0 0 0 0 1,5 1,5 3 1 30 93,3 10,0 J KL 8/12 12* 1 4 7 0 1 6 0 0 0 0 0 2 2 1 17 41,2 11,8 J PA 8/12 7 0 1 4 0 0 3 1 1 0 0 0 1 1 1 8 50,0 12,5 J IA 8/23 6* 1 0 10 0 0 8 0 0 0 1 0 1 2 1 15 66,7 13,3 J PN 8/23 21 4 1 7 2 0 7 2 2 1 0 1 1 3 1 21 33,3 14,3 J KL 8/74 21* 14 4 26 13 0 26 3 3 0 0 4 2 6 2 39 66,7 15,4 J KL 8/23 27* 45 2 62 43 0 62 8 8 1 0 10 4 15 3 96 64,6 15,6 J KL 8/39 25 7 8 14 7 0 14 2 2 0 0 4 1 5 4 28 50,0 17,9 J OP 0* 17 8* 20 17 0 20 7 7 0 0 3,5 1,5 5 0 26 76,9 19,2 N SD 37/19 4 2 4 3 1 0 3 0 0 1 0 0 0 1 1 4 75,0 25,0 N KL 37/62II 22 18 31 26 11 0 26 3 3 5 0 1 3 9 4 31 83,9 29,0 R3 OP 0 44 36* 44 35 0 44 13 13 6 1 10,5 1,5 19 5 52 84,6 36,5 N KL 37/16 6 2 8 6 0 0 6 2 2 2 0 0 2 4 4 8 75,0 50,0 J KL 8/18 7 2 6 6 0 0 6 1 1 0 1 0 3 4 3 8 75,0 50,0 N KL 37/27 0 4 9 7 1 0 7 0 0 3 0 0 2 5 5 9 77,8 55,6 N KL 37/40 3 7 7 7 0 0 7 2 2 3 1 0 0 4 4 7 100,0 57,1 N MO 37/32 0 2 5 4 2 0 4 1 1 0 0 1 2 3 3 5 80,0 60,0 N CL 37/16 6 8 13 12 0 0 12 0 0 5 0 0 3 8 1 13 92,3 61,5 N KL 37/19 4 6 8 8 0 0 8 1 1 4 0,5 0 0,5 5 5 8 100,0 62,5 N OP 37/4 0* 8 8* 10 1 0 10 2 2 5 0,66 0,66 0,68 7 0 11 90,9 63,6 N SD 37/23 8 40 67 62 10 0 59 2 2 26 3 7 10 46 25 68 91,2 67,6 N KL 37/55 17 18 38 38 8 1 36 1 1 7 2 4 13 26 18 38 100,0 68,4 N KL 37/47 14 51 72* 70 20 0 70 5 5 29 1,5 10,5 14 55 40 76 92,1 72,4 N KL 37/62 7 4 10 8 1 0 8 1 1 2 1 1 4 8 6 10 80,0 80,0 N BA 37/16 0 1 2 2 0 0 2 0 0 1 0 0 1 2 2 2 100,0 100,0 N R3+HP 37/19 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 100,0 100,0 91

Σ 254* 338 383* 534 204 2 520 61 61 102 12,66 59,66 76,68 251 142 806 66,3 31,1 * značí minimální počet Tabulka XIX: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2006, zde tříděno dle procentuálního obsahu embryí K DG END E D EO EK SE SEK NE1 NE2 NDEF NEMB N N n E/n [%] N/n [%] KL SPB 0 3 0 5 3 0 5 0 0 0 0 0 1 1 1 24 20,8 4,2 J SPA 28* 6 1*-4** 13 2 2 11 2 2 3 1 0 2 6 5 28 46,4 21,4 N R3 0 9 5*-13** 11 4 1 10 3 3 5 0 0,5 1,5 7 7 19 57,9 36,8 N EB 0 14 13*-27** 23 3 2 21 0 0 11 0 0 3 14 8 39 59,0 35,9 J KL 18 7 3*-10** 12 0 1 11 2 2 7 0 0 3 10 9 20 60,0 50,0 KL SPA 0 0 0 7 0 0 7 0 0 0 0 0 1 1 1 11 63,6 9,1 J SPB 34 36 4*-40** 38 22 1 37 3 3 14 0 9 2 25 11 55 69,1 45,5 J SPD 12 18 2*-20** 21 13 0 19 1 1 5 0 3 0 8 2 30 70,0 26,7 J SPC 6 16 5*-21** 18 9 0 18 2 2 7 0 0,5 2,5 10 4 25 72,0 40,0 R3 SP 0 5 14*-19** 18 2 0 18 2 2 3 0 1 2 6 3 21 85,7 28,6 J B2 2 1 1*-2** 2 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 2 100,0 50,0 J B3 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 100,0 100,0 Σ 101 115 49*-157** 169 58 8 159 15 15 56 1 14 19 90 53 275 61,5 32,7 * značí minimální počet, ** maximální počet Tabulka XX: Celková charakteristika explantátových kultur založených v roce 2006, zde tříděno dle procentuálně získaných jednotlivých genotypů in vitro K DG END E D EO EK SE SEK NE1 NE2 NDEF NEMB N N n E/n [%] N/n [%] KL SPB 0 3 0 5 3 0 5 0 0 0 0 0 1 1 1 24 20,8 4,2 KL SPA 0 0 0 7 0 0 7 0 0 0 0 0 1 1 1 11 63,6 9,1 92

J SPA 28* 6 1*-4** 13 2 2 11 2 2 3 1 0 2 6 5 28 46,4 21,4 J SPD 12 18 2*-20** 21 13 0 19 1 1 5 0 3 0 8 2 30 70,0 26,7 R3 SP 0 5 14*-19** 18 2 0 18 2 2 3 0 1 2 6 3 21 85,7 28,6 N EB 0 14 13*-27** 23 3 2 21 0 0 11 0 0 3 14 8 39 59,0 35,9 N R3 0 9 5*-13** 11 4 1 10 3 3 5 0 0,5 1,5 7 7 19 57,9 36,8 J SPC 6 16 5*-21** 18 9 0 18 2 2 7 0 0,5 2,5 10 4 25 72,0 40,0 J SPB 34 36 4*-40** 38 22 1 37 3 3 14 0 9 2 25 11 55 69,1 45,5 J B2 2 1 1*-2** 2 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 2 100,0 50,0 J KL 18 7 3*-10** 12 0 1 11 2 2 7 0 0 3 10 9 20 60,0 50,0 J B3 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 100,0 100,0 Σ 101 115 49*-157** 169 58 8 159 15 15 56 1 14 19 90 53 275 61,5 32,7 * značí minimální počet, ** maximální počet Tabulka XXI: Absolutní a procentuální hodnoty přímo vyklíčených semen u nosných genotypů pokusů (Jupiter a Neptún) v jednotlivých letech pokusů Rok Odrůda DG n DG/n [%] E DG/E [%] 2004 J 12 324 3,7 99 12,1 2005 J 120 361 33,2 213 56,3 N 172 291 59,1 264 65,2 2006 J 84 192 43,8 105 80,0 N 23 58 39,7 34 67,6 Celkem J a N 411 1226 33,5 715 57,5 93

NKL 37/47 (55) NSD 37/23 (46) NKL 37/55 (26) R3OP (19) NKL 37/62II (9) NCL 37/16 (8) NOP 37/4 (7) NKL 37/19 (5) NKL 37/27 (5) NKL 37/40 (4) NKL 37/62 (8) NKL 37/16 (4) JKL 8/23 (15) JPN 8/23 (3) NBA 37/16 (2) NR3HP 37/19 (1) ; NSD 37/19 (1) JKL 8/74 (6) JOP (5) JKL 8/39 (5) JKL 8/18 (4) JOP 8/18 (3) NMO 37/32 (3) JIA 8/23 (2) JKL 8/12 (2) JMO 8/23 (1) JPA 8/12 (1) JIA 8/39 (1) 0% 20% 40% 60% 80% 100% NE1 NE2 NDEF NEMB z N Obrázek 1: Stoprocentní skládaný pruhový graf porovnávající procentuální příspěvek NE1 až NEMB k celkovému součtu N (v závorce) pro různá křížení v roce 2005, sestupně řazeno dle absolutního počtu NE1 94

JSPB (25) NEB (14) JKL (10) JSPC (10) NR3 (7) JSPD (8) R3SP (6) JSPA (6) JB2 (1) JB3 (1) KLSPA (1) KLSPB (1) 0% 20% 40% 60% 80% 100% NE1 NE2 NDEF NEMB z N Obrázek 2: Stoprocentní skládaný pruhový graf porovnávající procentuální příspěvek NE1 až NEMB k celkovému součtu N (v závorce) pro různá křížení v roce 2006, sestupně řazeno dle absolutního počtu NE1 95

6.4 Diskuse Zygotická embryogeneze u stenospermokarpických odrůd révy vinné je z hlediska získání potomků z křížení mezi dvěmi stenospermokarpicky bezsemennými odrůdami dost účinným nástrojem. Nejedná se přitom o techniku používanou prvně u révy vinné, ale tato můžeme říci dnes už celosvětově rutinní záležitost staví na poznatky zygotické embryogeneze u ostatních rostlinných kultur (MAHESHWARI, 1958; STEWART a HSU, 1977, 1978). Tento globální pohled na zygotickou embryogenezi však nutně musí být konfrontován s lokálními podmínkami a zvyklostmi. Jsou nimi především podnebí daného místa a typ klimatu, vyžadující i víceméně lokální odrůdy. A skutečně, na určité místo adaptované odrůdy mohou být pevným základem pro tuto činnost, pro tvorbu nových odrůd pomocí explantátových kultur in vitro, zygotickou embryogenezí. Tato část výrazně navazuje na předešlé kapitoly jak na Kapitolu 4: Atlas bezsemenných stolních odrůd révy vinné, zabývající se průzkumem odrůd, tak na Kapitolu 5: Polní pokusy s antigibereliny. Je tedy zřejmé, že řazení odrůd dle hmotnosti jejich semen a bobulí, ještě správněji však dle jejich celkové hmotnosti semen a bobulí, což zohledňuje i integritu bobule, je naprosto klíčové. Vytypování odrůdy Jupiter jako nosného genotypu pokusu se jevilo správným, poněvadž vedle cizokrajných odrůd Regal seedless a Sugraone Jupiter ukazuje nejlepší parametry z domácích odrůd z hlediska hmotnosti jejich semen a bobulí a současně tvoří skupinu 3B. Tyto poslední dvě jmenované odrůdy (Regal seedless a Sugraone) byly zahrnuty do atlasu jako zdroj informace o našem zimním trhu, neexistují z nich však rozsáhlé výsadby ani v České republice, ani na Slovensku. Jak je to z předešlých zřejmé, do třetí skupiny patří ještě dva genotypy: Edro bezseme (do skupiny 3A) a Venuša (do skupiny 3C). Toto zařazení je významnou pomůckou, ale netřeba to přecenit: je potřebné poznat i ostatní (hlavně agrotechnické) vlastnosti odrůd. Zatímco Edro bezseme patří mezi největší objevy atlasu (skupina 3A), Venuša s její měkkou konzistencí dužniny, lehkým vylamováním letorostů jarnými větry a vyšší hmotností stenospermických semen než u odrůdy Jupiter se jeví málo použitelným genotypem. Dále se naskytne otázka, jak jsou cenné odrůdy nižších skupin: 2A-C, nebo dokonce 1A. Začněme se skupinou odrůd 1A! Všechny tyto odrůdy mají stenospermická semena do 10 mg, bezsemennost kterou konzumenti jednoznačně vnímají jako bezsemennou. Je známé, že i odrůdy skupiny 1A mohly posloužit k založení explantátových kultur (např. Thompson seedless (EMERSHAD a RAMMING, 1984)) a došlo 96

i k opětovnému vypěstování semenáčů z takto zakrnělých semen těchto odrůd. Tento přístup má však spíše teoretické uplatnění. I kdyby došlo k vypěstování semenáčů z křížení mezi odrůdami skupiny 1A, získaná bezsemenná novošlechtění by pravděpodobně nepřesahovala hmotnostní limity (jak pro hmotnost semen, tak pro hmotnost bobulí) stanovené pro tuto skupinu (1A). Navíc, velmi zakrnělá semena by vyžadovala značně komplexní kultivační média, bohatá na podpůrné látky. Křížení semenných odrůd s odrůdami skupiny 1A však má větší perspektivu, jak je to například v případě odrůd Kišmiš moldavskij (2A), Kišmiš lučistyj (2B), Carolus (1A) atd. Právě zde se jedná o to, že došlo ke křížení velkoplodých semenných odrůd s odrůdami bezsemennými ze skupiny 1A. Odrůdy skupiny 2A (m b = (3-6> g a m s = <0-10> mg) jsou velmi cennými genovými zdroji, můžeme říci, že se jedná o vylepšené odrůdy skupiny 1A (m b = (0-3> g a m s = <0-10> mg). A skutečně, v odpovídajících a promyšlených kříženích mohly dávat vznik i takovým odrůdám jako Elma, která je zatím nejvíce bezsemennou odrůdou atlasu a nepatří do skupiny 1A, nýbrž do skupiny 2A (m b = 3,74 ± 0,56 g, m s = 0,75 mg a M s = 1,6 ± 0,7 mg). Je to velmi cenný otcovský genotyp společně s ostatními odrůdami skupiny 2A: Venus, Dawn seedless, Kišmiš moldavskij (v narůstajícím hmotnostním pořadí bobulí). Hodnocení odrůd skupiny 2B a 2C se různí, zde by měl být kladen důraz na přítomnost endospermu. Sice přítomnost endospermu není nutnou podmínkou pro úspěšnou kultivaci zakrnělých semen in vitro (viz např. Thompson seedless (EMERSHAD a RAMMING, 1984)), jeho přítomnost značně usnadní kultivaci in vitro a jak lze to pozorovat v případě odrůdy Neptún, může významně přispívat ke klíčení zakrnělých semen přímým způsobem (direct germination (DG)). Křížení mezi dvěmi odrůdami druhé skupiny (2A-C) nemusí být špatné, ale nejlepší strategií se jeví křížit odrůdy 3A-C mezi sebou, případně s odrůdami 2A-C (šlechtíme-li i na ranost). Úplně ideální by bylo křížit odrůdy skupiny 3B/C s odrůdami skupiny 3B nebo 3A, jako např. Jupiter Sugraone, Jupiter Regal seedless, Jupiter Edro bezseme, tady se však musí upozornit na fakt, že tyto odrůdy jsou si navzájem více příbuzné (viz Atlas), což může mít i své klady, ale zejména svá negativa. Na základě výše uvedených tedy byly uskutečněny následující křížení: C R3 (CR3), J 12/5 (J5), J BV 16-20-2 (JB2), J BV 16-16-3 (JB3), J CL (JCL), J D (JD), J IA (JIA), J KL (JKL), J KM (JKM), J L (JL), J MO (JMO), J PA (JPA), J PN (JPN), J R3 (JR3), J SD (JSD), N BA (NBA), N EB (NEB), N KL (NKL), N MO (NMO), N R3 (NR3), N SD (NSD). 97

Významným pokračováním této činnosti bylo samoopylení nebo i volné opylení již zmíněných odrůd (J samo- a volné opylení (JSP, JOP), KL samoopylení (KLSP), N volné opylení (NOP), R3 samo- a volné opylení (R3SP, R3OP)), a to většinou v návaznosti na hlavní sezónu kvetení, v době kvetení zálistkových květenství. Jak je známé, tato si zachovají integritu a celistvost révového keře a většinou jsou drobnějšího vzrůstu než květenství na hlavních letorostech. Jejich kastrace je tedy obtížnější a tedy samoopylení těchto květenství se jevilo vhodnou a lehce uskutečnitelnou alternativou, a to u odrůd: J, KL a R3. Na straně jedné jsme se snažili vyhýbat se přílišnému příbuzenskému šlechtění (z důvodu genetické deprese při inbreedingu, příbuzenském šlechtění), na straně druhé jsme však po zjištění relativně dobré klíčivosti stenospermických semen pocházejících ze zálistkových hroznů ho rádi aplikovali, a to jednoduchým zasáčkováním celých zálistkových letorostů: hlavně u odrůdy Jupiter, ale i Rusalka 3 (u Neptúnu ne, protože má funkčně samičí květy). Tento materiál ještě nedosáhl plodný věk, ale už teď je jasné, že zatímco mezi samoopylenými jedinci odrůdy Jupiter mohou být zajímaví jedinci, samoopylení u odrůdy Rusalka 3 je poněkud na škodu, protože dává relativně slabší růst a nedostatek chlorofylu, vyšší citlivost na chlorózu ve formě žlutých listů. Dalším fenoménem je panašování listů, který se nejvíce vyskytuje u potomků odrůdy Jupiter. Mohlo se to zaznamenávat hlavně v nasledujících případech: J CL a JSP, ale i NKL. Zřejmě to souvisí s recesivními alelami. Co se týká médií, resp. jejich tvaru, naskytly se dvě možnosti: buď se používaly baňky, nebo zkumavky. Do baněk šlo umístit i více než 25-30 semen, do zkumavek většinou 3-4, často však 1-2. Práce se zkumavkami byla pomalejší a náročnější na čas, ale tato činnost byla spjata s vyššou bezpečností a menším výskytem infekcí. Někdy se povedlo bez infekce udržet i těch 25-30 semen v baňce, ale potřebovalo to větší zručnost, trpělivost a nepochybnost. Navíc, nerovnoměrné klíčení 25-30-ti semen mohlo vyvolat komplikace při nerovnoměrném klíčení, prakticky všechna semena musela být transportována do jiných zkumavek. Na rozdíl od toho, rostliny ve zkumavkách (většinou 2-3 rostliny) byly mnohem přehlednější a umožňovaly snadnější manipulaci. Shrnujíc tedy: kultivační baňky ulehčí práci na začátku, zkumavky práci na začátku zpomalí, ale ke konci kultivace je to naopak, použití kultivačních baněk je složitější (z důvodu velkého počtu semenáčů) a zkumavky jsou jednodušeji zvládnutelné. 98

K složení kultivačního média: většinou postačí základní médium (i s polovičními makro- i mikroelementy a železem), někdy s aktivním uhlím nebo bez něj, většinou bez fytohormonů. Z rostlinných hormonů se může přidávat BA, GA 3, ale i jiné, vždy podle potřeby. My jsme otestovali následující médiá: TU, BD, BD1, BD2, MS1, MS2, MS3, GR. ph má být kolem 5,8-6,0 (pro složení a citace použitých kultivačních médií viz Tab. IV až XVI v Příloze). Embrya nejlépe rostla na skupině médií BD, pak MS a nejslaběji na médiu TU, což je v souladu se složitostí uvedených médií. Co se týká převodu explantátově odvozené rostliny, nejvíce účinnou metodou je dekapitace vzrostlého vrcholu a jeho přemístění do zkumavky s živným médiem kalusování u báze a tvorba žádoucích kořenů se většinou dostaví do 7-10 dnů. Další převod do polosterilních podmínek je už velmi snadné v případě dobře zakořeněných řízků ze zkumavek (in vitro) lehce lze dosáhnout 100%-ní ujímavost. Třeba však dbát na správné značení a také je nutné vytvořit si zásoby pro případy, kdyby se přece nějaké řízky neuchytly. Celá tato fáze trvá asi tři týdny. Zdá se, že při tvorbě nových genotypů zygotická embryogeneze hraje klíčovou roli. Ať už se jedná o přímé vyklíčení (direct germination, DG) stenospermických semen nebo klíčení / růst embryí po jejich preparaci (embryo rescue, ER), zygotickou embryogenezi lze označit za klíčovou problematiku a velice prospěšnou věc práce. A skutečně, správné pochopení této problematiky umožňuje výrazný posun od ER k DG alespoň kvantitativně. Jedná se tedy o to, že za určitých podmínek dojde k masovému klíčení kultivovaných stenospermických semen, nicméně jejich schopnost vytvářet funkčně celistvé rostliny s funkčními kořeny, stonkem, listy a apexem může být už značně redukovaná. Je zajímavým poznatkem, že zdánlivě lépe vyvinutá embrya (tj. větších rozměrů) mají horší regenerační schopnost směrem k celistvé rostlině. Tento fenomén bychom mohli charakterizovat tak, že dojde k jejich předčasnému klíčení (většinou či téměř výhradně) v nepřítomnosti endospermu. Endosperm je tedy významným (kvalitativním i kvantitativním) regulátorem průběhu klíčení a nápodobně, jak se vinaři snaží vypěstovat nejkvalitnější surovinu pro budoucí víno již na vinici, šlechtitelé bezsemenných odrůd by se měli usilovat o získání kvalitního materiálu taktéž ve vinici volbou odrůd (jak zdůrazněné také v BURGER a TRAUTMANN, 2000; PONCE et al., 2000; TORREGROSA et al., 2001), správnou dobou založení kultury a přítomností endospermu (použitím kvalitního množitelského materiálu). Často to má své úskalí, ale: není odrůda jako odrůda, není termín založení kultury jako termín založení kultury, není antigiberelin 99

jako antigiberelin, není hrozen na keři jako hrozen na keři, není médium jako médium atd. Přes toto všechno jsme se snažili optimalizovat naši činnost na poli explantátových kultur jako úplně racionální a logický sled, ale také jako úplně jednoduchou, vůbec nekomplikovanou činnost. Byla zde zmínka o důležitosti endospermu. Nejjednoduchším důkazem, že stenospermické semeno obsahuje endosperm je jeho transverzální půlení a následná kultivace části, která obsahuje embryo. To bylo aplikováno u odrůdy Neptún, který má funkčně samičí květ, a tím jsme měli dostatek nakříženého materiálu pro kultivaci. (U odrůdy Jupiter byla použita i půlená semena bez endospermu.) Výše jsme již uvažovali o explantátových kulturách, jak jsou / mohou být užitečné při tvorbě nových stenospermokarpicky bezsemenných odrůd. Uvažujeme-li ale partenokarpii jako primárního a budoucího způsobu tvorby (samozřejmě bezsemenných) bobulí u révy vinné, je potřeba také všímat, že zdejší pokrok a křížení mohou být uskutečněny klasickým způsobem: v případě funkčně samičích květů postačí izolovat květenství před kvetením, opylyt je a vysévat normální semena; v případě odrůd s oboupohlavnými květy samozřejmě jsme nuceni před kvetením vykonávat odstranění prašníků kastraci. Je tady ale možnost samoopylení, což často může být velkou výhodou při kombinování žádaných znaků. 6.5 Závěr V pokusném období 2004 2006 byly vykonány pokusy v oblasti zygotické embryogeneze s velmi pozitivními výsledky. Nosnými mateřskými genotypy byly zvoleny odrůdy Jupiter (v období 2004 2006) a Neptún (v období 2005 2006). Byla snaha pokusit se získat co nejvíce rostlin přímým klíčením semen a co nejméně používat preparaci embryí. Ověřilo se, že preparovaná embrya nejlépe rostou na komplexních médiích (např. BD) a jejich růst na jednoduchých médiích (např. TU) je také možné, ale je velmi pomalý. Klíčovým se jevil fyziologický stav stenospermických semen a přítomnost endospermu. V tomto směru zálistkové hrozny lokalizované na zálistkových letorostech lze považovat za směrodatné a vhodné pro další bádání. Díky použití zálistkových hroznů 100

u odrůdy Jupiter se povedlo povýšit relativně nízkou úspěšnost v prvním roce pokusů na velmi vysokou v roce 2006. 101

7. SOMATICKÁ EMBRYOGENEZE Z ENDOSPERMU A OSEMENÍ 7.1 Úvod Triploidní rostliny jsou vesměs vitálnější než jejich diploidní paralely. Nejedná-li se o produkci semen, tyto triploidní rostliny mohou být dobrou volbou. Jejich indukce je však poněkud složitější: zpravidla se děje křížením diploidních rostlin s kolchicinem indukovanými tetraploidy. Triploidní endosperm u krytosemenných rostlin dává dobrou příležitost k tomu, aby byla využívána k tvorbě triploidních rostlin přes somatickou embryogenezi z endospermu, tedy jediným krokem. Somatická embryogeneze z endospermu byla úspěšně použita u mnoha rodů rostlin (THOMAS et al., 2000; CHATURVEDI et al., 2003; THOMAS a CHATURVEDI, 2008), u révy se však povedlo získat jen kalus. Totipotence rostlinného těla teoreticky umožňuje získání celistvých rostlin z každé živé buňky s jádrem, tedy i ze zeleného osemení stenospermických semen. 7.2 Materiál a metody Explantátové kultury endospermu byly založeny v rocích 2004 a 2005 použitím třech médií: BD24 s 1 mg.l -1 2,4-D, MS3 bez fytohormonů a W s 2 mg.l -1 2,4-D a 1 mg.l -1 kinetinu. Byla kultivována půlená semena bez embrya. Začátkem byla použita semena s tvrdým osemením, pak stenospermická semena odrůd Neptún a Jupiter. Vybrané kalusy pak byly dále kultivovány na médiu DAS s 1 mg.l -1 BAP a 0,1 mg.l -1 2,4-D. Explantátové kultury z osemení byly založeny v období 2004 2006 použitím média DAS s 1 mg.l -1 BAP a 0,1 mg.l -1 2,4-D. Byla kultivována celá semena s embryem. Byla použita semena odrůd Mystery, Regal seedless a Imperial seedless, pocházejících z obchodů v zimním období. 7.3 Výsledky 102

Explantátové kultury stenospermických semen s cílem získat polyploidní rostliny z endospermu byly založeny v roce 2005. Byla použita dvě různá média BD24 a W s fytohormony a pokusně médium MS3 v jedném případě. Jak je to patrné z Tabulky I., bylo použito 59 půlených semen. Došlo k nepřímé somatické embryogenezi, k tvorbě kalusu, který však nebyl embryogenní. Úspěšnost tvorby tohoto kalusu byla 71,1% u médiu BD24, 0% u médiu MS3 a 30,8% u médiu W. Některé kalusy byly kultivovány dále na médiu DAS s 1 mg.l -1 BAP a 0,1 mg.l -1 2,4-D, ale ani tady nedošlo k diferenciaci somatických embryí. Tabulka I: Přítomnost a nepřítomnost neembryogenního kalusu u vybraných půlených semen s endospermem, tříděno dle použitých médií Médium / NEK Přítomen Nepřítomen Celkem BD24 32 13 45 MS3 0 1 1 W 4 9 13 Celkem 36 23 59 Explantátová kultivace z osemení nebyla úspěšná ve formě celistvých rostlin, ale povedlo se získat somatická embrya z embrya kultivovaných semen. Jak je známé, zygotické embryo tvoří somatická embrya mnohem snadněji, než specificky diferenciované osemení (HAVEL, 2005, ústní sdělení). K tvorbě somatických embryí ze zygotických embryí došlo u embryí pocházejících z celých stenospermických semen, kultivovaných začátkem na médiu DAS s 1 mg.l -1 BAP a 0,1 mg.l -1 2,4-D, pak na médiu BD1 s 1 mg.l -1 GA 3 (Tab. II, Obr. 7.1 v Příloze). Kultivace embryí i kalusu na médiu PR1 s 1 mg.l -1 BAP nevedla k tvorbě somatických embryí. Co se týká tvorby kalusu z osemení, zde se médium PR1 s 1 mg.l -1 BAP jevil užitečným. Po té, co celá stenospermická semena byla kultivována na médiu DAS s 1 mg.l - 1 BAP a 0,1 mg.l -1 2,4-D, pak na médiu BD24 s 1 mg.l -1 2,4-D, následná kultivace na médiu PR1 s 1 mg.l -1 BAP vedla k tvorbě embryogenního kalusu z osemení, ale jen v případech, kde byla kultivována semena ze zeleným osemením (Tab. II). 103

Tabulka II: Směrodatné výsledky kvalitativního mikropokusu somatické embryogeneze u stenospermických semen Médium Datum založení Baňka no. DAS 9/2/2006 2. RL 11 Odrůda CSS Médium Datum Baňka no. Kultivováno Datum hodnocení Výsledek BD24 6/4/2006 3. 7 PR1 4/10/2006 10. 2 zelená osemení 5/12/2006 embryogenní kalus ze zelených PR1 4/10/2006 11. 3 zelená osemení 5/12/2006 embryogenní kalus ze zelených DAS 6/3/2006 1. RL 10 BD1 4/10/2006 12. embryo-kalus 5/12/2006 hodně somatických embryí PR1 4/10/2006 13. kalus 5/12/2006 -- PR1 4/10/2006 14. kalus 5/12/2006 -- BD1 4/10/2006 15. embrya 5/12/2006 hodně somatických embryí PR1 4/10/2006 16. - 18. kalus 5/12/2006 -- PR1 4/10/2006 19. embryo 5/12/2006 deformovaný kalus PR1 4/10/2006 20.-22. kalus 5/12/2006 -- 104

7.4 Diskuse Kultivace endospermu je zvláštní samotnou kapitolou. V případě úspěchu by to znamenalo světovou premiéru, takto ve skutočnosti se nám povedlo vytvořit jen dělící se mikrokalusy, které jsou hodně vzdáleny od vytyčených cílú: tri- až hexaploidních odrůd. Jako endospermy byly používány ty, které byly získány ze stenospermických semen (spolu s osemením) odrůdy Neptún (Damascenka růžová Perlette) nebo Jupiter (Damascenka růžová Bezsemenen chibrid V-6), a to z důvodu polyfenolových problémů u semen s tvrdým osemením. Tento kompromis však ubral i na důležitosti problematiky, zvláště poté, co jsme objevili první plody na odrůdě Talisman (tenkrát ještě pod označením Neša- 1, patřící k synonymu Keša-1) v ampelografické sbírce ZF v Lednici Mendelovy univerzity v Brně. Jak je to patrné i ze současných prací (WAKANA et al., 2007), triploidní odrůdy mají význam jen tam, kde nejméně jeden z rodičů má velmi velké bobule (např. Rizamat = Katta kurgan Parkentskij). Poté co došlo k vyhodnocení pokusu s kalusovými pletivy z endospermu, objev odrůdy Talisman (v atlasu je ještě pod jménem / synonymem Keša-1) ubral těmto pokusům na důležitosti. Polyploidizace v minulosti však často vedla k přeorganizaci genomů dnes existujících tvorů (jak rostlin, tak živočichů) a zvýšení ploidity určitého organismu není slepou uličkou, ale přímo evoluční dráhou. Na jedné straně tedy potenciál triploidního endospermu můžeme vnímat jako obrovskou šanci ke tvorbě vylepšených rostlin, na straně druhé všechny existující odrůdy révy samy jsou již polyploidy, včetně těch nejznámějších odrůd pro šlechtění: Talisman, Cardinal, Jupiter atd. Samozřejmě dnes se na tyto organismy / odrůdy díváme jako by byly diploidní, ale jejich genové tajemství rodokmenu je dává na správné místo (tento proces se nazývá whole genome duplication (WGD), duplikace celého genomu). Somatická embryogeneze skýtá i jinou možnost: kromě toho, že teoreticky somatická embrya mohou být získána z endospermu, zelené osemení v odpovídajících podmínkách může vést také k produkci somatických embryí, tedy i rostlin, totožných s mateřským genotypem. Tento případ a přístup by nám umožňovalo získání množitelského materiálu z odrůd u nás komerčně dostupných z celého světa, a to pro výzkumné a šlechtitelské účely. V tomto směru nás nejvíce zaujaly odrůdy: Regal seedless, Mystery a Imperial seedless, které byly dostupné na českém trhu většinou v zimních měsících z Jihoafrické republiky. To, že naše úvaha byla správná, se ukázalo i na IX. 105

Mezinárodní konferenci genetiky a šlechtění révy vinné v Udine v 2006, kde XU et al. popsali tentýž fenomén s odrůdou Autumn Royal s tím rozdílem, že oni nechtěli získat tuto odrůdu do sbírky a do šlechtění, ale vlastnili ji a somatickou embryogenezi mohli začít již ve stádiu značně zelených bobulí (před zaměkáním bobulí). My jsme zase chtěli získat odrůdy, hlavně Regal seedless do sbírky s cílem už zmíněného křížení, ale náš neúspěch lze konstatovat následovně: jednak jsme použili méně složité médium jako XU et al. (2009), jednak jsme neměli k dispozici tak nezralý materiál. V obchodech se přes velkou variabilitu a kvalitu vesměs vyskytovaly už podle nás přezrálé a tím méně regeneraceschopné plody s přezrálými semeny. Somatická embrya původem z embryí u odrůdy Regal seedless nakonec z časových důvodů nebyla převedena v celistvé rostliny. Z důvodu vysoké heterozygotnosti odrůd révy vinné bychom stejně nezískali původní odrůdu. 7.5 Závěr V rámci této specifické kapitoly došlo k otestování komplexních přístupů s pozoruhodnými dílčími výsledky. Sice ani z endospermu, ani z osemení nebyly získány celistvé rostliny, byl však potvrzen fakt, že jak výchozí materiál, tak i složení kultivačního média hraje klíčovou roli při komplexním procesu, kterým somatická embryogeneze bezpochyby je. Role jednotlivých fytohormonů je veliká: při získání embryogenního kalusu z osemení je potřebné upozornit na důležitost BAP, při získání somatických embryí ze zygotického embrya zase na důležitost GA 3. 106

8. CHOVÁNÍ DVOU MOLEKULÁRNÍCH MARKRŮ SCAR PRO BEZSEMENNOST U STŘEDOEVROPSKÝCH ODRŮD 8.1 Úvod Vedle povzbuzujícího pokroku v identifikaci genů spojených s bezsemenností je potřebné najít semenné odrůdy s potenciálem podpory bezsemennosti. A skutečně, analýzy křížení mezi semennými a bezsemennými odrůdami pomocí molekulárních markrů SCAR (ADAM-BLONDON et al., 2001) identifikovaly semenné jedince, kteří obsahují alelu SCC8 + a pravděpodobně i vázaný major lokus zapojený do bezsemennosti. Zvláště křížení mezi semennou odrůdou Alphonse Lavallée a bezsemennou odrůdou Black Monukka (jediná prastará odrůda, která je známá jako homozygotní SCC8 + /SCC8 + ) dalo jen jednoho bezsemenného jedince z 19 jedinců (ADAM-BLONDON et al., 2001). Ve stejné studii, vedle předpokládaných mutantů a předků odrůdy Sultana nebo opačně (Dastachine, Gora Chirine, Ouroum Uzumu a Sultana monococco), tři semenné odrůdy, Chaouch blanc, Pizzutello nero a Santa Paula, měly alespoň jednu alelu SCC8 +. Kromě toho mohou existovat semenné odrůdy, které nemají alelu sdi +, ale mají příznivé operátor geny, jak je to definované v BOUQUET a DANGLOT (1996). Odrůda Chaouch rose, růžová forma odrůdy Chaouch blanc, byla v 60-tých a 70- tých letech 20. století intenzivně použita ve šlechtění bezsemenných stolních odrůd révy vinné v bývalém Československu a vyselektovalo se několik vylepšených odrůd (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998). Cílem této práce bylo studium jejich alelového rozdělení u lokusů SCC8 a SCF27 pomocí odpovídajících molekulárních markrů SCAR, SCC8 a SCF27. V případě dvou bezsemenných odrůd, Jupitera a Neptúnu, byla analyzována sesterská potomstva jako i jedinci z různých křížení, všechny v podobě tříměsíčních juvenilních semenáčů. Tyto molekulární markry byly také použity u různých středo- a východoevropských stenospermokarpicky bezsemenných i semenných odrůd. Toto umožnilo srovnání rozdělení alel zodpovídajících za bezsemennost jak mezi molekulárními markry, tak mezi odrůdami a určení semenných odrůd se zvýšeným potenciálem podpory bezsemennosti (KORPÁS et al., 2009). 107

8.2 Materiál a metody 8.2.1 Rostlinný materiál Bylo analyzováno 24 bezsemenných genotypů (BV 16-16-3 (B3), BV 16-20-2 (B2), BV 47-1-6 (B6), Carina (C), Dawn seedless (D), Edro bezseme (EB), Elma (E), Flame seedless (F), Helios (H), Jupiter (J), Kišmiš lučistyj (KL), Kišmiš moldavskij (KM), Merkúr (M), Neptún (N), Perlon (PN), Picurka (PI), Rosina (RA), Rózsika (RO), Ruby seedless (RY), Rusalka 3 (R3), Slavjanka (SA), Sunred seedless (SD), Urkim (UM) a Venuša (V)), jeden genotyp s tvrdým osemením, ale bez endospermu (Mars (MS)) a devět semenných genotypů (Alphonse Lavallée (AL), Chaouch rose (CR), Heliotrop (HP), Karneol (K), Luna (L), Olšava (O), Queen of Vineyards (QV), Urán (U) a Victoria (VI)) (Tab. I). Také byla studována tři potomstva segregující na bezsemennost (Tab. III A-C): NKL (31 jedinců, N KL), NSD (26 jedinců, N SD) a JKL (12 jedinců, J KL). Všechny rodičovské genotypy analyzovaných potomstev byly bezsemenné, pocházející z křížení semenných odrůd s odrůdami bezsemennými (Tab. I). Rostliny potomstva byly získány v podmínkách in vitro: přímým klíčením nebo preparací embrya. S cílem objasnění alelového rozdělení rodičů byla vykonána analýza na 11 selektovaných, tříměsíčních, juvenilních semenáčech z různých křížení: JIA_90 (J Ilonka (IA)), JKM_85 (J KM), JMO_97 (J Marroo seedless (MO)), JPA_102 (J PA), JPN_87, JPN_88 (oba J PN), JR3_86 (J R3), NCL_94 (N CL), NMO_93 (N MO), R3OP_92, R3OP_96 (oba R3 volné opylení (open pollination (OP))), všech získaných v podmínkách in vitro (Tab. III D). Všechny rostliny byly pěstovány ve výzkumných vinohradech nebo sklenících v Lednici (Zahradnická fakulta v Lednici, Mendelova univerzita v Brně, ČR) nebo v Strekově (PD Strekov, SR). Mladé listy byly sbírány během růstového období, zmrazené v tekutém dusíku a skladovány při 20 o C až po extrakci DNA. Z obou potomstev NKL a NSD do roku 2008 dospěly jen dva semenáče, NKL_32 a NKL_77 a nesly jejich první plody teprve zcela nedávno. Jejich bobule byly zkoumány na keřích ve vinohradu při plné zralosti. 108

8.2.2 Extrakce DNA DNA byla extrahována z 0,2 g listů pomocí soupravy DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) na základě pokynů výrobce. DNA byla kvantitatívně měřena na základě fluorometrického měření s barvivem PicoGreen. 8.2.3 Analýza SCAR Dva molekulární markry SCAR, odvozené od molekulárních markrů RAPD byly použity: SCC8 (LAHOGUE et al., 1998) a SCF27 (MEJÍA a HINRICHSEN, 2003). Oba molekulární markry byly amplifikovány pomocí standardního PCR mixu (LAHOGUE et al., 1998) a TGradient termocykleru (Biometra) programovaného nasledovně: první krok 4 min při 94 C, 35 cyklů 1 min při 94 C, 1 min při 53 C, 1 min při 72 C a poslední krok 7 min při 72 C pro SCC8; a pro SCF27, první krok 4 min při 94 C, 35 cyklů 0,5 min při 95 C, 1,5 min při 62 C, 1 min při 72 C a poslední krok 7 min při 72 C. Štípání amplikonů SCC8 pomocí restrikční endonukleasy Bgl II bylo vykonáno na základě pokynů výrobce v konečném objemu 25 µl použitím 20 µl produktu reakce PCR a 10 jednotek enzymu. Amplikony SCF27 a štěpný produkty SCC8 byly roztříděny elektroforeticky použitím 1,5% agarosového gelu. Gely byly obarveny ethidium bromidem. DNA byla zviditelněna pomocí ultrafialového transiluminátoru a fotografována digitálním fotoaparátem. Oba molekulární markry byly použity u jednorázové extrakce každého genotypu, jen nulové alely nebo nejasné výsledky byly překontrolovány dvakrát. Schopnost amplifikovat templátovou DNA u vzorků s nulovými alelami byla úspěšně ověřena molekulárními markry SSR VVMD27 a VVMD7 v podmínkách uvedených v MORAVCOVÁ et al. (2006) a primery konstruovanými na amplifikaci dlouhých produktů PCR v případě kódového úseku malátdehydrogenasy (NASSUTH et al., 2000). 8.2.4 Statistické hodnocení 109

Shoda mezi pozorovanými a očekávanými štěpnými poměry u jednotlivých lokusů, jako i pravděpodobnost nezávislosti mezi SCC8 a sdi byly testovány pomocí analýzy Chikvadrátu. 8.3 Výsledky 8.3.1 Alelové rozdělení u lokusů SCC8 a SCF27 u vybrané skupiny stolních odrůd révy vinné Oba molekulární markry byly použity u vybrané skupiny stolních odrůd révy vinné (molekulární marker SCF27 u sníženého počtu odrůd použitých pro molekulární marker SCC8), zejména vyšlechtěných ve střední a východní Evropě, rozdělených do třech skupin (Tab. I). První skupina obsahovala stenospermokarpicky bezsemenné genotypy, druhou skupinu tvořil jeden genotyp s tvrdým osemením, ale bez endospermu a třetí skupina obsahovala semenné genotypy. Podle informací od vývojářů (LAHOGUE et al., 1998) pro molekulární marker SCC8 byly očekávány dvě různé alely, scc8 a SCC8 + (tato ve vazbě s bezsemenným fenotypem) a také nulová alela (ADAM-BLONDON et al., 2001). Pro molekulární marker SCF27 byla očekávána přítomnost nebo nepřítomnost alely SCF27 +, podle její vazby s bezsemenným fenotypem (MEJÍA a HINRICHSEN, 2003). Potvrzujíc existenci nulové alely v homozygotním stavu, z testovaných 34 genotypů čtyři genotypy neukázaly žádný amplifikační produkt u lokusu SCC8. Dva genotypy z těchto čtyř, H a PN patřily k stenospermokarpicky bazsemenné skupině a další dva, O a QV patřily ke skupině semenných genotypů (Tab. I). Z testovaných 20 genotypů šest neukázalo žádný amplifikační produkt u lokusu SCF27. Jeden z těchto genotypů, E byla ze stenospermokarpicky bezsemenné skupiny a ostatních 5 genotypů, AL, K, O, QV a VI patřilo ke skupině semenných genotypů (Tab. I). Ostatní tři genotypy, AL, K a VI, na rozdíl od O a QV, ukázaly amplifikační produkt u lokusu SCC8 v podobě alely scc8. Stenospermokarpicky bezsemenná E také ukázala alelu scc8. 110

Tabulka I: Původ a genotypy u lokusů SCC8 a SCF27 zkoumaných stenospermokarpicky bezsemenných a semenných odrůd Název Původ a SCC8 b SCF27 c Název Původ a SCC8 b SCF27 c Stenospermokarpicky bezsemenné genotypy N e CR (+/-) PA (+/0) d -/0* +/0* B2 BV 35-4-7 B6 (+/-) +/? na PI CR (+/-) DT (0/)* +/? na B3 BV 35-4-3 B6 (+/-) +/? na PN ER (-/0)* PA (+/0) d 0/0 +/? B6 AR RS +/- na RA PL (-/0)* J e (+/+)* +/- na D G (-/?)* PA (+/0) d +/- +/? RO PL (-/0)* J e (+/+)* +/- na E U (-/0)* KM (+/-) -/? 0/0 RY ER (-/0)* SM (+/-) d +/0* na EB RE (0/)* VI4 (+/)* +/0* na R3 MI V6 (+/)* +/0* +/0* H KK (0/)* PA (+/0) d 0/0 na SA B (-/?) d S (+/?) d +/- na J e CR (+/-) V6 (+/)* +/+* +/+* SD DL (-/0)* RY (+/0)* +/0* +/0* KL CL (-/0) d KR (+/?) d +/0* +/0* UM U (-/0)* KM (+/-) +/0* na KM P (-/?)* KR (+/?) d +/- na V e KK (0/)* V6 (+/)* +/? +/? C MR (CL (-/0) d S (+/?) d ) +/? na F (CL (-/0) d S (+/?) d ) ((RM TA) (MA (-/-) d S (+/?) d )) +/? d na M CR (+/-) (QV (0/0) AA (-/0) d ) +/0* +/? Stenospermokarpický genotyp s tvrdým osemením, ale bez endospermu MS e KK (0/)* V6 (+/)* +/- +/? Semenné genotypy L KK (0/)* PA (+/0) d +/? +/? AL BO LDS -/- d 0/0 O KOL (0/)* BK (0/)* 0/0 0/0 CR neznámý +/- +/? QV SQE (0/)* PC (0/)* 0/0 0/0 HP KK (0/)* V6 (+/)* -/? +/? U CR (+/-) DT (0/)* -/0* +/? K KK (0/)* V6 (+/)* -/? 0/0 VI CL (-/0) d AA (-/0) d -/? 0/0 a Původ s genotypem u lokusu SCC8 (když známý). b Genotyp u lokusu SCC8: +, - představují dvě kodominantní alely pro bezsemenný nebo semenný fenotyp. 0 představuje nulovou alelu. +/? je pro +/+ nebo +/0; -/? je pro -/- nebo -/0. U +/ nebo 0/ je jisté jen to, že odrůda obsahuje alelu + nebo nulovou alelu. c Genotyp u lokusu SCF27: + označuje alelu pro bezsemennost. 0 představuje nulovou alelu. +/? je pro +/+ nebo +/0. na znamená neanalyzované. d Genotyp u lokusu SCC8, který byl získán v LAHOGUE et al. (1998) nebo ADAM-BLONDON et al. (2001). e Značené odrůdy jsou čistě odrůdami V. vinifera a neměly by být popleteny s odrůdami z Arkansasu s podobnými názvy (viz původ odrůd). * Přítomnost nebo nepřítomnost nulové alely byla odvozena z analyzovaných potomstev nebo na základě rodokmenu. Z testovaných 24 stenospermokarpicky bezsemenných genotypů 20 ukázalo alelu SCC8 +. Z testovaných 10 semenných genotypů (včetně MS) tři měly alelu SCC8 + a sedm nemělo (Tab. I). Přidávajíc odrůdy této práce k odrůdám analyzovaným v ADAM- BLONDON et al. (2001), je zřejmé, že dvě dílčí skupiny (tj. stenospermokarpicky 111

bezsemenné a semenné odrůdy u lokusu SCC8) ukázaly odlišné rozdělení genotypových tříd (χ 2 R) a oba se průkazně lišily od očekávaného rozdělení 3:3:2:1 (ADAM-BLONDON et al., 2001) v panmiktické populaci (χ 2 D) (Tab. II). Z 62 stenospermokarpicky bezsemenných genotypů z obou prací, 52 (tj. 84%) mělo alespoň jednu alelu SCC8 + a z testovaných 45 semenných genotypů 35 (tj. 78%) nemělo alelu SCC8 +. Tabulka II: Rozdělení genotypových tříd u lokusu SCC8 v dílčích skupinách stenospermokarpicky bezsemenných a semenných odrůd, popsaných v Tab. I a v ADAM-BLONDON et al. (2001), test χ 2 (α = 0.05) shody mezi pozorovaným a očekávaným štěpným poměrem 3:3:2:1 (χ 2 D) a test χ 2 (α = 0.05) odlišnosti genotypového rozdělení mezi dvěma dílčími skupinami (χ 2 R) SCC8 + /? scc8 /? scc8 + /scc8 0/0 Celkem χ 2 a Bezsemenný 37 8 15 2 62 χ 2 D=20.13 Semenný 7 29 3 b 6 45 χ 2 D=20.25 Celkem 44 37 18 8 107 χ 2 R=40.67 a Pro kalkulaci χ 2 třídy byly sloučeny tak, že přítomnost (SCC8 + /?, SCC8 + /scc8 ) versus nepřítomnost (scc8 /?, 0/0) alely SCC8 +, tj. poměr 5:4 byl testován s 1 stupněm volnosti. b Včetně stenospermokarpického genotypu s tvrdým osemením, ale bez endospermu, MS. Rodokmenová analýza dále umožnila objasnit úplné nebo částečné alelové rozdělení u lokusu SCC8. Z analyzovaných odrůd, které jsou uvedeny v prvním sloupci Tab. I, u lokusu SCC8 mohl být odvozen genotyp 5 odrůd, EB, M, RY, U a UM. EB a M byly místo homozygotního SCC8 + SCC8 + /0, protože alela SCC8 + byla nepřítomná u jejich mateřských (RE = Yantar Italia, kde Yantar = QV AA) nebo otcovských (QV AA) prarodičů. RY a UM byly bezprostředně určené jejich rodiči. Skutečnost, že UM byl SCC8 + /?, umožnilo usoudit, že U i UM mají nulovou alelu, která byla zděděna od DT, protože CR postrádal nulovou alelu. Z rodičovských odrůd, které jsou uvedeny v druhém sloupci Tab. I (27 semenných odrůd (Afus Ali (AA), Arkadija (AR), Bellino (BO), Bicane (B), Boskolena (BK), BV 35-4-3, BV 35-4-7, Cardinal (CL), Chaouch rose (CR), Datal (DL), Emperor (ER), Gold (G), Katta kurgan (KK), Kossuth Lajos (KOL), Lady Downes seedling (LDS), Mirnyj (MI), Moscato rosa (MR), Muscat of Alexandria (MA), Pobeda (P), Palatina (PL), Pearl of Csaba (PC), Queen of Vineyards (QV), Red Malaga (RM), Rusensko edro (RE), Souvenir of Queen Elisabeth (SQE), Tifafihi Ahmer (TA), Urán (U)) 112

a 12 bezsemenných odrůd (BV 47-1-6 (B6), Chibrid bezsemen V-6 (V6), Chibrid bezsemen VI-4 (VI4), Delight (DT), Jupiter (J), Kišmiš moldavskij (KM), Kišmiš rozovyj (=Pink Sultana) (KR), Perletta (PA), Remaily seedless (RS), Ruby seedless (RY), Sultana (S), Sultana moscata (SM)), celkem 39 odrůd), u lokusu SCC8 mohl být úplně nebo částečně odvozen genotyp 13 odrůd, BA, DL, DT, ER, G, KK, KOL, P, PC, RE, SQE, V6 a VI4. Z testovaných 10 stenospermokarpicky bezsemenných genotypů 9 (tj. 90%) ukázalo alelu SCF27 +. Z testovaných 10 semenných genotypů (včetně MS) 5 (tj. 50%) nemělo alelu SCF27 + (Tab. I). Se zřetelem na původ těchto semenných odrůd však lze konstatovat, že ty, které neměly odrůdu S ve svých rodokmenech (AL, O, QV a VI), neukázaly alelu SCF27 +. 5 odrůd (HP, K, L, MS a U) jsou bezprostřednými potomky křížení mezi semennými a bezsemennými odrůdami, kdežto původ CR je neznámý. ADAM-BLONDON et al. (2001) identifikovali 3 semenné odrůdy (Chaouch blanc, Pizzutello nero a Santa Paula), které jsou nositely alely SCC8 + a pravděpodobně i vázaného major lokusu, zapojeného do bezsemennosti. My jsme zkoumali růžovou formu první odrůdy, CR u obou lokusů SCC8 i SCF27. V souladu s očekáváním, CR podobně k Chaouch blanc ukázal genotyp SCC8 + /scc8 a také alelu pro bezsemennost u lokusu SCF27, potvrzujíc, že se varianty odlišující se v barvě bobulí pravděpodobně liší jen v specifických genech pro anthokyaniny. S cílem objasnit, zda je alela SCC8 + odrůdy CR spojena s bezsemenným fenotypem, testovali jsme její přímé potomky, stenospermokarpicky bezsemenné J, M, N a PI a semenný U (Tab. I). Všechny ukázaly alelu SCF27 + (ačkoli PI nebyla testována u tohoto lokusu); J, M a PI měly alelu SCC8 + a N a U měly alelu scc8. Nesoulad byl tedy objeven u dvou genotypů: N neukázal alelu SCC8 + a byl bezsemenný a U ukázal alelu SCF27 + a byl semenný. Zajímavé je, že M je bezsemenným potomkem dvou semenných odrůd a dle očekávání měl alely pro bezsemennost u obou lokusů. 8.3.2 Analýza pomocí molekulárních markrů SCC8 a SCF27 v sesterských potomstvech NKL, NSD a JKL, jako i u jedinců z dalších křížení 113

Tabulka III: Rodokmen, segregace (S) molekulárních markrů SCAR a test χ 2 (α = 0.05) shody mezi pozorovaným a očekávaným štěpným poměrem 1:1:1:1 (A, B) ve třech analyzovaných sesterských potomstvech (A, B, C) a u několika jedinců z jiných různých křížení (D), všech získaných in vitro S - S + S - S + +/? na na na SCC8 NKL +/- +/0 -/0 +/? +/- +/0 -/0 0/0 Σ S χ 2 CR PA CL KR + 8 7 9 1 25 3 S + S + 0 0 0 0 6 6 1 +/0 +/0 SCF27 Σ 8 7 9 7 31 -/0 +/0 S 1 1 1 1 N KL χ 2 0.36 A 0.53 S - S + S - S + +/? na na na SCC8 NSD +/- +/0 -/0 +/0 +/- +/0 -/0 0/0 Σ S χ 2 CR PA DL RY + 7 6 9 0 22 3 S + S + 0 0 0 0 4 4 1 +/0 +/0 SCF27 Σ 7 6 9 4 26 -/0 +/0 S 1 1 1 1 N SD χ 2 2.00 B 1.28 Jiná různá křížení SCC8 SCF27 S - S + +/? na +/- +/ JIA_90 +/? + CR V6 SCC8 JKL JKM_85 +/+* + S + S + +/? JMO_97 +/- + +/+ +/0 JPA_102 +/? + +/+ +/0 JPN_87 +/0* + J KL JPN_88 +/0* + JR3_86 +/? + Legenda: SCF27 +/? 12 NCL_94 0/0 0 Fenotyp a S + NMO_93 -/? + Genotyp u lokusu SCF27 b +/0 R3OP_92 0/0 0 Genotyp u lokusu SCC8 c +/0 R3OP_96 +/? + D Zkratka pro název rodičů KL C a S -, S + představují fenotyp pro bezsemennost: semenný nebo bezsemenný. b + značí alelu pro bezsemennost. 0 představuje nulovou alelu. +/? je pro +/+ nebo +/0. na znamená neanalyzované. 114

c +, - pžedstavují dvě kodominantní alely pro bezsemenný nebo semenný fenotyp. 0 představuje nulovou alelu. +/? je pro +/+ nebo +/0; -/? je pro -/- nebo -/0. +/ je pro +/- nebo +/0. Genotypy u CL, KR a PA byly zjištěny v ADAM-BLONDON et al. (2001). * Přítomnost nebo nepřítomnost nulové alely byla odvozena z analyzovaných potomstev nebo na základě rodokmenu. Na základě původu N (vytvořený křížením CR PA) bylo odvozeno, že N je heterozygotní pro nulovou alelu u lokusu SCC8, díky genotypu SCC8 + /0 u PA (ADAM- BLONDON et al., 2001). S cílem určit, která alela N u lokusu SCC8 je spojená s jeho bezsemenným fenotypem, zkoumali jsme segregaci jeho alel ve dvou sesterských potomstvech, NKL a NSD. Sesterské potomstvo JKL a jedinci z dalších křížení byly také zkoumány. Genotypy rodičů, prarodičů a jedinců ze třech potomstev jsou shrnuty v Tab. III. Když byl použit molekulární marker SCC8, dva stenospermokarpicky bezsemenní rodiče potomstva NKL ukázali odlišné alely. N jako matka představil alelu scc8 a KL jako otec ukázal alelu SCC8 +. Pro molekulární marker SCF27 oba rodiče, N i KL představily alelu SCF27 + (Tab. I a III A). Z 31 jedinců potomstva 8 bylo heterozygotních SCC8 + /scc8 a 7 neukázalo žádný amplifikační produkt u lokusu SCC8. Oba rodiče tedy musí být heterozygotní pro nulovou alelu, přítomnost které jednoznačně určila genotyp zbylých jedinců potomstva: SCC8 + /0 (7 jedinců) a scc8 /0 (9 jedinců). Rozdělení u lokusu molekulárního markru SCC8 se nelišilo průkazně od očekávaného segregačního poměru 1:1:1:1 (Tab. III A). Segregace 25 jedinců SCF27 + /? a 6 jedinců 0/0 odpovídala poměru 3:1, naznačujíc nulovou alelu u obou rodičů. Všichni jedinci SCC8 + /scc8, SCC8 + /0 a scc8 /0 ukázali alelu SCF27 +, přičemž jedinci 0/0 u lokusu SCC8 s jednou výjimkou neukázali tuto alelu. Potomstvo NSD mělo velké podoby s potomstvem NKL. Když byl použit molekulární marker SCC8, dva stenospermokarpicky bezsemenní rodiče potomstva NSD ukázali odlišné alely. SD jako otec podobně ke KL ukázal alelu SCC8 +. Pro molekulární marker SCF27 oba rodiče, N i SD představily alelu SCF27 + (Tab. I a III B). Z 26 jedinců potomstva 7 bylo heterozygotních SCC8 + /scc8 a 4 neukázaly žádný amplifikační produkt u lokusu SCC8. Oba rodiče tedy musí být heterozygotní pro nulovou alelu, přítomnost které jednoznačně určila genotyp zbylých jedinců potomstva: SCC8 + /0 (6 jedinců) a scc8 /0 (9 jedinců). Rozdělení u lokusu molekulárního markru SCC8 se nelišilo průkazně od očekávaného segregačního poměru 1:1:1:1 (Tab. III B). Segregace 22 jedinců SCF27 + /? a 115

4 jedinců 0/0 odpovídala poměru 3:1, naznačujíc nulovou alelu u obou rodičů. Všichni jedinci SCC8 + /scc8, SCC8 + /0 a scc8 /0 ukázali alelu SCF27 +, přičemž žádný jedinec 0/0 u lokusu SCC8 neukázal tuto alelu. Alela SCF27 + byla většinou přítomna v potomstvech NKL a NSD, tj. u 47 z 57 jedinců. Toto bylo v kontrastu s molekulárním markrem SCC8, pro kterého alela SCC8 + byla přítomna u 28 z 57 jedinců (Tab. III A a III B). Detailní porovnání rozdělení u genotypových tříd pro oba molekulární markry v potomstvech NKL a NSD ukázalo, že všichni jedinci bez amplifikačního produktu u molekulárního markru SCF27 měli homozygotní nulový genotyp u lokusu SCC8. Obráceně: jednici bez amplifikačních produktů u molekulárního markru SCC8 měli s jednou výjimkou homozygotní nulový genotyp u lokusu SCF27. Protože molekulární marker SCF27 na rozdíl od molekulárního markru SCC8 ukázal u N očekávanou alelu pro bezsemennost, bylo uváženo, že tento molekulární marker ukazuje správné spojení genotypu s fenotypem v tomto případě. U jedinců scc8 /0 SCF27 + v potomstvech NKL a NSD by tedy alela scc8 měla být spojena s alelou sdi +. Následně jedinec NKL s nulovou alelou v homozygotním stavu u lokusu SCC8 a současně ukazující alelu SCF27 + (Tab. III A) by měl být rekombinantním jedincem s rekombinací mezi lokusy uvedených molekulárních markrů a mírou rekombinace 1 z 31 jedinců, tj. 3,23%. Oba stenospermokarpicky bezsemenní rodiče potomstva JKL, J a KL ukázali alely spojené s bezsemenným fenotypem u obou lokusů, SCC8 + a SCF27 + (Tab. I a III C). 12 jedinců potomstva JKL ukázalo SCC8 + /? a zároveň SCF27 + (Tab. III C). Bylo tedy odvozeno, že J je homozygotní jak pro SCC8 +, tak pro SCF27 +. A skutečně, pravděpodobnost pozorování nejméně jednoho jedince s homozygotní nulovou alelou mezi 12 jedinci, kdyby oba rodiče byli heterozygotní s jednou nulovou alelou je 1 (0,75) 12 = 0,968. (Uvažujíc jednoho jedince, pravděpodobnost pozorování alely SCC8 + (nebo SCF27 + ) je 0,75. Uvažijíc n jedinců, pravděpodobnost, že všichni ukazují alelu SCC8 + (nebo SCF27 + ) je (0,75) n.) Mezi jedinci získanými z dalších křížení všichni potomci J měli alely SCC8 + i SCF27 +, dále potvrzujíc homozygotní stav J u obou lokusů (Tab. III D). Tato informace umožnila usuzování homozygotního stavu JKM_85 nejméně u lokusu SCC8. V souladu s nulovou alelou CL u lokusu SCC8, jeden potomek z křížení N CL, NCL_94 byl homozygotně nulový u obou lokusů. Jeden jedinec z OP R3, R3OP_92 odhalil, že R3 obsahuje nulovou alelu u obou lokusů (Tab. I a III D). 116

8.3.3 Ověření spojení genotypu s fenotypem u dvou semenáčů NKL S cílem dalšího přezkoušení spojení scc8 u N s sdi +, zkoumali jsme bobule dvou jedinců z potomstva NKL. NKL_77, jedinec SCC8 + /scc8 SCF27 + dle očekávání byl stenospermokarpicky bezsemenný. NKL_32, jedinec scc8 /0 SCF27 + byl semenný s 1,2 ± 0,4 (n=5) semeny v bobuli. Vedle sníženého počtu semen tato semena byla většinou nedostatečně vyvinutá, tj. ve vodě plovoucí. 8.4 Diskuse Přítomnost nulových alel v homozygotním stavu u obou molekulárních markrů u několika jedinců může být amplifikačním nedostatkem. S cílem vyloučit tuto možnost byla ověřena kvalita DNA jinými fragmenty PCR, dvěma molekulárními markry SSR a primery konstruovanými na amplifikaci dlouhých produktů PCR v případě kódového úseku malátdehydrogenasy (NASSUTH et al., 2000). Výsledkem bylo, že na gelu všechny pochybní jedinci produkovali očekávané pruhy, potvrzujíc kvalitu DNA. Přítomnost nulových alel pro použité molekulární markry SCAR, SCC8 a SCF27 se tedy může považovat za normální a následně předpovídá existenci jedinců s nulovými alelami v homozygotním stavu současně u obou lokusů (Tab. I a III). Skutečně, na základě vymezení vývojářů pro molekulární marker SCF27 by všichni semenní jedinci měli mít nulové alely v homozygotním stavu (MEJÍA a HINRICHSEN, 2003) a v případě SCC8 by měli obsahovat alelu scc8 (LAHOGUE et al., 1998), u které se později ukázalo, že někdy může být nahrazována nulovou alelou (ADAM-BLONDON et al., 2001). Opravdu, z 38 semenných genotypů testovaných v ADAM-BLONDON et al. (2001) jen AL, Chaouch blanc a MA neobsahují tuto nulovou alelu s jistotou. Nulová alela (nebo dvojice různých nulových alel) u lokusu SCC8, pocházející pravděpodobně z polymorfismu jednoho nukleotidu (single nucleotide polymorphism (SNP)) v místě komplementárního primerům (DAKIN a AVISE, 2004), může být tedy bežná u pěstovaných odrůd révy vinné. Všechna křížení scc8 /0 scc8 /0, scc8 /0 SCC8 + /0 a SCC8 + /0 SCC8 + /0 by generovala většinu jedinců s alespoň jednou nulovou alelou a 25% potomků by měla nulové alely v homozygotním stavu. Následky tohoto jevu jsou shrnuty v Tab. IV. 117

Tabulka IV: Segregace, možnost výskytu bezsemenného fenotypu a chování nulových alel ve kříženích mezi dvěma semennými (A), semenným a bezsemenným (B) a dvěma bezsemennými (C, D) jedinci, kteří jsou heterozygotní pro nulovou alelu u lokusu SCC8 A. Křížení mezi 2 semennými jedinci, kteří jsou heterozygotní pro 0 alelu u lokusu SCC8 B. Křížení mezi semennýni a bezsemennými jedinci, kteří jsou heterozygotní pro 0 alelu u lokusu SCC8 -/- -/- -/- +/- 0 0 0 + -/0 -/0 -/0 +/0 -/- : -/- : -/- +/- : +/- : -/- : -/- 0 : 0 : 0 + : + : 0 : 0 -/- : -/0 : 0/0 +/- : +/0 : -/0 : 0/0 1 : 2 : 1 1 : 1 : 1 : 1 Jenom semenní jedinci. Všichni jedinci 0/0 u lokusu SCC8 ukazují nulovou alelu u lokusu SCF27. Avšak jedinci scc8 /? také ukazují nulovou alelu u lokusu SCF27. Jedinci v prvních dvou sloupcích mohou být bezsemenní. Všichni jedinci 0/0 u lokusu SCC8 ukazují nulovou alelu u lokusu SCF27. Avšak jedinci scc8 /0 také ukazují nulovou alelu u lokusu SCF27. C. Křížení mezi 2 bezsemennými jedinci, kteří jsou heterozygotní pro 0 alelu u lokusu SCC8 D. Křížení mezi 2 bezsemennými jedinci, kteří jsou heterozygotní pro 0 alelu u lokusu SCC8 a jeden z nich neukazuje alelu SCC8 + +/- +/- +/- +/- + + + + +/0 +/0 -/0 +/0 D1: Matka je rekombinantní mezi SCC8 a sdi a scc8 slouží pro sdi + +/+ : +/- : -/- +/+ : +/- : +/- : -/- + : + : 0 + : + : + : 0 +/+ : +/0 : 0/0 +/- : +/0 : -/0 : 0/0 1 : 2 : 1 1 : 1 : 1 : 1 Jedinci SCC8 + /? mohou být bezsemenní. Jedinci v prvních třech sloupcích mohou být bezsemenní. Všichni jedinci 0/0 u lokusu SCC8 ukazují nulovou alelu u lokusu SCF27. Všichni jedinci 0/0 u lokusu SCC8 ukazují nulovou alelu u lokusu SCF27. Avšak jedinci scc8 /0 neukazují nulovou alelu u lokusu Legenda: SCF27. Genotyp u lokusu sdi a +/- Genotyp u lokusu SCF27 b + D2: Matka je rekombinantní mezi SCC8 a sdi (ale to Genotyp u lokusu SCC8 c +/- není nezbytné) a nulová alela u lokusu SCC8 slouží Segregace 1 pro sdi + a +, - označují alely pro bezsemenný nebo +/+ : +/- : +/- : -/- semenný fenotyp. + : + : + : 0 b + označuje alelu pro bezsemenný +/0 : +/- : 0/0 : -/0 fenotyp. 0 představuje nulovou alelu. 1 : 1 : 1 : 1 c +, - představují dvě kodominantní alely Jedinci v prvních třech sloupcích mohou být bezsemenní. pro bezsemenný nebo semenný fenotyp. Jedinci 0/0 u lokusu SCC8 neukazují nulovou alelu u 118

0 představuje nulovou alelu. lokusu SCF27. Avšak jedinci scc8 /0 ukazují nulovou alelu u lokusu SCF27. Z testovaných 25 stenospermokarpických genotypů 21 mělo alespoň jednu alelu SCC8 + (Tab. I). Ze zbylých 4 genotypů H a PN měly nulovou alelu v homozygotním stavu, N byl scc8 - /0 a E byla scc8 - /?. Naskytla se otázka, proč byly E, H, N, PN a další genotypy, popsané v ADAM-BLONDON et al. (2001) (jako 3041-153, 3048-30, Sugraone a Yaghasti) bez alely SCC8 + bezsemenné. Vzhledem k tomu, že genetická vzdálenost mezi lokusy SCC8 a sdi byla odhadována nejprv na 0,7, pak na 4,0 cm (LAHOGUE et al., 1998, ADAM-BLONDON et al., 2001), rekombinace mezi těmito lokusy během šlechtění mohou vysvětlit bezsemennost u genotypů, které nemají alelu SCC8 +. Toto může být skutečností také u N, pro kterého se naskytnou dvě možnosti. Oba rodiče N měli alelu SCC8 + a mohli předat N vázanou alelu sdi + po rekombinaci. CR nemá nulovou alelu, tedy alela scc8 u N byla zděděna po této odrůdě a nulová alela po PA, umožňujíce jasné závěry ohledně dědičnosti potomstva. Jedinci SCC8 + /scc8 a SCC8 + /0 v potomstvech NKL a NSD mohou být bezsemenní z důvodu alely SCC8 +, která byla zděděna po otcovských genotypech KL nebo SD. Protože ještě nejsou k dispozici fenotypická data, je relativně těžké určit, zda genotypy scc8 /0 nebo 0/0 mohou být bezsemenné. Je však několik důkazů, které nasvědčují, že považovat jedince scc8 /0 za bezsemenné je správnou volbou. Prvně bylo zohledněno chování molekulárního markru SCF27, který ukázal správné spojení genotypu s fenotypem v případě N. Na základě skutečnosti, že v potomstvech NKL a NSD s jednou výjimkou všichni jedinci 0/0 u lokusu SCC8 ukázali nulovou alelu u lokusu SCF27 a jedinci scc8 /0 neukázali nulovou alelu u lokusu SCF27 (Tab. III A a III B), alela scc8 má být spojená s sdi + (Tab. IV D1). Toto je výsledkem rekombinace během vývinu vajíček u CR. Po druhé, i když plodící NKL_32 nebyl bezsemenný, jak se očekávalo, ukázal snížený počet semen v bobuli a většina semen byla ve vodě plovoucí. Jsou záznamy (DOLIGEZ et al., 2002; CABEZAS et al., 2006) o tom, že QTL s velikým efektem na LG18 může také ovlivnit počet semen v bobuli, tedy NKL_32 může skrývat alelu sdi + společně s nepříznivými oparátor geny pro bezsemennost, jak je to vymezené v BOUQUET a DANGLOT (1996). Fenotyp dalších jedinců zkoumaných potomstev by proto byl značného významu, i když 119

tato potomstva mohou obsahovat několik rekombinantních jedinců a také jedince sdi + s nepříznivými operátor geny. Je očekáváno, že jedinci scc8 /0 v potomstvech NKL a NSD skrývají alelu sdi + díky rekombinaci a ne díky nerozpoznání primerových míst, protože jejich alela scc8 byla obdržena po štípání alely SCC8 + (LAHOGUE et al., 1998) a jejich nulová alela u lokusu SCC8 byla zděděna po KL a proto po CL nebo po SD a proto po AA (DL je z křížení AA MA) a bylo ukázáno, že obě nulové alely jsou spojeny s sdi (ADAM-BLONDON et al., 2001). Alela SCC8 + u CR je tedy ve vazbě s alelou sdi +. Vedle důkazu u N nejpřesvědčivejším argumentem tohoto tvrzení lze najít u M, který je bezsemennou odrůdou z křížení dvou semenných odrůd, CR a jedné bulharské selekce z křížení QV AA, sestry Yantaru nebo Yantaru samotného. Jak to naznačuje i naše skupina odrůd, přes jeho neznámý původ CR byl intenzivně použitý v šlechtitelských programech (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998), a to evidentně díky jeho funkčně samičím květům, které nevyžadují žádnou kastraci. Pracovní hypotéza, že genotypy s funkčně samičími květy podporují bezsemennost (SMIRNOV, 1962, cit. in POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998), má být upřesněna. Zdá se, že spíše lehce získatelný velký počet semenáčů a nadměrná růstová síla v propojení s fytohormonálním obsahem, než příznivé genetické složení u lokusu sdi genotypů s funkčně samičími květy jsou ve prospěch selekčního procesu. Některé z nich však skrývají alelu sdi +, jako např. CR a jiné ne, jako např. Bicane (ADAM-BLONDON et al., 2001). Nicméně je potřebné další testování v této oblasti, zahrnujíce dalších genotypů, jako např. KK, Madeleine angevine, Nimrang a jiných a bližších molekulárních markrů k lokusu sdi, jako např. VMC7f2. Toto by pomohlo určit, zda je nulová alela u lokusu SCC8 spojena s alelou sdi + u těchto odrůd. Molekulární profil S u lokusu VMC7f2 však není specifický, jak to naznačují semenný Cabernet Sauvignon, nejznámejší odrůda pro červená vína a semenný botanický druh Vitis riparia Michx., oba ukazující stejné alely u tohoto lokusu jako S (PELLERONE et al., 2001). Je zajímavé, že CR a S patří do odlišných geograficko-ekologických skupin odrůd révy vinné; CR je convarietas pontica a S je convarietas orientalis (KOZMA, 1991). Nicméně uvažujeme-li lysé listy S jako výsledek recesivních genů, pak CR s jeho ochlupenými listy (dominantní znak) může být přímým nebo vzdáleným potomkem S nebo její příbuzných, což čeká na potvrzení analýzou SSR v budoucnu. Ačkoli CR je považovaný za semennou odrůdu, vykazuje také velké množství stenospermokarpických 120

semen bez endospermu a s hnědým nebo černým (předčasně odumřelým), ale relativně měkkým osemením (neuvedené údaje), jako další důkaz pro alelu sdi +. Případ odrůdy CR je docela zajímavý a podobný k případům odrůd Pizzutello nero a Santa Paula s obloukovitými bobulemi, u kterých některá semena v bobuli jsou ovlivněna stenospermokarpií. Případy NKL_32 a L v naší skupině odrůd se jeví podobnými. Je potřebné testovat případy semenných odrůd HP a U, oba mající alelu SCF27 +. Vzhledem k tomu, že U má nějaká stenospermokarpická semena, zatímco HP je nemá (neuvedené údaje), je očekáváno, že U skrývá alelu sdi + (rekombinace mezi SCC8 a sdi), ale HP ji neskrývá (rekombinace mezi SCF27 a sdi). Jiné semenné odrůdy, které jsou považovány za velmi užitečné ve šlechtění bezsemenných stolních odrůd, protože podporují bezsemennost, představují Yantar (PERL et al., 2003) a jeho rodiče QV (SZ. NAGY, 2003, ústní sdělení) a AA (TODOROV, 2000), jako i Diamant (BAKONYI a KOCSIS, 2006) (pocházející z křížení Yulski biser Pannónia kincse (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998), tedy nepřímý potomek obou AA i QV). Případ bezsemenné odrůdy Sába királynője (Helikon Diamant) se jeví podobným k případu M. Předpokládaná alela sdi + byla zde pravděpodobně zděděna po semenné odrůdě Helikon, která je přímým potomkem S. Mechanismus bezsemennosti u těchto odrůd není známý, ale nejspíše tyto odrůdy neobsahují alelu sdi + u lokusu sdi a skrývají homozygotní recesivní operátor geny, které jsou zodpovědné za bezsemennost, když tyto odrůdy jsou kříženy s bezsemennými anebo dokonce semennými odrůdami obsahujícími alelu sdi +, jako např. CR. Nicméně dle našich výsledků, které naznačují, že u lokusu SCC8 má QV nulové alely v homozygotním stavu (Tab. I) a dle mezer v rodokmenu QV nelze vyloučit hypotézu, že QV skrývá alelu sdi + u lokusu sdi. Je zajímavé, že PA je společným otcovským genotypem u třech předpokládaně rekombinantních odrůd v naší skupině odrůd, u H, N a PN; a nulová alela PA, která byla zděděna po QV, byla předána na potomstvo. Avšak nejpravděpodobnějším vysvětlením bezsemennosti u těchto odrůd je to, že oba H a PN jsou bezsemenné díky sdi + a během vývinu pylu u PA nastala rekombinace mezi lokusy SCC8 a sdi; a N je bezsemenný díky sdi + a během vývinu vajíček u CR nastala rekombinace mezi lokusy SCC8 a sdi. Poukázali jsme tedy na to, že nulové alely u lokusu SCC8 vedle toho, že mohou být spojeny se semenným fenotypem mohou být spojeny také s sdi +. Nehledě na speciální případy, kde nulová alela u lokusu SCC8 může být užitečná (kdy jen jeden rodič nese nulovou alelu, jako např. v křížení CR PA; nebo vedle jedné nulové alely pro 121

každého, bezsemenní rodiče mají odlišné alely, SCC8 + a scc8, jako např. v křížení N KL), mělo by se vyhnout jejímu použití. Detekce je dále obtížná a jejich přítomnost v homozygotním stavu vyžaduje dodatečné ověřování kvality DNA. Určení konkrétního hlavního genomického úseku, zapojeného do bezsemennosti, pravděpodobně VvMADS5, jako i dalších lokusů by tedy bylo velmi nadějné v této oblasti. 8.5 Závěr Tyto výsledky ukazují, že obě alely, SCC8 + i SCF27 + jsou ve vazbě s alelou sdi +, která je nutnou, ale nedostatečnou podmínkou pro bezsemenný fenotyp u révy vinné. Toto je v souladu s myšlenkou, že vedle lokusu sdi další lokusy jsou zapojeny do vývinu semen, který je poměrně složitým procesem. Z alelového rozdělení je zřejmé, že existují semenné odrůdy se zvýšeným potenciálem podpory bezsemennosti. Tyto odrůdy mohou být rozděleny do dvou skupin. První skupina zahrnuje odrůdy, které skrývají alelu sdi + a mohou být selektovány pomocí odpovídajících molekulárních markrů jako SCC8, SCF27 a VMC7f2 s velkou přesností: Chaouch blanc, Chaouch rose, Luna a pravděpodobně Helikon a Urán. Přítomnost stenospermokarpických semen vedle semen normálních u těchto odrůd může pomáhat jejich identifikaci. Ve skutečnosti všichni semenní jedinci z křížení mezi jedinci sdi /sdi (nebo sdi + /sdi ) a sdi + /sdi + mají patřit do této skupiny. Druhá skupina zahrnuje odrůdy, které neskrývají alelu sdi +, ale obsahují příznivé operátor geny, jak je to vymezené v BOUQUET a DANGLOT (1996): Afus Ali, Diamant, Queen of Vineyards a Yantar. Je potřebné najít odpovídající molekulární markry, vázané na tyto lokusy. Jak to naznačuje případ Merkúru, za okolností, že tyto semenné odrůdy z jednotlivých skupin jsou zkříženy mezi sebou, mohou dávat vznik bezsemenným jedincům. Avšak přítomnost nulových alel a genetická vzdálenost molekulárních markrů od lokusu sdi, zapojeného do bezsemennosti mohou způsobit komplikace. Dokonce i slibný Jupiter s alelami SCC8 + /SCC8 + a SCF27 + /SCF27 + může být díky rekombinaci heterozygotní u lokusu sdi. 122

9. O MIMOŘÁDNÉ VELIKOSTI PARTENOKARPICKÝCH BOBULÍ ODRŮDY TALISMAN 9.1 Úvod Je známé, že mnoho semenných odrůd má sklon k tvorbě stenospermokarpických nebo/i partenokarpických bobulí (KOZMA, 1991). Stenospermokarpická semena semenných odrůd se však většinou stávají víceméně tvrdými a tím pro konzumenty citelnými. Stenospermokarpické bobule o malé velikosti přitom kazí i estetický dojem z hroznů. A protože ani podmínky jejich vzniku ledaže by se jednalo o geneticky modifikovanou odrůdu nejsou kontrolovatelné, stenospermokarpické bobule semenných odrůd, na rozdíl od těch u bezsemenných odrůd, nepředstavují pokrok na poli šlechtění na bezsemennost přirozenou cestou (KORPÁS, 2006). Jiná může být situace u semenných odrůd, které mají sklon k tvorbě partenokarpických bobulí. Partenokarpické bobule jsou jednak úplně bezsemenné, jednak jejich tvorba je z funkčně samičích květů, které se řadí mezi květy s normálním tvarem a funkčními vajíčky, dost častým jevem (KOZMA, 1991). Protože květenství skládající se z funkčně samičích květů u odrůd, které vykazují sklon k partenokarpii po izolaci před kvetením vyvinou výlučně partenokarpické bobule, takovýmto způsobem lze získat hrozny o víceméně jednotné velikosti bobulí. Poněvadž partenokarpické bobule vznikají díky stimulaci, která je vyvolána fytohormony z pylu neschopného tvorby pylové láčky a které přes exsudát blizny postupně difundují do pletiv blizny, čnělky a nakonec semeníku, jejich velikost je malá, přinejmenším ve srovnání s velikostí semenných bobulí, které vznikají řádným dvojitým oplozením a vykazují pro danou odrůdu charakteristickou velikost (PRATT, 1971; KOZMA, 1991). Se zřetelem na výše uvedené bych chtěl představit jednu novou a slibnou metodu, která byla popsána v KORPÁS (2008). Tato metoda je zaměřena na mimořádnou hmotnost přibližně 5 g vykazující partenokarpické bobule odrůdy Talisman, která obvykle disponuje velmi velkými semennými bobulemi při nízkém počtu semen. 123

9.2 Materiál a metody 9.2.1 Původ a popis rostlinného materiálu Předmětem pokusu byla ruská odrůda Talisman, která (není totožná se španělskou odrůdou Talismano, získanou z křížení Ohanes Italia (MAUL et al., 2007)) se dostala do ampelografické sbírky Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně teprve nedávno, a to pod jejím synonymem Keša-1. První úrodu dala v roce 2005, když ze 3 keřů s rýnskohesenským vedením, vysazených v roce 2003 na středně těžké hnědozemi, ve sponu 2x1 m jeden do rozsahu jednoho hroznu ukázal první úrodu. Odrůda upozornila na sebe velmi velkými, zelenožlutými, ojíněnými a chutnými bobulemi, které měly dobrou konzistenci. Jelikož v té době v rámci mé disertační práce jsem se zabýval šlechtěním bezsemenných odrůd révy vinné, odrůda se jevila použitelnou pro zvětšení velikosti stenospermokarpických bobulí. Podle jejího ukrajinského popisu pochází z křížení odrůd Frumoasa albe a Vostorg (ANONYMUS, 2008a), tedy je interspecifickým hybridem. Její původ, získaný na základě výše uvedených literárních zdrojů (MAUL et al., 2007; ANONYMUS, 2008a) lze vidět na Obr. 1. Je ranou středně ranou odrůdou s velmi silným vzrůstem. Má funkčně samičí květ, ale dobře se oplozuje. Hrozen Talismanu je velmi velký (800-1100 g), středně hustý nebo řídký, úhledný, kuželovitý nebo rozvětvený. Za špatného počasí vyžaduje náhradné opylení, protože odkvétá špatně a hrozny pak obsahují velký počet partenokarpických bobulí. Bobule Talismanu se vyznačuje výše uvedenými vlastnostmi, které se vztahují k plně zralé bobuli. Nezralá, ačkoli vybarvená bobule má nepříjemně pevnou slupku. Bobule přetížených keřů zrají zdlouhavě, často zůstanou zelená (ANONYMUS, 2008a, upraveno). 9.2.2 Zjištění typu květů odrůdy Talisman podle pohlavnosti V roce 2006 část jednoho květenství byla vykastrována, pak opylena jednou odrůdou se stenospermokarpickou bezsemenností. Při kvetení pak vyšlo najevo, že květenství se skládají z funkčně samičích květů, což z důvodu vedení odrůdy pod jejím synonymem při nedostatku originálního popisu odrůdy nebylo zřejmé. S účelem potvrzení této skutečnosti, došlo k izolaci jednoho květenství, k jeho samoopylení. 124

Obrázek 1: Původ odrůdy Talisman 9.2.3 Popis pokusných variant V roce 2007 hlavní roli hrálo samoopylení: 28. května i 5. června byla izolována květenství hlavních letorostů, 18. i 26. června pak květenství zálistkových letorostů, v pořadí 5, 1, 4, 2 květenství. Zatímco z 5 květenství, která byla izolována v květnu, u 2 odstraněním apikální části na hlavní ose došlo k půlení květenství, u květenství izolovaných v červnu nedošlo k odstranění části květenství. Jako kontroly byly vybrány hrozny vzniklé volným opylením, a to z jednoho květenství dne 28. května na hlavním, resp. z jednoho květenství dne 18. června na zálistkovém letorostu. Vedle toho u 3 hroznů, které vznikly volným opylením, jejich semenné bobule, jakmile se od bezsemenných bobulí staly dobře rozeznatelnými, byly odstraněny, a to u 2 hroznů v plné míře, resp. u jednoho hroznu z bazální části hroznu. Dále v roce 2007 u 4 květenství určených na samoopylení byl porovnán počet květů ve květenství s počtem bobulí u hroznu vzniklého z tohoto květenství a byl pozorován vývin 2 vykastrovaných květenství, která nebyla opylena. Dále 6 květenství nacházejících se na hlavních letorostech a 2 květenství nacházející se na zálistkových letorostech byla použita na křížení. 125

9.2.4 Sledované znaky V obou letech izolaci při kvetení následovalo studium hroznů a bobulí při sklizni, a to určením délky hroznů, hmotnosti bobulí i semen, jako i počtu semen v bobuli. Schopnost klíčení semen byla určena bezprostředně po sklizni, a to jejich vhozením do vodu obsahující skleničky a u každého hroznu byl zaznamenán poměr ponořujících se, tj. klíčení schopných semen, vztažený k celkovému počtu semen. 9.2.5 Statistické hodnocení Výsledky byly vyhodnoceny jednofaktorovou analýzou variance. 9.3 Výsledky 9.3.1 Talisman při nízkém počtu semen vykazuje velmi velkou hmotnost bobulí Velmi velká hmotnost bobulí, která v roce 2005 byla zjištěna bez měření, v následujících dvou letech byla detailně měřena. Sledovaný hrozen získaný kontrolovaným opylením v roce 2006 s přihlížením k veškerým semenným bobulím vykazoval průměrnou hmotnost bobulí 12,82 ± 2,63 g, což na základě jednofaktorové analýzy rozptylu na hladině významnosti 0,05 nelišil průkazně od hmotnosti bobulí 13,95 ± 2,83 g, naměřené v roce 2007 u hroznu pocházejícího se z volného opylení (Obr. 2A). Na základě dvouletého průměru odrůda Talisman tvoří bobule o hmotnosti 13,18 ± 2,68 g (Obr. 9.1 v Příloze) a toto znamená velmi veliké bobule. 126

18 16 A Hmotnost bobulí [g] 14 12 10 8 6 4 2 0 a b b c d d d d d e f 28.5.2007 5.6.2007 18.6.2007 26.6.2007 Datum výběru ( ) / izolace( ) květenství 7 6 B Hmotnost bobulí [g] 5 4 3 2 c a b b c 1 0 28.5.2007 28.5.2007 28.5.2007 28.5.2007 28.5.2007 Datum výběru ( ) / izolace( ) květenství Obrázek 2: A. Závislost hmotnosti bobulí u hroznů se semennými ( ) nebo partenokarpickými ( ) bobulemi a hmotnosti partenokarpických bobulí u hroznů se smíšenými bobulemi ( ) na datu výběru / izolace květenství. B. Vliv semenných bobulí na hmotnost partenokarpických bobulí u hroznů se smíšenými bobulemi ( ), u hroznů s partenokarpickými bobulemi od začátku ( ) a u hroznů získaných úplným ( ) nebo částečným ( ) odstraněním semenných bobulí. Sloupce značené stejnými písmeny se neliší průkazně při hladině významnosti 5% Co se týká počtu semen v bobuli, semenné bobule v obou letech obsahovaly 1, resp. 2, průměrně 1,3 ± 0,5 semena. Vyskytly se však i hrozny, které obsahovaly i bobule o velmi velké hmotnosti a zároveň s vyšším počtem semen, ale tyto se jevily spíše jako výjimečné: jedna trojsemenná bobule měla hmotnost o 19,85 g a jedna šestisemenná 127