Setkání Thermo Fisher Scientific, Tichonice 2010 Identifikace aminokyselin a jiných organických strukturních jednotek v přírodních a syntetických peptidech technikou GC-MS. Identification of amino acids and other organic units in natural and synthetic peptides by GC-MS. Zahradníčková H., Hušek P., Šimek P. Biologické centrum v.v.i. Akademie věd České Republiky Laboratoř Analytické Biochemie České Budějovice http://www.bc.cas.cz/en/
BIOLOGICKÉ CENTRUM Praha 150km Budějovice ČESKÉ BUDĚJOVICE 280km 200km Munich Vienna
UNIVERZITNÍ KAMPUS S BIOLOGICKÝM CENTREM
PROČ STUDOVAT AMINOKYSELINY? AMINOKYSELINY = základní stavební jednotky života Chemie aminokyselin je nezbytná pro široké spektrum disciplin. Stanovení jednotlivých členůřady proteinových AAs i neproteinových AAs je vzhledem k jejich strukturním odlišnostem velmi obtížný úkol. Ačkoli je analytika AAs studována již po desetiletí, neexistuje rutinní robustní univerzálně použitelná metoda stanovení AA. Matrice, v nichž jsou aminokyseliny studovány: - nejrůznější biologické tekutiny - nejrůznější tkáně živočichů - bakterie a jiné nižší organismy - léčiva, agrochemikálie - potraviny, nápoje, aromatické látky - voda - půda, sedimenty - meteority, lunární vzorky - nově syntetizované peptidy a proteiny - fosilie, kosterní nálezy
CHIRALITA CHIRÁLNÍ je molekula mající zrcadlový obraz, který se s ní nekryje. CHIRALITA je neoddělitelnou vlastností základních stavebních jednotek života aminokyselin, cukrů a tedy i peptidů, proteinů a polysacharidů. ENANTIOMERY = molekuly, které jsou zrcadlovými obrazy jedna druhé. Strukturně se vzájemně liší absolutní konfigurací. DIASTEROIZOMERY = stereoizomery, které nejsou enantiomery, mají nejméně dvě chirální centra. CH 3 COOH CH 3 COOH NH 2 H NH 2 H L-alanin D-alanin (2S)-2-aminopropanová kyselina (2R)-2-aminopropanová kyselina
DŮSLEDKY ODLIŠNÉ STRUKTURY ENANTIOMERŮ Odlišné struktury enantiomerů způsobují různé účinky enantiomerů: toxikologické S-thalidomid teratogen, R-thalidomid sedativum organoleptické D-Leu, L-Phe sladký, L-Leu, D-Phe hořký biologické S-thyroxin-hormon štítné žlázy, R- thyroxin-snižuje hladinu cholesterolu D-AAs v potravinách jsou hůře stravitelné, než L-AAs celářada dalších účinků, i dosud nepoznaných
ENANTIOSELEKTIVNÍ METODY ANALÝZ AAs A) metody enzymatické - D-aminooxidázy reagují selektivně s D-aminokyselinami B) metody chromatografické HPLC, GC, TLC nepřímé metody: racemická směs + chirálníčinidlo = pár diastereomerů separován na nechirální fázi přímé metody: rozlišení enantiomerů pomocí chirálního selektoru, který může být součástí stacionární fáze nebo mobilní fáze C) ostatní - CE, SFC, rentgenová krystalografie, NMR
GC SEPARACE ENANTIOMERŮ AAs GC metody výborné dělení i účinnost, rychlé AAs je nutno převést na těkavé deriváty Klasické postupy - karboxyskupinu je nutno esterifikovat za bezvodých podmínek, aminoskupinu acylovat anhydridy nebo acylhalogenidy za bezvodých podmínek nepřímé metody jedno z činidel musí být chirální přímé metody používají se chirální stacionární fáze (Chirasil-L-Val, cyklodextriny), též v kombinaci s MS Reakce s chlormravenčany acylace i esterifikace probíhá tímtéžčinidlem v jednom kroku ve vodněorganickém prostředí
DERIVATIZACE ALKYLCHLORMRAVENČANY (ALKYLCHLORFORMIÁTY) Zahradníčková H., Hušek P., Šimek P., Hartvich P., Maršálek B., Holoubek I., Anal Bioanal Chem. 388 (2007) 1815-1822. Hušek P., Šimek P.,Hartvich P., Zahradníčková H., J. Chromatogr.A. 1186 (2008) 391-400. Hušek P., Šimek P., Zahradníčková H., Anal.Chem. 80 (2008) 5776-5782. Zahradníčková H., Hušek P., Šimek P., J. Sep. Sci. 32 (2009), 3919-3924.
CHARAKTERISTIKY REAKCE Vodní prostředí, laboratorní teplota Průběh v několika vteřinách s velkým výtěžkem Polarita analytů se výrazně snižuje, tudíž snadno přecházejí do nemísitelné organické fáze Odstranění anorganických solí a jiných polárních interferencí, které by zhoršovaly následnou separaci a MS detekci Vzniklé deriváty jsou vhodné pro GC/FID, GC/ECD, GC/MS i LC/MS, jsou tepelně i chemicky stálé Zavedením atomů fluoru do molekuly chlorformiátu se zvýší těkavost derivátů, čímž se zkrátí doba analýzy a je možno pracovat s chirálními stacionárními fázemi, které jsou stabilní jen do 200 C.
CO REAGUJE DERIVATIZACÍ ALKYLCHLORMRAVENČANY? Funkční skupina Derivát Typ látky NH 2 karbamát aminy(alifatické) NHR karbamát aminokyseliny N- heterocyclický karbamát imidazolyl OH (fenolická) karbonát fenoly SH thiokarbonát thioly COOH ester karboxylové kyseliny Hušek P., Šimek P., Current Pharmaceutical Analysis 3 (2006), 23-43.
Rozlišení (N,O,S)-HFBOC-HFB esterů na Chirasil-L-Val Ala Val Ile Leu ThrOR Asp SerOR Glu Met Phe Asn Cys 4FPhe Gln His Orn Tyr Lys Trp Izotermálně/Teplota ( C) 4.00/110 3.58/110 2.72/120 5.45/120 3.32/130 1.68/130 2.17/140 2.66/150 2.98/150 2.31/150 0.42/150 1.77/150 2.43/150 3.03/160 1.94/170 2.14/180 1.20/190 1.34/190 0.95/200 koloně Teplotní gradient 95-200 C, 3 C/min 5.68 4.18 3.85 6.72 4.51 2.06 2.79 4.47 5.56 3.7 0.66 1.69 4.09 4.9 2.36 3.07 2.43 2.29 1.36
CHIRÁLNÍ SEPARACE AMINOKYSELIN VÁZANÝCH V PEPTIDECH Aminokyseliny je nutno před analýzou uvolnit z peptidických vazeb hydrolýzou.ta probíhá v kyselém prostředí v zatavených ampulích za teplot > 100 C v atmosféře argonu > 12 hodin. Hydrolýza je velmi komplexní proces, podmínky hydrolýzy je nutno vždy optimalizovat. Doba hydrolýzy potřebná pro kompletní uvolnění AAs z peptidů závisí na povaze jejich vazeb. Chirální analýzy AAs jsou komplikovány racemizací AAs během hydrolýzy.
SYNTETICKÝ PEPTID CARBETOCIN Peptid je používán jako léčivo stimulující laktaci. N H 2 O H 2 N O O NH 2 O HN O O NH NH O H 3 C H 3 C O NH O N NH NH H 3 C O CH 3 S NH O H 3 C O
CÍL PRÁCE Stanovit molární % zastoupení L a D-enantiomerů aminokyselin ve vzorku D-Asn-Carbetocinu. Pro kontrolu byl dodán i L-Asn-Carbetocin. PRACOVNÍ POSTUP Hydrolýza peptidu: 100 nmol peptidu v 6M HCl s 1% thioglykolové kyseliny, 24 hod., 110 C, Po ochlazení odpaření proudem dusíku dosucha. Derivatizace aminokyselin: Roztoky standardů aminokyselin nebo peptidových hydrolyzátů (o množství až do 1500 nmol celkových aminokyselin) byly derivatizovány pentafluorpropylchlormravenčanem (PFPCF). Kolona: Alltech Chirasil-Val 25m x 0.25mm, 0,16 µm.
GC/ FID chromatogram enantiomerů AAs derivatizovaných PFPC představující poměr D- : L- AAs = 10 : 90 (2 nmol D-AAs : 18 nmol L-AAs).
GC/FID chromatogram aminokyselin v D-Asn Carbetocinu (100 nmol po hydrolýze a derivatizaci)
Výsledky stanovení enantiomerů AAs v Carbetocinu Aminokyselina Rozlišení *Poměr L-/D-Asp RSD [%] poměru D-/L- AA (n = 6) Celková L-Asn-Carb. D-Asn-Carb. Racemizace [% D enantiomeru] Způsobená hydrolýzou Leucin 3.83 2.25 1.92 3.03 2.8 0.23 Asparagová 1.69 2.20 2.28* 86.34-9.45 95.79 Glutamová 3.56 1.11 1.54 5.19 4.72 0.47 Cystein 3.13 3.17 3.74 3.13 3.03 0.1 O-Methyl-tyrosin 1.22 2.49 3.12 8.05 7.01 1.04 Průběh racemizace L-AAs během hydrolýzy byl obdobný jako u racemizace D-AAs během hydrolýzy Enantiomerníčistota aminokyselin v D-Asn Carbetocinu byla počítána tak, že od hodnoty odpovídající racemizaci proběhlé v D-Asn-Carbetocinu (celková) byla odečtena hodnota odpovídající racemizaci proběhlé v L-Asn-Carbetocinu (způsobená hydrolýzou). Čistá
CÍL PRÁCE PŘÍRODNÍ PEPTID IZOLOVANÝ ZE SINIC Stanovit složení peptidu a určit chiralitu jednotlivých komponent. PRACOVNÍ POSTUP Hydrolýza peptidu: 1 nmol peptidu v 6M HCl s 0.4% sodné soli 2,3-dimerkapto-1-propansulfonové kyseliny, 24 hod., 115 C, Po ochlazení odpaření proudem dusíku dosucha. Derivatizace aminokyselin: Roztoky standardů aminokyselin nebo peptidových hydrolyzátů byly derivatizovány ethylchlormravenčanem (pro GC/MS identikaci) a heptafluorbutylchlormravenčanem (pro separaci na chirální koloně). Kolona: Varian Chirasil-Val 25m x 0.25mm, 0,12 µm.
IDENTIFIKACE LÁTEK V HYDROLYZÁTU
CHIRÁLNÍ ANALÝZA HYDROLYZÁTU u V( x 1,0 0 0 ) 1 0. C 0 h r o m a to g ra m 7. 5 5. 0 L - a llo Ile /7.5 6 4 L - Ile /8.0 5 8 L - S e r O R /1 6.0 5 5 P r o /5.4 9 9 G ly /6.9 2 7 D - a llo Ile /7.2 7 1 2. 5 0. 0 u V(x 1,0 0 0 ) 1 0. C 0 h ro m a to g ra m D -P h e /1 8.4 8 9 D -G lu /1 8.2 9 1 L -G lu /1 8.6 7 5 L -P h e /1 8.8 8 5 7. 5 5. 0 2. 5 D -G ln /2 2.6 6 5 0. 0 5. 0 7. 5 1 0. 0 1 2. 5 1 5. 0 m in 2 0. 0 2 5. 0 3 0. 0 m in
Výsledky stanovení enantiomerů AAs v přírodním peptidu Protože reakcí s heptafluorobutylchlormravenčanem nelze separovat D,Lprolin, byl hydrolyzát byl podroben reakci s methylaminem, vzniklé deriváty prolinu pak na chirální koloně poskytují dva dobře oddělené píky. V peptidu byly nalezeny tyto látky: D-Pro 8.67 % L-Pro 91.33% Gly D-alloILe 97.98% L-alloIle 2.02% L-Ile L-Ser D-Glu 92.27% D-Phe 9.65% L-Glu 7.73% L-Phe 90.35% D-Gln
ZÁVĚR Byly vypracovány nové postupy analýz aminokyselin v peptidech metodou plynové chromatografie. Peptidy jsou podrobeny kyselé hydrolýze a derivatizovány fluorovanými chlormravenčany. Produkty hydrolýzy jsou identifikovány pomocí GC/MS. Získané deriváty většiny aminokyselin jsou těkavé, snadno separovatelné na kapilární koloně Chirasil-Val. Metoda je aplikovatelná na stanovení optické čistoty farmaceuticky významných peptidů i analýzu enantiomerů aminokyselin v přírodních peptidech.
PODĚKOVÁNÍ Projekty 1. Fund for Research Support, EEA/Norway grant No. A/CZ0046/1/0018 2. Grant Agency of the Czech Republic, project No. 213/09/2014 Děkuji vám za pozornost
Překryté záznamy peptidu (černý) a DL-Pro (červený) 2. 2 5 u V(x 1 0, 0 0 0 ) 2. 0 0 1. 7 5 1. 5 0 1. 2 5 1. 0 0 0. 7 5 0. 5 0 0. 2 5 0. 0 0-0. 2 5 1 2. 0 0 1 2. 2 5 1 2. 5 0 1 2. 7 5 1 3. 0 0 1 3. 2 5 1 3. 5 0 1 3. 7 5 1 4. 0 0 1 4. 2 5 1 4. 5 0 m i n