Historie Bacillus cereus

Bacillus cereus

Bacillus cereus

Historie Bacillus cereus První záznamy týkající se otrav z potravin způsobené rodem Bacillus pochází z roku 1906, kdy Lubenau popsal propuknutí onemocnění v sanatoriu, kde se u 300 pacientů a zaměstnanců objevily silné průjmy, křeče žaludku a zvracení. Přestože Lubenau pojmenoval microorganismus, které onemocnění vyvolalo, Bacillus peptonificans, vlastnosti, které u microorganismu popsal, se podobaly vlastnostem Bacillus cereus. V Evropě se pak objevila řada takovýchto onemocnění a v letech 1936 až 1943 Stockholmské ministerstvo zdravotnictví odhadovalo, že byl tento mikroorganismus tvořící aerobní spory příčinou onemocnění ve 117 případech z 367 zkoumaných.

Historie Bacillus cereus Do roku 1950 nebyl Bacillus cereus definitivně potvrzen jako příčina onemocnění z potravin. Stalo se tak až vyjasněním taxonomie rodu. Hauge popsal čtyři propuknutí nákazy v Norsku dohromady u 600 lidí. Zdrojem byla vanilková omáčka, která byla připravena den předem a uložena při pokojové teplotě. U této omáčky bylo později zjištěno 2,5*107 až 1,1*108 /ml buněk Bacillus cereus. Tyto klasické zprávy a mnohé další popisují onemocnění, pro které byl převládajícím příznakem průjem. Je známo, že je Bacillus cereus zodpovědný za dva odlišné typy onemocnění z potravin: průjmové onemocnění ( diarrhoeal syndrom ) s relativně delší inkubační dobou a onemocnění projevující se zvracením, tzv. emetický syndrom, který má rychlý začátek a byl poprvé popsán v roce 1971 ve Spojeném Království.

Charakteristika organismu Bacillus cereus je typická, v půdě žijící Gram-pozitivní, tyčinkovitá, betahemolytická bakterie. Některé kmeny jsou nebezpečné pro lidi a vyvolávají onemocnění z potravy, (foodborne illness), zatímco jiné mohou být prospěšné jako probiotika pro zvířata. Podle tvaru sporangia se člení do tří skupin Také se označuje jako syndrom čínské restaurace ( Fried Rice Syndrome). B. cereus je aerobní, a podobně jako další členové rodu Bacillus tvoří endospory. Serotypizace je založena na bičíkovém H antigenu

Systematické zařazení Scientific classification Kingdom Bacteria Phylum Firmicutes Class Bacilli Order Bacillales Family Bacillaceae Genus Bacillus Species Cereus

Sporulující kultura B.cereus barveno podle Grama

Růst a jeho kontrola Teplota: Optimum 30-37 ºC. Některé kmeny mohou růst až do 55 ºC zatímco další rostou ještě při 4-5 ºC (mléčné výrobky) ph: minimum pro růst je 4.3 a maximum okolo 9,3. Atmosféra: Růst je optimální v přítomnosti kyslíku. Růst za annaerobních podmínek je pomalý s nízkou produkcí toxinů. Vodní aktivita: Minimální rozsah vodní aktivity k vegetativnímu růstu je 0,912 0,950.

Onemocnění vyvolaná B.cereus B.cereus tvoří několik enterotoxinů. Ojediněle může způsobovat onemocnění u imunokompromitovaných pacientů (meningitis, endokarditis, endophtalmitis, konjunktivitis nebo akutní gastroenteritis).je též původcem oportunních infekcí. otrava z potravin (enterotoxikóza) meningitís endokarditis konjunktivitis pneumonie sepse infekce ran

Diarhoeální (průjmové) onemocnění Inkubace: 10-12 hodin po požití kontaminované potraviny Symptomy: bolest břicha, vodnatý průjem a občasné zvracení (podobné jako při infekci C. perfringens). Příčinou je požití vegetativních organismů nebo spor a jejich následné množení a produkce toxinu v zažívacím traktu (enterotoxin Nhe a/nebo hemolytický enterotoxin HBL) V Evropě dosti častý výskyt

Emetický syndrom Inkubace: 1-6 hodin po požití kontaminované potraviny Symptomy: nausea a zvracení,občas následované průjmem (výsledek požití již utvořeného toxinu: emetoxin ETE). Podobně jako u S. aureus. Velice časté v Japonsku

Probiotikum B. cereus soutěží s ostatními mikroorganismy jako je Salmonella a Campylobacter v trávícím traktu tak, že jeho přítomnost redukuje jejich počet. U hospodářských zvířat : kuřata, králíci a vepři některé neškodné kmeny B. cereus se užívají jako probiotická potravní aditiva ke snížení počtu salmonel ve střevech. Zlepšuje to růst zvířat a zároveň zvyšuje bezpečnost jejich masa pro lidskou výživu.

Vliv stáří kultury na barvení

Kriteria pro B. cereus Nařízení 1441/2007 Kapitola 2.2 2.2.11 Sušená počáteční kojenecká výživa a sušené dietní potraviny pro zvláštní léčebné účely určené pro kojence do šesti měsíců věku plán odběru vzorků limity anal. metoda Bacillus cereus n/5 c/1 m=50 KTJ/g EN/ISO 7932 M= 500 KTJ/g - vyhovující, pokud jsou všechny zjištěné hodnoty m - přijatelný, pokud nejvýše c/n hodnot nachází mezi m a M a zbývající zjištěné hodnoty jsou m - nevyhovující, pokud je jedna nebo více zjištěných hodnot > M nebo se více než c/n hodnot nachází mezi m a M.

Identifikace podle ISO normy ČSN EN/ISO 7932 Na povrch tuhé selektivní půdy v Petriho miskách se očkuje určený objem zkušebního vzorku, stejně s epostupuje při očkování desetinásobných ředění vzorku. Plotny se inkubují aerobnw při 30 oc po 18-48 h. Půda obsahuje kromě živin fenolovou červeň, polymyxin B a žloutkovou emulzi. Typické kolonie jsou velké, růžové a oobvykle obklopené zónou precipitace (tvorba lecitinasy) Konfirmace na agaru s ovčí krví hemolytická reakce

Biochemická charakteristika Identifikačním znakem pro B. cereus, B. thuringiensis, B cereus var. mycoides a v menší míře B. anthracis je schopnost syntetizovat lecithinasu, která způsobuje zamlženost ve žloutkovaječném bujónu a neprůhledné zóny opalescence okolo kolonií na tomto typu agaru. Stejně jako lecithinasa (α-toxin) druhu Clostridim perfringens, jsou tyto enzymy aktivovány Ca2+ a Mg2+ ionty, vykazují určitou termostabilitu, dávají Naglerovu reakci v lidském séru, lyzují erythrocyty a jsou neutralizovány specifickým sérem. Lecithinasovou reakci na žloutkovaječném agaru, avšak mnohem slabší a omezenou, vykazují i jiné druhy (B. laterosporus, B. polymyxa a B. macerans). K této reakci dochází v místě hned pod kolonií, a proto je viditelná pouze při odstranění narostlého mikroorganismu.

B.cereus produkuje fosfolipáza C hemolyzin - oxigenlabilní cereolysin, letální pro myš oxigenstabilní hemolysin enterotoxin - mimo jiné zvyšuje permeabilitu cév emetický toxin - termostabilní, odolný vůči ph, proteázám

Různé druhy z rodu Bacillus, zvláště ty z 1 morfologické skupiny, produkují hemolysiny. Primární hemolysin B. cereus, cereolysin, je oxygenlabilní, aktivuje se thioly a inaktivuje se cholesterolem a antistreptolysinem a je blízce příbuzný, není-li identický, s hlavním hemolysinem B. thuringiensis, thuringiolysinem. B. megaterium produkuje hemolysin podobný αhemolysinu Staphylococcus aureus

Virulenční faktory Diarhetické syndromy u pacientů jsou výsledkem účinku tří toxinů Hbl, Nhe a CytK. Geny nhe/hbl/cytk jsou lokalizovány na chromosomu bakterie. Transkripce těchto genů je řízena PlcR. Tyto geny se vyskytují také v taxonomicky příbuzných B. thuringensis a B. anthracis. Tyto enterotoxiny se tvoří v tenkém střevu hostitele, tak jsou chráněny před trávícími enzymy hostitele. Toxiny Hbl a Nhe mají porační aktivitu podobnou jako E. coli. Mají konformaci "beta-barrel" tak mohou pronikat do buněčných membrán vzhledem k hydrofobnímu exteriéru, tvoří póry s hydrofilním vnitřkem (interiérem). Výsledkem je ztráta buněčného membranového potenciálu a případně smrt buňky. CytK je pory tvořící protein příbuzný ostatním hemolysinům.

PlcR PlcR je regulátor transkripce u Bacillus cereus, který aktivuje genovou expresi tak, že se váže na sekvence nukleotidů označované jako PlcR box. Ke zjištění seznamu všech genů obsažených v PlcR regulonu byly pomocí mutagenese identifikovány shodné sekvence. Referenční kmen ATCC14579 byl kompletně sekvenován, shodné sekvence byly vyhledány a utvořen virtuální regulon. PlcR kontrola těchto genů byla potvrzena porovnáním genové exprese u referenčního kmene a jeho isogenního mutanta Δ-plcR využitím DNA chipů (microarray), lacz fuzemi a dalšími metodami proteomiky. Výsledný seznam obsahoval 45 genů kontrolovaných v 28 PlcR boxech. Čtyřicet proteinů řízených PlcR bylo exportováno,z nich 22 bylo sekretováno do media a 18 bylo vázáno nebo zachyceno na struktury buněčných obalů (membrána nebo peptidoglykanová vrstva).

Transkripční regulátor PlcR ( Phospholipase C regulator) kontroluje expresi většiny známých faktorů virulence.

Proteiny řízené PlcR Funkce těchto proteinů mají souvislost s výživou (fosfolipasy, proteasy, toxiny), s ochranou buňky (bakteriociny, toxiny, transportery, bioegenese buněčné stěny) a reakce na prostředí (dvou složkové sensory, proteiny chemotaxe, GGDEF regulátory). Ćtyři geny kódují cytoplasmatické regulátory. PlcR regulon zřejmě integruje velký počet environmentálních signálů, včetně nedostatku živin a reguluje transkripci genů umožňujících překonat tyto překážky, které brzdí růst B. cereus v hostiteli: dodávka živin, ochrana hostitele, jeho imuní obrana, a soutěž s ostatními druhy bakterií. PlcR je klíčovou složkou účinné adaptace B. cereus v prostředí hostitele.

Přehled PlcR regulonů

Vliv konservačních látek Růst je inhibován 0,26% sorbové kyseliny při ph 5,5 a 0, 39% sorbátem draselným při ph 6,6 Přídavek 0,2% propionátu vápenatého zabraňuje klíčení spor B.cereus v chlebu Nisin je běžně užíván k potlačení klíčení spor a růstu v tavených sýrech, mléčných desertech, konservách, uzeném mase a v pekárenských výrobcích s vysokou vlhkostí (3.75 μg/g)

Staphylococcus aureus úvod Byl popsán před více než 140 lety jako původce abscesů a o několik desítek let i jako původce alimentárních intoxikací. V patogenezi infekčních onemocnění lidí a zvířat se uplatňují i jiné druhy, SA má u stafylokokových infekcí a intoxikací dominantní postavení. Patogenita a virulence SA je způsobena schopností kmenů produkovat biologicky aktivní proteiny: syndrom toxického šoku exfoliativní toxiny enterotoxiny

Koagulasa-pozitivní stafylokoky Staphylococcus aureus Domain:Bacteria Říše: Eubacteria Kmen:Firmicutes Třída:Bacilli Řád:Bacillales Čeleď:Staphylococcaceae Rod:Staphylococcus Druh:aureus

Staphylococcus aureus

Stafylokoky tvořící hemolýzu

Výskyt Staphylococcus aureus je přirozenou součástí mikroflóry lidského těla. Člověk je stafylokoky kolonizován od prvních dnů života. Nejvíce jsou kolonizována kůže na rukou, perinea a sliznice dýchacího a zažívacího ústrojí. Přítomnost S. aureus lze prokázat v horních cestách dýchacích u 20 50% populace. Jejich přenašeči mohou být i zdraví jedinci, u kterých není vyvoláno žádné onemocnění. Nosičství stafylokoků organismus nijak nepoškozuje, ale naopak vede k poměrně dobré odolnosti vůči infekci. K onemocnění dochází jen při oslabení imunitního systému. S. aureus rovněž kolonizuje dýchací trakt hospodářsky významných zvířat. Nejčastěji se jedná o domácí prasata a drůbež. Vyskytuje se také u řady divoce žijících druhů.

Patogenita Stafylolyziny - patří sem hemolyzin alfa, beta, gama, delta. Jsou to cytotoxiny, které poškozují nejen erytrocyty, ale i buňky různých tkání. S. aureus a haemolyticus způsobují beta-hemolýzu. Leukocidin - zvyšuje permeabilitu membrány leukocytů Exfoliatin - je epidermolytický toxin typický pro S. aureus. Způsobuje syndrom opařené kůže (SSSS, Ritterův syndrom), což je toxická epidermolýza. Jedná se o těžké poškození kůže, při němž vznikají vodnaté puchýře, které postupně praskají a kůže se pak olupuje. Tekutina v puchýřích je sterilní.

Další faktory patogenity TSST-1 (toxic shock syndrome toxin) - jedná se o toxin syndromu toxického šoku, jehož hlavním projevem je multisystémový efekt ( horečka, difúzní erytrém, průjmy, hypotenze, selhání funkce jater a ledvin). Zvyšuje propustnost endotelu Enterotoxiny - způsobují stafylokokovou enterotoxikózu. Vyskytují se i v infikovaných potravinách, jsou termostabilní a odolné vůči kyselině chlorovodíkové v žaludku.

Další faktory patogenity Plazmokoaguláza (volná) - sráží fibrinogen. Vytváří ochranný fibrinový obal a napomáhá tím k tvorbě abscesů. Hyaluronidáza - je faktor invazivity. Napomáhá tvorbě flegmóny. Štěpí kyselinu hyaluronovou a pomáhá pronikání stafylokoků do mezibuněčných prostor. Stafylokináza - je fibrinolyzin, který rozpouští fibrinové sraženiny. Lipázy - hydrolyzují lipidy a způsobují tak lepší šíření do podkoží. Nukleáza - její úloha je zatím v patogenezi nejasná. Využívá se v laboratorní diagnostice. Penicilináza - je beta-laktamáza kódovaná plasmidem. Rozkládá betalaktamový kruh betalaktamových antibiotik.

Enterotoxiny Stafylokokové enterotoxiny jsou bazické proteiny rezistentní k proteolytickým enzymům zažívacího traktu. Odolávají účinkům varu po dobu 30 minut. Svými strukturními a biologickými vlastnostmi náležejí do skupiny stafylokokových a streptokokových pyrogenních toxinů označovaných jako superantigeny, které jsou schopny stimulovat větší množství T-lymfocytů než běžné antigeny. Superantigeny jsou aktivovány ve střevech, kde navodí odezvu, což je příčinou gastroenteritid spojených s dehydratací. Stafylokokové enterotoxiny jsou jednou z příčin bakteriální virulence, vyvolávají zvracení a mohou také zapříčinit toxický šok.

Typy enterotoxinů S. aureus produkuje 11 typů enterotoxinů (SE), přičemž doposud bylo identifikováno 20 sérologicky odlišných typů. Jedná se o malé jednořetězcové polypeptidy o velikosti 26 30 kda. Syntéza je řízena chromozomálními nebo plastidovými geny. Enterotoxiny SEA, SEB, SEC, SED a SEE byly popsány již dříve, zatím co SEG, SEH, SEI a SEJ, jsou nověji popsané enterotoxiny.

Antigenní struktura peptidoglykan - je složka buněčné stěny. Navozuje v těle tvorbu interleukinu-1 a opsonizačních látek. Aktivuje komplement, má endotoxinovou aktivitu a působí jako chemotaktický faktor. Na peptidoglykanu je navázána kyselina teichoová a protein A. kyselina teichoová - navozuje tvorbu protilátek. protein A - se váže na Fc fragment IgG, čehož se pak užívá v diagnostice u tzv. koaglutinační reakce. Dále inhibuje opsonizaci a fagocytózu - má antifagocytární a antikomplementární účinek. adheziny - jsou kolonizační faktory. Způsobují adhezi stafylokoků na mezibuněčné nebo buněčné struktury (např. fibrinogen, fibronektin, kolagen, sialoprotein) BIOFILM vázaná koaguláza - je shlukovací faktor a zprostředkovává vazbu na fibrinogen.

Stafylokoková enterotoxikosa Koagulasa enzym tvořený bakteriemi, zvláště Staphylococcus aureus, který napomáhá tvorbě fibrinu z fibrinogenu při tvorbě sraženin (krevních). Test používá králičí fibrinogen.

Koagulasa Plazmakoaguláza je určujícím znakem druhu a obecně známkou patogenity. Jednoduchý protein přeměňující fibrinogen na fibrin. Srážení vyvolané koagulázou vede k akumulaci fibrinu okolo bakteriální buňky a ztěžuje tak hostitelským obraným agens zkontaktovat se s ní a zabránit tak fagocytóze. Plazmakoaguláza může přispívat k ohraničení zánětlivé reakce vytvořením fibrinového lemu kolem léze, která se přeměňuje ve stafylokokový absces. Podle produkce plazmakoagulázy se stafylokoky rozdělují do dvou velkých skupin: koaguláza pozitivní a koaguláza negativní stafylokoky. Koagulázový test se používá pro rozlišení S. aureus a S. epidermidis, který je koaguláza negativní.

Patogeneze Toxická dávka 0,1-1 µg enterotoxinu je schopna vyvolat onemocnění. Inkubační doba se pohybuje od 1 do 7 hodin. Nástup klinických příznaků je velmi rychlý a dramatický, bolesti hlavy, zvracení, bolesti břicha, vzácněji průjem. Úzdrava je rychlá, do 2 dní. Předpokládá se, že enterotoxiny stimulují lokální neuroreceptory v trávícím traktu, které prostřednictvím vagu stimulují centrum pro zvracení v mozku.

19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 + počet hlášených případů Bakteriální intoxikace 1200 1000 800 600 400 200 0

Kriteria pro St. aureus Nařízení 1441/2007 EU Kapitola 1. Kriteria bezpečnosti potravin 1.21 Sýry, sušené mléko a sušená syrovátka podle kritérií pro koagulázopozitivní stafylokoky, viz kapitola 2.2 Stafylokokové enterotoxiny: n = 5, Neprokázány ve 25 g, podle metody referenční laboratoře Společenství pro koagulázopozitivní stafylokoky

Kriteria pro St. aureus Kapitola 2.2 Mléko a mléčné výrobky 2.2.3 Sýry vyrobené ze syrového mléka 2.2.4 Sýry vyrobené z mléka, které bylo podrobeno nižšímu tepelnému ošetření než pasterizaci a zrající sýry vyrobené z pasterizovaného či silněji tepelně ošetřeného mléka nebo z pasterizované či silněji tepelně ošetřené syrovátky 2.2.5 Nezrající měkké sýry (čerstvé sýry) vyrobené z pasterizovaného či silněji tepelně ošetřeného mléka nebo z pasterizované či silněji tepelně ošetřené syrovátky 2.2.7 Sušené mléko a sušená syrovátka

Limity n=5 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.7 c=2 m 104 KTJ/g 100 KTJ/g 10 KTJ/g 10 KTJ/g M 105 KTJ/g 1000 KTJ/g 100KTJ/g 100KTJ/g Pokud jsou hodnoty > 105 KTJ/g musí být příslušná partie sýra vyšetřena na stafylokokové enterotoxiny. Kapitola 2.4 Produkty rybolovu 2.4.1 Krunýře a lastury zbavené výrobky z vařených korýšů a měkkýšů se schránkami 100 KTJ/g 1000 KTJ/g

ČSN EN ISO 6888-1 Horizontální metoda stanovení počtu koagulázopozitivních stafylokoků Část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera Kultivace na živné půdě s K2TeO3 a žloutkovou emulzí. Typické černé nebo šedé kolonie obklopené zónou ptojasnění se konfirmují na přítomnost koagulasy

Vazba na potraviny Malá množství téměř na všech typech masa a drůbeže Uzenářské výrobky, šunka Mléko a mléčné výrobky Tvrdé sýry Zákusky, v Japonsku rýžové kuličky, zmrzlina (Maďarsko)

Vliv technologií Bakterie SA jsou velmi odolné k vnějšímu prostředí. Dobře přežívají v: suchém i kyselém prostředí, snáší vysoký obsah kuchyňské soli, chladírenské i mrazírenské teploty, aerobní i anaerobní prostředí. Nepřežívají sterilační ani pasterační teploty. Toxiny jsou velmi rezistentní!

Indikátorové mikroorganismy Indikace kontroly účinnosti antimikrobiálních technologických zákroků a hygieny prostředí Indikace fekálního znečištění Koliformní bakterie - zkvašují laktosu za vniku kyseliny a plynu Enterobacteriaceae zkvašování glukosy ukazatel při rozboru pitné vody Enterokoky

Enterobacteriacae

Standardní a patogenní mikroflora E. coli Klebsiella Enterobacter Proteus Serratia Salmonella Shigella Yersinia pathogennní E. coli Všechny jsou Gram negativní Fakultativně anaerobní Fermentují glukosu Oxidasa negativní Nitrát pozitivní

Nařízení 1441/2007 EU Kapitola 2.1 maso a výrobky z něj 2.1.1 jatečně upravená těla skotu, ovcí, koz a koňovitých 1,5 2,5 log KTJ/cm2 2.1.2 jatečně upravená těla prasat 4,0 5,0 log KTJ/cm2 2.2 Mléko a mléčné výrobky 2.2.1 Pasterizované mléko a další pasterizované tekuté mléčné výrobky 1 KTJ/ml, 5 KTJ/ml 2.2.7 Sušené mléko a sušená syrovátka 10 KTJ/g (c = 0)

Nařízení 1441/2007 EU 2.2.8 Zmrzlina a maražené méčné deserty 10 KTJ/g, 100KTJ/g 2.2.9 Sušená počáteční kojenecká výživa a sušené dietní potraviny pro zvláštní léčebné účely určené pro kojence do šesti měsiců věku Nepřítomnost v 10 g 2.3.1 Vaječné výrobky 10 KTJ/g nebo ml, 100KTJ/g nebo ml

Media pro identifikaci Testování na přítomnost nebo celkový počet indikátorových organismů ( coli-aerogenes - koliformní) v potravinách je prováděno standardně. Media s krystal. violetí, methyl červení, žlučovými solemi a laktosou jsou navržena pro koliformní,t.j. laktosa pozitivní bakterie. VRBA, jsou varianty klasikého MacConkey agaru Tato media jsou užívaná v posledních 20 30 letech pro počet a izolaci koliformních org. Nové typy medií jsou pro E. coli založených na βglukuronidasové aktivitě se také užívají pro koliformy.