Využití enzymů v medicíně 1. Stanovení enzymových aktivit diagnosticky významných enzymů 2. Stanovení analytů enzymovými analytickými metodami 3. Enzymy jako terapeutika
Enzymy jako diagnostické nástroje V buňkách 10 3 10 4 vyšší konc. enzymů než v tělních tekutinách Změna energetického a metabolického stavu buněk porušení membrán uvolňování enzymů Rychlost podle molekulové hmotnost, lokalizace Koncentrační gradient
Některé příčiny poškození buněk 1. Hypoxie - poruchy okysličení krve - anémie, kardiovaskulární insuficience 2. Chemikálie, léky, polutanty - těžké kovy, alkohol, drogy, nikotin 3. Fyzikální - traumata - chlad, horko, radiace 4. Mikrobiální infekce - viry, bakterie, plísně, protozoa, 5. Imunitní mechnaismy - alergeny 6. Genetické defekty 7. Nedostatek výživy - nedostatek živin, vitamínů, minerálů 8. Jiné příčiny - proliferace určitého typu buněk, změna produkce
Clearance enzymů inaktivace, stabilita v tělních tekutinách vstřebávání retikuloendoteliálním systémem (kostní dřeň, slezina, játra) endocytosa regulovaná receptory lysozomy Diagnostika Enzymová výbava buněk podobná (není orgánová specialisace) Liší se vzájemnými poměry Isoenzymy
Hlavní diagnostické enzymy Enzym Celosvětový objem prodeje (mil USD) Alkalická fosfatasa 15 Peroxidasa 15 Cholesterol esterasa, oxidasa 8 G-6-PDH, HK 7 GOD 5 Lipasa 3 GluDH 2 LDH 2 MalátDH 2 Pyruvátkinasa 2
Transaminasy, ASP (EC 2.6.1.1), ALT (EC 2.6.1.2) Onemocnění jater, virová hepatitida, mononukleosa, cirhosa Svalové distrofie, svalová poranění, gangréna, pankreatitida Chemické stanovení: Oxokyselina + dinitrofenylhydrazin DNF hydrazon MDH Oxaloacetát + NADH + H + malát + NAD + LDH Pyruvát + NADH + H + laktát + NAD +
Kreatinkinasa (EC 2.7.3.2, ATP: kreatin N-fosfotransferasa) Podjednotky M a B, CK-1 (BB), CK-2 (MB), CK-3 (MM), CK-Mt Vyžaduje Mg 2+, inakt. Ca 2+ Cr-P : Gº = - 43,1 kj/mol -1 Reservoár ATP ve svalových a nervových buňkách Infarkt myokardu, svalové dystrofie, onemocnění CNS
Stanovení aktivity kreatinkinasy Cr + ATP CrP + ADP (kreatin kinasa) ph 9 ADP + PPyr ATP + Pyr (pyruvát kinasa) Pyr + NADH + H + laktát + NAD + (laktát dehydrogenasa) Cr + ATP CrP + ADP (kreatin kinasa) ATP + luciferin + O2 APM + oxiluciferin + PPi + CO2 + hν (luciferasa) CrP + ADP Cr + ATP (kreatin kinasa) ph 6,7 ATP + Glc Glc-6-P + ADP (hexokinasa) GlC-6-P + NADP + 6-P-glukonát + NADPH + H + (Glc-6-P dehydrogenasa)
Laktátdehydrogenasa (EC 1.1.1.27) LDH1 a LDH2 srdeční sval, ledviny, erytrocyty LDH4 a LDH5 kosterní svalstvo, játra LDH 3 plíce, slezina, ostatní tkáně 1,6 -hexandiol inh. vše kromě LDH1, Imunodetekce PL proti LD5
Diagnostika infarktu myokardu
Alkalická fosfatasa, ALP (EC 3.1.3.1), ph optimum 10, fyziologická fce neznámá, Ve všech tkáních, konc v epitelu trávicího traktu, kostech, játrech, placentě Onemocnění jater, kostí (deformace, osteoporosa) Kyselá fosfatasa ACP (EC 3.1.3.2), ph optimum < 7 V lysozomech, játra, slezina, mléko, kostní dřeň, krevní destičky, prostata
γ-glutamyltransferasa (EC 2.3.2.2), γ-glutamyl-peptid:aminokyselina γ-glutamyltransferasa -Transport AK přes membrány, metabolismus GSH - onemocnění jater, neprůchodnost žlučovodů,
Enzymy trávicího traktu Amylasy - pankreas CHT, TRY, PEP Lipasa - pankreas, lipoproteinlipasa - metabolismus triacylglycerolů, arteriosklerosa Stanovení aktivit : a navíc
Acetylcholinesterasa (EC 3.1.1.7) Onemocnění jater, otrava insekticidy, plicní embolie, akutní infekce
Stanovení analytů enzymovými metodami Kyselina močová - dna, kardiovaskulární choroby, ledvinové kameny - roztroušená skleroza Jeden z markerů oxidativního stresu Cholesterol Močovina + Glukosové sensory
Enzymy jako terapeutika 1. Náhrada geneticky deficientních nebo defektních enzymů 2. Doplnění enzymů produkovaných v nedostatečném množství (např v důsledku onemocnění urč. orgánu 3. Specifický biologický efekt aktivity enzymu
Požadavky na terapeutické enzymy: dosažení místa účinku stabilita rozpustnost čistota (minimalizace vedlejších účinků)
Rizika a jejich minimalizace Nízká stabilita - imobilizace biologická degradace intravenosní, intramuskulární nebo subkutánní aplikace Neprocházejí membránami (působí extracelulárně) - snížení Mh, fuse se signálními peptidy (ve výzkumu) Imunogenicita (e. z jiných zdrojů než lidských...rekombinantní) PEGylace, odtranění epitopů
Příklady terapeutických enzymů Oxidoreduktasy Urikasa: Uric acid + O 2 + H 2 O 5-hydroxyisourate + H 2 O 2 allantoin + CO 2 Superoxiddismutasa: 2O 2 + 2H + O 2 + H 2 O 2. Transferasa: Koagulační faktor XIII transglutaminasa tvorba ε-(γ-glutamyl)lysinových vazeb ve fibrinu fibrinová síť
Hydrolasy Digestiva lipasy, proteasy, glykosidasy Nukleasy zvýšení rozpustnosti plicního sekretu při různých onemocněních dýchacích cest Glykosidasy Lysozym antibakteriální Hyaluronidasa hydrolysa pojivových tkání usnadnění penetrace injektovaných preparátů, resorpce exudátů β-galaktosidasa Proteasy odstranění krevních sraženin, ošetření ran