STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST Krystalografická a modelovací studie struktury a funkce modelového proteinu lysozymu a nově charakterizované fosfatasy Tt82 Rostislav Šimůnek
STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST Obor SOČ: 3.Chemie Krystalografická a modelovací studie struktury a funkce modelového proteinu lysozymu a nově charakterizované fosfatasy Tt82 vybraných proteinů Crystallographic and molecular modelling study of structure and function of model protein lysozyme and newly characterized phosphatase Tt82 Autoři: Rostislav Šimůnek Škola: Česko-anglické gymnázium, Třebízského 1010/9, 370 06 České Budějovice Kraj: Konzultanti: Jihočeský kraj Mgr. Michal Kutý, Ph.D. RNDr. Květa Tůmová
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou práci SOČ vypracoval (a) samostatně a použil (a) jsem pouze podklady (literaturu, projekty, SW atd.) uvedené v seznamu vloženém v práci SOČ. Prohlašuji, že tištěná verze a elektronická verze soutěžní práce SOČ jsou shodné. Nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon) v platném znění. V. dne podpis:
Poděkování Děkuji Mgr. Michalu Kutému Ph.D., doc., Mgr. Ivaně Kuté Smatanové Ph.D., Mgr. Tatyaně Prudnikové Ph.D., Mgr. Barboře Kaščákové, RNDr. Květě Tůmové a Mgr. Petru Klierovi za obětavou pomoc a podnětné připomínky, které mi během práce poskytovali.
Obsah 1 Úvod... 1 2 Teoretická část... 2 2.1 Protein... 2 2.2 Enzymy... 2 2.2.1 Lysozym... 2 2.2.2 Fosfatasa... 3 2.3 Úvod do krystalizace... 4 2.4 Fáze krystalizace... 4 2.4.1 Nukleace... 4 2.5 Růst krystalů... 4 2.5.1 Zastavení růstu krystalů... 5 2.6 Fázový diagram... 5 2.7 Test před krystalizací... 6 2.8 Krystalizační metody... 7 2.8.1 Základní krystalizační metody... 7 2.8.2 Pokročilé krystalizační metody... 11 2.9 Krystalizační testy... 13 2.9.1 Polarizace (Polarization test)... 13 2.9.2 Obarvení (Dye test)... 14
2.9.3 Drcení (Crush test)... 14 2.9.4 Dehydratace (Dehydratation test)... 15 2.10 Makromolekulární databáze... 17 2.11 Programy pro vizualizaci 3-D makromolekulárních struktur... 17 2.11.1 Visual Molecular Dynamics (VMD)... 17 2.11.2 ACD Chemsketch... 18 2.11.3 UCSF Chimera... 18 2.11.4 SwissDock... 18 2.11.5 AutoDock Vina... 18 3 Experimentální část... 19 3.1 Krystalizace lysozymu... 19 3.1.1 Vlastní krystalizace... 19 3.1.2 Metoda visící kapky... 19 3.1.3 Metoda sedící kapky... 20 3.1.4 Mikrokrystalizace pod olejem... 20 3.1.5 Čirá kapka (Clear drop)... 21 3.1.6 Precipitace (Precipitate)... 22 3.1.7 Vytvoření kůže (Skin formation)... 22 3.1.8 Fázová separace (Phase separation)... 23 3.1.9 Sferulity (Sperulites)... 23
3.1.10 Krystaly... 23 3.2 Zobrazení struktury proteinu lysozymu a fosfatasy Tt82 pomocí grafického software 24 3.2.1 Práce s programem VMD... 24 3.2.2 Modelování programem UCSF Chimera... 26 3.2.3 Dokování programem Swissdock... 28 4 Výsledky... 29 4.1 Výsledky krystalizačních experimentů... 29 4.2 Výsledky krystalizace lysozymu... 29 4.2.1 Metoda sedící kapky... 29 4.2.2 Metoda visící kapky... 30 4.2.3 Mikrokrystalizace pod olejem... 31 4.3 Dokování ligandu a fosfatasy programem Autodock Vina... 32 4.4 Dokování ligandů a fosfatasy web aplikací SwissDock... 36 5 Diskuze... 40 5.1 Krystalizace proteinu... 40 5.2 Molekulové modelování... 40 6 Závěr... 40 7 Seznam literatury... 42 7.1 Online zdroje... 42 7.2 Použitá literatura... 43
7.3 Zdroj článku... 43 7.4 Softwarové programy... 43 7.5 Použité obrázky... 44 8 Přílohy... 44 9 Seznam zkratek... 47 9.1 Další zkratky... 47
1 Úvod Chemie je přírodní věda, která zkoumá strukturu, vlastnosti a přeměny látek. Již od starověku byla chemie, nebo tehdy spíše alchymie, nástrojem vedoucí k poznání okolního světa. Jedni chemii pokládali za kacířství, druzí za způsob, jak pomáhat lidem. Dnešní chemie má obrovský význam, využívá současné moderní znalosti a technologie a život bez ní si již ani nedokážeme představit. Chemické reakce jsou základem procesů při výrobě důležitých sloučenin (anorganických, organických i syntetických- plastů), skla, léků, kosmetiky, keramiky, získávání kovů, v potravinářství a stavebnictví. Vzhledem k tomu, že studované chemické děje jsou často velmi různorodé, je praktické chemii dělit do menších oborů, které zkoumají podobné děje. Například biochemie je hraniční obor na pomezí biologie a chemie, který studuje chemické složení a reakce probíhající v živých organismech. Velký rozmach biochemie nastal až ve 20. století společně s rozvojem nových experimentálních metod jako mikroskopie, chromatografie, rentgenová difrakce, nukleární magnetická rezonance aj. Díky těmto novým technologiím a metodám můžeme například studovat proteiny. Jako vysokomolekulární přírodní látky s relativní molekulovou hmotností 10 3 až 10 6 složené z aminokyselin. Hlavním cílem této práce je teoretické i praktické seznámení se základními metodami proteinové krystalografie na modelovém proteinu lysozymu, tj. připravit krystaly vhodnými metodami a najít optimální podmínky k jejich tvorbě. Dalším cílem je osvojit si metody molekulárního modelování, tj. naučit se orientovat v internetových strukturních databázích, pomocí grafického rozhraní zobrazovat, upravovat či postavit molekuly od velikosti dvouatomové molekuly až po DNA nebo proteiny. Součástí modelovací studie bude i tzv. dokování neboli vyhledávání vhodného vazebného místa v enzymu pomocí speciálních výpočetních nástrojů. Získané znalosti a dovednosti pak budou aplikovány na výzkum reálného systému, enzymu fosfatasy, izolovaného z mikroorganismu Thermococus thioreducens (Tt82), který je studován na pracovišti odborného konzultanta. 1
2 Teoretická část 2.1 Protein Proteiny jsou významné látky, které se vyskytují v každém živém organismu. Proteiny jsou lineární nevětvené kopolymery tvořené sledem dvaceti různých L-αaminokyselin navzájem spojených peptidovými vazbami. Aminokyseliny v proteinu mohou být uspořádány různým způsobem, což podrobně popisuje tzv. primární, sekundární (β-skládané listy, α-šroubovice, aj.), terciální a kvarterní struktura bílkovin (Mareček a Honza, 2005). 2.2 Enzymy 2.2.1 Lysozym Lysozym je antibakteriální enzym, který se nachází v každém organismu a je obsažený například v slzách, slinách či ve vaječném bílku (Crampton, 2015). Lysozym patří do velké skupiny glykosidas, enzymů, které hydrolyticky štěpí glykosidickou vazbu (Kirby, 2001). Konkrétně lysozym štěpí β-1,4 glykosidické vazby v polysacharidech mezi kyselinou N-acetylmuramovou a N-acetylglukosaminem. Tyto polysacharidy se vyskytují v buněčných stěnách určitých mikroorganismů (EEI, 2017). Lysozym je proto používán ve farmacii a v potravinářství jako antibakteriální prostředek. Na Obr.1 je detailně zobrazeno schéma enzymatického štěpení glykosidické vazby lysozymem. Toto schéma bylo vytvořeno na základě experimentální metody rentgenové difrakce na krystalech proteinu lysozymu. Na schématu je přehledně zobrazena vazba substrátu (polysacharidu) na dvě katalytické aminokyseliny Glu 35 a Asp 52 a následná enzymatická reakce (Kirby, 2001). 2
Obr. 1. Schéma enzymatického štěpení glykosidické vazby lysozymem (Kirby, 2001) 2.2.2 Fosfatasa Fosfatasa je enzym, který hydrolyzuje monoestery kyseliny fosforečné na fosfátový ion a alkohol. Patří do podkategorie hydroláz. Obr. 2. Schéma hydrolytického štěpení substrátu fosfoserinu v aktivním místě enzymu fosfatasy. Enzymatická katalýza sestává ze dvou reakčních kroků, v prvním substitučním kroku dochází k nukleofilnímu ataku fosfátu aminokyselinou Asp 11 za uvolnění alkoholu (serinu), v následném kroku je vzniklý intermediát atakován 3
molekulou vody za uvolnění kyseliny fosforečné. Kofaktor hořečnatý kation je nezbytný pro správnou orientaci substrátu, nukleofilu i intermediátu. 2.3 Úvod do krystalizace Krystalizace je složitý proces, skládající se z několika různých parametrů a podmínek, které ovlivňují vznik krystalů a jejich optimalizace k získání difraktujících monokrystalů. Podstatou správné krystalizace je pomalé přivedení systému do stavu snížené rozpustnosti a následná úprava vlastností systému pro dosažení limitního stupně přesycení.(kutá Smatanová, 2003) Cílem krystalizace je získat kvalitní monokrystaly, které jsou vhodné pro rentgenové difrakční analýzy. Vzniklé krystaly by měly být aspoň 0,05 mm velké, bez prasklin a v celku. K úspěchu lze dojít pomalým snížením rozpustnosti proteinu a dosažením limitního stupně přesycení roztoku a úpravou fyzikálně-chemických podmínek jako např. teplota nebo ph. (Kutá Smatanová, 2003) 2.4 Fáze krystalizace růstu krystalů. Proces krystalizace se skládá ze tří fází: nukleace, růstu krystalů a zastavení 2.4.1 Nukleace Nukleace je první a nejsložitější fáze, kdy dochází ke vzájemnému kontaktu vhodně orientovaných molekul respektive iontů a po překročení limitu nasycení se začínají tvořit stabilní agregáty, vzniká tzv. precipitát nebo krystalická jádra. Nukleace je proces, kdy musí být překonána energetická bariéra, aby došlo ke vzniku jádra. Vznik krystalizačních jader může být studován pomocí počítačových simulací. Po vzniku jádra krystal roste samovolně.(chayen, 2004) 2.5 Růst krystalů Druhá fáze, fáze růstu krystalů je dynamický proces, kdy dochází k interakci a uspořádání vhodně orientovaných molekul nebo iontů s povrchem krystalických jader. 4
Tato fáze je ovlivňována rychlostí difúze molekul v oblasti růstu krystalů a rychlostí odčerpání pevné fáze z roztoku. Tyto dva vlivy se nazývají difúzní a depoziční stupeň. Difúzní stupeň označuje rychlost difúze v oblasti růstu krystalů. Depoziční stupeň označuje rychlost odčerpání. (Kutá Smatanová, 2003) Pokud je depoziční stupeň nízký, nedochází ke tvorbě růstových center. Růst krystalů je pomalý nebo žádný. Naopak, jestliže je depozice vysoká, dochází ke vzniku velkého množství drobných krystalků, krystaly rostou rychle a s defekty. Ideální krystaly vznikají z malého množství stabilních krystalových jader, která rostou volnou rychlostí bez defektů. 2.5.1 Zastavení růstu krystalů Poslední fází je ukončení růstu krystalů. Malé krystaly mohou pomalu zvětšovat svůj objem a poskytnout vhodné vzorky pro rentgenovou strukturní analýzu. Může dojít ale také ke vzniku velkého množství drobných mikrokrystalů, či velkých multikrystalických agregátů nebo vznikají hydrofobní olejovité agregáty. Tyto zmíněné agregáty naznačují, že nepatrná změna experimentálních podmínek může vést ke vzniku monokrystalů vhodných pro strukturní měření. V opačném případě vznikají nekrystalické gely, amorfní pudry nebo neproběhne žádná změna a roztok zůstane čirý. 2.6 Fázový diagram Různé příklady fázových přeměn můžeme spatřit všude kolem nás, např. zmrznutí vody do ledových krystalů. Všechny tyto děje jsou založeny na nukleaci a růstu krystalů stejně jako vznik proteinových krystalů. Protein zůstává v roztoku do určité koncentrace. Změna fáze nastává tehdy, když je tento limit koncentrace dosažen. Protein již nezůstává homogenní a protein se vyloučí s roztoku v pevném stavu (ve formě krystalu). (Kutá Smatanová, 2004) Proces krystalizace je zobrazen 2D fázovým diagramem. Fázový diagram je mapa, která popisuje závislost koncentrace proteinu jako funkci okolních podmínek (teplota, koncentrace srážecího činidla, ph, atd.). Typický fázový diagram se skládá ze čtyř oblastí, kde každá oblast reprezentuje odlišné stupně přesycení. Tyto oblasti jsou zobrazeny na Obr.3: 5
Oblast vysokého přesycení (srážecí oblast, červená) protein se bude srážet Oblast mírného přesycení (labilní oblast, zelená) zde probíhá nukleace Oblast nízkého přesycení (metastabilní oblast, žlutá) - neprobíhá nukleace, ale krystaly zde můžou růst, vznikají stabilní krystaly. V této oblasti jsou nejvhodnější podmínky pro růst vhodně uspořádaných krystalů) Oblast nenasycení (bílá) zde protein nekrystalizuje, je plně rozpuštěn Obr. 3. Fázový diagram růstu krystalů Důležitou součástí fázového diagramu je křivka rozpustnosti, která udává změnu rozpustnosti proteinu v závislosti na koncentraci srážecího činidla. Křivka rozpustnosti je rozmezí, kde se proteinové krystaly rozpouští v nenasycené oblasti, kde je koncentrace pod rozpustností proteinu a naopak růst krystalů probíhá v oblasti přesycení. 2.7 Test před krystalizací Před samotnou krystalizací se provádí pre-krystalizační test, který se používá k určení vhodné koncentrace vzorku proteinu pro krystalizační experimenty. Tato vhodná koncentrace vzorku je klíčová krystalizační proměnná. Vzorky, které mají 6
vysokou koncentraci, vedou ke vzniku amorfní sraženiny, kdežto ve vzorcích, které jsou hodně zředěné, nedochází ke vzniku krystalů a roztoky zůstávají čiré. Tyto dva výsledky jsou typické pro krystalizační činidla, která nepodporují krystalizaci a jsou částí většiny krystalizačních pokusů. Jakmile se optimalizuje koncentrace vzorku, počet čirých kapek a sraženin se v průběhu experimentu sníží, což vede k většímu využití vzorku, a zároveň zvyšuje šanci na úspěšnou krystalizaci. Existuje sada pro pre-krystalizační test, ve zkratce PCT, která obsahuje 4 unikátní činidla (Hampton Research, Aliso Viejo USA). Vzorek proteinu se smíchá se dvěma z nich, a tím stanovíme, zda je koncentrace proteinu vhodná ke krystalizaci. Pokud je protein velmi citlivý vůči koncentraci soli a polymeru, test se opakuje s dalšími dvěma činidly. Výsledky testu směřují k odpovídající koncentraci vzorku. Další způsoby testu lze udělat nativní gelovou elektroforézou nebo dynamickým rozptylem světla. 2.8 Krystalizační metody Ke krystalizaci se používá různá řada metod, jejímž účelem je dostat roztok do stavu přesycení. To znamená do stavu, kdy dochází ke krystalizaci. Metody se rozdělují na základní, pokročilé a alternativní. 2.8.1 Základní krystalizační metody Mezi základní krystalizační metody patří metoda sedící, visící a sendvičové kapky založená na difúzi par (Sitting/Hanging/Sandwich Drop Vapor Diffusion), viz. Obr. 4, 5, 6. Rezervoár (jamka v destičce) je naplněn srážecím činidlem a kapka obsahuje srážedlo (precipitant) a roztok proteinu. V kapce je nižší koncentrace srážecího činidla, což způsobí difúzi vody (rozpouštědla). Krystaly se vytvoří v okamžiku, kdy je systém v rovnovážném stavu nebo v blízkosti rovnováhy. Stručně řečeno, rovnováha je ustanovena v závislosti na různé koncentraci roztoku v rezervoáru a v kapce pomocí difúzi vodních par. (Hampton research, 2015) 7
2.8.1.1 Metoda sedící kapky (Sitting Drop Vapor Difussion) Metoda sedící kapky je nejvíce používaná metoda pro krystalizaci makromolekul. Do rezervoáru je napipetováno určité množství (500-1000µl) precipitátu. Kapka (až 20µl), která je složená z roztoku proteinu a srážecího činidla v daném poměru je poté umístěna do stojanu uprostřed rezervoáru. Kapka obsahuje nižší koncentraci činidla než v rezervoáru. Celý systém se poté zaizoluje lepicí páskou nebo překryje krycím sklíčkem. Schéma této metody je zobrazena na Obr. 4. Obr. 4. Schéma metody sedící kapky (obrázek autora) Výhody metody sedící kapky: Efektivní Nanesení kapky je jednodušší a kapka má stabilní polohu Kompatibilita s gely Často jednodušší při použití detergentů, organických a hydrofobních činidel Nevýhody metody sedící kapky Riziko přilnutí kapky k povrchu 8
2.8.1.2 Metoda visící kapky (Hanging Drop Vapor Diffussion) Metoda visící kapky patří také mezi běžně používané metody pro krystalizaci makromolekul pomocí difúze par. Postup je u ní trochu obtížnější. Kapka smíšená se vzorkem proteinu a reakčním činidlem je umístěna doprostřed krycího sklíčka. Obvod rezervoáru je potřen silikonovým gelem, aby došlo k vytvoření uzavřeného systému po přiložení krycího sklíčka s kapkou na rezervoár. K rovnováze dojde tehdy, když je koncentrace činidla v kapce stejná jako v rezervoáru. Schéma metody je zobrazeno na Obr. 5. Obr. 5. Schéma metody visící kapky (obrázek autora) Výhody metody visící kapky Je efektivní Jednoduchý přístup ke krystalům Lze provést více kapek (experimentů) s jediným rezervoárem Nevýhody metody visící kapky Riziko znečištění kapky Omezený objem kapky 9
2.8.1.3 Metoda sendvičové kapky (Sandwich Drop Vapor Difussion) Další metodou je metoda sendvičové kapky, která je zobrazena na Obr. 6. Tato metoda se používá oproti metodě sedící a visící kapky vyjimečně. Do rezervoáru se napipetuje určitý objem precipitátu, dále se napipetuje smíchaný roztok proteinu se srážecím činidlem doprostřed na spodní sklíčko, a poté se přiloží horní krycí sklíčko. Mezi sklíčky zůstane malý prostor a kapka je sevřena z obou stran, jako sendvič, podle toho dostala metoda název. Obr.6. Schéma metody sendvičové kapky (obrázek autora) Výhody sendvičové metody: Skvělá volba pro pozorování krystalů Nevýhoda sendvičové metody: Časová náročnost 2.8.1.4 Mikrokrystalizace pod olejem (Microbatch Under Oil) Další metodou je mikrokrystalizace, kde jsou směs vzorku proteinu a precipitátu uzavřeny v kapiláře nebo pipetovány pod vrstvu oleje. 10
V této technice je malá kapka roztoku proteinu a srážecího činidla nepipetována pod malou vrstvou parafinového nebo silikonového oleje. Olej umožňuje postupné odpařování vody, viz Obr. 7. Obr. 7. Metoda mikrokrystalizace pod olejem (převzato od Chayen) 2.8.2 Pokročilé krystalizační metody Mezi pokročilé krystalizační metody patří metoda volné difúze (Free Interface diffusion). Vzorek proteinu a srážecí činidlo jsou umístěny v malých skleněných kapilárách. Metoda je zobrazena na Obr. 8. Obě složky jsou v přímém kontaktu, kapilára je zaizolována voskem. Postupem času se obě složky promíchávají. Krystaly mohou vzniknout v původním místě, nebo v místě, kde je vyšší či nižší koncentrace proteinu. 11
Obr. 8. Schéma metody volné difúze ve skleněné kapiláře (obrázek autora) 12
2.9 Krystalizační testy Při testování krystalů musíme rozlišit, zdali jsou vzniklé krystaly biologické makromolekuly (proteiny) nebo krystaly solí (anorganické, malé molekuly). Proto se provádí řada testovacích metod, jak rozlišit krystal proteinu od soli. Mezi časté metody patří Polarizace, Obarvení, Drcení a Dehydratace. 2.9.1 Polarizace (Polarization test) Metoda polarizace je založena na dvojlomu světla při použití polarizačního filtru. Pokud je krystal proteinového původu, vykazuje slabý dvojlom světla, zatímco krystaly soli vykazují tuto vlastnost velmi silně. Obr. 9. Krystaly bez polarizace (foto autor) 13
Obr. 10. Krystaly proteinu s polarizací (foto autor) 2.9.2 Obarvení (Dye test) Barvící test spočívá v nanesení (1 µl) methylové modře (komerční barvivo IZIT) do kapky s krystalem. Proteinové krystaly obsahují ve své struktuře značné množství vody. Molekuly barviva difundují do kanálků a dochází k obarvení celého krystalu. Na rozdíl od proteinových krystalů, krystaly soli tyto kanálky neobsahují, tudíž nemůže dojít k absorpci barviva a obarvení krystalu. Obr. 11: Krystal proteinu před (vlevo) a po (vpravo) obarvení (dye test) (foto autor) 2.9.3 Drcení (Crush test) Proteinové krystaly se chovají více jako uspořádaný gel než tvrdé krystaly soli. Proteinové krystaly mají tu vlastnost, že se na dotyk rozpadnou na malé krystalické části. Krystaly soli se také rozpadnou, ale musíme k tomu vynaložit větší sílu. Navíc často můžeme uslyšet menší křupnutí. Na provedení metody Drcením potřebujeme speciální mikro-nářadí nebo jehlu. 14
Obr. 12. Krystal proteinu před (vlevo) a po (vpravo) metodě drcení (crush test) Obr. 13. Krystal proteinu po metodě drcení s polarizací 2.9.4 Dehydratace (Dehydratation test) Tato metoda je ze všech nejjednodušší. Kapku s krystalem necháme volně na vzduchu. Dojde k vypaření vody a na sklíčku zůstane jen krystal. Proteinový krystal se po vypaření rozpouštědla dehydratuje a degraduje. Krystaly soli se po vypaření nijak nedeformují a většinou nezmění svůj vzhled. 15
Obr. 14. Krystaly proteinu před dehydratací Obr. 15. Krystaly proteinu po dehydrataci 16
2.10 Makromolekulární databáze Struktury biomakromolekul jsou spolu se strukturními informacemi o rentgenových difrakčních datech ukládány do online databází. Nejpoužívanější databáze ve strukturní biologii je RCSB PDB (Protein Data Bank, 2008). Tato databáze byla založena v roce 1971 doktorem Walterem Hamiltonem. RCSB PDB je celosvětový zdroj, kde jsou uloženy 3-D struktury makromolekul jako např. proteinů, nukleonových kyselin a makromolekulárních komplexů. Všechny informace jsou všem dostupné zdarma a obsah je každý týden aktualizován. Ke dni 27.2.2019 RCSB PDB databáze obsahovala 149 424 struktur biomakromolekul. V databázi PDB lze vyhledat struktury podle názvu sloučeniny, ID, sekvence, či autora, který strukturu uložil. Databáze PDB vytváří prostředky a nástroje pro vzdělávání a výzkum v oblasti molekulární biologie, strukturní biologie a výpočetní biologie. Další populární databáze je PubChem (PubChem, 2019), což je databáze anorganických a organických molekul. Tento systém je spravován Národním centrem pro biotechnologické informace (National Center for Biotechnology Information, NCBI). Přístup do této databáze a k jejím informacím je volně přístupný. Tato databáze byla založena v roce 2004. 2.11 Programy pro vizualizaci 3-D makromolekulárních struktur 2.11.1 Visual Molecular Dynamics (VMD) VMD je grafický software pro zobrazení, modifikaci, analýzu a animaci velkých bimolekulárních systémů jako jsou proteiny, nukleové kyseliny, dvojvrstvové sestavy lipidů, atd. VMD lze spustit na počítačích s operačním systémem MacOS X, Unix nebo Windows. Program ve formě binárního i zdrojového kódu je poskytován zdarma ke stažení (VMD, 1996). Tento program se používá hlavně na práci s velkými molekulami. VMD má mnoho možností a metod pro zobrazení tvaru či barvy struktury: jednoduché drátové modely, modely kuličkové CPK cylindrické, stužkový model hlavního řetězce, povrchový model a mnohá další užitečná zobrazení. VMD má také možnost provádět různé animace a prezentace nebo analyzovat trajektorii molekulární dynamické simulace (VMD, 1996 ). 17
2.11.2 ACD Chemsketch Program Chemsketch umožňuje kreslit chemické strukturní 2D i 3D vzorce malých molekul organických a organometalických sloučenin. Tento program umožňuje i měření a výpočty molekulárních vlastností (molekulovou hmotnost, meziatomové vzdálenosti, vazebné a torzní úhly, aj.) a dokonce vygenerovat jejich systematický název (ACD/Chemsketch 2012). 2.11.3 UCSF Chimera UCSF Chimera je velmi populární program pro interaktivní vizualizaci a analýzu molekulárních struktur a souvisejících dat, včetně map elektronové hustoty, molekulových povrchů, sekvence aminokyselin. Program také provádí analýzu dokování a trajektorií molekulové dynamiky. Program má možnost vygenerovat animace a obrázky molekul ve vysoké kvalitě. Chimera poskytuje také manuály a dokumentace, které mohou být stáhnuty zdarma pro akademické či osobní využití (UCSF Chimera, 2004). 2.11.4 SwissDock Na rozdíl od ostatních programů, SwissDock je webová služba, která předpovídá molekulární interakce, které se mohou nacházet mezi cílovým proteinem a malou molekulou. SwissDock je založen na dokovacím softwaru EADock DDS (SwissDock, 1996). 2.11.5 AutoDock Vina Autodock Vina je samostatný nezávislý program, který nemá žádné grafické rozhraní a ovládá se na příkazovém řádku. Proto se často vyskytuje jako modul modelovacích nástrojů, například je i součástí programu UCSF Chimera. Nástroj Autodock Vina se vyznačuje poměrně velkou spolehlivostí v nalezení případného enzymatického aktivního místa a určení pravděpodobných pozic a konformací ligandu ve vazebném místě. Podle (reference) je AutoDock Vina v porovnání s jeho předchůdcem AutoDock 4 úspěšnější v nalezení správné pozice substrátu ve vazebném místě. 18
3 Experimentální část 3.1 Krystalizace lysozymu 3.1.1 Vlastní krystalizace Ke krystalizaci lysozymu byly použity následující metody: metoda visící a sedící kapky, metoda mikrokrystalizace pod olejem a volná difúze v kapilárách. Byl použit lysozym vaječného bílku z PDB databáze pod kódem 5b1f. K provedení experimentu se použily již předem připravené krystalizační roztoky, naředěný roztok lysozymu, krystalizační destičky a automatické mikropipety. Celý experiment probíhal při pokojové teplotě 24 C. 3.1.2 Metoda visící kapky Při metodě visící kapky byly testovány čtyři různé koncentrace roztoku lysozymu (20 mg/ml, 40 mg/ml, 80 mg/ml, 100 mg/ml) a 5 koncentrací srážecího roztoku chloridu sodného (6%, 8%, 10%, 12%, 14%). Reservoáry v krystalizační destičce byly naplněny 500 µl krystalizačního činidla a kapky obsahovaly 1 µl roztoku proteinu a 1 µl roztoku z rezervoáru. 19
3.1.3 Metoda sedící kapky Metoda sedící kapky byla provedena při stejných podmínkách jako metoda visící kapky. Opět byly testovány čtyři různé koncentrace roztoku lysozymu (20 mg/ml, 40 mg/ml, 80 mg/ml, 100 mg/ml) a 5 koncentrací krystalizačního roztoku chloridu sodného (6%, 8%, 10%, 12%, 14%). Rezervoár byl naplněn 500 µl krystalizačního činidla a kapky byly připraveny v poměru 1:1. 3.1.4 Mikrokrystalizace pod olejem Pro metodu mikrokrystalizace pod olejem byl použit parafínový olej, čtyři různé koncentrace lysozymu (20 mg/ml, 40 mg/ml, 80 mg/ml, 100 mg/ml) a 5 koncentrací roztoku chloridu sodného (6%, 8%, 10%, 12%, 14%). Krystalizační destička byla naplněná vrstvou parafinového oleje a následně byly pod vrstvičku oleje napipetovány kapky složeny z roztoku proteinu a činidla v poměru 1:1. 20
. 3.1.5 Čirá kapka (Clear drop) Čirá kapka indikuje stav, kdy je vzorek proteinu v roztoku. To je způsobeno nízkou koncentrací proteinu nebo srážecího činidla, takže koncentrace roztoku nedosáhla bodu nasycení a systém se nachází v nenasycené zóně. Nemohla tedy proběhnout nukleace a ani růst krystalů. Čirá kapka je bez krystalů, sraženin nebo fázové separace. Obr.19: Čirá kapka se vzorkem proteinu v roztoku (foto autor) 21
3.1.6 Precipitace (Precipitate) V roztoku může dále dojít ke vzniku sraženiny (precipitátu), nebo se může zformovat tzv. kůže, může také dojít k fázové separaci či vzniku sferulitů. Obr. 20: Precipitace (BERGFORS, Terese. Protein Crystallization [online]. [cit. 5.3.2019]. Dostupný na WWW: http://xray.bmc.uu.se/terese/images/4.gif) 3.1.7 Vytvoření kůže (Skin formation) Obr. 21: Vytvoření kůže, tzv. skin formation (převzato od Bergfors) 22
3.1.8 Fázová separace (Phase separation) Obr. 22: Fázová separace (převzato od Bergfors) 3.1.9 Sferulity (Sperulites) Obr. 23: Sferulity (převzato od Bergfors) 3.1.10 Krystaly Krystaly se mohou objevit jako mikrokrystaly nebo mikrokrystalické sraženiny, či jako jedna jehlice, dvourozměrná deska nebo trojrozměrné monokrystaly, jehličky či desky. Krystal se od sraženiny vcelku lehce rozezná. Krystal má zřetelně viditelné 23
hrany, kdežto sraženiny ne. Nejvhodnějším výsledkem krystalizace je ideálně velký, kvalitní monokrystal. Obr. 24: Krystaly proteinu (převzato z Imperial college) 3.2 Zobrazení struktury proteinu lysozymu a fosfatasy Tt82 pomocí grafického software Pro zobrazení struktury lysozymu byla použita struktura z PDB proteinové databanky pod kódovým označením XXX. Struktura fosfatasy izolované z mikroorganismu Thermococus thioreducens (Tt82) byla vyřešena na pracovišti konzultanta a také uložena v databázi PDB pod kódem 6iah. Pro vizualizaci 3D struktury fosfatasy a lysozymu byly použity programy VMD a UCSF Chimera. 3.2.1 Práce s programem VMD Pomocí programu VMD byla zobrazena struktura molekul lysozymu a fosfatasy různými způsoby. Byly vytvořeny modely proteinů a na strukturách byla vyhledána a zvýrazněna zajímavá místa, jako jsou aminokyseliny a kofaktory související s aktivním místem enzymu. 24
Obr. 25. Hlavní ovládací (vpravo nahoře) a grafické okno (uprostřed) programu VMD s vyobrazením proteinu fosfatasy Tt82. Protein je zobrazen tyčinkovým modelem (červeně kyslík, světle modře uhlík, tmavě modře dusík, žlutě síra, velká hnědá kulička - atom hořčíku v aktivním místě enzymu) Obr. 26. Detailní pohled na aminokyseliny a kofaktor - atom hořčíku v aktivním místě enzymu fosfatasy Tt82 25
Obr. 27: Grafické okno (uprostřed) programu VMD se zobrazenou strukturou lysozymu v tyčinkové formě, hnědá kulička indikuje kationt Na +. Okno (vpravo nahoře) slouží k úpravě a vizualizaci struktury. 3.2.2 Modelování programem UCSF Chimera Program UCSF Chimera je podobný programu VMD. Umožňuje zobrazit celou strukturu molekuly a libovolně ji modifikovat. Bylo provedeno dokování pěti vybraných ligandů pomocí nástroje Autodock Vina. Jako ligandy byly použity následující deriváty monosacharidů: D-ribóza-5-fosfát, D-manóza-6-fosfát, D-fruktóza-1-fosfát, 2-deoxy-D-ribóza-5-fosfát a 2-deoxy-glukóza- 6-fosfát. V první přípravné fázi dokování byla z experimentální pdb struktury vytvořena data proteinu ve formátu mol2 pomocí volby dock prep. Takto byly vymazány molekuly 26
vody a molekuly precipitantu, byly dodány náboje na atomech a následně byla 3D struktura proteinu energeticky zoptimalizována. Poté byla k proteinu načtena i 3D struktura ligandu pro následný dokovací proces. Obr. 28. Grafické okno programu Chimera se zobrazenou strukturou fosfatasy. Šedá stužka reprezentuje polypeptidový řetězec, tyčinkovým modelem jsou vyobrazeny klíčové molekuly (amionokyseiny aktivního místa, kofaktor atom hořčíku zelenou kuličkou, kation Na + modrou kuličkou) Obr. 29: Grafické okno (uprostřed) programu Chimera se strukturou lysozymu, modrá kulička indikuje kationt Na +. Ke grafickému oknu je (vpravo nahoře) zobrazena sekvence lysozymu. Pomocí nástroje AutoDock Vina (modul Chimery) byla na molekule proteinu manuálně zvolena oblast (ve tvaru kvádru o definované velikosti hran) pro hledání potenciálních vazebných míst pro navázání ligandu na protein. Vzhledem k tomu, že 27
vazebné místo nebylo přesně známo, byla do vybrané oblasti vyhledávání zahrnuta celá molekula proteinu Obr. 30. Hlavní grafické okno (uprostřed) programu Chimera s aktivním oknem modulu Autodock Vina (vpravo nahoře) 3.2.3 Dokování programem Swissdock Webový dokovací nástroj Swissdock byl otestován na stejné sadě ligandů (fosfátovaných derivátů monosacharidů) jako v předchozím případě. Nástroj Swissdock byl spuštěn po zadání strukturních dat proteinu a ligandu (ve formátu pdb) a emailové adresy, na které mají být zaslány výsledky z dokování. Obr. 31. Internetový dokovací nástroj Swissdock. Do zadávacího řádku Target selection zadáme strukturu proteinu, do řádku Ligand selection zadáme strukturu ligandu 28
4 Výsledky 4.1 Výsledky krystalizačních experimentů Výsledky krystalizačních experimentů byly pozorovány po dobu 1 týdne stereomikroskopem SZX9 (Olympus, ČR). Výsledky krystalizace lysozymu se lišily z důvodu použití odlišných metod a krystalizačních podmínek. Dobu vzniku krystalů nelze s přesností určit, některé krystaly se vytvoří po pár minutách, jiné po uplynutí delší doby, někdy až po roce. 4.2 Výsledky krystalizace lysozymu 4.2.1 Metoda sedící kapky Lysozym při krystalizaci metodou sedící kapky krystalizoval jen v některých případech. Krystaly vznikly při všech koncentracích lysozymu (20 mg/ml, 40 mg/ml, 80 mg/ml, 100 mg/ml) a koncentraci roztoku chloridu sodného (6%, 8%, 10%, 12%) kromě (14%), kdy se krystaly nevytvořily. Tvar, velikost a množství bylo ovlivněno koncentrací lysozymu. V následující tabulce jsou vyznačeny zelenou barvou jamky, kde došlo ke krystalizaci a následnému vytvoření krystalů, modrou barvou jamky s mikrokrystalky a bílá barva naznačuje precipitaci, jamky bez krystalů. 29
Obr. 32: Krystaly vzniklé metodou sedící kapky. (vlevo) lysozym 80 mg/ml, 6% roztok NaCl. (uprostřed) lysozym 1000 mg/ml, 8% roztok NaCl. (vpravo) lysozym 40 mg / ml, 15% roztok NaCl. 4.2.2 Metoda visící kapky U metody visící kapky byly zaznamenány krystaly u všech koncentrací lysozymu a roztoku chloridu sodného, kromě hodnoty 14%. Nejvíce krystalů bylo vytvořeno za podmínek koncentrace lysozymu (40 mg/ ml). V osmi krystalizačních jamkách krystalizační destičky vznikly monokrystaly (zelené pozadí tabulky), čtyři jamky obsahovaly mikrokrystalky (modré pozadí) či precipitát a v osmi jamkách nedošlo ke krystalizaci, tedy růstu krystalů (bílé pozadí). 30
Obr. 33: Krystaly vytvořené metodou visící kapky. (vlevo) lysozym 80 mg / ml, 6% roztok NaCl. (uprostřed) lysozym 20mg / ml, 10% roztok NaCl. (vpravo) lysozym 100 mg / ml, 8% roztok NaCl. 4.2.3 Mikrokrystalizace pod olejem U mikrokrystalizace pod olejem se jako nejvhodnější koncentrace precipitačního činidla ukázala koncentrace 8% roztoku chloridu sodného a koncentrace lysozymu 40 mg/ml, 80 mg/ml a 100 mg/ml. Ve třech krystalizačních jamkách krystalizační destičky vznikly monokrystaly (zelené pozadí tabulky), tři jamky obsahovaly mikrokrystalky či 31
precipitát (modré pozadí) a ve čtrnácti jamkách nedošlo ke krystalizaci, tedy růstu krystalů (bílé pozadí). Obr. 34: Krystaly vytvořené mikrokrystalizací pod olejem. (vlevo) Lysozym 20 mg / ml, 6% roztok NaCl. (vpravo) Lysozym 80 mg / ml, 8% roztok NaCl. 4.3 Dokování ligandu a fosfatasy programem Autodock Vina Prostřednictvím programu Autodock Vina a grafického prostředí programu UCSF Chimera bylo dokováno celkem 5 ligandů (fosfátovaných derivátů 32
monosacharidů). U všech ligandů bylo nalezeno nejvhodnější vazebné místo mezi ligandem a proteinem. Výsledky byly porovnány s výsledky webové aplikace SwissDock. Při postupném dokování jednotlivých ligandů bylo nalezeno vždy 10 pozic pro vhodné navázání ligandu ke zkoumanému enzymu. Obr. 35: Dokování D-ribóza-5-fosfátu. (vlevo) Grafické okno programu Chimera se zobrazením ligandu v aktivním místě enzymu. Žlutá přerušovaná čára vymezuje vzdálenost 3,538Å mezi fosforem a aminokyselinou Asp6. (vpravo) Okno ViewDock se všemi deseti nalezenými pozicemi ligandu. Pátá pozice (zobrazena v levém grafickém okně) s interakční energií (Score) -5,5 kcal/mol je vhodně naorientována pro nukleofilní atak aminokyselinou Asp6. Rozměry boxu pro hledání vhodného vazebného místa v proteinu byly následující: x = 34,41 Å, y = 35,53 Å, z = 31,59 Å. 33
Obr. 36: Dokování D-mannóza-6-fosfátu. Druhá pozice (zobrazena v levém grafickém okně) s interakční energií (Score) -5,8 kcal/mol je vhodně naorientována pro nukleofilní atak aminokyselinou Asp6, vzdálenost mezi fosforem a aminokyselinou Asp6 je 3,350 Å. Rozměry boxu pro hledání vhodného vazebného místa v proteinu byly následující: x = 35.62 Å, y = 31.15 Å, z = 31.65 Å. Obr. 37: Dokování D-fruktóza-1-fosfátu. Druhá pozice (zobrazena v levém grafickém okně) s interakční energií (Score) -5,8 kcal/mol je vhodně naorientována pro nukleofilní atak aminokyselinou Asp6, vzdálenost mezi fosforem a aminokyselinou 34
Asp6 je 3,350 Å. Rozměry boxu pro hledání vhodného vazebného místa v proteinu byly následující: x = 34.62 Å, y = 27.98 Å, z = 29.98 Å. Obr. 38: Dokování 2-deoxy-D-ribóza-5-fosfátu. Osmá pozice (zobrazena v levém grafickém okně) s interakční energií (Score) -5,0 kcal/mol je vhodně naorientována pro nukleofilní atak aminokyselinou Asp6, vzdálenost mezi fosforem a aminokyselinou Asp6 je 3,898 Å. Rozměry boxu pro hledání vhodného vazebného místa v proteinu byly následující: x = 44.94 Å, y = 33.41 Å, z = 38.48 Å. 35
Obr. 39: Dokování 2-deoxy-D-glukózy-6-fosfátu. Druhá pozice (zobrazena v levém grafickém okně) s interakční energií (Score) -5,8 kcal/mol je vhodně naorientována pro nukleofilní atak aminokyselinou Asp6, vzdálenost mezi fosforem a aminokyselinou Asp6 je 3,585 Å. Rozměry boxu pro hledání vhodného vazebného místa v proteinu byly následující: x = 38.32 Å, y = 32.08 Å, z = 33.61 Å. 4.4 Dokování ligandů a fosfatasy web aplikací SwissDock K dokování 5 vybraných fosfátovaných monosacharidů byla použita webová služba SwissDock. Výsledky vytvořené touto internetovou službou byly následně zobrazeny prostřednictvím grafického rozhraní programu UCSF Chimera a později porovnány s výsledky vytvořené programem Autodock Vina. 36
Obr. 40: Dokování D-ribóza-5-fosfátu. 68. pozice (zobrazena v levém grafickém okně) s interakční energií -2,77949 kcal/mol není vhodně naorientována pro nukleofilní atak aminokyselinou Asp6, vzdálenost mezi fosforem a aminokyselinou Asp6 je 7,804 Å. Obr. 41: Dokování D-mannózy-6-fosfátu. Byly nalezeny dvě vzdálené pozice. Vzdálenost mezi fosforem a aminokyselinou Asp6 je 5,797 Å, respektive 5,974 Å. 37
Obr. 42: Dokování D-fruktóza-1-fosfátu. Byla nalezena jedna vzdálená 32. pozice s interakční energií -38,6528 kcal/mol. Vzdálenost mezi fosforem a aminokyselinou Asp6 je 6,763 Å. Obr. 43: Dokování 2-deoxy-D-ribóza-5-fosfátu. Byla nalezena jedna vzdálená 18. pozice s interakční energií -63,53 kcal/mol. Vzdálenost mezi fosforem a aminokyselinou Asp6 je 6,160 Å. 38
Obr. 44: Dokování 2-deoxy-D-glukózy-6-fosfátu. Byla nalezena jedna vzdálená 147. pozice s interakční energií -57,9355 kcal/mol. 39
5 Diskuze 5.1 Krystalizace proteinu Krystalizace lysozymu byla provedena několika metodami za různých podmínek. Přestože krystalizační metody byly rozdílné, použití všech metod vedlo ke zdárné tvorbě krystalů proteinu lysozymu. Nejlepší výsledky byly dosaženy při použití metody visící kapky. Proteinový charakter krystalů byl následně úspěšně ověřen pomocí obou standardních testů (crush test, dye test). 5.2 Molekulové modelování Práce s modelovací technikou zahrnovala několik programů (Chimera, VMD, Chemsketch), pomocí nichž byla vizualizována 3D struktura molekul. Uvedené softwarové nástroje jsou také vhodné na měření meziatomových vzdáleností, vazebných úhlů, optimalizaci molekul, atd. V porovnání s programem VMD je program Chimera velmi intuitivní nástroj s mnoha funkcemi, vhodný i pro začátečníky v molekulovém modelování. Na základě dosažených výsledků z dokování pěti fosfatovaných monosacharidů a fosfatasy programem Autodock Vina (který je součástí programu Chimera) a webovou aplikací SwissDock je zřejmé, že program Autodock Vina byl mnohem úspěšnější v nalezení vhodných vazebných pozic než v případě aplikace SwissDock. Na základě této i jiných studií lze konstatovat, že Autodock Vina patří k nejspolehlivějším dokovacím nástrojům. 6 Závěr Prvním cílem této práce bylo seznámit se teoreticky i prakticky s problematikou proteinové krystalografie, tj. připravit proteinové krystaly za použití vhodných metod a nalézt optimální podmínky k jejich tvorbě. Krystaly lysozymu byly získány metodami visící a sedící kapky a metodou mikrokrystalizace pod olejem. Výsledky každé metody byly rozdílné, ale při použití všech metod došlo ke vzniku krystalů. Proteinový charakter krystalů byl následně ověřen pomocí několika testů (crush test, dye test). Dále byly v krystalizačních jamkách 40
nalezeny mikrokrystaly spolu s jehlicemi nebo precipitací. Nejlepší výsledky byly získány při použití metody visící kapky. Dalším cílem bylo seznámit se s metodami molekulárního modelování. Tato část zahrnovala vyhledávání informací v internetových molekulárních strukturních databázích a pomocí grafických programů zobrazit, upravit, či vytvořit molekuly od velikosti dvouatomové velikosti až po velké makromolekuly, jako jsou proteiny. Pět vybraných fosfatovaných monosacharidů pro účely dokování bylo vyhledáno volně dostupnou databází Pubchem, která shromažďuje strukturní informace organických i anorganických sloučenin. Molekulární 3D struktura proteinu lysozymu byla vyhledána v proteinové databance RCSB PDB a 3D struktura proteinu fosfatasy byla získána na pracovišti školitele. Součástí projektu byla aplikace metody dokování (docking) - vyhledání vhodné pozice pěti vybraných fosfatovaných monosacharidů v enzymu fosfatase izolované z mikroorganismu bakterie Thermococus thioreducens. Dokování bylo provedeno dvěma softwarovými nástroji, programem Autodock Vina (ktery je součástí programu Chimera) a webovou aplikací SwissDock. Pomocí nástroje Autodock Vina byly nalezeny vhodné pozice pro všechny uvedené ligandy, nicméně důkaz o tom, že uvedené ligandy jsou vhodné substráty pro hydrolýzu ve fosfatáze Tt-82 mohou s určitostí potvrdit pouze plánované experimenty. Některé uvedené výsledky byly využity i v připravovaném článku pro mezinárodní odborný časopis ActaCrystalografica-D, kde je v sekci poděkování uvedeno jméno autora této práce. (Havlickova a kol., Acta Crystallographica Section D, accepted after minor revisions., 2019) 41
7 Seznam literatury 7.1 Online zdroje Chayen, N. E. (2004). Methods for separating nucleation and growth in protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 88 (3). 329-337. Chipman, David M., and Nathan Sharon. Mechanism of Lysozyme Action. Science, vol. 165, no. 3892, 1969, pp. 454 465. JSTOR, www.jstor.org/stable/1727647. CRAMPTON, Linda. Lysozyme - An antibacterial Enzyme [online]. [cit. 11.3.2019]. Dostupný na WWW: http://www.marycliffallergy.com/blog/2015/2/17/hubpages-lysozyme-an-antibacterialenzyme-and-a-cause-of-egg-allergies Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285, doi:10.3791/2285 (2011). EEI. Enzyme Education Institute - Lysozome [online]. [cit. 11.3.2019]. Dostupný na WWW: https://enzymeeducationinstitute.com/enzymes/lysozyme/ HAVLÍČKOVÁ, Petra. Krystalizační studie cukr-fosfatasy DH Tt80 z Thermoccoccus kodakarensis KOD1. České Budějovice, 2017. Kirby, A. J. (2001). Nature Structural Biology, 8(9), 737 739.doi:10.1038/nsb0901-737 Kutá Smatanová, I. (2003). Krystalizace biologických makromolekul od teorie k praxi [online]. In: Krystalografická společnost. [cit. 2016-01-15]. Dostupné z WWW: <https://ww w.xray.cz/kryst/difrakce/iva/krystalizace.htm>. MALCHER, Pavael. Strukturní studie mutantní varianty halogenalkandehalogenasy Dha106. České Budějovice, 2015. 42
MALCHER, Pavel. Biodegradace environmentálních polutantů charakterizace mutantní halogendehalogenasy DhaA31 z Rhodoccocus rhodochrous NCIMBB 13064. České Budějovice, 2013. 7.2 Použitá literatura Berman HM. The Protein Data Bank: A historical perspective. Acta Crystallographica A. 2008;64:88 95 MAREČEK, Aleš; HONZA, Jaroslav. CHEMIE pro čtyřletá gymnázia: 3. díl. 1. vydání, reprint 2005. Olomouc: NAKLADATELSTVÍ OLOMOUC, s.r.o., 2005. 255 s. ISBN 80-7182-057-1. RCSB PDB: Homepage [online] Dostupné: https://www.rcsb.org/pdb/static.do?p=general_information/about_pdb/index.html Kim S, Chen J, Cheng T, Gindulyte A, He J, He S, Li Q, Shoemaker BA, Thiessen PA, Yu B, Zaslavsky L, Zhang J, Bolton EE. PubChem 2019 update: improved access to chemical data. Nucleic Acids Res. 2019 Jan 8; 47(D1):D1102-1109. doi:10.1093/nar/gky1033. [PubMed PMID: 30371825] 7.3 Zdroj článku Petra Havlickova, Vitezslav Brinsa, Jiri Brynda, Petr Pachl, Tatyana Prudnikova, Jeroen R. Mesters, Barbora Kascakova, Michal Kuty, Marc L. Pusey, Joseph D. Ng, Pavlina Rezacova and Ivana Kuta Smatanova (2019) Novel Structurally Characterized HAD Phosphatase from Thermococcus thioreducens with Diverse Substrate Specificity. Acta Crystallographica Section D, accepted after minor revisions. 7.4 Softwarové programy ACD/ChemSketch Freeware, version 10.00 (2012). Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, ON, Canada, dostupné z: www.acdlabs.com. 43
Grosdidier A, Zoete V, Michielin O. (2011). "SwissDock, a protein-small molecule docking web service based on EADock DSS." Nucleic Acids Res, 39, W270-7 Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. (1996). VMD - Visual Molecular Dynamics, Journal of Molecular Graphics, 14: 33-38. O. Trott, A. J. Olson, AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading, Journal of Computational Chemistry 31 (2010) 455-461 Pettersen, E.F., Goddard, T.D., Huang, C.C., Couch, G.S., Greenblatt, D.M., Meng, E.C., and Ferrin, T.E. "UCSF Chimera - A Visualization System for Exploratory Research and Analysis." J. Comput. Chem. 25:1605-1612 (2004). 7.5 Použité obrázky AUTOR NEUVEDEN. Imperial College London [online]. [cit.5.3.2019].dostupný_na:www:https://www.imperial.ac.uk/news/image/mainnews2 012/33466.jpg Testy proteinových krystalů BERGFORS, Terese, Protein Crystallization [online].[cit.5.3.2019].dostupný_na:www:http://biocryst_stud.home.a mu.edu.pl/serp/pics/skin.jpg BERGFORS, Terese. Protein Crystallization [online]. [cit. 5.3.2019]. Dostupný na WWW: http://xray.bmc.uu.se/terese/images/18.gif BERGFORS, Terese. Protein Crystallization [online]. [cit. 5.3.2019]. Dostupný na WWW: http://xray.bmc.uu.se/terese/images/13.gif CHAYEN, Naomi E. cell.com [online]. [cit. 4.3.2019]. Dostupný na WWW: https://els-jbs-prod-cdn.literatumonline.com/cms/attachment/3babf02c-49a7-4c8f-986c- 1737f1c855df/gr1.jpg 8 Přílohy Sekvence proteinu TT-82: 44
WIVFDVDGVLIDVRESYDEATKLTAEYFLGLFGVEREIKPEWVRELRRK GSFGDDFKVSEALILFALSGRAEELVEEFPEGGTIEWVREKFGFQVFGGSIERVF NTFYLGREYPERLFDFPGLWKKERPIVRRGLLERASKHFKLGVVTGRSALEMEL AERIIGFKFENAVTREAYLKPDPRALWELVRGEPGVYIGDTINDELFVENYRGK YGDFDFVMVGRDVKDVNEFLENALEGGL Sekvence proteinu lysozymu 5b1f: KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNT DGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDG NGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRLXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXX Obr. 45: Krystalizační destička pro metodu sedící kapky (foto autor) 45
Obr.46: Krystalizační destička pro metodu visící kapky (foto autor). 46
Obr. 47: Krystalizační destička pro mikrokrystalizaci pod olejem (foto autor). 9 Seznam zkratek aminokyseliny: Ala (A) alanin Arg (R) arginin Asn (N) asparagin Lys (K) - lysin Met (M) - methionin Phe (F) - fenylalanin Asp (D) - kyselina aspartová Cys (C) cystein Gln (Q) glutamin Glu (E) - kyselina glutamová Gly (G) glycin His (H) histidin Ile (I) - izoleucin Pro (P) - prolin Ser (S) - serin Thr (T) - threonin Trp (W) - tryptofan Tyr (Y) - tyroxin Val (V) - valin Pyl (O) - pyrolysin Leu (L) - leucin Sec (U) selenocystein 9.1 Další zkratky informace DNA - deoxyribonukleová kyselina, nukleová kyselina nesoucí genetické RCSB PDB - Protein Data Bank, online databáze makromolekulárních struktur 47
48