VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION VYUŽITÍ FLOWCYTOMETRIE PRO MULTIPLEXOVÉ ANALÝZY V KLINICKÉ BIOCHEMII DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR Bc. LUCIE BABUŠÍKOVÁ BRNO 2012

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION VYUŽITÍ FLOWCYTOMETRIE PRO MULTIPLEXOVÉ ANALÝZY V KLINICKÉ BIOCHEMII APPLICATION OF FLOW CYTOMETRY FOR MULTIPLEX ANALYSES IN CLINICAL BIOCHEMISTRY DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR Bc. LUCIE BABUŠÍKOVÁ RNDr. Miroslava Beňovská, Ph.D. BRNO 2012

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12 Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: FCH-DIP0650/2011 Akademický rok: 2011/2012 Ústav: Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí Student(ka): Bc. Lucie Babušíková Studijní program: Chemie a technologie ochrany životního prostředí (N2805) Studijní obor: Chemie a technologie ochrany životního prostředí (2805T002) Vedoucí práce RNDr. Miroslava Beňovská, Ph.D. Konzultanti: doc. Ing. Josef Čáslavský, CSc. Název diplomové práce: Využití flowcytometrie pro multiplexové analýzy v klinické biochemii Zadání diplomové práce: 1. Vypracujte literární přehled k dané problematice 2. Popište použité experimentální metody 3. Zpracujte získané experimentální výsledky 4. Vyhodnoťte získané výsledky formou diskuse Termín odevzdání diplomové práce: 11.5.2012 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Bc. Lucie Babušíková RNDr. Miroslava Beňovská, Ph.D. doc. Ing. Josef Čáslavský, CSc. Student(ka) Vedoucí práce Ředitel ústavu V Brně, dne 15.1.2012 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Diplomová práce pojednává o technice flow cytometrie pro multiplexové analýzy a jejím využitím ve spojení s imunochemickými metodami. V rámci této práce byla provedena klinická studie, která se zabývá sekundární prevencí infarktu myokardu a aterosklerózy u souboru 186 pacient. V dnešní dob pedstavuje infarkt myokardu celosvtový civilizaní problém. ada možných parametr pro monitorování aterosklerózy pedstavuje ve svt dosud nevyešenou problematiku. V praktické ásti této práce jsme provádli analýzu pomocí xmap technologie Luminex u nových parametr (adiponektin, resistin, osteopontin) pedpovídajících aterosklerotické onemocnní ve spojitosti s infarktem myokardu. Také jsme chtli zjistit, jak se tyto parametry zmní u pacient po zvýšení dávky léebných medikament. ABSTRACT This thesis discusses the technique of flow cytometry for multiplex analysis and its use in conjunction with imunochemical methods. As part of this work was carried out clinical studies dealing with secondary prevention of myocardial infarction and atherosclerosis in 186 pacient. In this time represents myocardial infarction worldwide civilizational problem. A number of possible parameters for monitoring atherosclerosis in the world is still an unresolved issue. In the practical part of this work we performed an analysis using Luminex xmap technology for new parameters (adiponectin, resistin, osteopontin) to predict atherosclerotic disease associated with myocardial infarcion. Also we wanted to see how these parameters are changed in patients after increasing the dose of therapeutic drugs. KLÍOVÁ SLOVA flow cytometrie, xmap technologie Luminex, imunoanalýza, ateroskleróza, infarkt myokardu, adiponektin, resistin, osteopontin, Lp-PLA 2, myeloperoxidáza KEY WORDS flow cytometry, Luminex xmap technology, immunoassay, atherosclerosis, myocardial infarction,, adiponectin, resistin, osteopontin, Lp-PLA 2, myeloperoxidasa 3

BABUŠÍKOVÁ, L. Využití flowcytometrie pro multiplexové analýzy v klinické biochemii. Brno: Vysoké uení technické v Brn, Fakulta chemická, 2012. 97 s. Vedoucí diplomové práce RNDr. Miroslava Beovská, Ph.D.. PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatn, že všechny použité literární zdroje jsem správn a úpln citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brn a mže být využita ke komerním úelm jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a dkana FCH VUT.... podpis studenta PODKOVÁNÍ Touto cestou bych ráda podkovala své vedoucí diplomové práce RNDr. Miroslav Beovské PhD. za ochotu, laskavost a cenné rady. Dále bych ráda podkovala Ing. Martin Lízalové PhD., doc. RNDr. Josefu Tomanandovi, Mgr. Marii Tomandlové za pomoc pi vypracování praktické ásti této práce. Dále bych chtla podkovat RNDr. Simon Littnerové za pomoc pi vyhodnocení statistických údaj v programu SPSP. V neposlední ad bych chtla podkovat svému píteli a rodin za psychickou podporu, kterou mn poskytovali po celou dobu studia. 4

Obsah 1 ÚVOD...8 2 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE...9 3 POUŽITÉ METODIKY...10 3.1 Imunoanalýza...10 3.1.2 Rozdlení imunoanalytických metod... 11 3.2 Luminiscence...13 3.2.1 Druhy luminiscence... 13 3.2.2 Luminofory a flurofory... 14 3.2.3 Pístroj k mení chemiluminiscence... 14 3.3 Fotometrie a imunoturbidimetrie...14 3.3.1 Fotometrie... 14 3.3.2 Imunoturbidimetrie... 15 3.4 Flow cytometrie s využitím xmap technologie LUMINEX...16 3.4.1 Flow cytometrie... 16 3.4.2 xmap technologie Luminex... 16 3.4.3 Výhody a pednosti xmap technologie Luminex... 19 3.4.4 Pístroje ady Luminex... 20 3.5 Využití automatických biochemických analyzátor pi bžné biochemické analýze a imunoanalýze...22 3.5.1 Automatické imunochemické analyzátory - ARCHITECT i 2000 SR... 22 3.5.2 Využití fotometrie a imunoturbidimetrie na automatických biochemických analyzátorech... 23 3.5.2.1 Princip analyzátoru... 23 3.5.2.2 Cobas 6000 a cobas 8000... 24 4 STANOVOVANÉ PARAMETERY...26 4.1 Adiponektin...26 4.1.2 Adiponektin a ateroskleróza... 26 4.1.3 Možnosti stanovení adiponektinu... 28 4.2 Resistin...28 4.2.1 Resistin ve spojení s aterosklerotickým onemocnním... 29 4.2.2 Možnosti stanovení resistinu... 29 4.3 Osteopontin...30 4.3.1 Osteopontin a jeho význam pi aterogenezi... 30 4.3.2 Možnosti stanovení osteopontinu... 30 4.4 Myeloperoxidáza...31 4.4.1 Myeloperoxidáza a aterosklerotické onemocnní... 32 4.4.2 Možnosti stanovení MPO... 32 4.4.2.1 Stanovení koncentrace MPO na imunochemickém modulu automatického analyzátoru ARCHITECT i 2000 SR... 32 4.4.2.2 Imunochemické stanovení koncentrace MPO založené na principu ELISA... 32 4.5 Lp-PLA2...33 4.5.1 Lp-PLA2 a ateroskleróza... 33 4.5.2 Možnosti stanovení Lp-PLA2... 34 4.5.2.1 Stanovení koncentrace Lp-PLA2 imunoturbidimetrickou metodou... 34 5

4.5.2.2 Stanovení koncentrace Lp-PLA2 metodou ELISA... 35 4.5.2.3 Stanovení koncentrace Lp-PLA2 enzymatickou metodou... 35 4.6 Cholesterol...35 4.6.1 Možnosti stanovení cholesterolu... 37 4.6.1.1 Enzymatická, fotometrická metoda... 37 4.7 HDL-cholesterol...37 4.7.1 Možnosti stanovení HDL-cholesterolu... 38 4.7.1.1 Homogenní enzymatické fotometrické stanovení... 38 4.8 LDL-cholesterol...38 4.8.1 Možnosti stanovení LDL-cholesterolu... 39 4.8.1.1 Homogenní enzymatické fotometrické stanovení... 39 4.9 Triacylglyceroly...40 4.9.1 Možnosti stanovení triacylglycerol... 41 4.9.1.1 Enzymatické, fotometrické stanovení... 41 5 EXPERIMENTÁLNÍ ÁST...42 5.1 Soubor pacient a kontrolní skupiny...42 5.2 Popis analýzy jednotlivých parametr...44 5.2.1 Stanovení adiponektinu, resistinu a osteopontinu na pístroji Luminex... 44 5.2.1.1 Stanovení adiponektinu a resistinu... 44 5.2.1.1.1 Píprava a použité reagencie... 44 5.2.1.1.2 Píprava vzork... 45 5.2.1.1.3 Pracovní postup... 46 5.2.1.1.4 Mení na pístroji Luminex 200... 47 5.2.1.2 Stanovení osteopontinu... 47 5.2.1.2.1 Píprava a použité reagencie... 47 5.2.1.2.2 Píprava vzork... 48 5.2.1.2.3 Pracovní postup... 48 5.2.1.2.4 Mení na pístroji Luminex 200... 49 5.2.2 Stanovení MPO na automatickém analyzátoru ARCHITECT i 2000 SR... 49 5.2.2.1 Zavedení metody... 50 5.2.2.2 Postup mení... 50 5.2.3. Stanovení Lp-PLA2 na automatickém analyzátoru cobas 6000 od firmy Roche... 50 5.2.4 Stanovení lipidových parametr na automatickém analyzátoru cobas 8000... 50 5.3 Prezentace výsledk a statistika...51 5.3.1 Analytické aspekty jednotlivých metodik... 51 5.3.1.1 Adiponektin... 51 5.3.1.2 Resistin... 53 5.3.1.3 Osteopontin... 54 5.3.1.4 Myeloperoxidáza... 55 5.3.1.4.1 Stanovení opakovatelnosti... 55 5.3.1.4.2 Stanovení reprodukovatelnosti (mezilehlé pesnosti)... 55 5.3.1.5 Lp-PLA2... 56 5.3.1.5.1 Srovnání imunoturbidické a enzymatické metody... 57 5.3.1.5.2 Stanovení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti... 59 5.3.1.6 Lipidy... 60 5.3.2 Statistické vyhodnocení... 61 5.3.2.1 Histogram... 61 6

5.3.2.2 Studentv t-test... 62 5.3.2.3 Korelaní koeficient... 67 5.3.2.4 ROC kivka... 67 6 VÝSLEDKY A DISKUZE...69 7 ZÁVR...71 8 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK...72 9 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...74 10 SEZNAM PÍLOH...78 7

1 ÚVOD Infarkt myokardu spolu s aterosklerózou jsou hlavní píinou úmrtí a invalidity na celém svt. Ateroskleróza a její rizikové faktory pedstavují jeden z nejvýznamnjších zdravotních problém západní civilizace. Tímto onemocnním se zabývá celá ada nejkvalifikovanjších výzkumných tým po celém svt. Hlavním cílem této práce bylo seznámit se s technikou flow cytometrie pro multiplexové analýzy a jejím využitím ve spojení s kardiovaskulárním onemocnním. Experimentální ást se zabývá také dalšími technikami stanovujícími parametry, které by mohly pedpovídat zvýšené kardiologické riziko u pacient po infarktu myokardu a uplatnit se v rámci sekundární prevence. 8

2 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE 1. Osvojení techniky flowcytometrie pro multiplexové analýzy a její využití ve spojení s imunochemickými metodami pro úely klinické studie zabývající se sekundární prevencí infarktu myokardu a aterosklerózy. 2. Zpracování rozsáhlého souboru pacient po infarktu myokardu a u vybrané skupiny z nich monitorování úinnjší léby na základ namených moderních biochemických parametr jako Lp-PLA 2, interleukiny a myeloperoxidáza. 3. Praktické využití dalších analytických metod jako chemiluminiscence, imunoturbidimetrie, fotometrie a turbidimetrie. 9

3 POUŽITÉ METODIKY Pi analýze mených parametr byly využity jak speciální kombinace analytických princip (jako nap. imunoanalýza ve spojení s flow cytometrií, fosforescencí, imunoanalýza ve spojení s chemiluminiscencí), tak bežné metodiky jako fotometrie i turbidimetrie. 3.1 Imunoanalýza Imunoanalytické metody jsou založeny na reakci antigenu a specifické protilátky za vzniku imunokompexu. U bžné imunoanalytické metody antigen tvoí stanovovaný analyt a protilátka je obsažena v reagencii. [1,2] Na tomto základ pracují metodiky xmap (multiplex analits profilig) technologie na pístroji Luminex 200 a taktéž chemiluminiscenní technika na pístroji ARCHITECT i 2000 SR využívané v této práci. Antigeny jsou makromolekuly pirozeného nebo umlého pvodu. Po chemické stránce se vtšinou jedná o proteiny, lipidy, nukleové kyseliny, karbohydráty. Antigeny mají dv základní vlastnosti - navozují specifickou imunitní odpov, bunného nebo protilátkového typu, a také specificky reagují s produkty této reakce. Na vlastní reakci antigenu s protilátkou se neúastní celá molekula antigenu, ale pouze nkteré z jejich povrchových skupin - jedná se o determinantní skupiny neboli epitopy. Antigenní determinantu pedstavuje jen uritá skupina atom (ást struktury, funkní skupiny) na povrchu molekuly antigenu a charakterizuje jeho specifitu se schopností reagovat s vazebným místem protilátky. Molekula antigenu musí mít dostaten velkou molekulovou hmotnost (M r > 5000 Da) a velikost musí mít kompletní strukturu. Jedna molekula antigenu na svém povrchu mže nést rzné množství antigenních determinant. Poet epitop, které reagují s vazebným místem protilátek udává valenci antigen. Antigeny v živém organizmu vyvolávají tvorbu specifických protilátek. Pouze kompletní antigen mže vyvolat imunitní odpov. Hapten (hormony, léky, nízkomolekulární peptidy, atd.), což je nekompletní antigen, vyvolá tvorbu protilátek jen tehdy, pokud je navázán na bílkovinný nosi. [1,2] Protilátky jsou produkovány plazmatickými bukami, vyvíjejícími se z B-lymfocyt po stimulaci antigenem. Protilátky pedstavují heterogenní skupinu glykoprotein živoišného pvodu. Vznikají v organizmu jako odpov na pítomnost antigen a vykazují specifickou vazebnou aktivitu k antigenu, proti kterému byly pipraveny. Jedná se o imunoglobuliny, v laboratorní praxi jsou obsaženy v tzv. antisérech. Imunoglobulin G je z analytického pohledu nejvíce pevládající imunochemickou reagencií. Specificita a senzitivita imunoanalytických metod je ovlivnna používanou protilátkou. Používané protilátky využívané v imunoanalytických metodách mohou být vyrobeny rzným zpsobem. [1,2] 10

Monoklonální protilátky jsou produkty jednoho klonu plazmatických bunk odvozených od B-lymfocyt, jsou pipravovány v laboratorních podmínkách pomocí hybridomové technologie. Její podstatou je bunná fúze nádorových (myelomových) bunk s lymfocyty sleziny imunizovaných myší. Monoklonální protilátky jsou namíené proti jednomu epitopu ureného antigenu. Pedstavují identické kopie molekul imunoglobulin, které mají stejnou primární strukturu a stejnou specifitu vazebných míst. Tyto protilátky jsou charakteristické významnou specifitou, avšak špatn precipitují. [1,2] Polyklonální protilátky se pipravují imunizací zvíat (nejastji se jedná o králíky, kozy, ovce), obvykle opakovaným intravenózním podáním antigenu (lidské sérum). Krevní sérum imunizovaného zvíete, které obsahuje protilátky proti antigenu použitému k imunizaci, se oznauje jako antisérum. Jestliže byl k imunizaci použit jeden antigen (nap. jedna bílkovina), vytváejí se monospecifické protilátky (antisérum). Každý epitop v molekule antigenu stimuluje pro tvorbu protilátek jeden klon B-lymfocyt. Kompletní antigeny mají více epitop, protože aktivují nkolik klon B-bunk. Imunizované zvíe proto syntetizuje sms monoklonálních protilátek lišících se tím, že jejich vazebná místa mají rznou afinitu a tím i specifitu k jednotlivým epitopm uritého antigenu, který vyvolal jejich tvorbu. Pi imunizaci zvíat smsí antigen dochází k tvorb polyspecifických protilátek, které obsahují imunoglobuliny proti vtšímu potu antigen. [1,2] Na vazb antigen - protilátka se uplatuje nkolik vazebných sil. Jedná se o nekovalentní interakce jako nap. elektrostatická interakce, vodíkové mstky,van der Waalsovy síly, hydrofobní síly a iontové interakce hlavn mezi COO - a NH 4 + skupinami antigenu a protilátky. [1,2] 3.1.2 Rozdlení imunoanalytických metod Imunoanalytické metody se mohou dlit podle uspoádání reakce na kompetitivní (soutživou) imunoanalýzu nebo nekompetitivní (sendviovou) imunoanalýzu. Podle prostedí, ve kterém reakce probíhá se mže jednat o homogenní i heterogenní imunoanalýzu. Dále je možné imunoanalytické metody dlit podle techniky použité k mení signálu jako je nap. luminiscenní imunoanalýza, fluoroimunoanalýza, radioimunoanalýza, enzymoimunoanalýza. Dále je možno tyto metody rozdlit dle toho, zda využívají znaku (enzym, fluor, substráty atd.) i nevyužívají znaek (nap. imunoturbidimetrie). [3,4,5] U nekompetitivní (sendviové) metody stanovovaný antigen ze vzorku reaguje se dvma protilátkami, které jsou v reakní smsi v pebytku. Jedna protilátka je znaená, funkce druhé protilátky závisí na použité technologii nap. u heterogenní imunoanalýzy je navázána na pevnou fázi a umožuje separaci imunokomplexu. Ve vzniklém imunokomplexu je analyt (antigen) vázán mezi dvma protilátkami (sendvi). Velikost meného signálu je pímo úmrná koncentraci stanovovaného antigenu. Kalibraní kivka má parabolický tvar. [3,4,5] 11

Tato nekompetitivní (sendviová) metoda se využívá pro molekuly s vyšší molekulovou hmotností, které umožují vazbu protilátek na dv antigenní determinanty nap. adiponektin, osteopontin, resistin, srdení troponiny aj. Používají se dv monoklonální nebo jedna monoklonální a jedna polyklonální protilátka. Pokud se v reakci využívají monoklonální protilátky specifické pro uritý epitop, je možno provádt simultánní inkubaci vzorku a konjugátu s ukotvenou protilátkou, což stanovení zjednodušuje. [3,4,5] Pi využití kompetitivní metody stanovovaný antigen soutží se stejn znaeným antigenem ve vazb na specifickou protilátku proti stanovovanému antigenu, který je v limitovaném množství. Vzniknou imunokomlexy, které obsahují znaku, a imunokomplexy bez znaky. ím je koncentrace stanovovaného antigenu vyšší, tím více vznikne imunokomplex bez znaky. Po ukonené reakci se mí signál imunokomplex se znakou. Velikost odezvy je nepímo závislá na koncentraci stanovovaného analytu. Dle typu použité znaky míme luminiscenci, fluorescenci, pípadn další veliiny. Kalibraní kivka má hyperbolický tvar. Tato kompetitivní metoda je vhodná pedevším pro nízkomolekulární analyty, které mají malou molekulu a pouze jednu antigenní determinantu (nap. steroidní hormony). [3,4,5] Obr.. 1 Kalibraní závislosti u kompetitivního a nekompetitivního uspoádání [3] Homogenní imunoanalýza nevyžaduje separaci vázané (v imunokomplexu) a volné znaené protilátky i antigenu. U homogenního stanovení není poteba odstraovat reaktanty. Stanovení a detekce probíhá pímo v reakní smsi. U tchto pípad je aktivita znaky navázaná na antigen modulovaná pímo navázáním protilátky. [3,4] Pi heterogenní imunoanalýze jsou z reakní smsi odstraovány pomocí rzných zpsob (nap. magnetickou separací nebo ukotvením na pevném nosii a promytím) nepotebné reaktanty a imunokomplexy. Separuje se znaka volná od znaky vázané. Reakce s detekcí probhne až po této separaci. Obecn stanovení probíhá v tchto 12

krocích smíchání komponent, inkubace, pi které dochází ke vzniku komplexu antigen protilátka, separace a detekce. [3,4] 3.2 Luminiscence Princip luminiscence je rovnž využíván pi analýze parametr mených v této práci. Luminiscence je principem mnoha analytických systém a to pedevším pro vysokou citlivost.[3] Luminiscence je jev, který pedstavuje vyzaování pebytené energie ve form foton, ke kterému dochází pi návratu excitovaných elektron na základní hladiny. K excitaci atom dochází psobením jiného záení, elektron nebo pi chemické reakci. Pi návratu excitovaného atomu do základního stavu dochází k emisi svtla. Existují excitované energetické hladiny, na kterých mže atom setrvávat relativn dlouho (10-8 s a déle). Tyto hladiny se nazývají metastabilní hladiny. Je možno také konstatovat, že luminiscence je dj, pi kterém záení o kratší vlnové délce (vtší frekvenci) vyvolává v látce uritého složení vznik záení o delší vlnové délce (nižší frekvenci) a ást energie se vyzáí ve form tepla (nesvítivé deexcitaní procesy). [6] 3.2.1 Druhy luminiscence Ke vzniku luminiscence je nutné dodat látce energii v rzné podob. Dle druhu energie rozlišujeme nkolik druh luminiscence: chemiluminiscence, fotoluminiscence, elektroluminiscence, termoluminiscence. V laboratorní medicín je nejvíce využita chemiluminiscence a fluorescence. Fotoluminiscence - luminiscence je vyvolána prostednictvím elektromagnetického záení, do této kategorie patí fosforescence a fluorescence. Chemiluminiscence - je druh luminiscence vyvolaný pomocí energií chemické reakce. Vzniká vyzáením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci za psobení oxidant jako je nap. O 2, H 2 O 2 atd. Bhem chemiluminiscence dochází k produkci svtelného záení exitovanými molekulami v prbhu chemické reakce. V pírod je pirozenou formou chemiluminiscence - bioluminiscence, která oznauje chemiluminiscenci v živých organismech. [6] Pro chemiluminiscenní reakci musí být splnny ti základní požadavky: 1. Pi reakci musí vznikat dostatek energie, aby došlo k excitaci elektron. Reakce musí být exotermní a obvykle je to oxidace. 2. Musí existovat zpsob jak tuto energii usmrnit do excitace elektron. Pokud se chemická energie ztrácí ve form tepla jako obvykle, pak se chemiluminiscence neobjevuje. 13

3. Excitovaný produkt musí být schopný ztrácet svoji energii bu ve form fotonu, nebo ji pevádt na fluoreskující sloueniny. Pímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje jen krátké záblesky svtla, zatímco transfer energie na fluoreskující sloueniny se vtšinou projevuje jako dlouhodobá (v minutách) svtelná emise. [8] 3.2.2 Luminofory a flurofory Látky, u kterých dochází k luminiscenci, se nazývají luminofory. Ve vtšin fluoreskujících organických molekul jsou obsaženy konjugované dvojné vazby. Jen málo biologických molekul, jako je nap. tryptofan a malá skupina nkterých porfyrit, fluoreskuje spontánn. Práv molekuly spontánn nefluoreskující je možné pevést na fluoreskující produkty. Je možné využít látky, které pi uritých chemických reakcích produkují chemiluminiscenní záení. Pi imunoanalytických reakcích jsou luminofory a fluorofory navázány jako znaka na protilátky, antigeny nebo tvoí substrát anebo vznikají až po jeho rozštpení. [6] Luminofory používané ke znaení nemají interference v biologickém materiálu a jsou velmi stabilní. [3] Uplatují se látky jako je akridin a jeho estery, cheláty platinových kov (nap. ruthenium), cheláty lanthanoid (europium). [6] 3.2.3 Pístroj k mení chemiluminiscence K mení luminiscence je využívaný pístroj luminometr. Je složen z mící komrky a detektoru, jeho souástí je fotonásobi. Mící komrka spolu se vzorkem a ostatními reaktanty obsahuje systém zrcadel. Tato zrcadla sousteují co nejvíce svtelného záení na detektor. Pokud pi chemiluminiscenní rekci vznikají záblesky svtla, využívá se poítání foton. Pomocí fotonásobie dochází k zachycení potu foton s velmi rychlou odezvou, která je proporcionální produktu chemiluminiscenní reakce. Množství produkovaného svtla je úmrné potu molekul, které emitují svtelné záblesky. [6] 3.3 Fotometrie a imunoturbidimetrie 3.3.1 Fotometrie Fotometrií rozumíme mení absorpce svtla vzorkem pi jedné nebo nkolika uritých vlnových délkách. V klinické biochemii velká ada stanovení využívá skutenosti, že mnoho látek pohlcuje elektromagnetické záení v oblasti viditelné nebo ultrafialové ásti spektra. Množství absorbovaného záení o urité vlnové délce závisí na charakteru a množství absorbující látky. K mení absorpního spektra analyzovaného vzorku využíváme spektrofotometr, který je schopen mení pi více vlnových délkách. Spektrofotometrie vychází z Lambert-Beerova zákona, který 14

vyjaduje vztah mezi koncentrací látky v roztoku a její absorbancí, tj. schopností molekul látky pohlcovat elektromagnetické záení o dané vlnové délce. [3,6,9] Ve viditelném spektru se nejastji jako zdroj záení používají žárovky nebo halogenové lampy. Monochromátor je zaízení, které rozkládá polychromatické bílé svtlo na spektrum barev svtelné záení o rzných vlnových délkách. Obvykle jako monochromátor slouží optická mížka. Optický systém je složen ze štrbin a optických zrcadel. Vstupní a výstupní štrbina monochromátoru slouží k ovládání velikosti a pozice svtelného paprsku. ím je výstupní štrbina širší, tím vtší je intenzita vycházejícího svtla, avšak za cenu menší specifinosti mení. Užší výstupní štrbina zajišuje pesnjší dodržení požadované vlnové délky, ovšem za cenu menší intenzity svtla a zhoršení odstupu signálu od šumu. Absorpní prostedí ve fotometrii pedstavuje kyveta s meným vzorkem. [3,6,9] K pevodu svtelného záení na elektrický signál je využíván detektor. Ve viditelné oblasti se pro detekci záení používá fotodiody, fotonásobie, nebo také detektor diodového pole.[6] Ve fotonkách se elektrony po uvolnní z fotokatody po dopadu foton pohybují k anod úinkem sacího naptí. Fotonásobie jsou uspoádány takovým zpsobem, že elektrony dopadnou po ozáení fotokatody na první zesilovací elektrodu, dynodu, kde je poet fotoelektron násoben sekundární emisí. Takových dynod je ve fotonásobii 10 i více. U detektoru diodového pole je svtlo rozptýleno mížkou na pole nkolika svtlocitlivých diod a vzniká naptí, které je pevádno na digitální signál. [3,9] 3.3.2 Imunoturbidimetrie Optická metoda založená na mení procházejícího svtla zeslabeného rozptylem na ásticích se nazývá turbidimetrie. [8] V klinické biochemii se asto využívají reakce antigenu s protilátkou, kdy dochází k imunoprecipitaci. Výsledkem smísení roztoku antigenu s odpovídající protilátkou je vznik imunokoplex. V daném roztoku dochází k zakalení. Svtlo, které prochází zakaleným roztokem je rozptylováno na rozdíl od roztoku, kde neprobhla žádná imunochemická reakce. Stupe zákalu je v oblasti nadbytku protilátky úmrný koncentraci antigenu. Turbidimetrie využívá optické detekní systémy, které mí intenzitu svtla prošlého v pímém smru jako u klasické fotometrie. A proto je možné využívat bežné spektrofotometry. Fotometrická citlivost je nepímo úmrná vlnové délce, proto se nejastji pro turbidimetrické mení používá vlnová délka 340 nm. Výhody turbidimetrického stanovení spoívají ve velké specificit metody (je možnost mit vzorky o koncentraci 5 20 mg/l), další výhodou je jednoduché a rychlé provedení, možnost vyhodnotit velké množství vzork za krátkou dobu a poteba malého objemu vzorku (10 l). [2,8,9] 15

3.4 Flow cytometrie s využitím xmap technologie LUMINEX 3.4.1 Flow cytometrie Flow cytometrii adíme mezi techniku, která umožuje kvalitativní i kvantitativní analýzu bunk nebo jiných ástic (jadérka, latexové ástice, mikroorganizmy aj.) v suspenzi. Za pomoci definovaných mených parametr jako je rozptyl svtla, fluorescence, dovoluje rozlišovat buky na základ jejich fyzikálních a chemických vlastností (velikost, obsah DNA) a po oznaení bunk fluorescenním konjugátem monospecifických protilátek umožuje taktéž studium povrchových molekul, diferencianích antigen, intracelulárních molekul. Buky v suspenzi (usmrnné do velmi tenkého proudu) protékají kapilárou a postupn protínají dráhu paprsku svtla (nejastji laseru) kolmého na smr toku bunk. Každá buka se chová jako sférická oka a podle své velikosti a vnitní struktury (granulace) rozptyluje svtlo do rzných smr. Vyhodnocením rozptylu lze buky roztídit na jednotlivé bunné populace (nap. lymfocyty, monocyty, granulocyty). Jestliže byly buky obarveny fluorescenním barvivem, dochází k excitaci fluorochrom laserovým paprskem a následné emisi fluorescenního záení. Tímto zpsobem mžeme vyšetit nap. vnitní strukturu buky. Svtlo vznikající interakcí bunk pi prchodu laserovým paprskem (rozptýlené svtlo a emitovaná fluorescence) je rozdleno optickou soustavou hranol, filtr a zrcadel podle vlnové délky fluorescence. [6] Tuto techniku v kombinaci s imunoanalýzou využívá pístroj Luminex 200, na kterém byly v rámci diplomové práce meny parametry adiponektin, resistin a osteopontin. 3.4.2 xmap technologie Luminex xmap technologie je založena na využití nkolika dobe zavedených technik: flow cytometrie, xmap technologie, digitální zpracování signálu, imunoanalýza, fluorescence, které byly kombinovány jedineným zpsobem. xmap technologie využívá polystyrénové mikroástice o velikosti 5,6 m, které jsou intern oznaené s rznou intenzitou, kterou urují dv rzná fluorescenní barviva (ervené, infraervené). Pomocí odlišné intenzity barev pro mikroástice bylo vyvinuto 100 xmap barevn kódovaných sad mikroástic, každá s jedineným rozsahem spektra. Jejich vzájemné kombinace tvoí až 500 rzných barevných odstín (typ) mikroástic. [46] 16

Obr.. 2 Schéma principu barevného znaení mikroástic u xmap technologie [30] Na každém typu mikroástice je vázána specifická protilátka nebo proba rozpoznávající a vázající uritou molekulu (antigen, protilátku, substrát enzymu atd.). Po smísení vzorku (sérum, plazma, bunný lyzát) s mikroásticemi dojde v jamce mikrotitraní destiky ke specifickému navázání píslušného analytu ze vzorku na povrch mikroástice. Ke smsi je poté pidána fluorescenn znaená protilátka proti navázanému analytu. Jako fluorescenn znaená protilátka se nejastji využívá phycoerytrin, nebo poskytuje velmi dobrý signál. [46] Obr.. 3 Mikroástice xmap technologie [31] Mikroástice s navázaným vzorkem postupují pomocí nosné tekutiny jednotliv za sebou úzkou kapilárou a vstupují do detekní komrky, skrze kterou procházejí paprsky dvou laser. ervený laser o vlnové délce 635 nm detekuje intenzitu fluorescence uvnit mikroástic a tím uruje typ stanovovaného analytu. Zelený laser s vlnovou délkou 532 nm je typický pro phycoerytrin. Tento laser mí intenzitu 17

fluorescence phycoerytrinu na povrchu mikroástic a ta je pímo úmrná koncentraci navázeného analytu na mikroástici. [46] Obr.. 4 Multiplexová imunoanalýza: uvnit mikroástice jsou dv rzné fluorescenní barviva (ervené a infraervené). K výrob 100 barevn kódovaných sad mikroástic se používá deset rzných koncentrací erveného a infraerveného barviva. Každá mikroástice je schopna specificky vázat uritý analyt (a). Ten pak reaguje s biotinylovanou protilátkou (b), na kterou se naváže konjugát streptavidin phycoerytrin (c) [32] Detekní zaízení analyzátoru Luminex: jeden detektor mí rozptyl záení emitovaného z mikroástic a odstrauje signály, které souvisejí s jinými materiály procházející detektorem nap. vzduchové bubliny, mikroásticové agregáty. Druhý detektor mí koncentraci prvního barviva uvnit mikroástice a tetí mí koncentraci druhého vnitního barviva. Integrace tchto údaj definuje a identifikuje mikroástici. Fotonásobi spojený se zeleným laserem poté mí intenzitu signálu na základ množství a obsahu barviva jednotlivých mikroástic. Existuje 100 rzných typ kuliek, takže teoreticky mžeme analyzovat 100 analyt ve stejné jamce mikrotitraní destiky. [46] 18

Obr.. 5 Popis detekce na pístroji [31] Obr.. 6 Mikroástice s navázanými protilátkami pi prchodu lasery [33] 3.4.3 Výhody a pednosti xmap technologie Luminex Z malého množství vzorku je možné analyzovat až 100 analyt ve stejné jamce mikrotitraní destiky. Možnost stanovení vtšího potu analyt odpovídá potebám dnešní doby v rzné škále aplikací, jako nap. u autoimunitních onemocnní, 19

genetického onemocnní, infekního onemocnní na molekulární úrovni, atd. xmap technologie nám pináší více dat o pacientech v kratším asovém úseku v porovnání s imunochemickými metodami typu ELISA. [26] 3.4.4 Pístroje ady Luminex Pístroje ady Luminex využívající xmap technologii pracují s imunokomplexy nekompetitivního charakteru (sendviová technika). LUMINEX 200 je speciální prtokový cytometr, který byl vyvinut pro xmap technologii. Tento cytometr pracuje na principu flow (prtokové) bunné fluorometrie a speciáln znaených mikroástic. Jedná se o techniku, která umožuje simultánní analýzu velkého potu analyt v jednom vzorku (až 100 analyt). Takto lze mit parametry jako osteopontin, resistin a adiponektin. Souástí pístroje Luminex 200 jsou dv fluidní cesty a vyhívací blok, který umožuje provádt analýzu pi kontrolované teplot. První fluidní cesta zajišuje dávkování vzorku pomocí pipetoru (automatické dávkování vzorku). Nasávací mechanismus umožuje transport vzorku do mící kyvety. Pi analýze pipetor dávkuje vzorky z klasické 96 jamkové mikrotitraní destiky, která je opatená ve spodní ásti filtraní membránou. Následn jsou analyzované vzorky injektovány do mící kyvety. Filtraní membrána dovoluje provádt jednotlivé promývací kroky bez ztráty mikroástic odsáváním pes membránu s využitím vývvy. Jako transportní médium slouží nosná tekutina Luminex xmap, která transportuje vzorky do optické ásti pístroje. Pomocí této tekutiny jsou analyzované mikroástice ped vstupem do detekní komory vedeny úzkou kapilárou v ad za sebou, což umožuje mení jednotlivých mikroástic. Analyzované mikroástice po prchodu kapilárou vstupují do detekní komory, kde jsou následn meny. Optická ást pístroje je složena ze dvou laser. ervený laser o vlnové délce 635 nm podncuje excitaci fluorescence v oblasti viditelného svtla a tím identifikuje jednotlivé mikroástice se specificky navázaným antigenem, respektive protilátkou. Zelený laser s vlnovou délkou 532 nm excituje fluorofor navázaný na povrchu mikroástic xmap. Detektor diodového pole mí intenzitu záení barevn kódované smsi uvnit mikroástic (uruje barvivo ze základní sady 100 barev) a fotonásobi detekuje intenzitu excitaní energie molekuly navázané na povrch mikroástice. Vysokorychlostní digitální procesor a moderní poítaový algoritmus zajišují analýzu mikroástic. Po ukonení analýzy je cesta vzorku automaticky propláchnuta nosnou tekutinou Luminex xmap s využitím druhé fluidní cesty. Pohyb této tekutiny pod tlakem odstraní zbytky [34] vzorku z hadiek, ventil, pipetoru. Technologie Luminex 20

umožuje mit vzorky nepetržit po dobu 48 hodin bez doplnní kontejneru s nosnou tekutinou (V= 20 l). [34] Obr.. 7 Pístroj Luminex 200 [35] V souasné dob je na trhu další pístroj ady Luminex FLEXMAP 3D. Systém sdílí spolené prvky s pístrojem Luminex 200, avšak využívá polystyrénové mikroástice, které jsou vnitn obarveny vtším potem fluorescenních barviv o rzných koncentracích. Další pedností u pístroje FLEXMAP 3D je automatické nastavení výšky jehly, rychlejší mení díky zdvojené fluidní cest a rychlejší pipetování. Taktéž je možno využít vtších mikrotitraních destiek, které obsahují 384 jamek. V kombinaci s xmap technologií mže souasn mit až 500 analyt z jednoho vzorku. [26] 21

Obr.. 8 FLEXMAP 3D [36] 3.5 Využití automatických biochemických analyzátor pi bžné biochemické analýze a imunoanalýze 3.5.1 Automatické imunochemické analyzátory - ARCHITECT i 2000 SR Spojení luminiscenních technik a imunoanalýzy pedstavují automatické imunochemické analyzátory, na kterých se v souasnosti provádí vtšina imunoanalytických metod v laboratorní medicín. Tyto analyzátory jsou na trhu znan rozšíené. Vyznaují se vysokou citlivostí, takže jsou pro stanovení analyt obsažených v biologických materiálech v nízkých koncentracích velmi vhodné. Nejrozšíenjší jsou analyzátory, jejichž detekce je založena na principu chemiluminiscence, pípadn fluorescence. [6,7] Analyzátory využívají reakce antigen protilátka založené jak na kompetitivním tak i nekompetitivním principu. Rozšíenjší než homogenní je heterogenní imunoanalýza, která pracuje se znaenou protilátkou i antigenem. Detekce využívá vysoce citlivých reakcí jako chemiluminiscence, elektrochemiluminiscence, fluorescence. Oddlení komplexu antigen - protilátka se nejastji provádí separací na paramagnetických mikroásticích. Jde o oxidy železa, které vykazují magnetické vlastnosti. Na svém povrchu, který je mnohonásobn vtší než stny reakní nádobky, mají mikroástice vazebná místa pro navázání stanovovaných a znaených analyt. Po probhlé imunoanalytické reakci je teba z reakní smsi odstranit pro detekci nepotebné souásti. Psobením magnetu se mikroástice s navázaným imunokomplexem bhem promývání pidrží na stn reakní nádobky a nepotebné souásti jsou odmyty. [6,7] 22

Píkladem imunoanalytického analyzátoru je modul Architect i 2000 SR od firmy Abbott, na kterém lze v rámci laboratorní medicíny analyzovat parametry jako kardiomarkery, myeloperoxidáza, natriuretrické peptidy, hormony apod. Obr.. 9 ARCHITECT i 2000 SR [38] 3.5.2 Využití fotometrie a imunoturbidimetrie na automatických biochemických analyzátorech Na principech fotometrie a turbidimetrie (imunoturbidimetrie) pracují automatické biochemické analyzátory. Na tchto analyzátorech se zpracovávají vzorky plazmy, séra a moe. [6,7] 3.5.2.1 Princip analyzátoru Zdrojem svtelného záení je vtšinou halogenová wolframová žárovka nebo xenonová výbojka, svtelný paprsek spojitého spektra je po prchodu absorpním prostedím (kyvetou) rozložen monochromátorem (optickou mížkou) na paprsky s definovanou vlnovou délkou (monochromatické záení), které dopadají na detektor diodového pole (diode array). Zmny absorbance reakní smsi v kyvet jsou monitorovány (zaznamenávány) pi každém prchodu kyvety paprskem optického 23

systému. K transportu svtelných signál z místa, kde je mena reakní sms, do detekní jednotky se využívají optická vlákna. [6,7] Obr.. 10 Optická dráha fotometru modulu c501 systému Cobas 6000, Roche [39] Vysvtlivky: A Lampa fotometru F Štrbina (vstupní) K Štrbina B Vodní pláš G Reakní láze L Fotometr C Filtr k eliminaci infraervené složky H Reakní kyveta s obsahem M Mížka D Maska I Štrbina (výstupní) N Detektor E oky kondenzoru J Zobrazovací oka Velká vtšina fotometrických test využívá pi výpotu výsledk hodnot dvou vlnových délek tzv. bichromatickou analýzu. Jedna vlnová délka je v blízkosti vrcholu absorbance chromogenu vytváeného pi reakci, druhá vlnová délka je v oblasti, ve které daný chromogen vykazuje malou nebo žádnou absorbanci. Použitím rozdílu mezi odety dvou vlnových délek (bichromatický systém) mže být eliminován vliv interferencí a šumu fotometru, ímž se zlepšuje citlivost fotometru. [6,7] 3.5.2.2 Cobas 6000 a cobas 8000 Na výše uvedeném fotometrickém principu pracují nap. klinické moduly analyzátor cobas 6000 a cobas 8000 od firmy Roche. Slouží k analýze enzym, lipid (fotometrie), specifických protein (imunoturbidimetrie). 24

Obr.. 11 cobas 6000 od firmy Roche [37] Obr.. 12 cobas 8000 od firmy Roche 25

4 STANOVOVANÉ PARAMETERY 4.1 Adiponektin Adiponektin byl poprvé identifikován roku 1995 v tukové tkáni myší, o rok pozdji v tukové tkáni a plazm u lidské populace. Je to bílkovinný hormon produkovaný bukami tukové tkán - adipocyty a poté postupn uvolovaný do cirkulace. Skládá se z 244 aminokyselin a jeho molekulová hmotnost je 30 kda. Strukturn je molekula adiponektinu podobná molekule kolagenu VIII a kolagenu X. Adiponektin psobí pomocí svých specifických receptor. Jedná se o receptory, které se vyskutují ve dvou izoformách AdipoR1 a AdipoR2. Tyto receptory jsou exprimovány v mnoha tkáních nap. srdení svalovina, makrofágy, aterosklerotické léze, -buky pankreatu. Receptor AdipoR1 se vyskytuje pevážn v kosterních svalech, AdipoR2 v játrech. [10,11] Funkce adiponektinu v organismu je velmi rozliná. Adiponektin potlauje proliferaci a migraci hladkých svalových bunk a tím chrání organismus ped rozvojem aterogenních zmn, inhibuje pemnu makrofág v pnové buky. Adiponektin inhibuje zántlivé procesy snížením exprese adhezivních molekul v bukách endotelu a snížením produkce cytokin v makrofázích. Podílí se na zvýšení -oxidace ve svalech a pomocí tohoto zvýšení zlepšuje inzulínovou rezistenci ve svalech a játrech. Taktéž zvyšuje oxidaci mastných kyselin ve svalech a snižuje plazmatické hodnoty triacylglycerol, glukózy a volných mastných kyselin v krvi. Obecn má adiponektin protizántlivé, antiaterogenní a protiapoptické úinky a celkov ovlivuje metabolismus. [10,11] 4.1.2 Adiponektin a ateroskleróza Adiponektin psobí jako protektivní faktor pi iniciaci a progresi aterosklerózy díky svým protizántlivým a protiaterogenním vlastnostem. Nižší plazmatické hladiny adiponektinu se vyskytují u obézních jedinc, u pacient s diabetem 2. typu, u pacient s ischemickou chorobou srdení. Fyziologická koncentrace adiponektinu se pohybuje v rozmezí 5 10 mg/l. [12] ada studií pojednává o úloze adiponektinu v souvislosti s aterosklerotickým onemocnním. Tento polypeptidický hormon je pítomný v krevním obhu, pedstavuje pibližn 0,01 % z celkové plazmatické bílkoviny. Hraje velmi dležitou roli pi zántu, v imunitním systému a pi ateroskleróze. V cévní výstelce snižuje adhezi monocyt k endotelu, potlauje transformaci makrofág v pnové buky, brání proliferaci a migraci hladkých svalových bunk. Ateroskleróza je chronické degenerativní onemocnní cévní stny. Ateroskleróza pedstavuje jeden z nejvýznamnjších zdravotních problém civilizace. [23] První zmnou, která 26

pedchází vzniku aterosklerotické léze je poškození cévního endotelu, což je zpsobeno zántlivými podnty. Dochází taktéž k pesunu hladkých svalových bunk do místa zántu a k jejich proliferaci. Do cévní stny zanou pronikat lipoproteiny, cholesterol, vazivové tkán a další komponenty a následn dochází k jejich akumulaci. [7] Tento stav pechází do stádií, které se oznaují jako tukové proužky (vyskytují se již v dtském vku a jsou uloženy v intim), ateromy fibrózní pláty až po komplikované léze, které vznikají postupným zvápenatním aterom, jejich prasknutím a trombotizací. Ateroskleróza zpsobuje postupné zužování až uzavení postižené cévy. Pi prasknutí aterosklerotického plátu a následné trombotizaci dochází k uzávru cévy. [29] Obr.. 13 Ruptura aterosklerotického plátu a tvorba trombu [42] Experimentální studie prokázaly, že adiponektin se pi poškození cévní výstelky akumuluje v subintimálním prostoru arteriální stny. Bylo zjištno, že adiponektin stimuluje produkci oxidu dusného v bukách endotelu. [13] Nižší hladiny adiponektinu byly stanoveny u pacient s esenciální hypertenzí, s diabetem a u pacient s koronárním arteriálním onemocnním (CAD). Plazmatická koncentrace adiponektinu je významn snížena u osob s ischemickou chorobou srdení. Mení plazmatických koncentrací adiponektinu mohou být použity pro hodnocení rizika CAD a souviset s rozvojem akutního koronárního syndromu (AKS). [13] Úelem další studie bylo prozkoumání úink ty bžn používaných hypolipidemických medikament (statiny, fibráty, niacin, omega 3 - mastné kyseliny) na cirkulující koncentrace adiponektinu a resistinu, viz dále str. 21. Medikamenty, které snižují hladiny sérových lipid, mají velký vliv na sekreci protein, tyto proteiny - adipokiny jsou sekretovány pomocí tukové tkán a hrají významnou roli pi zántlivých procesech. Skupina tchto jmenovaných medikament mla minimální vliv na koncentrace resistinu, zatímco koncentrace cirkulujícího adiponektinu se výrazn zvýšila vlivem každé skupiny léku. Nejvetší efekt byl 27

pozorován pod vlivem niacinu. Prokázal se zde velmi silný vztah mezi redukcí lipid a adiponektinu a užíváním tchto lék. [14] Tuková tká je známá jako zdroj kalorií, její role jako endokrinní orgán nebyla ocenna až do doby popsání leptinu a adiponektinu v polovin 90. let. Od té doby bylo ve svt identifikováno více než 100 adipokin v tukové tkáni. [14] Hydrofilita statin, jejich druh a velikost ástice adiponektinu hraje velkou roli v úinnosti léby. Její výsledky prokázaly, že medikamenty ze skupiny fibrát zvyšují HMW (high molecular weight) adiponektin, nikoliv celkový adiponektin. Niacin se ukázal jako velmi robustní a konzistentní. Celková hladina adiponektinu se zvýšila díky léb niacinem o 54%. Také omega-3- mastné kyseliny vedly ke zvýšení celkového adiponektinu. [14] U diabetických pacient byla sledována korelace adiponektinu s HDL (high density lipoproteins) cholesterolem, triacylglyceroly (TG), C-reaktivním proteinem (CRP) a body mass indexem (BMI), tato studie zjistila, že adiponektin má vztah k zántlivým markerm prostednictvím obezity. U pacient, kteí podstoupili lébu Atorvastinem, nedošlo k poklesu adiponektinu ani resistinu. Je potvrzena pozitivní korelace adiponektinu s HDL cholesterolem. [15] Bylo taktéž prokázáno, že plazmatické koncentrace adiponektinu byly signifikantn nižší u pacient s ischemickou chorobou srdení ve srovnání se skupinou kontrolních subjekt (zdraví jedinci). Tyto klinické studie naznaují, že adiponektin moduluje endoteliální zántlivou reakci a mení plazmatických hladin adiponektinu mohou být užitená pi posuzování rizika CAD. [27] 4.1.3 Možnosti stanovení adiponektinu Jednou z možností stanovení hladiny adiponektinu je využití xmap technologie LUMINEX. Vzorky séra nebo plazmy mohou být analyzovány pomocí komern dostupného kitu vyrobeného spoleností Millipore Corporation, další spoleností je nap. Bio-Rad spol. s. r. o. Další zpsobem stanovení adiponektinu je využití sendviové techniky ELISA. Dodavatel komerních kit ELISA je nap. firma BioVendor Laboratory Medicine, R nebo RIA kit dodává firma Linco Research. 4.2 Resistin Resistin byl poprvé objeven roku 2001. Skládá se ze 108 aminokyselin. Je to endokrinní hormon vyluovaný výhradn tukovými bukami. Resistin je velmi bohatý na aminokyselinu cystin. Molekulová hmotnost resistinu je 12,5 kda. [16] 28

4.2.1 Resistin ve spojení s aterosklerotickým onemocnním Resistin je považován za jeden z hlavních mediátor kardiovaskulárního onemocnní. Hraje dležitou roli v patogenezi aterosklerózy, objevuje se pedevším v zántlivých bukách. Vyvolává zvýšení adhezivních molekul ve vaskulárních endotelových bukách, které se zásadn podílí na poátením stadiu aterosklerotických zmn. Resistin podporuje proliferaci další adhezivní molekuly VSMC (vascular smooth muscle cell), která podporuje tvorbu pnových bunk. Zvýšená hladina resistinu koreluje s Lp-PLA 2 (fosfolipáza A2 asociovaná s lipoproteiny). [16] Byly provedeny ady studií, u hlodavc se resistin vyskytuje v tukové tkáni a reguluje metabolismus glukózy a citlivost na inzulín, u lidí je detekován pevážn v zántlivých bukách. V roce 2005 byla publikována studie, která se zabývala plazmatickými hladinami resistinu ve spojitosti se zántlivými markery a ischemickou kalcifikací. U 879 pacientských sér byly zmeny hladiny koncentrací resistinu a zántlivých marker nap. IL-6 (Interleukin-6), ICAM (Intercellular Adhesion Molecule 1), TNF (Tumor necrosis factor) a Lp-PLA 2. Ukázalo se, že hodnoty resistinu korelují s tmito zántlivými markery a pedpovídají koronární aterosklerózu u lidí, nezávisle na CRP. [17] Resistin mže být regulován zántlivými signály. S poruchou imunity a taktéž s chronickým zántem souvisejí obezita a diabetes 2. typu, což mže také vysvtlit zvýšenou hladinu resistinu u takto nemocných. [17] V poslední dob bylo zjištno, že vysoké koncentrace resistinu zpsobují vaskulární endoteliální dysfunkci a proliferaci bunk hladkého svalstva. Bylo zkoumáno vyluování resistinu z bunk makrofág v míst aterosklerotického plátu a jeho vliv na vaskulární funkci bunk u lidské populace. Koncentrace resistinu u tchto studií byly podstatn vyšší než fyziologické koncentrace, které dosahují hodnot pod 20 ng/ml. Pedpokládá se, že resistin hraje potencionální roli v procesu aterogeneze, je sekretován z makrofág aterosklerotických tepen a mže zásadn ovlivnit vaskulární bunnou funkci a pispt tak k ateroskleróze. Na základ této hypotézy byly zkoumány makrofágy, které byly infiltrovány do aterosklerotické tepny a resistin vyluovaly místn. [18] Odpov resistinu na statinovou lébu je kontroverzní. Ve vtšin studií se uvádí, že jeho koncentrace nebyla výrazn ovlivnna po osmitýdenní terapii se jeho koncentrace snížila o 20% i ješt mén. Studie, které se zabývaly vlivem niacinu na pokles koncentrace resistinu, nezjistily žádný významný úinek tohoto medikamentu. [14] 4.2.2 Možnosti stanovení resistinu Resistin lze stanovit imunoanalytickou metodou ELISA. Komerní soupravu ELISA poskytuje nap. firma Biovendor Laboratory Medicine, R. Další možností stanovení resistinu je využití xmap technologie LUMINEX. Vzorky séra nebo plazmy mohou 29

být analyzovány pomocí komern dostupného kitu vyrobeného spoleností Millipore Corporation, další spoleností je nap. Bio-Rad spol. s. r. o. 4.3 Osteopontin Osteopontin je hydrofilní, extracelulární protein. Skládá se pibližn z 300 aminokyselin a je vyluován do všech tlních tekutin. Je syntetizován rznými typy tkání, kostními bukami, makrofágy, kosterními svaly, hladkým svalstvem atd. Syntéza osteopontinu je stimulována prostednictvím Calcitriolu (1,25-dihydroxyvitamin D 3 ). Funkce osteopontinu v organismu je rznorodá. Osteopontin je velmi dležitým faktorem pi remodelaci kostí. Má velký význam pi ukotvení kostních bunk - osteoklast na minerální matrix kostí. Úastní se v procesu mineralizace kostí, bunné adhezi, bunné migraci. [20] Osteopontin je produkován bukami imunitního systému, vetn makrofág, neutrofil, dendritických bunk, T a B lymfocyt, hladkými svalovými bukami. Má chemotaktické vlastnosti, funguje také jako adhezivní bílkoviny, které se uplatují pi hojení ran. [20] Osteopontin se nachází nejenom v kostní matrix, mléce, moi, plazm, ale také v maligní a aterogenní tkáni a aterosklerotických plátech. [28] 4.3.1 Osteopontin a jeho význam pi aterogenezi Osteopontin se vyskytuje v oblastech dystrofické kalcifikace, která je spojena s degenerativním, aterosklerotickým cévním onemocnním. [20] Osteopontin je zapojen do zántlivých proces, jeho vyšší koncentrace hrají roli pi aterogenezi arteriální stny a mohou vést k potenciální ruptue aterosklerotického plátu. Dalším vysvtlením zvýšených hladin osteopontinu u kardiologických onemocnní je možná koronární kalcifikace arteriální stny. Navíc souasné nálezy naznaují souvislost mezi zántem a kalcifikací. U pacient se stabilní anginou pectoris, kteí užívali statiny, došlo k poklesu koncentrace osteopontinu. Fyziologická koncentrace osteopontinu u zdravých osob je do 1,2 ng/l. [21] 4.3.2 Možnosti stanovení osteopontinu Jedním ze zpsob stanovení hladiny osteopontinu je využití xmap technologie LUMINEX. Vzorky séra nebo plazmy mohou být analyzovány pomocí komern dostupného kitu vyrobeného spoleností Millipore Corporation, další spoleností je nap. Bio-Rad spol. s. r. o. Další možností pro stanovení osteopontinu je využití sendviové techniky ELISA. Dodavatelem komerních ELISA kit je firma Biovendor Laboratory Medicine, R. 30

4.4 Myeloperoxidáza Myeloperoxidáza (MPO) je enzym, který obsahuje molekuly hemu. Tento hemoprotein se vyskytuje v leukocytech - v granulech neutrofil, monocyt a makrofág. Z tchto bunk je MPO uvolována v míst zántlivého procesu. Je to siln bazofilní protein o molekulové hmotnosti 150 kda, strukturou je tetramer, který je tvoen párem identických dimer spojených disulfidickým mstkem. MPO se významn uplatuje v procesu destabilizace aterosklerotického plátu. [22] Obr.. 14 Struktura MPO [40] Aktivace leukocyt zpsobí sekreci MPO a ta katalyzuje vznik kyseliny chlorné z peroxidu vodíku a chloridových iont. H 2 O 2 + Cl - + H + HOCl + H 2 O Z kyseliny chlorné mohou vznikat velmi úinné oxidan psobící látky. Reakcí se superoxidem nebo s ionty dvojmocného železa tak mže vzniknout ješt reaktivnjší hydroxylový radikál: HOCl + O 2.-. OH + Cl - + O 2 HOCl + Fe 2+. OH + Cl - + Fe 3+ Pi reakci HOCl s peroxidem vodíku mže vzniknout nebezpený singletový kyslík, který pedstavuje další aktivní formu kyslíku: HOCl + H 2 O 2 1 O 2 + H 2 O + HCl Tyto produkty vyvolávají oxidaní poškození práv v míst zántu arteriální stny. [22] 31