MASARYKOVA UNIVERZITA

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE Stanovení riboflavinu v pivu metodou CE - LIF Bakalářská práce Brno, leden 2012 Magda Jandusová

Děkuji vedoucímu své bakalářské práce doc. Mgr. Janu Preislerovi, Ph.D. za odborné rady, připomínky a vřelý přístup. Dále bych chtěla poděkovat Bc. Lence Michalcové za její cenné rady, vysvětlení, připomínky a především trpělivost. Další díky patří Mgr. Ctiradu Hofrovi, Ph.D, který poskytl přístroj flluorimetr a Mgr. Tomášovi Prušovi za korekturu mé práce. Rodině a příteli za jejich podporu. 2

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně v souladu s uvedenou literaturou. Datum: Magda Jandusová 3

Obsah Úvod... 6 Teoretická část... 7 1. Kapilární elektroforéza... 7 1.1 Historie... 7 1.2 Princip... 7 2. Módy kapilární elektroforézy... 8 2.1 Kapilární zónová elektroforéza (CZE)... 8 2.2 Kapilární isotachoforéza (ITP)... 9 2.3 Kapilární gelová elektroforéza (CGE)... 9 2.4 Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF)... 10 2.5 Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MEKC)... 10 3. Faktory ovlivňující průběh kapilární elektroforézy... 10 3.1 Elektroosmotický tok... 10 3.2 Zdánlivá pohyblivost... 12 3.3 Jouleovo teplo... 12 3.4. Adsorpce na stěnu kapiláry... 13 4. Instrumentace... 13 4.1. Dávkování... 13 4.2. Detektory... 14 4.3. Zdroje záření... 15 4.4 Luminiscence... 15 4.5. Fluorescence... 16 5. Charakteristiky fluorescence... 18 5.1. Kvantový výtěžek fluorescence... 18 5.2. Fluorofor... 19 5.3. Intenzita fluorescence... 19 5.4. Spektrální charakteristiky fluorescence... 19 5.5 Fluorimetrie... 19 6. Vitaminy... 20 7. Riboflavin... 21 7.1. Fyziologie riboflavinu... 22 7.2. Fyzikálně chemické vlastnosti riboflavinu... 22 7.3 Doporučená denní dávka, příznaky deficitu... 25 4

7.4. Výskyt riboflavinu... 25 7.5. Charakteristika piva... 26 7.6. Stanovení riboflavinu... 26 8. Cíl práce... 28 Experimentální část... 29 9. Materiály a metody... 29 Chemikálie... 29 Vzorky piva... 29 10. Přístroje a programové vybavení... 29 11. Přístroj CE-LIF... 30 12. Charakteristika fluorescenčních vlastností riboflavinu... 31 Výsledky a diskuze... 31 13. Nastavení přístroje CE-LIF... 32 13.1. Fluorescenční vlastnosti riboflavinu... 32 13.2. Fluorimetrické stanovení riboflavinu v pivu... 34 13.3. Stanovení piva metodou CE - LIF... 35 13.3.1. Metodika... 35 13.3.2. Výběr vhodných filtrů... 36 13.3.3. CE-LIF modelového (standardního) vzorku riboflavinu... 36 13.3.3.1. Opakovatelnost měření... 36 13.3.3.2. Stanovení limitu detekce standardu riboflavinu... 37 13.3.4. CE-LIF reálného vzorku... 38 13.3.4.1. Reprodukovatelnost CE-LIF riboflavinu v pivu pomocí CE - LIF... 38 13.3.4.2. Stanovení koncentrace riboflavinu v pivu... 39 Souhrn... 42 Summary... 43 Použitá literatura... 44 Seznam převzatých obrázků... 47 Seznam použitých zkratek... 48 5

Úvod Kapilární elektroforéza (CE) je separační metoda, která se v současné době hojně využívá zejména z důvodu rychlosti a účinnosti analýzy, oceňují se i nízké nároky na množství vzorku a proměnlivých separačních podmínek. Důležitou roli hrají i nízké provozní náklady. Analytické využití leží zejména v oblasti chemie, speciálně v oblasti proteomiky, genomiky a metabolomiky, ale může být využívána i v dalších odvětvích. V případě spojení CE s laserem indukovanou fluorescencí (LIF) je možné stanovit velmi malá množství molekul, někdy až jedinou molekulu. 1 Práce podává přehled o riboflavinu, označované jako vitamin B 2, jeho vlastnostech a chemii. Riboflavin se považuje za ideální látku pro stanovení pomocí CE -LIF díky malým molekulám a možnosti nenáročného zacházení s nimi. Bakalářská práce bude zkoumat, zda je možné využít tuto metodu pro stanovení riboflavinu v běžných pivech. 2 6

Teoretická část 1. Kapilární elektroforéza 1.1 Historie První práci o elektroforetické separaci, přesněji o kapilární elektroforéze, zveřejnil v roce 1937 švédský vědec Arne Tiselius. Za svoji publikaci o tomto přístroji získal Nobelovou cenu za chemii. V tu dobu se rozvíjely i další podobné metody, mezi něž patří například gelová elektroforéza. Kapilární elektroforéza zaujala významné postavení až v 80. letech 20. století. 3 1.2 Princip Kapilární elektroforéza patří mezi elektromigrační metody, které jsou založeny na rozdílné pohyblivosti elektricky nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli. Nabité částice se při elektroforéze pohybují k opačně nabité elektrodě, tzn. kationty se pohybují ke katodě, anionty k anodě a neutrální částice se nepohybují. Když se částice pohybují různou rychlostí, dochází tak k separaci jednotlivých složek. Rychlost pohybu částice v elektrickém poli o jednotkové intenzitě je charakterizována elektroforetickou pohyblivostí μ. Rychlost iontů závisí na náboji částice a na odporu prostředí. Rychlost iontů definuje rovnice (1): v= μ E (1) kde v je rychlost migrujících iontů, μ elektroforetická pohyblivost a E intenzita elektrického pole. Elektroforetická mobilita iontu je dána vztahem (2): (2) kde q je náboj iontu, η viskozita roztoku a r poloměr iontu. Na nabitou částici působí v elektrickém poli dvě síly (obr. 1) elektrická síla F 1 ji uvádí do pohybu a odpor viskózního prostředí charakterizován silou F 2 částici brzdí. 7

Obr. 1: Síly působící na iont 1 Obě síly jsou charakterizovány vztahy (3) a (4): F 1 =q E (3) F 2 =k v (4) kde k je koeficient závislý na viskozitě prostředí a velikosti částice. Vyjádříme-li koeficient k jiným způsobem, dostáváme vztah pro frikční sílu v tomto tvaru (5): F 2 = -3 π d η v (5) kde d je průměr pohybující se částice, η viskozita prostředí a v rychlost iontu. 4 2. Módy kapilární elektroforézy Kapilární elektroforetické metody zahrnují i jiné módy než je CE. Volba separace záleží na migračním chování molekul a iontů. Podle toho se vybírá vhodný přístroj ke stanovení iontů. V současnosti se využívá pět hlavních módů: kapilární zónová elektroforéza (CZE), kapilární izotachoforéza (ITP), kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) a kapilární gelová elektroforéza (CGE). Modifikací kapilární zónové elektroforézy je micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MEKC). 2.1 Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Kapilární zónová elektroforéza je nejjednodušší a nejrozšířenější formou CE, při níž se využívá jednoho základního elektrolytu (BGE). Separace analytů je prováděna v tenké kapiláře bez speciální úpravy, použití jednoho základního elektrolytu zajišťuje dostatečnou 8

elektrickou vodivost v celém systému. V důsledku toho je v celé separační kapiláře konstantní elektrické pole. Jednotlivé zóny (analyty se stejnou elektroforetickou mobilitou) jsou od sebe oddělené a migrují různou konstantní rychlostí, takže se v průběhu separace od sebe stále více vzdalují. Separace je optimalizována výběrem elektroforetické metody s vhodným ph pufru, iontovou silou a složením. Výhodou CZE je schopnost oddělovat během jedné separace jak kationty, tak anionty. Využívá se elektroosmotického toku (EOF). 2.2 Kapilární isotachoforéza (ITP) ITP dělí ionty na základě jejich rozdílných elektroforetických mobilit. Roztok dělených iontů je dávkován jako rozhraní dvou rozdílných elektrolytů. Pro ITP je charakteristické použití dvou elektrolytů. První elektrolyt před vzorkem se nazývá vedoucí (leading), ten obsahuje iont stejného znaménka, ale má větší elektroforetickou pohyblivost než všechny separované ionty. Druhý elektrolyt za vzorkem se nazývá uzavírající (terminating), ten obsahuje iont stejného znaménka jako dělené ionty, ale má menší elektroforetickou pohyblivost než všechny dělené ionty. Každý separovaný iont vytváří během analýzy svoji vlastní zónu. Zóny všech dělených iontů jsou uzavřeny mezi vedoucí a uzavírající elektrolyt, a tak jsou seřazeny za sebou podle klesající elektroforetické pohyblivosti dělených iontů. Kapilární izotachoforéza je použitelná pouze pro molekuly s nábojem (ionty). Během jednoho experimentu lze dělit a detekovat pouze jeden druh iontů (kladné nebo záporné). 2.3 Kapilární gelová elektroforéza (CGE) CGE dělí velké molekuly s nábojem (ionty) na základě jejich rozdílných elektroforetických pohyblivostí. Gel v kapiláře zvyšuje rozdíly mezi elektroforetickými rychlostmi velkých migrujících iontů různých tvarů. Velké ionty se zanořují do gelu, tím pádem se zpomalí jejich separace. U malých iontů je tomu naopak. Přítomnost gelu v kapiláře je výhodou, neboť zabraňuje vzniku EOF. Kapilární gelová elektroforéza je použitelná pouze pro jeden druh iontů a využívá se zejména pro velké ionty, jako jsou peptidy, bílkoviny, sacharidy, štěpy DNA a RNA. 9

2.4 Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) CIEF separuje amfolyty v lineárním gradientu ph na základě jejich rozdílných isoelektrických bodů pi. Jakmile se amfolyt dostane do místa, kde ph = pi, stane se neutrálním a zastaví se. Po ustálení všech analytů v gradientu se zóny uvedou do pohybu směrem k detektoru. 2.5 Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MEKC) MEKC je mód CE, ten se používá k separaci neutrálních sloučenin. Využívá povrchové aktivity micel. Do základního elektrolytu (vodná fáze) je přidána povrchově aktivní látka (detergent, např. dodecylsíran sodný - SDS), která vytvoří v pufru micely, tzv. v micelární pseudostacionární fázi. Povrchově aktivní látky se do elektrolytu přidávají v koncentraci převyšující kritickou micelární koncentraci (CMC). CMC je minimální koncentrace povrchově aktivní látky v roztoku, při níž dochází k tvorbě micel. Micely jsou kulovité shluky povrchově aktivních látek; svými hydrofilními konci směřují vně a hydrofobní konce tvoří jádro micely. K separaci neutrálních látek dochází na základě rozdílných koeficientů u hydrofobních interakcí mezi jádrem micely a analytem. Micely mají velký povrchový náboj, tedy i velkou elektroforetickou rychlost. Čím déle se analyt zdržuje uvnitř micely, tím více je ovlivněn jeho migrační čas. 5,6 3. Faktory ovlivňující průběh kapilární elektroforézy Průběh separace CE mohou ovlivňovat různé faktory. Mezi nejvýznamnější faktory patří elektroosmotický tok, zdánlivá pohyblivost, Jouleovo teplo a adsorpce analytu na stěnu kapiláry. Vliv na průběh separace může mít i dopad injektáže (předávkování kapiláry). 3.1 Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok neboli EOF je významný děj vznikající v kapiláře při aplikaci elektrického pole. Vzniká jako důsledek náboje na stěně křemenné kapiláry, nejčastěji kapiláry z taveného křemene. Povrch stěn kapiláry je tvořen silanolovými skupinami Si-OH, které jsou v závislosti na ph částečně nebo úplně disociovány. 10

Si-OH Si-O - + H + Negativně nabité skupiny přitahují kationy z elektrolytu a tvoří se elektrická vrstva, která má dvě části: Sternova (Helmholtzova) vrstva je elektrická dvojvrstva a Gouy - Chapmanova vrstva je tzv. difúzní, kde se ionty mohou volně vyměňovat s ostatními ionty pracovního elektrolytu. Spojení Helmholtzovy vrstvy a Gouy-Champanova modelu popisuje tzv. Sternův model. Kationty ve středu kapiláry tvoří difúzní vrstvu, která se po připojení napětí začne pohybovat směrem ke katodě. Tento pohyb je označován jako EOF a je tak silný, že unáší ke katodě i anionty. Pohyblivost EOF μ EOF je dána rovnicí (6): (6) kde ε je permitivita základního elektrolytu, ζ je potenciálový rozdíl difúzní vrstvy, takzvaný zéta potenciál, η je viskozita a r je poloměr kapiláry. Zéta potenciál, a tedy i celá pohyblivost, jsou ovlivněny elektrostatickými vlastnostmi materiálu kapiláry. Celková pohyblivost částic, tzv. zdánlivá pohyblivost μ z je dána součtem pohyblivosti EOF μ EOF a pohyblivosti samotné částice μ (7): μ z = μ EOF + μ (7) Elektroforetická pohyblivost kationtů je kladná, u aniontů je tomu naopak, tzn. záporná. Když je separační napětí kladné, tak z toho vyplývá, že kationty jsou rychlejší a naopak anionty pomalejší. Vzhledem k tomu, že elektroforetická pohyblivost neutrálních částic je nulová, pohybují se tyto částice rychlostí EOF. Pístový profil toku při EOF je rozdílný od hydrodynamického toku (Obr. 2). EOF lze ovlivnit prostřednictvím iontové síly roztoku, ph použitého elektrolytu, teploty a vnitřního povrchu kapiláry. Obr. 2: Tok kapaliny v kapiláře bez EOF a s EOF 2 11

Celkově elektroosmotický tok může být ovlivňován vhodnou volbou iontů. Zvýšení síly elektroosmotického toku způsobuje kolaps elektrické dvojvrstvy. Elektroosmotický tok může být také potlačován modifikací vnitřního povrchu kapiláry, který způsobuje omezení ionizace silanolových skupin, např. polyakrylamidem či methylcelulosou. 1,7 3.2 Zdánlivá pohyblivost Výsledná efektivní mobilita μ ef molekuly odpovídá její efektivní rychlosti migrace uvnitř kapiláry. Jde o součet elektroforetické pohyblivosti částice a pohyblivosti elektroosmotického toku kapaliny podle rovnice (8): μ ef = μ EOF + μ e (8) Pohyb částic znázorňuje obr. 3. EOF je obecně větší než elektroforetická pohyblivost jednotlivých molekul a unáší všechny ke katodě. Kladná částice má vektor elektroforetického pohybu shodný s vektorem EOF, a proto je pohyb kladných částic urychlován elektroforetickou složkou. Naopak na záporně nabité částice působí elektroforetická síla opačným směrem, a proto se pohybují pomaleji než elektroosmotický tok kapaliny. Neutrální látky se pohybují stejnou rychlostí jako EOF a tímto způsobem se neseparují. 8 Obr. 3: Znázornění separace nabitých a neutrálních částic, směru jejich elektroforetického pohybu a jejich výsledné pohyblivosti v závislosti na velikosti náboje a velikosti částice. 3 3.3 Jouleovo teplo Zvýšením vkládaného napětí je možné zvýšit EOF a tím urychlit separaci a zkrátit dobu analýzy. Jenže současně se zvyšujícím se napětím roste procházející proud a s ním roste produkce Jouleova tepla. Platí vztah (9): 12

(9) kde W je disponovaný elektrický výkon, I elektrický proud a U napětí. Pokud není vznikající teplo dostatečně odváděno, vzrůstá teplota uvnitř kapiláry, a tak může docházet k rozkladu termolabilních složek vzorku, např. může docházet k denaturaci bílkovin. V kapiláře vzniká radiální teplotní gradient, protože teplo je odváděno jen na povrchu kapiláry, což ovlivňuje konstantní separační podmínky. Existují i řešení na snížení produkce Jouleova tepla, např. použití pufru s nízkou iontovou silou a koncentrací, zlepšení odvodu tepla z kapiláry zvětšením jejího povrchu a účinným chlazením. 9 3.4. Adsorpce na stěnu kapiláry Pokud má separovaný analyt náboj opačného znaménka než je náboj stěny kapiláry, dochází k vzájemným interakcím. Adsorpce se může projevit asymetrií píku, např. chvostující. Abychom omezili adsorpci na stěnu kapiláry, je možné zvýšit koncentraci základního elektrolytu, kdy se sníží elektivní náboj stěny kapiláry. S tím však souvisí nevýhoda, a sice že zvýšením proudu se zvyšuje produkce Jouleova tepla. 1,10,11 4. Instrumentace Přístroj kapilární elektroforézy se skládá ze separační kapiláry, zdroje napětí, dávkovače vzorku, detektoru a zařízení pro záznam a vyhodnocení analytického signálu. Separace probíhá v kapiláře, ta je spojena s elektrodami a je s nimi ponořena do zásobníků s elektrolytem. Vysokonapěťový zdroj vytváří napětí nutné k separaci analytu. Na druhém konci kapiláry se nachází detektor, který snímá analytický signál. Vyhodnocování zařízení zaznamenává odezvu detektoru v čase. Tento záznam se nazývá elektroforegram. 4.1. Dávkování Velmi malé objemy dávkovaných vzorků (v řádech desítek nanolitrů) je možné dávkovat dvěma základními způsoby. Je to dávkování hydrodynamickým tlakem a dávkování elektrokinetické. Hydrodynamického dávkování lze docílit např. rozdílem hladin, tlakem na vzorek či vakuem na straně detektoru. Elektrokinetické dávkování je prováděno aplikací 13

dávkovacího napětí po určitý časový interval. U elektrokinetického dávkovaní je nevýhoda, že vzorek má změněné složení v důsledku rychlejší migrace mobilnějších částic. Množství analytu nadávkovaného hydrodynamicky lze vypočítat z Poiseuilleovy rovnice (10): (10) kde n je množství nadávkovaného analytu, d je průměr kapiláry, P je rozdíl tlaků na začátku a na konci kapiláry, t délka trvání injektáže, c je koncentrace analytu, η viskozita analytu a l celková délka kapiláry. vztahu (11): Při elektrokinetickém dávkování lze vypočítat nadávkované množství analytu pomocí (11) kde Q je množství nadávkovaného nadávkového analytu, t délka injektáže, c je koncentrace analytu, μ mobilita analytu, μ EOF mobilita EOF, λ b je vodivost analytu, λ a vodivost pufru. Při kvantitativním elektrokinetickém dávkovaní je nevýhoda, že vzorek má změněné složení v důsledku rychlejší migrace mobilnějších částic. Má-li vzorek nižší vodivost než pufr, lze zkoncentrovat (stacking) dávkování vzorku. 12,13 4.2. Detektory CE lze kombinovat s nejrůznějšími typy detektorů. Nejběžnějším užívaným detektorem je UV-VIS spektrofotometrie. Často se také používá fluorescence, laserem indukovaná fluorescence, hmotnostní spektrometrie a konduktometrie. U UV-Vis spektrofotometrie je nevýhoda, má menší citlivosti než u fluorescenční či hmotnostní detektor, ale je universálně použita pro stanovení mnoha analytů. Abychom mohli přiřadit analyty ke správným detektorům, je důležitá jejich struktura. Aby analyt mohl být separován, musí obsahovat ve své struktuře chromofor. Jednou z omezujících podmínek této detekce je použití pufrů, které nesmí při daných vlnových délkách absorbovat a musí být dostatečně čisté. Skoro vždy se jedná o anorganické pufry, neboť ty na rozdíl od organických neobsahují ve struktuře chromofor. Mezi nejčastěji používané anorganické pufry patří borátový a fosfátový. Fluorescenční detekce je velmi citlivou metodou schopnou detekovat nejnižší 14

limity. Využívá typické vlastnosti laserového paprsku, jakou je monochromatičnost, díky níž odpadá používání monochromátorů pro výběr dané vlnové délky. Další důležitou a výhodnou vlastností laserového paprsku je minimální divergence. Ta umožňuje zaostřit laser do středu kapiláry a účelně tak využít výkon laseru. Platí to i pro absorpční detekci, aby mohla detekovat analyt, musí tento analyt obsahovat ve struktuře vhodný fluorofor. Pokud chceme i přes nepřítomnost fluoroforu použít fluorescenční detekci, je nutné do struktury fluorofor začlenit pomocí derivatizační reakce. 11,13 4.3. Zdroje záření Mezi využívané zdroje záření řadíme např. lampy (Hg, Xe, deuteriová výbojka), polovodičové diody (tzv. LED diody) a lasery. Laser a laserová dioda na sebe poslední dobou poutají nejvíce pozorností, neboť mají výrazné přednosti - LED diody jsou levné a mají malé rozměry, což vyhovuje miniaturizacím. Laser, pod zkratkou Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, je zdroj vysoce koherentního záření. Jeho typickým znakem je úzká spektrální čára a vysoce intenzivní záření. Právě tyto vlastnosti se využívají v laserem indukované fluorescenci (LIF), kdy je molekula fluoroforu excitována přesnou vlnovou délkou jejího absorpčního maxima a je dosahováno vysokých citlivostí (limity detekce se pohybují od 10-14 až 10-16 mol/l). Jenže laser s sebou nese i nevýhodu, kterou je jeho přísná monochromatičnost, neboť existuje pouze omezený počet typů laserů a tím i excitačních vlnových délek. Dalšími nevýhodami laserů je jejich vysoká cena a omezená životnost (řádově tisíce hodin). Nejpoužívanějšími lasery jsou argon - iontový (vlnové délky 488 a 514 nm) a helium-kadmiový (vlnové délky 325 a 442 nm). V poslední době je Nd:YAG nejpoužívanějším typem pevnolátkového laseru, který má různé využití, zejména je hojně využíván v technologii a oftalmologii. Nejběžnější zástupci laserů jsou laserové diody používané v širokém odvětví, např. telekomunikace, lékařství. Laserová dioda emitující při 405 nm je složena z GaAs. V poslední době je hojně rozšířená a relativně levná díky využití v počítačové technice pro záznam dat. 12,13 4.4 Luminiscence Luminiscence je emise světla z nějaké látky a nastává z elektronových excitovaných stavů. Luminiscenci můžeme dělit dle toho, jakým způsobem se molekuly dostávají do excitovaného stavu na fotoluminiscenci (absorpce světelného záření), chemiluminiscenci (energie uvolňována z chemických procesí), termoluminiscenci (energie dodávaná teplem), 15

elektroluminiscenci (energie dodávaná elektrickým polem). Dále mezi luminiscenci řadíme fluorescenci a fosforescenci, mezi nimiž je rozdíl v přechodech elektronů. Pro vznik luminiscence je potřeba, aby látka nejprve absorbovala energii a její atomy nebo molekuly přešly na vyšší kvantové elektronové hladiny. Získanou energii pak látka může za příznivých okolností vyzářit jako luminiscenci. Luminiscence molekul nezávisí pouze na jejich vlastní struktuře a skupenství, ale i na okolním prostředí (např. u roztoků má na luminiscenci vliv rozpouštědlo a iontová síla. 14 4.5. Fluorescence Fluorescence je druhem fotoluminiscence. Jde o sekundární záření, které látka vydává po absorpci primárního elektromagnetického záření (paprsků rentgenového, ultrafialového anebo viditelného záření). K absorpci může dojít, jestliže energie elektronů v atomech odpovídá frekvenci procházejícího světelného paprsku. Fluorescenci a fosforescenci lze přibližně rozlišit podle doby, po kterou trvá sekundární záření, když přestalo působit primární záření. U fluorescence tato doba bývá 10-8 až 10-5 s, u fosforescence 10-2 s až několik dní. Na obr. 4 je zobrazeno zjednodušené schéma zářivých a nezářivých přechodů mezi elektronově vibračními stavy složité molekuly. Absorpcí elektromagnetického záření přechází molekuly ze základního singletového elektronového stavu S0 do různých excitovaných vibračních hladin singletových stavů S1, S2, a tripletových stavů T1, T2, Absorbovanou energii může excitovaná molekula vyzářit jako fluorescenci nebo fosforescenci. K deexcitaci může dojít i nezářivými pochody, např. částečnou nebo úplnou přeměnou na vibrační energii nebo předáním energie jiným molekulám. Obr. 4. : Jablonského diagram (Schéma zářivých i nezářivých přechodů mezi elektronově vibračními stavy) 4 16

Díky vnitřním konverzím mezi excitačními vibračními hladinami se energie fotonu zmenší, tudíž platí, že hv EX (excitační) je větší než hv EM (emisní) V praxi se tato skutečnost projevuje jako tzv. Stokesův posuv (obr. 5), kdy se emisní spektrum vůči absorpčnímu posunuje k větším vlnovým délkám. Je-li emisní spektrum posunuto k nižším vlnovým délkám, hovoříme o tzv. anti-stokesově posunu. 15,16 Obr. 5: Stokesův posun 5 U fluorescenční detekce je důležitý parametr - kvantový výtěžek fluorescence, který je definován jako poměr počtu světelných vyzářených kvant k počtu kvant absorbovaných nebo poměr intenzity emitovaného a absorbovaného záření. Proto je kvantový výtěžek jedním z faktorů ovlivňujících celkovou intenzitu fluorescence F odvozenou z Lambert-Beerova zákona (12): (12) kde k je konstanta zahrnující přístrojové parametry, extinkční koeficient, c koncentrace analytu a l optická dráha. 15,16 intenzita excitačního záření, ε molární 17

5. Charakteristiky fluorescence 5.1. Kvantový výtěžek fluorescence Kvantový výtěžek fluorescence je podíl počtu světelných kvant vyzářených (N emit ) a počtu absorbovaných (N abs ) (13): (13) Pokud budící spektrum nepřekročí určitou vlnovou délku, jeho kvantový výtěžek nezávisí na vlnové délce, ale po překročení vlnové délky se začne projevovat vnitřně filtrační efekt. Obdobou je energetický výtěžek fluorescence χ (14), který je definován jako poměr mezi emitovanou energií Eemit a energií absorbovanou Eexcit. Energetický výtěžek je menší nebo roven jedné. (14) Obsah fluoreskujícího analytu je spojeno s Lambert- Beerovým zákonem (15): (15) kde Ф je tok záření po absorpci, Ф 0 je vstupující tok absorbovaného záření, ε je molární absorpční koeficient, c je koncentrace dané látky, l je tloušťka kyvety. Nejběžněji se pracuje s malými koncentracemi fluoreskující sloučeniny, což je v oblasti lineární závislosti fluorescence na koncentraci, protože při vyšší koncentraci dochází k poklesu kvantového výtěžku zapříčiněného koncentračním samozhášením. 14,16,17 Což vyjadřuje již výše zmíněný vztah: 18

5.2. Fluorofor Fluorofor je látka schopná absorbovat elektromagnetické vlnění o určité vlnové délce a následně emitovat zářeni o vlnové délce, která bývá zpravidla delší než absorbovaná. Přirozené fluorofory se vyskytují v organismech. V nich se vyskytuje celá řada sloučenin fluoreskujících po vybuzení UV zářením. Intenzivní fluorescenci vykazují některé polyaromatické uhlovodíky či heterocykly. Tyto látky se nazývají fluorofor. Řadíme mezi ně např. tryptofan, tyroxin, dále mezi ně patří i FMN, FAD, NAD, ale u těch záleží na tom, jestli jsou v oxidované či redukované formě. Modelový vzorek neboli riboflavin obsahuje v sobě fluorofor. 15,16 5.3. Intenzita fluorescence Intenzita fluorescence je definována jako počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času. 5.4. Spektrální charakteristiky fluorescence Excitační spektrum popisuje závislost intenzity fluorescence na vlnové délce (tzn. vlnočtu, frekvenci) při konstantní vlnové délce emitovaného záření. Tento typ spektra lze použít pro výběr budícího záření pro danou látku. Emisní spektrum popisuje závislost intenzity fluorescence na vlnové délce (tzn. vlnočtu, frekvenci) při konstantní vlnové délce budícího záření. 14,15 5.5 Fluorimetrie Fluorimetrie je analytická metoda, která se zabývá studiem záření emitovaného molekulami, které přešly do excitovaného stavu po absorpci záření o vhodné vlnové délce, např. VIS, UV oblasti. 18 19

6. Vitaminy K objevení vitaminů došlo s rozvojem chemie v 19. století. V té době nebyla ještě známá chemická struktura všech vitaminů a díky tomu začaly vznikat názvy, v nichž byly vitaminy spojovány s onemocněním, např. vitamin proti šerosleposti, později označován jako vitamin A. Později vitaminy dostávaly názvy podle abecedy dle toho, kdy byly objeveny. Při zjišťování fyziologických vlastností u více sloučenin se k písmenům přiřazovaly číselné dolní indexy, následně triviální názvy. V současné době se používají názvy odvozené od chemického složení vitaminů. 2,19 Vitaminy jsou organické esenciální nízkomolekulární sloučeniny syntetizované autotrofními organismy. Lidé je neumějí syntetizovat z jednoduchých sloučenin, a tak je musí přijímat jako exogenní látky ve formě potravy. Jsou ale i výjimky, některé vitaminy jsou lidé schopni syntetizovat střevní mikroflórou. Sem patří například vitaminy K. 20,21 Vitaminy se dělí podle rozpustnosti na hydrofilní a lipofilní. Hydrofilní vitaminy jsou rozpustné ve vodě. Nadměrné užívání hydrofilních vitaminů není pro organismus tak škodlivé, neboť je organismus dokáže z těla eliminovat snáze a ve větším množství, zejména ve formě moči. V toxických koncentracích se hromadí v těle jen výjimečně. Díky průběžnému vylučování těchto vitaminů má organismus jen omezené zásoby, a tak musí být tyto vitaminy dodávány plynule. Vitaminy se také snadno degradují, při vaření se ničí, víc než částečně jsou vyluhovány do vody. Mezi hydrofilní vitaminy se řadí vitaminy skupiny B, přesněji tiamin (vitamin B 1 ), riboflavin (vitamin B 2 ), kyselina nikotinová a nikotinamid (vitamin B 3 ), kyselina pantotenová (vitamin B 5 ), pyridoxin (vitamin B 6 ), korinoidy (vitamin B 12, jsou i formy, které obsahují 5,6-dimethylbenzimidazol, ty se nazývají kobalaminy), biotin, folacin, vitamin C, známý též pod názvem kyselina L-askorbová. 22,23 Lipofilní vitaminy jsou rozpustné v tucích, ukládají se v játrech, proto se u nich zvyšuje pravděpodobnost hypervitaminózy. Zásoby v organismu mohou pokrývat denní potřebu i na pár let dopředu. Tyto vitaminy jsou poměrně stabilní, řadíme mezi ně vitaminy skupiny A, D, E, K. 2,22 20

Pro organismus jsou vitaminy nepostradatelné, poněvadž zastávají životně důležité funkce, např. působí jako katalyzátory řady reakcí v rámci metabolismu, jsou součástí oxidačně-redukčních systémů, jsou to i antioxidanty, které mají za úkol tlumit tvorbu aktivní formy kyslíku, popřípadě dusíku. Trpí-li organismus nedostatkem nějakého vitaminu, jedná se o hypovitaminózu, pokud je tento nedostatek dlouhodobý, jedná se avitaminózu, která se projevuje až fatálními zdravotními následky. 2,24,25 Opakem hypovitaminózy je hypervitaminóza. Ta vzniká při nadměrném užívání vitaminů rozpustných v tucích, jedná se tedy hlavně o vitaminy skupiny A a D. Ty způsobují poruchy biochemických procesů, a tak může docházet ke zdravotním komplikacím. 24,25 7. Riboflavin Před více než 110 lety dostala dosud neznámá látka, která byla izolována z kravského mléka, a měla jasně žluté zbarvení, dostala různé názvy, např. laktoflavin, ovoflavin či laktochrom. Před 2. světovou válkou byla tato látka popsána jako vitamin. Dostala jméno riboflavin a je součástí skupiny vitaminů B. Pro riboflavin se užívá označení B 2. Řadí se mezi 2, 26 hydrofilní vitaminy a strukturně patří do skupiny flavinů. Molekula riboflavinu je složena z heterocyklického isoalloxazinového jádra, které je připojeno na ribitol (6,7dimethyl-9-(D-1 -ribityl)izoalloxazin) (obr. 6). Riboflavin tvoří žluté krystaly odolné vysokým teplotám tání v rozmezí 275 až 292 C. Avšak působením světla se riboflavin rozkládá. 20 Obr. 6: Struktura molekuly riboflavinu 6 21

sítnici. 21 Vitamin B 2 je též součástí enzymu glutationreduktázy, ta je FAD-dependentní enzym, 7.1. Fyziologie riboflavinu V lidském těle je riboflavin potřebný k přeměně energie z bílkovin, tuků a sacharidů. Je i součástí dýchacího řetězce, oxidoredukčních enzymů. Flavinové enzymy působí jako akceptory vodíkových atomů z redukovaných pyridinových koenzymů, např. nikotinamidadenindinukleotid, nikotinamidadenindinukleotidfosfát, a ty vstupují do reakcí, při kterých je přenášen kyslíkový atom. 24 Vitamin B 2 plní preventivní roli proti migrénám, šedému zákalu, revmatické artritidě, akné, keratitidě, ale i ekzému. Pro správnou funkci těla je riboflavin velmi důležitý. Riboflavin je potřeba pro normální reprodukci, růst, regeneraci a vývoj tělesných tkání, včetně kůže, vlasů, nehtů, pojivových tkání, imunitního systému a pro tvorbu červených krvinek. 19 Riboflavin se účastní procesu vidění, ve kterém převádí krátkovlnné modré paprsky na žlutozelené a tím umožňuje vidění za šera. Dále umožňuje oxidační pochody a metabolismus aminokyselin v oční čočce a rohovce. Velké množství volného riboflavinu se nachází v oční který se účastní redukce glutationu. Redukce glutationu hraje důležitou roli při ochraně organismu před reaktivním kyslíkem, např. před peroxidem vodíku. Nedostatek riboflavinu zvyšuje oxidativní stres. Měření aktivity glutationreduktázy v červených krvinkách se využívá 2, 21,25 při zjišťování výživové dávky riboflavinu. Riboflavin se uvolňuje z vazby na potravinové bílkoviny v kyselém prostředí žaludku a je štěpen v proximální části tenkého střeva, kde dochází k regulaci nízké koncentrace riboflavinu pomocí saturačního mechanismu a jeho vyšší koncentrace jsou absorbovány pasivní difúzí. Po fosforylaci vlivem enzymů je riboflavin vázán na bílkovinu a dále transportován do jater, srdce, a ledvin, kde nemůže vytvářet velké zásoby. Z toho důvodu je nutné, aby příjem riboflavinu byl relativně plynulý. Pokud se poškodí trávicí trakt vlivem alkoholu, léčiv a při vyšším výskytu mědi, zinku, nebo železa v trávicím traktu, dochází ke snížení absorpce riboflavinu. 20,25 7.2. Fyzikálně chemické vlastnosti riboflavinu Riboflavin se snadno rozpouští ve vodných roztocích alkalických hydroxidů. Plní funkci akceptoru jednoho elektronu za vzniku superoxidového radikálu či jako akceptor dvou elektronů, kdy vzniká peroxid vodíku. 25 22

Riboflavin je značně odolný vůči vzdušnému kyslíku a prakticky stálý v kyselém prostředí při vyšších teplotách. Při ozáření viditelným zářením (400-750 nm) a zvláště pak UV zářením (400-100 nm) se riboflavin rychle rozkládá. Působením UV paprsků v neutrálním nebo kyselém ph se riboflavin rozkládá za vzniku lumichromu (6,7-dimetylisoalloxazin) nebo v zásaditém prostředí za vzniku bezbarvého lumiflavinu (6,7,9-trimetylisoalloxazin) (Obr. 7). Oba flaviny jsou účinnější oxidační činidla než 2, 21,27 riboflavin. FMN a riboflavin mají funkci fotosenzibilizátorů, tzn., že předávají absorbovanou světelnou energii vzdušnému kyslíku, ze kterého vzniká singletový kyslík a ten oxiduje další organické sloučeniny. Jednoelektronovou redukcí riboflavinu vznikají dvě formy radikálu riboflavinu, červený anion a modrá neutrální molekula tzv. flavosemichinon. Redukovanou, téměř bezbarvou formou při enzymových oxidoredukčních reakcích je 1,5-dihydroriboflavin, který se spontánně oxiduje vzdušným kyslíkem na riboflavin. Další redukovanou formou je 4,5-dihydroriboflavin. 24,30 Obr. 7: Fotodegradace riboflavinu 7 V biochemických systémech se riboflavin vyskytuje jako volný, ale hlavně ve formě flavinmononukleotidu (FMN) a flavinadenindinukleotidu (FAD) (obr. 8). FMN a FAD jsou pevně vázány na proteinové apoenzymy ve formě prostetické skupiny, což znamená, že nedisociují ani při izolaci a purifikaci enzymu. Jsou připojeny kovalentní vazbou, deriváty riboflavinu mají funkci jako kofaktory vázané na 30 až 40 enzymů, označovaných jako flavinové enzymy, obecněji jako flavinoproteiny. Flavinové 23

kofaktory jsou širokospektrální katalyzátory v biologických oxidačně redukčních systémech. FMN je syntetizován v organismech enzymem riboflavinkinázou či riboflavotransferázou. 2, 24,28,29 riboflavin + ATP á riboflavin-5-fosfát + ATP riboflavin + riboflavin-5-fosfát á FMN + glukóza FAD vzniká z FMN adenylací účinkem FMN-adenyltransferázy: FMN + ATP á FAD + PP1 Obr. 8: Struktura FAD a FMN 8 FAD a FMN hrají významnou roli při metabolismu sacharidů, lipidů a proteinů. Oba flavinové kofaktory jsou v oxidované formě žluté. Jako vlastní přenašeč vodíkových atomů působí isoalloxazinový kruh, na jehož dva atomy dusíku se připojují dva atomy vodíku za vzniku hydrochinoidní struktury. Při této redukci mizí žluté zbarvení. Oxidovaná a redukovaná forma se liší jak barvou, tak i absorpčními spektry, čehož se využívá při fotometrickém sledování. 24,28 FAD a FMN jsou koenzymy či prostetickými skupinami různých dehydrogenáz a oxidáz. Jsou to akceptory vodíkových atomů z redukovaných forem pyridinových koenzymů a vstupují do reakcí, ve kterých je přenášen kyslíkový atom. Působením enzymů je vodík 24

přenášen na prostetickou skupinu. Pro aktivaci enzymu, aby enzym mohl plnit svou katalytickou funkci, musí být flavinový systém opět oxidován. Tato reakce probíhá na téže bílkovině, nejčastěji zapojením dalšího enzymového systému. Flavinové enzymy mohou působit jako aerobní dehydrogenázy přímým přenosem vodíku na kyslík za vzniku peroxidu 2, 24,30 vodíku. 7.3 Doporučená denní dávka, příznaky deficitu Výše doporučené denní dávky závisí na obsahu bílkovin a energetické hodnotě potravy, vzhledem k působení riboflavinu v energetickém metabolismu a metabolismu bílkovin. Jeho množství by mělo být v souladu s energetickým výdajem a tělesnou hmotností konzumenta. Doporučená denní dávka pro dospělého člověka je v rozmezí 1,1 až 1,3 mg den -1 Nedostatek samotného riboflavinu se vyskytuje vzácně. Nedostatečná saturace riboflavinu, která trvá déle, než 100 dní vede k hypovitaminóze. Ragády ústních koutků, malinový jazyk jako určitý druh zánětu jazyka, keratitidy, dermatitidy a nervové poruchy mohou být projevem nedostatku riboflavinu, ale mohou být také vyvolány jinými faktory. Často jde o současný nedostatek kyseliny nikotinové, popřípadě dalších vitaminů skupiny B. Hypovitaminosa může být také způsobena stresem organismu, nemocemi štítné žlázy, záněty tenkého střeva, při chronické konzumaci alkoholu a při nedostatečném příjmu tuků. Avitaminosa se v organismu člověka projevuje drobnými trhlinkami v koutcích úst a charakteristickým prorůstáním drobných cév rohovkou. Nejsou známy žádné nepříznivé účinky způsobené nadbytkem v organismu riboflavinu. 2,21,24,27 7.4. Výskyt riboflavinu Riboflavin se vyskytuje zejména jako FMN a FAD, méně pak jako volný, např. v syrovátce, v moči. Vyskytuje se v rostlinných i v živočišných potravinách. V živočišných zdrojích se riboflavin vyskytuje v mléce, játrech, mléčných výrobcích, ledvinách, masu, vejcích a některých mořských rybách U rostlinného zdroje se riboflavin málo vyskytuje v ovoci a zelenině, jeho obsah je nízký. Bohatým zdrojem riboflavinu jsou obiloviny a luštěniny, např. pohanka, obilné klíčky, ovesné vločky, čočka, fazole, hrách, ze zeleniny růžičková kapusta a také kvasnice a houby. Riboflavin je v malém množství i v běžném 25

pečivu a cereálních výrobcích, ve vyšším množství se nachází v celozrnných výrobcích. Vitamin B 2 můžeme nalézt také v pivu. 2,21 7.5. Charakteristika piva Pivo jako alkoholický nápoj provází člověka dlouhou historií. V pivu jsou přítomné těkavé produkty lihového kvašení a extraktivní látky. Mezi těkavé řadíme oxid uhličitý, alkoholy, především etanol. Ze skupiny aldehydů v pivu je obsažen acetaldehyd, z těkavých kyselin kyselina mravenčí a octová, dále v sobě obsahuje malé množství sirné sloučeniny. 35 Mezi extraktivní látky patří sacharidy, dusíkaté látky, glycerol, minerální látky, např. sodné a draselné soli, křemičitany, dále třísloviny, barviva a organické netěkavé látky. Pivo obsahuje v sobě i mnoho vitaminů, skupiny B, např. B 1, B 2, dále obsahuje kyselinu listovou. 32 7.6. Stanovení riboflavinu V současné době se stanovuje riboflavin přístroji, jako jsou HPLC, CE-LEDs, lumiflavinová metoda, mikrobiologické metody, TLC a CE. Tyto zkratky byly vysvětleny výše. Pro stanovení riboflavinu byla použita metoda HPLC s fluorescenční detekcí vyvinutou pro rutinní stanovení riboflavinu v nápojích. 33 Vzorky nápojů byly po filtraci nastříknuty na kolonu. Jako mobilní fáze byl použit dihydrogenfosforečnan sodný (ph 3,0) a acetonitril (80 : 20) v/v s gradientovou elucí. V této metodě byla excitační vlnová délka 265 nm a emisní vlnová délka 525 nm. Autoři právě využili prekoncentraci s CE (MEKC), aby mohli použít méně citlivý detektor s LED jako budící zdroj. 34 Pro stanovení riboflavinu v pivu byla i použita metoda CE-LEDIF. Při separaci riboflavinu z 12 - ti druhů piv došli k závěru, že optimální podmínkou pro analýzu riboflavinu je použití 100 mm roztoku tetraboritanu sodného (ph 8,2) pro úpravu pozadí a nástřik vzorku by měl být dlouhý 10,6 cm. Prekoncentrace v této metodě byla nutná, aby byla dosažena vysoká citlivost. Koncentrace byla zjištěna v rozmezí 130 280 ng ml -1. 26

U lumiflavinové metody se vzorek nejdřív hydrolyzuje buď kyselou hydrolýzou za přítomnosti kyseliny chlorovodíkové či enzymaticky pepsinem s následnou extrakcí chloroformem. 2,35 Ozařováním extraktu UV zářením v zásaditém prostředí je od riboflavinu odštěpen ribózový zbytek a tak vzniká lumiflavin. Extrakt je měřen fluorimetricky při vlnových délkách primárního záření 435,8 nm a sekundárního záření 525 nm. Obsah riboflavinu je určován pomocí kalibrační křivky. Tato metoda je vhodná pro běžné stanovení riboflavinu v potravinách. U mikrobiologické metody se nejčastěji používají bakterie druhu Lactobacillus casei, neboť se během stanovení riboflavinu sleduje růst bakterií na základě obsahu přítomného riboflavinu. 21,36 Pokud je riboflavin přítomen, projeví se to úměrným obsahem sušiny, obsah se stanovuje vážkově či turbidimetricky měřením zákalu. Pomocí chromatografie na tenké vrstvě stanovili Glisczynska a kolektiv obsah riboflavinu a jeho derivátů. 36 Separace byla provedena na silikagelové a celulózové desce. Byla při tom použita vyvíjecí mobilní fáze: n-butanol : ledová kyselina octová: voda (0,2: 0,1: 0,1) v/v. Pomocí této metody se povedlo stanovit jednotlivé flavinové deriváty. První stanovení riboflavinu v potravinách rostlinného původu pomocí metody CE- LIF byla zjištěna italskými vědci. 36,37 Nejprve se prováděla extrakce flavinů, pak k nim byla přidána směs metanol : metylenchlorid v poměru 9:10, Poté byly okyseleny octanem sodným a odstřeďovány. Tyto supernatanty byly odfiltrovány před elektroforetickou separací. 27

8. Cíl práce Cílem bakalářské práce bylo seznámení se s přístrojem pro CE LIF a pochopení principu metody. Cílem experimentální části byla vyzkoušení CE metody pro stanovení standardního vzorku riboflavinu a případné optimalizace a ověření reprodukovatelnosti výsledků měření riboflavinu, následně pak využití těchto poznatků pro složitější stanovení riboflavinu v pivu. Těchto cílů mělo být dosaženo s využitím cenově dostupné 405 nm LD. Otázkou je, zda bude dosažený LOD dostatečně nízký pro přímé stanovení riboflavinu v pivu bez jakékoli prekoncetrace. 28

Experimentální část 9. Materiály a metody Chemikálie Chlorid sodný, (NaCl, Lachema, Česká republika) Riboflavin - 98,8% (C 17 H 20 N 4 O 6 ; Sigma Aldrich, Steinherin, Německo) Dodekahydrát hydrogenfosforečnanu sodného (Na 2 HPO 4 12H 2 O, Merck, Česká republika) Hydroxid sodný, p.a. (NaOH, Lachema, Česká republika) Kyselina octová (CH 3 OOH, Merck, Česká republika) Octan sodný, p.a. (CH 3 OONa 3H 2 O, Lachema, Česká republika) Pro přípravu roztoků byla použita voda redestilovaná v křemenné aparatuře od firmy Haraeus (Německo) Vzorky piva K analýze piv bylo použito šest druhů. (Tabulka č. 1) Značka Typ Druh Obsah alkoholu [%] Staropramen Ležák Světlé Chmelové 5 Ležák Světlé Chmelové 5 Starobrno Řezák Polotmavé Karamelové 4 Medium 11% Chmelové 4,7 Tradiční Světlé Chmelové 4 Tabulka č. 1: Přehled analyzovaných piv 10. Přístroje a programové vybavení Digitální váhy (model WAX 40/160, RADWAG RADOM; Polsko) Sonikátor (NOTUS-POWERSONIC s.r.o., Vráble, Slovenská republika) ph - metr (model 720A; ORION, Česká republika) 29

CE-LIF (Katedra analytické chemie PřF MU, Česká republika) Software: program CE-LIF vytvořený v prostředí LabVIEW v 6.1 Všechny výsledky byly zpracovány programem MS Excel 2007 (Microsoft, USA) Fluoromax 3 (model TCSPC, HORIBA Jobin Yvon, USA) Software: program FluorEssence TM Výsledky byly zobrazovány v programu Origin85View, poté zpracovány v programu MS Excel 2007(Microsoft, USA) 11. Přístroj CE-LIF Přístroj CE-LIF byl navržen Dr. Preislerem, a zkonstruován Ing. Krásenským a Mgr. Vrábelem na Katedře analytické chemie PřF MU Brno. CE-LIF obsahuje zdroj napětí, které je vybavené digitálním ukazatelem napětí a proudu. Zdroj poskytoval výstupní napětí v rozmezí 0 15 kv, maximální hodnota proudu dosahovala 100 μa. Vysoké napětí je vyvedeno kabelem do dávkovací vialky s pufrem, druhý konec kabelu byl uzemněn. Pro analýzu byla používána nemodifikovaná křemenná kapilára o celkové délce 37 cm s efektivní délkou 30 cm a průměrem kapiláry: i.d. (inner diameter, neboli vnitřní průměr) 50 μm, o.d. (outer diameter, vnější průměr) 375 μm. Kapilára je na obou koncích zavedena do zásobních vialek s pufrem a elektrodami. K dávkování slouží plastový držák (karusel) se čtyřmi otvory pro umístění vialek se vzorkem a pufrem a základním elektrolytem. Oproti původní CE LIF byl nahrazen laser 532 nm laserem 405 nm. Zdrojem záření je modul s laserovou diodou (SHM 405-7, ROITHNER LASER TECHNIK, Rakousko) záření o vlnové délce 405 nm. Je zaostřeno křemennou čočkou o ohniskové vzdálenosti 100 mm do středu kapiláry umístěné na mikrometrickém stojanu. Při měření 2. 3. 2011 byl naměřen výkon 23 mw. Laserový paprsek dopadá na křemennou kapiláru zbavenou ochranného polyimidového povlaku. Rozptýlené záření je pohlcováno černými stěnami přístroje a stínítky a štěrbinami z černého papíru, které jsou udělané tak, aby se do mikroskopového objektivu kolmo na laserový paprsek dostalo jen záření fluoreskujícího analytu. Interferenční filtry jsou umístěné před fotonásobičem a propouští jen světla vyšší než λ excit. 30

A Fluorescenční záření detekuje fotonásobič (R1414, Hamamatsu, UK). Signály, pocházející z fotonásobiče, jsou zaznamenávány programem CELIF s kartou USB-6211 (National instruments, Texas, USA), který byl vytvořen Dr. Kusým v prostředí Labview v 6.1 na Ústavu chemie Masarykovy univerzity. 12. Charakteristika fluorescenčních vlastností riboflavinu Výsledky a diskuze Před vlastním měřením bylo potřeba nastavit parametry pro získání co nejnižšího LOD. Mezi optimalizované parametry řadíme např. zaostření laseru do středu, umístění štěrbin, výběr filtrů. Intenzita fluorescence závisí i na vlnové délce zdrojového záření, tj. na tom, jak intenzivně analyt absorbuje excitační záření o dané vlnové délce. Závislost absorbance na vlnové délce je znázorněna na obr. 9. 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 400 440 480 520 λ[nm] Obr. 9: Absorpční spektrum modelového vodného roztoku riboflavinu o c = 10-7 M, ph = 5,1 31

Fluorescence [a.u.] 13. Nastavení přístroje CE-LIF 13.1. Fluorescenční vlastnosti riboflavinu Excitační spektrum nemusí být vždycky totožné se spektrem absorpčním. Excitační a emisní spektra jsou znázorněna na obr. 10 a 11. 6 5 4 3 2 1 0 400 420 440 460 480 500 520 λ [nm] Obr. 10: Excitační spektrum modelového riboflavinu o c = 10-7 M, ph = 6,1 32

Fluorescence [a.u.] Miliony 6 5 4 3 2 1 0 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 λ [nm] Obr. 10: Emisní spektrum modelového riboflavinu o c = 10-7 M, ph = 6,1 445 nm. Maximum emise bylo zjištěno při vlnové délce 520 nm, maximum excitace při Byly připraveny standardní roztoky o c = 10-7 M v rozmezí 3-10 ph. ph bylo upraveno pomocí NaOH. Na obr. 11 je znázorněna závislost intenzity fluorescence na ph. Cílem měření bylo zjistit průběh excitačních a emisních spekter a závislost fluorescence na ph. 33

Fluorescence [a.u.] Miliony 1,095 0,895 0,695 0,495 3 4 5 6 7 8 9 10 ph Obr. 11: Závislost fluorescence riboflavinu o c = 10-7 M na ph při λ excit = 525 nm a λ em = 445 nm 13.2. Fluorimetrické stanovení riboflavinu v pivu Účelem prováděného měření bylo porovnání výsledků měření přístrojem CE LIF a výsledků měření na fluorimetru. Princip metody fluorimetru byl vysvětlen v kapitole Fluorimetrie. Vzorky na fluorimetrické měření byly připraveny dle tabulky č. 2. Standardní vzorek riboflavinu byl naředěn na 10-6 M, pivo (Starobrno, ležák) nebyl zředěn. Pivo[μl] St.RF [μl] CH 3 OOH[μl] CH 3 OONa[μl] F (při λ emise =525nm) 15 0 150 150 15 10 150 150 15 20 150 150 567875,1 765875,1 1009690 Tabulka č. 2: Vzorky použité na fluorimetrické měření 34

Při použití přístroje fluorimetru byla zjištěna koncentrace vzorku piva zjištěna koncentrace 6,4 μg/l. Koncentrace vzorku piva byla vypočítána v programu MS Excel pomocí vztahu (16): ě (16) kde F pivo+st.rf je fluorescence piva se standardním přídavkem riboflavinu při vlnové délce λ emise = 525 nm se standardním přídavkem riboflavinu, F pivo fluorescence piva při vlnové délce λ emise = 525 nm, a Neznámá koncentrace piva byla vypočtena ze vztahu (17): ě (17) kde A pivo je průměrná plocha piva a c pivo koncentrace standardního přídavku riboflavinu. Následně byla koncentrace vynásobena molární hmotností riboflavinu. 13.3. Stanovení piva metodou CE - LIF 13.3.1. Metodika Nová kapilára byla inicializovaná 15 min. 0,1 M NaOH; 5 min. H 2 O; 15 min. 0,1 M HCl; 5 min. H 2 O a 15 min. BGE. Před každým prvním měřením dne byla kapilára promyta v následujícím pořadí: 10 min 0,1 M NaOH a 10 min fosfátovým pufrem o ph 9,3, jehož koncentrace byla 30 mm. Pufr před promytím a analýzou byl vždy odplyněn v ultrazvukové lázni. První analýza dne byla ověřovací se standardem riboflavinu o koncentraci 10-9 M. Po každé analýze byla kapilára promývána 10 min. fosfátovým pufrem. Vzorek byl dávkován elektrokineticky po dobu 5 s za dávkovacího napětí 15 kv. 35

13.3.2. Výběr vhodných filtrů Dalším důležitým parametrem byl výběr filtrů, který se bude používat na další měření standardů riboflavinů a piv. Filtry byly měřeny buď samostatně či v různých kombinacích. Naměřené hodnoty jsou zaznamenány v tabulce č. 2. λ 1/2 filtrů λ 1/2 LOD 435 38 1,3 10-10 435+475 30 2,2 10-10 455 19,5 1,8 10-10 455+435 35,5 1,2 10-10 435+455+475 24 1,8 10-10 475 16 2,1 10-10 455+475 30,5 1,4 10-10 Tabulka č. 2: Samostatné filtry a kombinace filtrů, výsledky LOD Vlnová délka λ 1/2 long-pass filtrů je vlnová délka, kdy je transaminace, T=50 % maximální transaminace, T max. Po měření standardního riboflavinu s různými filtry se určovalo, který filtr či kombinace filtrů je vhodné pro budoucí měření vzorků riboflavinu. Výsledky byly vyhodnocovány z hodnoty limitu detekce (LOD), nejnižší limit detekce vykazovala kombinace filtrů s λ 1/2 435 nm + 455 nm. Tato kombinace filtrů byla použita pro následné měření piva. 13.3.3. CE-LIF modelového (standardního) vzorku riboflavinu 13.3.3.1. Opakovatelnost měření Pro stanovení standardu riboflavinu byl zvolen separační pufr Na 2 HPO 3 o koncentraci 30 mm a ph= 9,3. Při vyšší ph je fluorescence stále dostatečná, lze očekávat výrazně kratší dobu separace. Již zmíněné ph fosfátového pufru bylo změřeno pomocí ph metru a nebylo upravované. Separační napětí na kapiláře bylo nastavené na hodnotu 12 kv, elektrický proud se pohyboval v rozmezí 44-46 μa. Dávkovaní vzorku bylo elektrokinetické po dobu t inj =5 s a dávkovací napětí bylo 15 kv. Vzorek riboflavinu byl připraven z navážky standardu, poté byl 36

Fluorescence [a.u.] zředěn na vybranou koncentraci. Na elektroforegramu (obr. 12) jsou patrné píky riboflavinu, které se objevují v migračním čase t mig = 2,31 min. Relativní směrodatná odchylka (RSD) píku v migračním čase je 5 %. Měření byla prováděna v průběhu jednoho dne. 1150 1130 1110 1090 1070 1050 1030 1010 990 970 0 1 2 3 4 5 6 t[min] Obr. 12: Opakovatelnost: elektroforegramy standardu riboflavinu c= 4,33 10-8 M 13.3.3.2. Stanovení limitu detekce standardu riboflavinu Měření bylo prováděno za stejných podmínek, které jsou definovány v metodice. Pro výpočet limitu detekce byl použit vztah (18): (18) kde σ je směrodatná odchylka šumu, c koncentrace riboflavinu a h výška píku analytu. Při použití elektrokinetického dávkování byla hodnota LOD = 6,3 10-9 M. Směrodatná odchylka šumu je část před píkem, byla vyhodnocována pomocí programu Microsoft Excel pomocí funkce SMOD. 37

Fluorescence [a.u.] 13.3.4. CE-LIF reálného vzorku Vzorek piva byl před analýzou odplyněn v ultrazvukové lázni po dobu 15 min, následovalo přefiltrování přes 0,45 μm filtr a stonásobné naředění vodou. 13.3.4.1. Reprodukovatelnost CE-LIF riboflavinu v pivu pomocí CE - LIF Po první ověřovací analýze na modelovém vzorku bylo přikročeno k analýze riboflavinu v pivu. Pro určení množství riboflavinu v pivu bylo důležité dosáhnout co nejlepší reprodukovatelnosti. Pro analýzu riboflavinu v pivu byly použity stejné podmínky separace jako pro standard. Dávkování bylo elektrokinetické. První měření probíhalo po dobu tří dnů. Vzorek byl naředěn stokrát bez jakékoliv další úpravy, tzn. pouze filtrování, lázně. Docházelo k odchylkám jak v migračním čase, tak v kolísání základní linie v důsledku matrice vzorku. Na elektroforegramu na obr. 15 se píky riboflavinu objevují v migračním čase t migr = 2,25 min. RSD migračního času činila 0,32%. 840 830 820 810 800 790 780 770 0 1 2 3 4 5 6 t [min] Obr. 15. : Elektroforegramy 10 x naředěného vzorku piva 38