Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd TEST ANTINUKLEÁRNÍCH PROTILÁTEK ( ANA)

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd TEST ANTINUKLEÁRNÍCH PROTILÁTEK ( ANA) Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: Doc. RNDr. Vladimír Semecký, CSc. Odborný školitel: MUDr. Markéta Haschová Hradec Králové, 2008 Eva Kondelíková

Prohlašuji, že jsem předloženou bakalářskou práci vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v seznamu použité literatury. V Plzni 18.2. 2009... Podpis

Děkuji Doc. RNDr. Vladimíru Semeckému,CSs., dále děkuji MUDr. Markétě Haschové za odborné vedení a všestrannou pomoc při vypracování této práce a své rodině za podporu ve studiu.

CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo popsat antinukleární protilátky jakožto komplex protilátek proti jaderným strukturám. Shrnout vyšetřovací metody a postupy a poukázat na nejčastější klinické asociace antinukleárních protilátek v klinické imunologii a revmatologii. Úvodní část práce je věnována vymezení základních pojmů, další popíše metodiky používané při stanovení ANA. Závěr je věnován klinické asociaci a obrazové příloze výsledků nepřímé imunoflourescence.

OBSAH OBSAH... 5 SEZNAM ZKRATE K... 6 1. ÚVOD... 7 2. AUTOIMUNITA... 8 2.1 AUTOIMUNITNÍ ONEMOCNĚNÍ... 9 2.2 KLASIFIKACE AUTOIMUNITNÍCH ONEMOCNĚNÍ... 10 2.2.1 ORGÁNOVĚ SPECIFICKÁ AUTOIMUNITNÍ ONEMOCNĚNÍ... 11 2.2.2 SYSTÉMOVÁ (ORGÁNOVĚ NESPECIFICKÁ) AUTOIMUNITNÍ... ONEMOCNĚNÍ... 15 3. ORGÁNOVĚ NESPECIFICKÉ AUTOPROTILÁTKY... 17 3.1 ANTINUKLEÁRNÍ PROTILÁTKY... 18 3.2 ANTI-DSDNA... 21 3.3 ANTI-NUKLEOSOMY... 22 3.4 ANTI-HISTONY... 22 3.5 EXTRAHOVATELNÉ NUKLEÁRNÍ ANTIGENY - ENA... 23 3.5.1 PROTILÁTKY ANTI-SS/A ( ANTI-RO )... 24 3.5.2 PROTILÁTKY ANTI- SS/B ( ANTI-LA )... 25 3.5.3 PROTILÁTKY ANTI-SM... 25 3.5.4 PROTILÁTKY ANTI-SCL-70... 26 3.5.5 PROTILÁTKY ANTI-JO-1... 26 4. METODY DETEKCE... 27 4.1 NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE... 28 4.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE IFA... 32 4.3 ELISA-ENZYMOVÁ IMUNOANALÝZA... 34 4.4 WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)... 37 4.5 HODNOCENÍ IMUNOBLOTING... 38 5. KLINICKÁ ASOCIACE... 39 5.1 SYSTÉMOVÝ LUPUS ERYTHEMATOSUS... 40 5.2 SJÖGRENŮV SYNDROM... 42 5.3 SYSTÉMOVÁ SKLERODERMIE... 43 6. OBRAZOVÁ PŘÍLOHA... 44 ZÁVĚR... 52 SEZNAM LITERATURY... 53 5

SEZNAM ZKRATEK ANA dsdna ELISA ENA FITC GAD GBM HEp-2 IA IF IFA LE-buňky RNP Scl SLE Sm SS antinukleární protilátky dvoušroubovice DNA enzymová imunoanalýza na imunosorbentech extrahovatelné nukleární antigeny fluorescein izothyocyanát dekarboxyláza kyseliny glutamové glomerulární bazální membrána buněčná linie lidského nazofaryneálního karcinomu protilátky proti Langerhansovým ostrůvkům vnitřní faktor nepřímá imunoflourescence polymorfonukleární leukocyty, které fagocytují uvolněný jaderný materiál jiných leukocytů ribonukleoprotein sklerodermie systémový lupus erythematodes Smithův antigen Sjögrenův syndrom 6

1.ÚVOD Historie antinukleárních protilátek začala již v roce 1948, kdy byly Hargravesem popsány LE-buňky. Detekce LE-buněk se velmi rychle stala důležitou laboratorní metodou průkazu systémového lupusu a navíc bylo možné tyto buňky vzácně najít i u revmatické artritidy nebo sklerodermie. Od roku 1957 bylo stanovení LE-buněk nahrazováno jednodušší metodou nepřímou imunofluorescencí, která zachycuje mnohem širší spektrum antinukleárních protilátek ( ANA ). V šedesátých letech umožnily metody imunodifúze přesnější detekci nových autoprotilátkových specifit, např. anti-sm, anti-rnp, anti-ss-a nebo anti-ss-b. Zavádění dalších specializovaných vyšetřovacích postupů, jako je imunoblotting nebo radioaktivní imunoprecipitace, vedlo k určení několika desítek dalších ANA a zároveň také napomohlo k poznání funkce a struktury příslušných autoantigenů. Tyto autoantigeny často plní v buňce důležitou úlohu při uchování genetické informace, dělení buňky či proteosyntéze. Příkladem mohou být jaderné ribonukleoproteiny, které mají zásadní úlohu při zpracování nezralé informační RNA a které jsou cílem pro anti-sm či anti-nrnp protilátky. 7

2. AUTOIMUNITA Klasická definice autoimunity, která nám říká že imunitní systém odpovídá tvorbou autoprotilátek a autoreaktivních T-lymfocytů na vlastní antigeny, v dnešní době již neplatí 1. Autoimunita je většinou charakterizovaná jako imunopatologický proces, při kterém vzniká neregulovaná imunitní odpověď proti vlastním orgánům a tkáním 2,3. Je třeba si uvědomit, že ne vždy se jedná o patologický proces, či poruchu. Autoimunitními mechanismy jsou odstraňovány i poškozené a nefunkční buňky organismu. Pouze v některých případech se tato funkce patologicky rozšíří na funkčně normální buňky nebo orgány 4. Pod pojmem autoimunita lze v dnešní době zahrnout dva stavy autoreaktivitu a autoagresivitu. Autoreaktivita se považuje za fyziologickou a nutnou součást imunitních mechanismů. Má v zásadě obrannou a regulační funkci potřebnou pro udržování genetické dispozice každého jedince. Autoagresivita je imunopatologický stav, který může mít přechodnou povahu nebo povahu postupně se zvyšující poškození tkáně nebo orgánu. Rozdělení autoimunity na autoreaktivní a autoagresivní má za následek, že průkaz autoprotilátek nelze považovat za jediný důkaz autoimunitní choroby - tzv. Witebského kritérium. Po určení tohoto kritéria lze onemocnění označit za autoimunitní chorobu. Witebského kritérium zahrnuje: 1. Určení cíle. Určit, který orgán či buňka je napadena. 2. Určit mechanismy, které jsou zodpovědné za napadení vlastních tkání. 3. Experimentální důkaz. Zdravé zvíře je imunizováno látkou aktivující reakci a příslušným autoantigenem. Dojde k tvorbě autoprotilátek proti určité tkáni, která se stala cílem útoku při určitém onemocnění. 4. Vznik autoimunitního onemocnění je vyvolané přenosem protilátek z nemocného zvířete na zvíře zdravé 1. 8

2.1 AUTOIMUNITNÍ ONEMOCNĚNÍ Na vzniku autoimunitního onemocnění se podílí řada faktorů, které můžeme rozdělit na vnitřní a vnější. Jedním ze základních vnitřních faktorů je genetická predispozice. 1 Většina autoimunitních chorob je dědičná, záleží však na dalších, většinou vnějších faktorech, zda se projeví. Pokud se tak stane, tak působením zevních činitelů, mohou vznikat patologické pochody, které jsou charakterizovány abnormální reakcí na endogenní antigeny. Závisí na mnoha okolnostech, např. na věku pacienta či na jeho přidružených chorobách 5, který z imunologických mechanismů probíhá. Podíl na vzniku onemocnění má zajisté i hormonální regulace. Spouštěcí mechanismy onemocnění mohou být faktory biologické (infekce), fyzikální (UV záření) nebo chemické. Jednotlivé spouštěcí mechanismy se však liší případ od případu. Podmínkou pro vznik autoimunitních chorob je prolomení mechanismů autotolerance a přeměna fyziologické autoimunity v patologickou. Autoimunitní onemocnění postihuje asi 5-8 % populace, což je z medicínského hlediska považováno za velmi významnou část. Závažnost nemoci spočívá v tom, že jsou postiženi především jedinci mladšího věku a dále ženy v reprodukčním období 6. Ženský imunitní systém je mnohem efektivnější než imunitní systém mužů. To je způsobeno především hormonální regulací, kdy u žen se hormonální hladiny během života mění a to má za následek, že se u nich častěji vyskytují autoimunitní onemocnění než u mužů 7. 9

2.2 KLASIFIKACE AUTOIMUNITNÍCH ONEMOCNĚNÍ Autoimunitní onemocnění může postihovat jakýkoliv orgán či tkáň lidského těla. Jedná-li se o autoimunitní onemocnění postihující pouze jeden orgán, mluvíme o orgánově specifickém onemocnění. Autoreaktivita vůči antigenům je omezena pouze na jeden orgán 1,6. V případě, že je postiženo více orgánů nebo tkání, jedná se o orgánově nespecifické (systémové) onemocnění 1,2. Mezi těmito dvěma kategoriemi stojí imunopatologické choroby, u nichž je postižen převážně jeden orgánový systém, avšak jsou provázeny celou řadou systémových příznaků. U těchto chorob se vyskytují většinou orgánově nespecifické autoprotilátky, které se využívají jako pomocný diagnostický znak. U orgánově specifických autoimunitních chorob vedou k poškození obvykle cytotoxické mechanismy zprostředkované autoprotilátkami nebo autoreaktivními lymfocyty a jejich produkty (II. a IV. typ reakce přecitlivělosti). V jednotlivých fázích vývoje onemocnění, se mohou uplatňovat oba typy reakcí. U systémových orgánově nespecifických chorob převažuje poškození zprostředkované imunokomplexy, které jsou tvořeny autoprotilátkou s autoantigenem (III. typ). Pouhý nález autoprotilátek v séru nemusí znamenat, že se jedná o autoimunitní onemocnění, je však pravdou, že u některých chorob je tento nález diagnostickým kritériem 6. 10

2.2.1 ORGÁNOVĚ SPECIFICKÁ AUTOIMUNITNÍ ONEMOCNĚNÍ Autoimunitní reakce je u těchto chorob namířena proti strukturám specifickým pro daný orgán. Diagnostické jsou autoprotilátky v séru proti cílovým autoantigenům příslušných tkání. Na destrukci tkáně se podílejí cytotoxické reakce zprostředkované protilátkami nebo buňkami (II. a IV. typu). U některých chorob se uplatňují také stimulační nebo blokující autoprotilátky. U pacientů s lokalizovanými autoimunitními chorobami se často vyskytují v séru protilátky proti různým orgánům 6. Onemocnění obvykle diagnostikuje a léčí specialista příslušného oboru. Záleží na tom, ve které orgánu nebo tkáni dochází k autoimunitní reakci. Důležité je vyšetření orgánově specifických protilátek 5. Přehled autoimunitních orgánově specifických chorob uvádí tab.č. 1 a přehled orgánově specifických protilátek tab.č. 2 ( tabulka je rozdělena na dvě části ) 11

Tab.č. 1 Přehled autoimunitních orgánově specifických chorob 5 SKUPINA Autoimunitní endokrinopatie Autoimunitní neurologická onemocnění Autoimunitní cytopenie Autoimunitní kožní onemocnění Autoimunitní oční onemocnění ONEMOCNĚNÍ Hashimotova thyreoditida Gravesova-Basedowova choroba, tyreotoxikóza juvenilní diabetes mellitus Addisonova choroba atrofická gastritida a perniciózní anémie autoimunitní poruchy reprodukce a syndrom předčasného ovariálního selhání autoimunitní polyglandulární syndromy myasthenia gravis periferní demyelinizační neuropatie roztroušená skleróza hemolytická anemie trombocytopenie neutropenie pemphigus psoriáza ( lupénka ) uveitida 12

Tab.č. 2 Přehled autoimunitních orgánově specifických protilátek 8 AUTOPROTILÁTKA CHARAKTERISTIKA a-parientální buňky a-if a-gbm a-bazální membrána epidermis a-desmozomy a-pohárkové buňky ICA a-gad protilátky proti parientálním buňkám, postiženo je téměř 80% dospělých pacientů s perniciózní anemií a chronickou gastritidou, protilátky způsobují sníženou sekreci HCl a gastritidu IF ( vnitřní faktor ) jedná se o glykoprotein vážící se k vitamínu B12, který zabraňuje k rychlému rozkladu, výskyt je 55-70% u perniciózní anemie protilátky proti bazální membráně glomerulů (GBM), detekce slouží k diagnostice nefropatií a glomerulonefritid výskyt u autoimunitních chorob kůže, protilátky namířené proti bazální membráně mezi dermis a epidermis charakteristické pro pemfigus, přítomnost substancí v určitých epiteliálníh buňkách protilátky proti pohárkovým buňkám střeva se vyskytují především při ulcerózní kolitidě a dalších zánětlivých střevních onemocněních vyšetření protilátek proti buňkám Langerhansových ostrůvků pankreatu ( ICA=islet cell antibodies ) slouží k diferenciální diagnostice diabetu I typu, mají screeningový význam protilátky proti dekarboxyláze kyseliny glutamové, vysoce citlivý marker, ale málo specifický, specifitu lze 13

zvýšit dalšími markery, např. autoprotilátky proti inzulínu Tab.č. 2 Přehled autoimunitních orgánově specifických protilátek 8 AUTOPROTILÁTKA CHARAKTERISTIKA a-ia-2 a-kůra nadledvinek a - štítná žláza a-testes antigen Langerhansových ostrůvků 2, protein tyroxin fosfatáz, výskyt je u 50-80% pacientů s nově diagnostikovaným diabetem I.typu a u 2-5% jejich příbuzných, detekce je pouze u poloviny pacientů u kterých dojde k rozvoji diabetu I.typu výskyt u 60-75% pacientů s idiopatickou Addisonovou chorobou, která bývá pozorována u perniciózní anemií, Sjögrenova syndromu, Hashimotovy thyreoiditidy při autoimunitním onemocnění štítné žlázy dochází k tvorbě protilátek proti thyreoglobulinu (anti-thr,anti-tg) a proti thyreoidální peroxidáze (mikrosomální peroxidáze, anti-tpo); protilátky proti štítné žláze jsou nejčastější autoprotilátky v populaci; výskyt je častější u žen, lze je detekovat u 10% zdravé populace; protilátky proti thyreoglobulinu a TPO jsou přítomny u pacientů s chronickou thyreoiditidou, autoimunitními onemocněními; anti-thr protilátky nalézáme také u hypothyreoidních pacientů v 70 % a u Gravesovy choroby ve 40%; u Hashimotovy thyreoiditidy se vyskytují anti-thr ve 40-70%, anti-tpo v 90-100% výskyt u endokrinopatiích, tvorba širokého spektra protilátek proti buňkám produkujícím steroidy 14

2.2.2 SYSTÉMOVÁ (ORGÁNOVĚ NESPECIFICKÁ) AUTOIMUNITNÍ ONEMOCNĚNÍ Jedná se o nemoci postihující více druhů buněk, tkání či systémů. Dochází k selhání mechanismů tolerance a k rozvoji imunopatologických reakcí vůči vlastním buňkám, tkáním či orgánům. Při poškození vznikají imunokoplexy obsahující autoprotilátku s jaderným autoantigenem, které se usazují v tkáních, kde způsobují zánětlivé procesy 5. Přehled systémových onemocnění uvádí tabulka č. 3 15

Tab.č. 3 Přehled autoimunitních systémových (nespecifických) chorob 5 ONEMOCĚNÍ CHARAKTERISTIKA Systémový lupus erythematodes multiorgánové systémové onemocnění postihující převážně ženy v reprodukčním období Revmatoidní artritida zánětlivé postižení kloubů, postiženy jsou převážně ženy, existují i juvenilní formy Dermato-polymyozitida onemocnění svalů a kloubů Sjögrenova choroba onemocnění postihující 9x častěji ženy než muže, autoimunitní zánět postihující žlázy s vnější sekrecí Systémová sklerodermie dochází k fibróze kůže a orgánů, ženy jsou postiženy 3x častěji než muži, existují i juvenilní formy Smíšená choroba pojiva podobné onemocnění jako sklerodermie s mírnějším průběhem Antifosfolipidový syndrom 1. u 5 % ženské populace opakované spontání aborty nejasného původu 2. trombózy 3. trombocytopenie 4. přítomnost antifosfolipidových protilátek nebo lupus antikoagulans široká skupina onemocnění postihující cévní Vaskulitidy systém, kdy dochází k zánětům a nekróze cév, to má za následek, že může být postižen jakýkoliv orgán, nejčastěji jsou to ledviny, plíce nebo kůže Sarkoidóza onemocnění postihující především plíce, u této nemoci však není dosud identifikována typická autoprotilátka 16

3. ORGÁNOVĚ NESPECIFICKÉ AUTOPROTILÁTKY 17

3.1 ANTINUKLEÁRNÍ PROTILÁTKY Jako antinukleární protilátky (ANA) označujeme celý soubor autoprotilátek, které jsou namířeny proti orgánově nespecifickým buněčným antigenům vyskytujících se převážně v jádře, ale můžeme je nalézt i v cytoplazmě. Dosud bylo popsáno přes 100 různých antigenů. První popsané ANA byly LE buňky, což jsou polymorfonukleární leukocyty, které fagocytují uvolněný jaderný materiál jiných leukocytů. Od roku 1957 bylo stanovení LE buněk nahrazováno jednodušší metodou nepřímé imunofluorescence (viz.kap. metody detekce). Tabulka č. 4 udává nejčastější antigenní struktury v buňce, které jsou cílem pro antinukleární protilátky 9. Nízké titry ANA lze nalézt i u některých zdravých jedinců, zejména ve vyšším věku (až ve 20-25 %). Většinou se jedná o nízké hladiny málo afinních autoprotilátek izotypu IgM. Je třeba si uvědomit, že pouhá přítomnost autoprotilátky není diagnostickým ukazatelem a je nutné brát v úvahu nejen průkaz pouhé autoprotilátky, ale také v jaké kombinaci se tyto protilátky vyskytují 10. Pomocí vyšetření ANA lze detekovat protilátky proti antigenům jádra (DNA, histony, nukleoproteiny). Dále pak protilátky proti ostatním částem buňky jako je cytoplazma, mitochondrie, skelet, mikrosomy, lysosomy, peroxisomy, Golgiho aparát. Jejich stanovení je důležitým diagnostickým kritériem při výskytu klinických známek systémového imunopatologického onemocnění a jejich nepřítomnost v mnoha případech silně zpochybňuje tuto diagnózu. Vyšetření ANA slouží k diagnostice a monitorování léčby především systémového lupusu erythematodu (SLE), Sjögrenova syndromu (SS), revmatoidní artritidy (RA), dermatomyositidy, polymyositidy, systémové sklerózy. Falešně negativní výsledek lze obdržet při užívání kortikosteroidů. V nízkých titrech mohou být ANA protilátky přítomny i u dalších imunopatologických stavů jako jsou systémové vaskulitidy, infekce, malignity, endokrinopatie, roztroušená skleróza, chronická plicní a hematologická onemocnění a hepatopatie. Pozitivní ANA lze detekovat rovněž při užívání 18

některých léků (acylpyrin, sedativa, antikoncepce, antibiotik atd.). Slabou pozitivitu lze nalézt asi u 10-25% osob starších 60 let 11. Přítomnost ANA je nálezem u téměř 100% nemocných se SLE, smíšeným onemocněním pojiva a lupusu indukovaného léky. Dále jsou nálezem až u 80 % nemocných se sklerodermií, 60 % nemocných se Sjörgenovým syndromem a 50 % nemocných s revmatoidní artritidou a vaskulitidou. Detekce jednotlivých druhů autoprotilátek je komplexní úkol, při němž je v ideálním případě zapotřebí využít několika testů, které se vzájemně doplňují, a interpretovat výsledky při znalostech předností a nevýhod jednotlivých metod. Mikroskopické vyšetření ANA nepřímou imunofluorescencí by mělo být první screeningovou metodou, na kterou by v případě pozitivity mělo navazovat vyšetření ANA některou ze složitějších a přesnějších metod vedoucích k určení přesné protilátkové specifity. Při použití lidských proliferujících buněk, kultivovaných a zafixovaných na podložních sklech (např. Hep-2 buňky z lidského laryngeálního karcinomu), je možno odečítat různé typy fluorescence tak, jak různé autoprotilátky reagují s různými komponentami buněk. Většina těchto obrazů neurčí jednoznačně některou z autoprotilátek, ale může napomoci při dalším vyšetřování. Rozeznáváme několik typů fluorescence: homogenní, skvrnitá, nukleolární a některé s dalšími podtypy. Typ fluorescence závisí nejen na druhu fluorescence, ale také na jejím množství. U některých pacientů se může vyskytnout více autoprotilátek současně 13. Jedním s hlavních antigenních cílů je DNA. ANA reaguje buďto s denaturovanou jednořetězovou ssdna nebo nativní dvoušroubovicí dsdna. Pro diagnostiku SLE je specifická spíše dsdna (95 %) k průkazu se využívá imunofluorescenční test a ke kvantitativnímu stanovení je možné použít techniku ELISA (viz.kap. metody detekce) 12. 19

Tab. č. 4 Nejčastější antigenní struktury v buňce 9 1. jaderná membrána a jaderné póry 2. různé součásti cytoplasmy, především enzymy 3. DNA, histony, nehistonové chromozomální proteiny 4. RNA, především v komplexu s proteiny, jedná se ribonukleoproteiny ( RNP ) 5. jaderná tekutina, obsahující řadu rozpustných antigenů 6. jaderná matrix, která je fibrilární kostrou jádra 7. jadérko Obr. č. 1 Schéma hlavních antigenních struktur, které jsou cílem pro ANA 12 mitotický aparát dsdna centromery ssdna ANTINUKLEÁRNÍ PROTILÁTKY SSB/La SSA/Ro Jo-1 Scl-70 ENA U-RNP histony Sm 20

3.2 ANTI-dsDNA Pomocí vyšetření anti dsdna protilátek lze detekovat heterogenní protilátky namířené proti různým epitopům na molekule nativní dvouvláknové DNA. Vyšetření se provádí pomocí nepřímé fluorescence, kde jako substrát je využíván kinetoplast bičíkovce Crithidia luciliae, který je tvořen čistou dvouvláknovou DNA. Test se vyznačuje vysokou specifitou 11. Jsou-li ve vyšetřovaném séru přítomny protilátky proti dsdna dochází k fluorescenci kinetoplastu. Test je velmi specifický, ale nepříliš senzitivní. ELISA se pro detekci protilátek doporučuje pouze pro sledování hladiny anti-dsdna u pozitivních pacientů 14. Vyšetření slouží k diagnostice a monitorování léčby především u SLE. U pacientů s přítomností těchto autoprotilátek se z pravidla vyvine nefritida. Tyto autoprotilátky jsou přítomny asi u 60% SLE pacientů. Silně pozitivní nález je typický pro neléčený SLE. Léčba kortikoidy pozitivitu snižuje. Stanovení anti-dsdna je vhodné doplnit o vyšetření metodou ELISA, nebo imunoblotting, vyšetření protilátek proti nukleosomům a protilátek proti histonům 11. 21

3.3 ANTI-NUKLEOSOMY Nukleosomy zahrnují definovaný úsek dsdna (146 párů bazí) a histony. Tento test nahrazuje stanovení anti-dnp (autoprotilátky proti deoxyribonukleoproteinu). Protilátky proti nukleosomům jsou detekované v sérech pacientů se SLE, specifita tohoto ELISA testu je téměř 100%. Pacienti trpící sklerodermií, Sjögrenovým syndromem nebo polymyozitidou nevykazují zpravidla v testu a-nukleosomy žádnou reakci. Tento marker je citlivější než konvenčně užívané dsdna (60-90% prevalence pro SLE) 15. V současné době jsou nukleosomy považovány za hlavní imunogen v patogenním procesu lupusové nefritidy, imunokomplexy obsahující nukleosom se vážou na bazální membránu glomerulů, kde způsobují tkáňové léze. Antinukleosomální protilátky se vyskytují ještě dříve než se objeví protilátky proti DNA a histonům 11. 3.4 ANTI-HISTONY Histony jsou polypeptidy buněčných jader a mohou se proti nim tvořit antihistonové protilátky 2. Protilátky proti histonům představují důležitý marker SLE s pozitivitou u 20-50 % pacientů 11. Autoprotilátky proti histonům se vyskytují především léky navozeného lupusu a slouží k rozlišení polékového a idiopatického lupusu. Nacházejí se také u SLE ( 30-50 % ), RA ( 20 % ) a lupusové nefritidy 15. 22

3.5 AUTOPROTILÁTKY PROTI EXTRAHOVATELNÝM NUKLEÁRNÍM ANTIGENŮM-ENA Vyšetření patří k základnímu vyšetření autoprotilátek při podezření na autoimunitní onemocnění. Při pozitivitě ENA screeningu následuje ENA typizace (konfirmace) jinou metodou např. ELISA, imunoblotting, které umožní stanovit konkrétní autoprotilátku 15. ENA screening zahrnuje stanovení protilátek proti směsi jaderných proteinů, zejména proti RNP a enzymům. Směs antigenů obsahuje antigeny: Sm (anti-smith), RNP (ribonukleoprotein), SS/A (anti-ro, protilátky proti ribonukleoproteinu), SS/B (anti-la, protilátky proti fosfoproteinu), Scl-70 (protilátky namířené proti enzymu topoizomeráze), Jo-1 (protilátky proti enzymu histidyl-trna syntetáze). Typizace ENA stanovuje nejčastější a nejvýznamnější extrahovatelné jaderné antigeny, jejichž nález se může vyskytovat u autoimunitních onemocnění i v kombinaci 11. 23

3.5.1 PROTILÁTKY ANTI-SS/A ( ANTI-Ro) Název tohoto antigenu je odvozen od prvních dvou písmen jména pacienta u kterého byl poprvé popsán. Skupina Ro antigenů je zřejmě komplexnější než antigen La ( SS/B ). Jde opět o RNP komplex. Celý komplex ribonukleoproteinu pak tvoří oba proteiny současně s tzv. hystidyl-rna (hystidyl1-rna až hystidyl5-rna), což jsou lidské cytoplazmatické RNA. Funkce tohoto antigenu je zatím nejasná. Výskyt anti-ss/a protilátek má vliv na proteosyntézu. Protilátky anti-ss/a lze detekovat klasicky imunodifuzí, částečně lze použít i imunoblotting. V případě imunoblottingu je stanovení protilátek poněkud obtížnější, poněvadž při separaci antigenů z buněčných extraktů se proteiny velmi těžko oddělují. Nejvhodnější metodou stanovení je ELISA, která je také nejčastěji používána. Nomenklaturní název antigenu SS/A stejně jako u SS/B opět připomíná nejčastější chorobu s níž je výskyt protilátek anti-ss/a asociován Sjögrenův syndrom (zkratka SS znamená právě tuto chorobu). Vůbec nejvyšší výskyt protilátek anti-ro je u primárního Sjögrenova syndromu. Uvádí se, že výskyt je až u 70-95 % pacientů. U sekundárního Sjögrenova syndromu a revmatoidní artritidy hladina anti-ro klesá (stejně jako u anti-la). Anti-Ro protilátky se často vyskytují při SLE. U subakutního kožního lupusu erythematodu jsou anti-ro přítomny asi v 65 %, u neonatálního lupusu jsou relativně vyšší titry anti-ro doprovázeny i protilátkami anti-la (SS/B). Při vysokých titrech anti-ro v těhotenství mohou dokonce zánětlivé reakce po přenesení protilátek anti-ro do plodu vést až ke kongenitálnímu srdečnímu bloku. Obecně platí, že výskyt anti-ro není dobrým prognostickým znakem. Pro vztah anti-la a anti-ro lze trochu zjednodušeně uvést, že anti-la jsou téměř vždy doprovázeny protilátkami anti-ro. Samostatně se vyskytnou jen výjimečně na rozdíl od anti-ro, které se samostatně vyskytují často. V menší míře (kolem 10 % případů) se mohou anti-ro vyskytnout i u dalších systémových autoimunitních chorob. 24

3.5.2 PROTILÁTKY ANTI-SS/B (ANTI-La) Název antigenu je odvozen od prvních dvou písmen jména pacienta u kterého byl poprvé popsán. Protein je lokalizovaný v jádře i cytoplazmě a jedná se o ribonukleoprotein. Vyplývá to z funkce, kterou SS/B protein v organizmu má váže se na různé transkripční produkty RNA polymerázy III. Výskyt anti-la bude mít tedy z biochemického hlediska vliv na dynamiku proteosyntézy. Nejčastější výskyt anti-la je asociován s primárním Sjögrenovým syndromem. Výskyt anti-la je však o něco nižší než anti-ro. Tyto protilátky se vyskytují i při sekundárním Sjögrenově syndromu, revmatoidní artritidě a SLE, většinou však v nižší frekvenci. U systémového lupus erythematodes se anti-la vyskytují pouze u přibližně 15 % pacientů (což je podstatně méně než anti-ro). Samostatně se objevují jen výjimečně. 3.5.3 PROTILÁTKY ANTI-Sm Jako u obou předchozích zástupců anti-ena i zde se jedná o ribonukleoprotein. Název antigenu Sm pochází od jména Smith jméno pacienta u kterého byly protilátky anti-sm poprvé popsány. Antigen Sm se může vyskytovat buďto vázaný na RNA nebo je součástí komplexu. Používá se název Sm/RNP nebo dokonce jen RNP. Výskyt anti-sm má opět vliv na proteosyntézu. Vhodným způsobem detekce je ELISA. Protilátky anti-sm se objevují asi u 20 30 % pacientů se systémovým lupus erythematodes (SLE) a pro tuto chorobu jsou velmi specifické (specificita až 99 %). 25

3.5.4 PROTILÁTKY ANTI-Scl-70 Antigen Scl-70 je enzymem topoisomerázy I. Funkce tohoto enzymu je regulovat tzv. superhelicitu DNA. Superhelicita se nejčastěji vyskytuje u kruhových DNA a znamená, že DNA v nativní dvoušroubovicové formě může být stočena ještě do další šroubovice (tzv. superšroubovice=superhelix). Zmíněná topoizomeráza I může měnit formu superšroubovice tím způsobem, že rozvolní jeden závit DNA, čímž dočasně přeruší jedno vlákno dvoušroubovice, které poté provlékne přes druhé vlákno a opět je spojí. Tím dojde k částečnému rozvolnění dvoušroubovice. U eukaryontních buněk hraje topoizomeráza I významnou roli např. při syntéze nukleozomů, které jsou základními stavebními jednotkami jaderného chromatinu. Napomáhá dosažení správné topologické formy DNA, která je ovinutá kolem histonového oktameru. Výskyt protilátek anti-scl-70 může mít u člověka obecně vliv na syntézu jaderných nukleozomů. Snížená aktivita topoizomerázy vede ke snížení tvorby nukleozomů. Nejčastější používanou metodou je ELISA. Citlivost i specificita stanovení anti-topoizomerázových protilátek je dostatečná. Protilátky proti topoizomeráze I se vyskytují nejčastěji u těžších forem systémové sklerodermie. 3.5.5 PROTILÁTKY ANTI-Jo-1 Jde o enzym ze skupiny aminoacyl-trna syntetáz, konkrétně o histidyltrna syntetázu. Tento enzym se účastní proteosyntézy, které z hlediska biochemických procesů určila lokalizaci v hrubém endoplazmatickém retikulu jde tedy o antigen cytoplazmatický. Přesto je však do anti-ena protilátek z praktických důvodů často zařazovány 16. 26

4. METODY DETEKCE 27

4.1 NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE Princip metody spočívá v průkazu protilátek v séru. Na vhodný antigenní substrát různého původu (tkáňové řezy, buňky tkáňových kultur, nátěry) je nejdříve aplikováno vyšetřované sérum s předpokládanými protilátkami. Pokud jsou tyto protilátky přítomny, dojde k jejich vazbě na antigenní struktury substrátu, tj. vytvoření imunokomplexu antigen-protilátka. Po promytí nenavázaných protilátek a proteinů séra je přidán vhodný konjugát (protilátky proti lidské protilátce značená fluorochromem, např. fluoresceinem). Po inkubaci, promytí a uzavřením krycím sklíčkem lze výsledek reakce odečíst. Pozitivní reakce se projeví fluorescencí struktur nesoucích antigeny, proti nimž byly v séru přítomny protilátky (např. v případě průkazu přítomnosti antinukleárních protilátek se projeví pozitivní reakce fluorescencí jaderných struktur v buňkách). Nepřímá fluorescence je v současné době nejčastější používaná metoda k průkazu autoprotilátek - jak orgánově nespecifických tak i orgánově specifických 18. Ředění séra určuje semikvantitativní hladinu autoprotilátek. Doporučeno je uvádět výsledky každého séra v ředění alespoň 1:40 a 1:160. První uvedený titr má vysokou senzitivitu a je pozitivní téměř u 100 % systémových chorob, ale zároveň také až u 31 % zdravých jedinců. Titr 1:160 je výrazně specifický, protože je pozitivní u 5 % populace, ale klesá zde procento záchytnosti u nemocných 19. V současnosti nejčastěji používaný titr je 1:100, titr uvádí výrobce substrátu. Při pozitivitě vyšetřovaného séra se používají následné titry ( 1:160, 1:320 atd. ), které slouží k dourčení typů protilátek a nepřímo vyjadřuje koncentraci protilátek v séru 17. 28

Obr.č. 2 Schéma nepřímé imunofluorescence 21 Pracovní postup IFA ( EUROIMMUN ) 21 1. sáčky se substráty se vytemperují na laboratorní teplotu, aby se zamezilo orosení, případně znehodnocení substrátu. 2. ředění séra (doporučené ředění pro ANA a další orgánově nespecifické protilátky je 1:100) 3. na skleněnou kapací podložku se napipetuje příslušně naředěné sérum, opatrně se přiloží sklíčko se substráty otočené dolů a zkontroluje se zda ředěná séra se dotýkají všech polí 4. substráty se inkubují při laboratorní teplotě po dobu 30 minut. 5. po opatrném uvolnění sklíčka se substráty z kapací destičky se provede oplach, opláchneme proudem PBS pufru a vzorek se vloží na 1 minutu do kyvety s PBS pufrem; 6. dále je nutné si připravit konjugát ze soupravy EUROIMMUN 29

IgG FICT, naředíme v poměru 1:5 a napipetuje na skleněnou kapací podložku. 7. po vyjmutí sklíčka se substráty z kyvety, se opatrně otře zadní a boční strana sklíčka, sklíčko se substráty přiložíme na skleněnou kapací podložku, kde je rozpipetovaný naředěný FICT, zkontrolujeme zda se konjugáty dotýkají všech polí. 8. substráty se inkubují zakryté alobalem při laboratorní teplotě, po dobu 30 minut. 9. po inkubaci se opatrně uvolní sklíčko se substráty z kapací destičky a opláchne proudem PBS pufru a na 1 minutu vloží do kyvety s PBS pufrem 10. na polystyrénovou podložku s číselnými pozicemi se položí krycí sklíčko, na příslušné číselné pozice se nakape montovací médium (roztok glycerolu+pbs); kapky by měli být co nejmenší 11. po vyjmutí sklíčka z kyvety, je nutné otřít zadní a boční hrany sklíčka se substráty a opatrně přiložíme sklíčko se substráty otočené dolů na krycí sklíčko, jemně přitlačíme a zkontrolujeme zda se konjugáty dotýkají všech polí, preparát je připraven k odečtení v mikroskopu při UV světle; Obr.č. 3 Schéma fluorescenčního mikroskopu 22 30

Obr.č. 4 Schéma komponent pro vizualizaci nepřímé imunofluorescence 23 Pro nepřímou imunoflourescenci se nejčastěji využívá diagnostických souprav Euroimmun, založené na technologii BICHIPů. Jednotlivé substráty jsou lepeny na plastovou podložku, s možností kombinace více typů substrátů (1 až 9 ) pro jedno stanovení nebo i kombinace 24. 31

Obr.č. 5 Plastová destička se substrátem HEp-2 24 4.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ IFA Samotné hodnocení vychází z aktuálních norem konkrétní laboratoře, které jsou závislé na použité metodice a použitém diagnostickém prostředku. Laboratoř by měla vždy vybrat ty nejoptimálnější metodické postupy, které je nutné stále inovovat. Laboratoře se zúčastňují pravidelných externích kontrol organizovaných v České republice (např. SEKK). Na žádost nebo dle domluvy lze stanovit titr protilátek a v případě pozitivního výsledku se uvádí nalezený typ imunofluorescence (zrnitá, homogenní, nukleolární, centromerová, složky dělícího aparátu a další). Tab.č.5 udává hodnocení ANA a tab.č.6 udává typ imunofluorescence, jednotlivé protilátky a nejčastější výskyt při onemocnění. Tab.č. 5. hodnocení ANA, vycházející ze základního ředění séra ( 1:40 ) 11,17, 25 negativní - není pozorována žádná fluorescence hraniční +/- nezřetelná, ale patrná fluorescence slabě pozitivní + zřetelná, ale slabá fluorescence 32

pozitivní ++ zřetelná, jasná, fluorescence silně pozitivní +++ velmi silná fluorescence, která může někdy způsobovat i splývání struktur ( např. zrnění ) Tab.č. 6 19 Typy fluorescence, jednotlivé protilátky a nejčastější výskyt Typ fluorescence ANA asociovaná onemocnění a-dsdna SLE homogenní a-histonové SLE a-sm SLE skvrnitý a-ss/b La SS, SLE ( zrnitý ) a-ss/a Ro SS, SLE anti-scl-70 SCL nukleolární a-rnp SLE 33

4.3 ELISA ENZYMOVÁ IMUNOANALÝZA Jedná se o typ enzymové imunoanalýzy (enzymová imunosorbentní analýza). Jde o imunochemickou analytickou metodu, pomocí které je možné kvantitativně určovat i velmi malé množství antigenů, haptenů nebo protilátek, nacházejících se ve složitějších směsích. Jedna z dvojic reagujících látek ( protilátka nebo antigen) se označí enzymem a imobilizuje se navázáním na tuhý nosič (většinou stěna jamky v mikrotitrační destičce nebo stěna zkumavky). Po jejich reakci se množství vzniklých imunokomplexů určí přidáním substrátu, který reaguje s přítomným enzymem barevnou reakcí, tato se pak měří fotometricky 2. Obr.č. 6 DSX automatický ELISA systém 26 34

Plně automatický otevřený ELISA systém pro všechny diagnostické soupravy na mikrotitračních destičkách, který je vhodný pro všechny diagnostické laboratoře. Tab. č. 7 Hodnocení ELISA 27 Skupina antinukeárních Metoda Materiál Hodnocení protilátek histony ELISA sérum <25 U/ml - negativní >25 U/ml - pozitivní ENA-screening ELISA sérum Kvalitativní hodnocení negativní/pozitivní anti-rnp ELISA sérum <25 U/ml - negativní >25 U/ml - pozitivní 35

anti-ro(ss-a) ELISA sérum <25 U/ml - negativní >25 U/ml - pozitivní anti-la(ss-b) ELISA sérum <25 U/ml - negativní >25 U/ml - pozitivní anti-sm ELISA sérum <25 U/ml - negativní >25 U/ml - pozitivní anti-scl-70 ELISA sérum <25 U/ml - negativní >25 U/ml - pozitivní anti-jo-1 ELISA sérum <25 U/ml - negativní >25 U/ml - pozitivní Obr.č. 7 Schéma screeningu systémových chorob ( ELISA ) 10 36

ANA pozitivní negativní IFA zrnitá homogenní a-sm a-rnp a-dsdna a-histon a-ss/a a-ss/b a-actin a-centromera a-scl-70 a-jo-1 cytoplazmatická nukleolární a- mitochondrie a-scl-70 a-centromera 4.4 WESTERN BLOT ( IMUNOBLOT ) 37

Imunobloting je velmi citlivá metoda k určení většiny autoprotilátek. Směs buněčných antigenů, připravených z HeLa buněk (pocházejících z lidského cervikálního karcinomu), je elektroforeticky rozdělena v polyakrylamidovém gelu podle molekulové hmotnosti a poté v elektrickém poli přenesena na nitrocelulózový papír. Působením vyšetřovaného séra na proužek nitrocelulózy s takto rozdělenými buněčnými antigeny dojde v pozitivním případě k vytvoření imobilizovaného komplexu autoprotilátka - antigen, který se projeví vznikem jednoho či více proužků, lokalizovaných podle molekulové hmotnosti antigenu. Nevýhodou této metody je denaturace antigenu, což v některých případech může vést k falešně negativnímu výsledku 13. Oproti metodě ELISA je Western blot časově náročnější a dražší, ale za to přesnější (specifičtější) 28. Tato metoda je většinou používaná v případech, kdy ostatní metody ( IFA, ELISA ) neposkytnou jasný výsledek 18. Postup 28 : 1. fáze: do klasické elektroforézy s polyakrilamidovým gelem je nanesen antigen a separován v elektrickém poli dle molekulové hmotnosti proteinů antigenů; na gelu se vytvoří tzv. bandy ( proužky ), gel se vyjme a následuje tzv. blotování viz. fáze 2 2. fáze: gel se přiloží na membránu ( nitrocelulózový papír ) a na blotovacím zařízení působením elektrického proudu dojde k přeblotování z gelu na membránu, kde vzniknou kopie proteinů separovaných v gelu, následující tzv. vyvíjení viz. 3. fáze 3. fáze: membrána se nastříhá na potřebný počet proužků, kdy na každý proužek proteinem se nechá inkubovat ve vaničkách s testovaným sérem ( protilátkami ); po promytí proužků se přidá konjugát ( protilátka proti druhově specifickým protilátkám značené enzymem ); po inkubaci s konjugátem a promytí se substrát a proužky, na které se navázaly protilátky se obarví 4.5 VYHODNOCENÍ IMUNOBLOTINGU 13 38

1 - anti-nrnp, 2 - anti-la, 3 - anti-ro 52, 60, 4 - anti-jo-1, 5 - anti-scl-70 39

5. KLINICKÁ ASOCIACE Tato část práce je věnována třem systémovým autoimunitním onemocněním. Je nutné si uvědomit, že nelze v této rešeršní práci popsat všechna onemocnění. Cílem bylo zmínit alespoň některé choroby, které 40

postihují danou problematiku v celé její šíři a částečně tyto choroby popsat. Je však zřejmé, že hodnocení těchto chorob je na specialistovi, který se v dané problematice orientuje a má s ní dlouholeté praktické zkušenosti. 5.1 SYSTÉMOVÝ LUPUS ERYTHEMATOSUS Jedná se o systémové autoimunitní onemocnění charakteristické produkcí autoprotilátek k různým autoantigenům. Původ tohoto onemocnění není přesně stanoven, ale předpokládá se, že je způsobeno genetickými faktory, imunologickými a hormonálními vlivy. Postižen může být jakýkoliv orgán, nebo systém v těle. Proto je diagnostika, sledování a léčba tohoto onemocnění velmi složitá 29. Onemocnění provází nadměrná produkce autoprotilátek, které způsobují přímé poškození buněk. Onemocnění se vyskytuje na celém světě. Nemoc je až 9 častější u žen než mužů, což je způsobeno hladinami hormonů, zvláště estrogenů a prolaktinu. Proto je výskyt SLE převážně u žen ve fertilním věku. Častý výskyt SLE lze i pozorovat u negroidní skupiny obyvatelstva. Nejdůležitějším laboratorním projevem SLE je přítomnost antinukleárních protilátek, které jsou prokazatelné nepřímou imunofluorescencí téměř u všech nemocných se SLE (>98 %). Výjimkou jsou některé případy (1 2 % všech nemocných) s izolovanou pozitivitou anti-ssa/ro ANA protilátek, které mohou někdy být negativní při použití metody nepřímé imunofluorescence. Ty se prokážou jinou metodou. Typickým rysem SLE je častá přítomnost několika autoprotilátek najednou. Pro SLE jsou diagnosticky významné především protilátky proti dvouvláknové DNA ( a-dsdna ) a dále antihistonové protilátky, které se nacházejí asi u dvou třetin nemocných. Dalším z důležitých cílů ANA u SLE je skupina jaderných ribonukleoproteinových částic. Mezi ně patří anti-sm protilátky, které jsou velmi specifické pro SLE, senzitivita je však malá (10 30 %). Klinicky významná je přítomnost anti-ssa/ro a anti-ssb/la, protilátky proti ribozomálnímu RNP jsou velmi specifické pro SLE (10 40 %) 30. Tabulka č. 8 uvádí výskyt antinukleárních autoprotilátek u SLE. 41

Tab.č. 7 Antinukleární protilátky u SLE 19 protilátka % výskyt u SLE ANA 99 % a-dsdna 40-90 % a-nukleosomy 84-88 % a-histony 70 % a-sm 10-30 % a-rnp 30-40 % a-ssa/ro 35-60 % a-ssb/la 10-50 % 5.2 SJÖGRENŮV SYNDROM 42

Sjögrenův syndrom (SS) je chronické zánětlivé onemocnění, které postihuje hlavně slzné a slinné žlázy, ve kterých probíhá imunopatologický zánětlivý proces. Současně jsou přítomné imunologické abnormality, zvláště nadměrná tvorba autoprotilátek, specificky zaměřených proti buněčným antigenům SS-A/Ro a SS-B/La. Onemocnění probíhá buďto zcela samostatně (primární forma) nebo se sdružuje s jinými systémovými autoimunitními chorobami (sekundární forma). Prevalence onemocnění se udává mezi 1 2,5 %. Vyskytuje se na celém světě a bez ohledu na věk. Ženy postihuje onemocní až 9 častěji než muže. Účast orgánově nespecifických autoprotilátek v patogeneze onemocnění není stále jasná. Víc než 95 % má prokazatelné antinukleární autoprotilátky (ANA), stejně tak anti-ro a anti-la protilátky 31. Tabulka č. 9 uvádí výskyt antinukleárních autoprotilátek u Sjögrenova syndromu. Tab.č. 8 antinukleární protilátky u Sjögrenova syndromu 19 protilátka % výskyt u Sjögrenova syndromu ANA 95 % a-ssa/ro 88-96 % a-ssb/la 71-87 % 5.3 SYSTÉMOVÁ SKLERODERMIE 43

Systémová sklerodermie ( Scl ) je onemocnění pojivové tkáně postihující jak kůži, tak vnitřní orgány. Jde o málo časté onemocnění s prevalencí udávanou v počtu asi 250 nemocných na milión obyvatel. Ženy jsou postihovány častěji. Původ a příčina choroby je stále neznámá. Antinukleární autoprotilátky se prokazují až u 90 % nemocných. Častý je nukleolární typ fluorescence. Specifickým nálezem jsou protilátky zvané anti Scl-70, které bývají přítomné až u 60 % nemocných se systémovou formou sklerodermie. Dále lze u menšího procenta nemocných prokázat též anti-rnp 32. Tab.č.9 udává nejčastější výskyt antinukleárních autoprotilátek u systémové sklerodermie. Tab.č. 9 Antinukleární protilátky u systémové sklerodermie 19 protilátka % výskyt u systémové sklerodermie ANA 95 % a-scl-70 20-65 % 44

6.OBRAZOVÁ PŘÍLOHA 45

Obr. č. 8 ANA, imunofluorescence homogenní 33 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA Obr. č. 9 ANA, imunofluorescence homogenní 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA 46

Obr. č. 10 ANA, fluorescence jadérek 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA Obr. č. 11 ANA, imunofluorescence jaderné membrány 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA 47

Obr. č. 12 ANA, imunofluorescence jaderné membrány Substrát: HEp-2 Metoda: IFA Obr. č. 13 ANA, imunofluorescence zrnitá 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA 48

Obr. č. 14 ANA, imunofluorescence zrnitá, hrubá 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA Obr. č. 15 ANA, cytoplazmatické imunofluorescence, zrnitá cytoplazma 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA 49

Obr. č. 16 ANA, nálezy v cytoplazmě Golgiho aparát 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA Obr. č. 17 ANA, nálezy v cytoplazmě, vláknitá cytoplazma 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA 50

Obr. č. 18 ANA, fluorescence dělícího tělíska 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA Obr. č. 19 ANA, fluorescence póly dělícího vřeténka ( velmi vzácný výskyt ) 34 Substrát: HEp-2 Metoda: IFA 51

Obr. č. 20 a-dsdna 34 Substrát: Crithidia luciliae Metoda: IFA Obr. č. 21 a-dsdna 34 Substrát: Crithidia luciliae Metoda: IFA 52

ZÁVĚR V této práci byla probrána problematika antinukleárních protilátek, které zahrnují soubor autoprotilátek, namířených proti orgánově nespecifickým buněčným antigenům. Popsána byla stanovení, detekce a klinické asociace. Jak již bylo uvedeno, klinické hodnocení je vždy na vysokoškolském specialistovi. Pro mou práci v klinické laboratoři je důležité této problematice porozumět a podílet se na kvalitním zpracování vyšetřovaného materiálu. Nedílnou součástí je informovanost a základní orientace laboratorního personálu provádějící screeningové metody v daném klinickém oboru a docílení kvalitního vydávání výsledků požadovaného vyšetření ordinujícím lékařům. 53

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. FERENČÍK, M., ROVENSKÝ, J., SHOENFELD, Y., MAŤHA, V., Imunitní systém. Praha : Grada, 2005., s. 109-137, ISBN-80-247-1196-6 2. FERENČÍK, M., ROVENSKÝ, J., MAŤHA, V., Ilustrovaný imunologický slovník. Praha : Galén, 2004., ISBN-80-7262-243-9 3. VOKURKA, M., HUGO, J. a kolektiv, Velký lékařský slovník. Praha : Maxdorf, 2006, ISBN-80-7345-105-0 4. Autoimunitní terapie, Postgraduální medicína, roč. 8, č. 5 ( 2006 ), str. 472, ISSN-1212-4184 5. BARTŮŇKOVÁ, J., PAULÍK, M. a kolektiv, Vyšetřovací metody v imunologii. Praha : Grada, 2005., s. 43-63, ISBN-80-247-0691-1 6. http://www.medicina.cz/odborne/clanek.dss?s_id=4729&s_ts=39555,295 474537 04/2008 7. SHOENFELD, Y., FUČÍKOVÁ, T., BARTŮŇKOVÁ, J., Autoimunita vnitřní nepřítel. Praha : Grada, 2007, s. 10-19, s. 24-45, s. 46-57, ISBN-978-80- 247-2044-9 8. http://www.onkologickecentrum.cz/downloads/clanky/organovespecificke-autoprotilatky.pdf. 04/2008 9. VENCOVSKÝ, J., Autoimunitní systémová onemocnění minimum pro praxi. Praha : 1998., s. 13-91, ISBN-80-85875-97-7 10. ZIMA, T. a kol. Laboratorní diagnostika. Praha : Galén, 2002., s. 250-255, s. 503-510, ISBN 80-7262-201-3 11. KOPECKÝ, O. a kolektiv, Laboratorní vyšetření v klinické imunologii a alergologii. Hradec Králové : Garamond, 2004., s. 28-31, ISBN 80-86472-17-5 12. KREJSEK, J., KOPECKÝ, O. Klinická imunologie. Hradec Králové : Nukleus, 2004., s. 588-592, ISBN 80-86225-50-X 13. www.revma.cz/anp.htm 04/2008 54

14. www.revma.cz/dsdna.htm 04/2008 15. http://www.onkologickecentrum.cz/downloads/clanky/organovenespecificke-autoprotilatky.pdf. 04/2008 16. http://www.solen.cz/pdfs/int/2002/12/16.pdf. 04/2008 17. http://www.onkologickecentrum.cz/downloads/clanky/ana-popis.pdf. 04/2008 18. LITZMAN, J., FREIBERGER, T., KRÁL, V., THON, V., Základy vyšetření v klinické imunologii. Brno : 2007., s.19-25, s. 53-55, ISBN-978-80-210-4227-8 19. PAVELKA, K., ROVENSKÝ, J., Klinická revmatologie. Praha : Galén, 2003, s.11, s.89-99, s.181, 235, 273, ISBN-80-7262-174-2 20. http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/ge17/22b.jpg 04/2008 21. ústní sdělení, Mgr. Pánek, MN Privamed a.s 04/2008 22. http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fluorescenceintro.html 04/2008 23. http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html 04/2008 24. http://www.dynex.cz/euroimmun 04/2008 25. http://www.sekk.cz/texty/fluorescence.pdf 26. http://www.imunolusti.cz/index.php?ukaz=autoimunita&s_id=c2cb7f7842d566631e2dca61 874f6d4e 04/08 27. http://www.dynex.cz/system-dsx 04/2008 28. http://cs.wikipedia.org/wiki/western_blot 04/2008 55

29. Systémový lupus erythematosus (130. internistický den - Revmatologie v klinické praxi), Vnitř. Lék., Roč. 52, č. 7-8 (2006), s.702, ISSN: 0042-773X 30. http://www.internimedicina.cz/savepdfs/int/2001/03/03.pdf. 04/2008 31. http://www.internimedicina.cz/pdfs/int/2001/06/04.pdf. 04/2008 32. http://www.solen.cz/pdfs/int/2001/04/06.pdf. 04/2008 33. http://library.med.utah.edu/webpath/immhtml/immidx.html 04/2008 34. dokumentace IFA, MUDR. Markéta Haschová, MN Privamed a.s. 04/2008 56