UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd RIGORÓZNÍ PRÁCE Vliv MDOC TM na expresi buněčných adhezních molekul ve stěně cévy u apoe/ldlr-deficientních myší.. MDOC and its effects on cell adhesion molecules in the vessel wall of apoe/ldlr-deficient mice. Hradec Králové, 2008 Mgr. Ludvík Drnek 1
Prohlašuji, že tato rigorózní práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracoval samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Datum: 30. 8. 2008 podpis rigorozanta 2
Poděkování Dovoluji si poděkovat PharmDr. Petru Nachtigalovi, Ph.D. za odborné vedení rigorózní práce a poskytnuté rady. 3
Seznam použitých zkratek ACE acetylcholinesteráza ACH acetylcholin ADP adenosindifosfát apoe apolipoprotein E bfgf basic fibroblast growth factor, základní fibroblastový růstový faktor CAM cell adhesion molecules, buněčné adhesivní molekuly CMP cévní mozková příhoda CMV cytomegalovirus CRP C reaktivní protein EBV virus Epsteina a Barrové EDGF endothelium derived growth factor, růstový faktor produkovaný endotelem EDHF endothelium derived hyperpolarizing factor Hb hemoglobin HDL high density lipoprotein, lipoproteiny s vysokou hustotou HMG-CoA 3-hydroxyl-3-methyl-glutaryl koenzym A ICAM-1 Intercellular Cell Adhesion Molekule, adhezní molekula IDL intermedite density lipoproteins, lipoproteiny se střední hustotou IGF-1 inzulínu podobný růstový faktor ICHS ischemická choroba srdeční ICMP ischemická cévní mozková příhoda IL-6, 8 interleukin 6, 8 LDL low density lipoprotein, lipoproteiny s nízkou hustotou LPS lipopolysacharidy MAdCAM-1 mucosal addresin cell adhesive molekule MCP-1 monocytární chemotaktický protein-1 M-CSF macrophage colony stimulating factor, růstový hormon pro makrofágy MDGF monocyte-derived growth factor, růstový faktor monocytů NF-κB nukleární faktor kappa B NO oxid dusnatý OxLDL oxidované LDL částice PAF faktor agregace 4
PAI-1 PDGF PECAM-1 TAG TGF β TNF α t-pa VCAM-1 VLDL inhibitor aktivátoru plazminogenu platelet-derived growth factor, destičkový růstový faktor Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule triacylglyceroly transforming growth factor, transformující růstový faktor tumor necrosis factor tkáňový aktivátor plazminogenu Vascular Cell Adhesion Molecule, adhezní molekula very low density lipoprotein, lipoproteiny s velmi nízkou hustotou 5
Abstrakt Ateroskleróza patří mezi kardiovaskulární onemocnění, které tvoří v posledních letech nejčastější příčinu morbidity a mortality ve všech ekonomicky vyspělých zemích Evropy a USA. Cílem této rigorózní práce bylo zjistit potencionální hypolipidemické a protizánětlivé účinky MDOC jako nové potenciální substance patří do skupiny dietární vlákniny. V této rigorózní práci byl použit geneticky modifikovaný kmen ApoE/LDLr deficientní myši (n=8), které byly krmeny po odstavení aterogenní dietou s obsahem 1,25% cholesterolu po dobu 8 týdnů (kontrolní skupina). V MDOC skupině byly myši krmeny stejnou aterogenní dietou, ke které bylo přidáváno 5% MDOC denně. Zvířatům byly odebrány ze srdce vzorky krve pro biochemické vyšetření. Dále byly odebrány segmenty tkáně tvořené aortou spolu s horní polovinou srdce. Dále byla provedena biochemická analýza krve a imunohistochemická a stereologická analýza exprese VCAM-1 a ICAM-1 v aortálním sinu a oblouku. Výsledky ukázaly, že podávání MDOC statisticky významně snížilo hladiny celkového cholesterolu, VLDL a navíc statisticky významně zvýšilo hladiny HDL cholesterolu Stereologická analýza imunohistochemického barvení cév ze všech zvířat ukázala, že podávání MDOC signifikantně snížilo expresi VCAM-1 v aterosklerotických plátech ve srovnání s kontrolní skupinou v oblasti aortálního sinu a aortálního oblouku. Podávání MDOC však neovlivnilo expresi ICAM-1 v aterosklerotických plátech. Závěrem lze tedy konstatovat, že výsledky této rigorózní práce prokázaly hypolipidemické účinky MDOC, které ale zřejmě způsobily také jisté protizánětlivé efekty v cévní stěně reprezentované snížením exprese buněčné adhezní molekuly VCAM-1 u apoe/ldlr-deficientních myší. 6
Abstract Atherosclerosis belongs to the cardiovascular diseases, which have been the most frequent cause of the morbidity and mortality in all the economically advanced countries of Europe and the USA in the last few years. The purpose of this thesis was to find some potential hypolipidemic and antiinflammatory effects of MDOC. The new potential substance belongs to the group of dietary fibre. ApoE/LDLr-deficient mice (n=8) was used in the study. The mice were fed with aterogenic diet containing 1.25% cholesterol for 8 weeks. In MDOC group, the mice were fed on the same aterogenic diet, with 5% MDOC added to this diet. Blood sample for the biochemical investigation were taken from animals. Then, partitions of the tissue formed by the aorta together with the upper part of the heart were taken, too. Then, a biochemical analysis of the blood was made and also in aortic sinus and arch an imunohistochemical and stereological analysis of the endothelial expression of VCAM-1 and ICAM-1 were performed. The results of the biochemical analysis showed that MDOC treatment resulted in a significant decrease of total cholesterol, VLDL and significant increase of HDL cholesterol. Stereological analysis of immunohistochemical staining showed significant decrease of VCAM-1 staining in the atherosclerotic lesion after the administration of MDOC. The area of ICAM-1 was decreased non-significantly. In conclusion, we demonstrated hypolipidemic properties of MDOC which are likely related to anti-inflammatory effects represented by decreased expression of VCAM-1 in the atherosclerotic lesion of apoe/ldlr-deficient mice. 7
OBSAH 1. ÚVOD... 9 2. TEORETICKÁ ČÁST... 11 2.1. ATEROSKLERÓZA... 12 2.1.1. Rizikové faktory aterosklerózy... 13 2.1.2. Stavba krevních cév... 15 2.1.3. Patofyziologie aterosklerózy... 17 2.1.3.1. Schéma aterogeneze... 17 2.1.3.1. Stabilní a nestabilní aterosklerotický plát... 20 2.1.3.2. Klinické projevy aterosklerózy... 21 2.1.3.3. Lipoproteiny... 22 2.1.3.4. Buněčné adhezní molekuly... 25 2.2. VLÁKNINA... 28 2.2.1. Klasifikace vlákniny... 28 2.2.1.1. Rozpustná vláknina... 29 2.2.1.2. Význam vlákniny... 30 2.2.2. MDOC oxidovaná celulóza... 31 2.3. MYŠÍ MODELY ATEROSKLERÓZY... 32 3. CÍL PRÁCE... 34 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 35 4.1. ZVÍŘATA A PŘEDEPSANÁ DIETA... 36 4.2. BIOCHEMICKÁ ANALÝZA... 36 4.3. IMUNOHISTOCHEMIE... 36 4.3.1. Kvantitativní analýza imunohistochemie a velikost lézí... 38 4.4. STATISTICKÁ ANALÝZA... 38 5. VÝSLEDKY... 39 5.1. BIOCHEMICKÁ ANALÝZA... 40 5.2. IMUNOHISTOCHEMIE... 41 5.2.1. Imunohistochemické barvení VCAM-1 a ICAM-1 v oblasti aortálního sinu... 41 5.2.2. Stereologická analýza exprese VCAM-1 a ICAM-1 u ApoE deficientních myší... 44 6. DISKUZE... 46 7. ZÁVĚR... 51 8. LITERATURA... 53 8
1. Úvod 9
Kardiovaskulární onemocnění tvoří v posledních letech nejčastější příčinu morbidity a mortality ve všech ekonomicky vyspělých zemích. Z nich převážnou většinu tvoří následky aterosklerózy. Ateroskleróza je nejčastější příčinou úmrtí ve vyspělých státech Evropy a USA a tvoří více než 50% všech úmrtí. Na počátku 20. století byla ateroskleróza v ČR poměrně vzácným onemocněním, pak ale začal její výskyt prudce stoupat až do dnešní doby, kdy patří ČR v úmrtnosti na komplikace aterosklerózy na přední místa ve světě. Např. v České republice zemřelo v roce 1999 na kardiovaskulární nemoci více jak 27000 mužů, 33000 žen z toho kolem 24000 na ischemickou chorobu srdeční. Stav vysoké úmrtnosti na kardiovaskulární choroby u nás však není důsledkem nedostatku poznatků o ateroskleróze, ale je zaviněn spíše nedostatečnou zdravotní výchovou obyvatelstva, nesprávným životním stylem, především dietními návyky a nedostatečnou pohybovou aktivitou. V zemích, kde se lékařům podařilo dostatečně informovat veřejnost o rizikových faktorech těchto onemocnění, kde občané projevili dostatek zodpovědnosti za vlastní zdraví, a kde byly vytvořeny podmínky k dodržování lékařských rad a doporučení, úmrtnost i nemocnost na srdeční a cévní choroby v posledních letech rychle klesá. Ateroskleróza je tedy závažné onemocnění a také dnes velice studované onemocnění. V současné době se studium aterosklerózy ubírá několika směry. Autoři se svých studiích zaměřují na možnosti prevence a léčby aterosklerózy, intenzivně se studuje chování aterosklerotických plátů, především otázka stability a nestability plátu a velká pozornost je dnes věnována časné patogenezi a rozvoji tohoto onemocnění, a to jak na úrovni, morfologických i funkčních změn vlastních cév, tak na úrovni biochemických parametrů a molekulárních mechanismů. Obecně je dnes ateroskleróza považována za chronické zánětlivé onemocnění a velká pozornost se věnuje vlivu složek imunitního systému na aterogenní proces, studiu chování adhezivních molekul, přičemž je snaha všechny aterogenní změny vždy objektivně vyhodnotit pomocí různých morfometrických metod. Cílem této rigorózní práce bylo zjistit potencionální hypolipidemické a protizánětlivé účinky MDOC. Jako model byly použity apoe/ldlr-deficientní myši, kterým byla podávána aterogenní dieta. Byly sledovány hladiny lipidů a zejména exprese cytoadhezních molekul VCAM-1 a ICAM-1 pomocí imunohistochemických metod. 10
2. Teoretická část 11
2.1. Ateroskleróza Ateroskleróza je podle WHO definována jako variabilní kombinace změn intimy arterií spojená s ukládáním lipidů (cholesterolu), polysacharidů a krevních elementů a v dalším vývoji tvorbou fibrózní tkáně provázenou ukládáním vápenatých sloučenin, se změnami v medii arterií. Postihuje velké a střední arterie tvorbou subintimálního ztluštění (ateromu), které může vést k redukci nebo až obstrukci krevního průtoku. K základním predispozičním místům vzniku onemocnění, patří arteria carotis communis dextra et sinistra, oblast arcus aortae a to především oblasti hlavních odstupů, dále arteriae coronariae, aorta thoracica, aorta abdominalis, zejména v oblasti odstupů viscerálních větví, arteriae renales, arteriae iliacae a arteriae femorales (1). Místa výskytu aterosklerózy nejsou náhodná. Lokalizace vzniku aterosklerotického plátu je silně determinována především různými vlastnostmi v jednotlivých místech cévního řečiště (2). Obrázek 1. Predispoziční místa výskytu aterosklerotických lézí podle De Bakey et al. (3). 12
2.1.1. Rizikové faktory aterosklerózy Ateroskleróza je dnes z hlediska etiologie považována za multifaktoriální onemocnění. Pro vznik a progresi aterogenního procesu je tedy důležité společné působení jednotlivých faktorů. Mezi nejdéle známé faktory patří věk. Řada epidemiologických studií prokázala korelaci mezi vzrůstajícím věkem a vznikem aterosklerózy. Proto byla ateroskleróza považována za nemoc stáří (4). Dalším aterogenním faktorem je hemodynamický stres. Některé studie prokázaly závislost mezi hemodynamickými silami a vznikem aterogenních lézí. Ukázalo, že v oblastech s nízkým shear stresem (síla krevního proudu působící kolmo na endoteliální buňky) dochází k poškození interendoteliálních spojů s následným zvýšením endoteliální permeability, ale také ke zvýšení exprese adhezivní molekuly VCAM-1, což přispívá ke vzniku endoteliální dysfunkce jako základního kroku při vzniku aterosklerózy (5). S hemodymamickými vlastnostmi je také úzce spjatá hypertenze. Hypertenze se podílí na riziku vzniku aterosklerózy zejména zvýšenou produkcí volných radikálů a také zvýšenou hladinou angiotenzinu II a endotelinu-1 (6). Genetická predispozice je dalším významným rizikovým faktorem. Mutace jednoho nebo více genů vede k manifestaci dyslipoproteinemie (7). Mezi nejvíce rizikové geneticky podmíněné dyslipoproteinemie se vztahem ischemické chorobě srdeční lze zařadit Familiární hypercholesterolémii, Familiární defekt apolipoproteinu B 100 a Familiární dysbetalipoproteinémií. Riziko vzniku aterosklerózy je spjato s hypercholesterolémií zejména zvýšenou hladinou VLDL a LDL. Jejich zvýšená hladina je často spjata se zvýšeným příjmem potravy a obezitou. Aterogenita LDL je způsobena především jejich schopností pronikat cévním endotelem a následně podléhat oxidativní modifikaci. Oxidativní modifikace vede k tomu, že tyto LDL nejsou rozpoznávány LDL receptory ale scavengerovými receptory makrofágů, což vede k jejich kumulaci právě v makrofázích. Riziko vzniku a progrese aterosklerózy vzrůstá se zvýšenou koncentrací LDL v plazmě a s jejich klesající velikostí (8). Dalším možným rizikovým faktorem je lipoprotein(a) Lp(a). Je to lipoproteinová částice podobná svou strukturou LDL. Lp(a) soutěží s plazminogenem o vazbu na plazmin zasahuje tak do procesu fibrinolýzy což vede k převaze trombogeneze nad fybrinolýzou. Některé studie prokázaly vztah mezi zvýšenou hladinou Lp(a) a rizikem rozvoje aterosklerózy, zatímco jiné práce tuto teorii nepotvrdily (9). Diabetes mellitus jako celková metabolická porucha je také považován za rizikový faktor aterosklerózy. Existuje několik mechanismů, které se u diabetu podílejí na zvýšeném 13
riziku vzniku a progrese aterosklerózy. Patří mezi ně především nízká hladina HDL současně s vyšší hladinou Lp(a) a VLDL, zvýšená glykace kolagenu a oxidace LDL částic (10). Zvýšený oxidační stres spojený s kouřením patří k dalším rizikovým faktorům aterosklerózy. Kouření je spojeno s vyšším výskytem lipidního proužkování u mladých lidí, ale podílí se také na progresi onemocnění zejména po 35 roku života (11). Mezi rizikové faktory lze zařadit také některá infekční agens zejména Chlamydii pneumoniae a Helicobacter pylori (12). Vzhledem k tomu, že ateroskleróza postihuje krevní cévy je následující kapitola věnována stavbě krevních cév. 14
2.1.2. Stavba krevních cév Stěny krevní cévy se obvykle skládají z několika vrstev neboli tunik (13). Tunica intima: tunika intima je tvořena vrstvou endotelových buněk vystýlající vnitřní povrch cév. Tyto buňky jsou uloženy na bazální membráně tvořené především kolagenem IV, glykoproteinem lamininem a proteoglykany. Pod endotelem se nachází vrstva subendotelového řídkého vaziva, která může obsahovat i hladkosvalové elementy a to zejména u artérií svalového a elastického typu. Tunica media: Medie se skládá ze šroubovitě vyvinutých koncentrických hladkých svalových buněk. Mezi hladkosvalovými elementy se nacházejí v různém množství elastická vlákna, kolagenní vlákna (především kolagen typu III) a proteoglykany. Zdrojem tohoto extracelulárního materiálu jsou hladkosvalové buňky. Tunica media je oddělena od zevní adventicie elastickou blankou nazvanou lamina elastica externa a od intimy elastickou blankou nazvanou lamina elastica interna. Tunica adventicia: Adventicie je tvořena podélně orientovanými kolagenními (především typ I) a elastickými vlákny. U cév s větším průsvitem se zde nacházejí fibroblasty a tukové buňky ale také lymfatické cévy, nervy a vasa vasorum. Adventicie pak plynule přechází do vaziva kterým céva prochází. Oběhový systém obvykle dělíme na oddíl makrocirkulační (cévy o průměru >0,1mm), ke kterému lze přiřadit a arterie a žíly, a oddíl mikrocirkulační (cévy viditelné jen ve světelném mikroskopu), ke kterému patří zejména kapiláry (13). Kapiláry Kapiláry se skládají z jediné vrstvy endotelových buněk stočených do trubice uzavírající cylindrický prostor. Kapiláry mají malý průsvit, v průměru od 7 do 9 μm. Jejich délka se obvykle pohybuje mezi 0,25 až 1 mm. Na nejrůznějších místech jsou podél kapilár a malých venul rozmístěny pericyty, mezenchymové buňky s dlouhými výběžky, které částečně obepínají endotelie. Přítomnost myosinu, aktinu a tropomyosinu v pericytech naznačuje, že mají kontrakční schopnost. Pericyty suplují v těchto nejmenších cévách tuniku medii. Kapiláry jsou také obklopeny tenkou vrstvou kolagenních vláken, které jsou ekvivalentem adventicie. 15
Arterie Arterie dělíme podle velikosti na arterioly, svalové arterie středního, či velkého kalibru a velké elastické arterie. a) Arterioly: arterioly mají obecně průměr menší než 0,5 mm a relativně úzký průsvit. Jejich lumen je vystlán endotelovými buňkami. Subendotelová vrstva je velmi tenká a vnitřní elastická blanka většinou zcela chybí. Svalová medie je tvořena 1-5 cirkulárně uspořádanými vrstvami hladkosvalových buněk. Adventicie je tenká a nemá vyvinutou zevní elastickou blanku. b) Arterie svalového typu: Intima těchto arterií je shodná s arteriolami až na to, že subendotelová vrstva je poněkud tlustší a může obsahovat i něco hladkosvalových buněk. Membrána elastica je zřetelně vyvinuta. Medie může obsahovat až 40 vrstev hladkosvalových buněk. Tyto buňky jsou proloženy různým počtem elastických blanek, retikulárních vláken a proteoglykanů. Membrana elastica externa je přítomna jen ve větších svalových arteriích. Adventicie je tvořena z kolagenních a elastických vláken i malého počtu fibroblastů a tukových buněk. V adventicii najdeme lymfatické cévy, vasa vasorum a nervy, které mohou pronikat až do zevních vrstev medie. c) Velké arterie elastického typu: k tomuto typu cév řadíme aortu a její hlavní větve. Intima, silnější než v arteriích svalového typu, je vystlána endotelovými buňkami. Subendotelová vrstva je silně vyvinuta. Vazivová vlákna subendotelové vrstvy jsou orientována podélně a hrají důležitou roli při deformaci endotelu během rytmických kontrakcí a dilatací tepen. Medie je tvořena z řady perforovaných koncentricky uspořádaných elastických blanek jejichž počet vzrůstá s věkem. Mezi elastickými blankami se nacházejí hladkosvalové buňky, retikulární vlákna a základní hmota obsahující především chondroitin sulfát. Žíly Žíly, můžeme dělit podobně jako arterie na venuly, vény malého, středního a velkého kalibru. a) Venuly: venuly mají průměr 0,2-1mm. Jsou tvořeny intimou skládající se z endotelu, tenké medie, neobsahující žádnou nebo jen několik vrstev hladké svaloviny. Adventicie je nejsilnější a je tvořená kolagenními vlákny. b) Vény malého a středního kalibru: Tyto vény mají průměr 1-9 mm. Intima je obvykle opatřena tenkou subendotelovou vrstvou. Medie sestává z malých svazečků hladkých svalových buněk smíšených s retikulárními vlákny a jemnou síťovinou vláken elastických. Kolagenní vrstva adventicie je dobře vyvinuta. 16
c) Velké vény: Velké vény mají dobře vyvinutou intimu. Tunica media je mnohem tenčí než u arterií a obsahuje jen několik vrstev hladkosvalových buněk a spoustu vaziva. Nejsilněji a nejlépe vyvinutá je v žilách adventicie. V žilách uložených pod úrovní srdce obsahuje adventicie podélné svazky hladké svaloviny, která se podílí společně s žilními chlopněmi na čerpání krve směrem k srdci (13). 2.1.3. Patofyziologie aterosklerózy Ateroskleróza, jak již bylo několikrát řečeno, je systémové onemocnění postihující cévy tepenného řečiště (velké a střední); z klinického hlediska mají největší význam léze srdečních věnčitých tepen, extrakraniálních tepen zásobujících mozek, eventuálně dalších orgánů (ledviny). Na patogenezi aterosklerózy se podílí komplex po sobě jdoucích událostí, zahrnujících rozvoj chronického zánětlivého procesu stěny artérií jako odpověď na hemodynamické poškozování cévní stěny v nejvíce namáhaných místech, jejíž příčina nebyla odstraněna a proces nebyl neutralizován. To způsobuje nejprve dysfunkci cévního endotelu s tvorbou cytokinů, adhezivních molekul a růstových faktorů (14). 2.1.3.1. Schéma aterogeneze Leukocyt má tendenci rolovat po endotelu. Dochází k tomu prostřednictvím vzájemného kontaktu molekul selektinů na endotelové buňce a oligosacharidových molekul na leukocytech. Následuje pevná adheze leukocytu na endotel díky molekulám z řady imunoglobulinů VCAM-1 a ICAM-1. Vazebnou složku tvoří integriny, které se zvýšeně exprimují až při aktivaci endotelu. Pro proniknutí leukocytu do subendotelu mezi endotelovými buňkami je zapotřebí molekula PECAM-1 (ve velkém množství je v meziendotelových spojích). Na invazi leukocytů do cévní stěny se velkou měrou podílejí chemokiny, chemotaktické cytokiny, které hrají roli v řízení pohybu a aktivaci leukocytů (15). Určitá místa arterií, jako jsou bifurkace a oblouky, způsobují charakteristické změny v toku krve. Změny v krevním průtoku se zdají být rozhodující v určení, která místa cév mohou být náchylná k tvorbě lézí. Pohyb a adheze monocytů a T-buněk na těchto místech je výsledkem up-regulace adhezních molekul jak na endotelu, tak i na leukocytech. Endoteliální dysfunkce vede ke kompenzační odpovědi, která mění normální homeostatické vlastnosti endotelu. Zvyšuje se tak adhezivita (s přičiněním leukocytů a krevních destiček) i propustnost (permeabilita) endotelu. Endotel má tedy spíše koagulační 17
než antikoagulační schopnosti a vytváří vazoaktivní molekuly, cytokiny a růstové faktory. Pokud není zánětlivá odpověď účinně kompenzována a nejsou odstraněny napadající agens, může proces dále pokračovat. Takto stimuluje zánětlivá odpověď migraci a proliferaci buněk hladké svaloviny, ty se prolínají s oblastí zánětu a vytváří intermediární (střední) lézi. Pokud tato reakce pokračuje trvale, může způsobit ztluštění stěny tepny, které je později kompenzováno postupnou dilatací, tudíž průsvit cévy zůstává ještě nezměněn (16). Obrázek 2. Schéma počáteční fáze dysfunkce endotelu (převzato z internetových stránek: http://www.zdravcentra.sk/index.php?act=k-10&did=408) Odpověď je dále způsobena a usměrňována makrofágy vzniklými z monocytů a specifickými subtypy T-lymfocytů. Aktivace těchto buněk vede k uvolnění hydrolytických enzymů, cytokinů, chemokinů a růstových faktorů, které způsobují další poškození a případně vedou k místní nekróze. Akumulace mononukleárních buněk, migrace a proliferace buněk hladké svaloviny a vznik fibrotické tkáně vedou k dalšímu zvětšení a restrukturalizaci léze. Ta začíná být pokryta vazivovým krytem (čepičkou), který překrývá jádro (je tvořeno lipidovou a nekrotickou tkání) a vzniká tzv. komplikovaná léze. V tomto okamžiku již céva dále nemůže kompenzovat tuto situaci dilatací, vyklenuje se do lumen cévy a omezuje krevní průtok (17). 18
Obrázek 3. Schéma ztlušťování artérie v průběhu aterogeneze (převzato z internetových stránek: http://www.zdravcentra.sk/index.php?act=k-10&did=408) Obrázek 4. Schéma mechanismu rozvoje aterogeneze (převzato z internetových stránek: http://www.zdravcentra.sk/index.php?act=k-10&did=408) 19
2.1.3.1. Stabilní a nestabilní aterosklerotický plát Ruptura plátů a trombóza jsou významnými komplikacemi, které vedou k nestabilním koronárním syndromům. Ruptura jako komplikace ateromového plátu je hluboké prasknutí s uvolněním trombogenního materiálu do krve, kdežto u tzv. eroze mluvíme o povrchovém odstranění endotelu díky apoptóze endotelových buněk na povrchu léze. Aterosklerotické pláty můžeme rozdělit na stabilní a nestabilní. Stabilní plát má nízký obsah tuků a nemá tendenci k ruptuře s vytvořením následné trombózy, která pak obturuje cévní lumen. Nestabilní plát je bohatý na lipidy a při okrajích často praská. Dává tak vzniknout trombóze, která se projeví akutní cévní příhodou (14). U pacientů s infarktem myokardu je nestabilita a ruptura plátů výsledkem eroze, ztenčení a ruptury vazivové čepičky. Děje se tak často na okrajích lézí, kudy mohou vstupovat makrofágy, kde se hromadí, aktivují a kde probíhá apoptóza. Rozpad vazivové čepičky může být také výsledkem působení metaloproteináz (jako jsou kolagenázy, elastázy a stromelyzíny). Také T-buňky mohou stimulovat produkci mataloproteináz v lézích, což způsobuje nestabilitu plátů a má za následek další imunitní odpověď. Tyto změny mohou být také doprovázeny produkcí tkáňových prokoagulačních faktorů a dalších hemostatických faktorů, které dále zesilují možnost vzniku trombózy (18). Následkem ukládání plátů je zúžení cévního průsvitu, které může vést k ischemii. Dalšími následky tvorby plátů jsou ztuhnutí cévní stěny (kalcifikace), vznik trombů, které uzavírají zbylý průsvit a mohou způsobit periferní embolizaci, dále krvácení do plátů a do cévní stěny. Takto poškozená stěna může mimo jiné povolit tlaku a dokonce prasknout, takže dojde k nebezpečnému krvácení do okolní tkáně, např. z aorty nebo z mozkových cév (19). 20
Obrázek 5. - Schéma stabilního a nestabilního aterosklerotického plátu (19). 2.1.3.2. Klinické projevy aterosklerózy Projevy aterosklerózy jsou potom velmi rozmanité a závisí na oblasti, ve které se postižená céva vyskytuje. Jedná-li se o postižení koronární tepny srdce, může dojít k srdečnímu infarktu. Při infarktu se snižuje dodávka kyslíku a živin svalovým buňkám srdce. Dochází k srdeční ischemii (nedokrvení tkáně). Následkem je postižení až odumření svalových buněk a jejich náhrada neplnohodnotnou tkání neboli jizvou. Srdeční infarkt se nejčastěji projeví náhlou bolestí na hrudi, někdy vystřelující do levé paže, pocitem dušnosti a úzkosti. Rozsah následků vždy závisí na druhu postižené srdeční tepny a na jejím průměru (20). Pokud je nedokrvení pouze dočasné, vzniká přechodná ischemie, která se projeví přechodnými bolestmi na hrudi a dušností ustupujícími zpravidla po chvilkovém zklidnění nebo tabletě nitroglycerínu. Tento stav se nazývá angina pectoris a je zpravidla předstupněm srdečního infarktu. Mozková mrtvice (iktus, centrální mozková příhoda) je další komplikací aterosklerózy. Postižení je lokalizováno do cévního řečiště mozku. Postihuje zejména starší pacienty. Stejně jako v případě infarktu myokardu (srdečního svalu) i zde dochází k uzávěru 21
tepny a následné nedokrevnosti mozku. Na rozdíl od postupného uzavíraní cév způsobujícího sklerózu, je zde příčinou uzávěr náhlý. Podle oblasti, která je zasažena uzávěrem, vznikají příslušné neurologické příznaky. Nejčastějšími příznaky jsou: ztráta vědomí, ztráta citlivosti některých částí těla, ztráta hybnosti končetin, poškození mimiky obličeje apod. Rozsah postižení je různý. Změny mohou být i nevratné. Mírnějším projevem bývá takzvaná tranzitorní ischemická ataka (TIA), která se projeví chvilkovým bezvědomím a žádnými, případně rychle se upravujícími změnami hybnosti, řeči či cítění. Ischemická choroba dolních končetin (ICHDK) je onemocnění tepen dolních končetin. Zúžení průsvitu cév vede k charakteristickým příznakům. Pacienti si nejčastěji stěžují na klaudikační neboli námahovou bolest. Později se objevují i klidové bolesti dolních končetin, končetina je studená, mizí ochlupení, často se rozvíjí plísňové postižení nohou. Dlouhodobá nedokrevnost vede ke vzniku kožních defektů, které se špatně hojí. V případě úplného tepenného uzávěru je dolní končetina ohrožena tzv. gangrénou - odúmrtím tkáně s následnou infekcí. Tento stav často končí částečnou amputací končetiny (11). 2.1.3.3. Lipoproteiny Vzhledem k tomu, že lipidy mají hydrofobní povahu, je jejich transport v plazmě (vodném prostředí organismu) uskutečňován ve vazbě na bílkovinný nosič, kterým může být např. albumin (transport mastných kyselin), nebo prostřednictvím velkých makromolekulových komplexů, tzv. lipoproteinů. Tyto částice mají polární obal a nepolární jádro. Obal je tvořen apoproteiny, fosfolipidy a volným cholesterolem, jádro pak triacylglyceroly a estery cholesterolu (8). Procentuální zastoupení jednotlivých složek je u různých lipoproteinů rozdílné (tab. 1). 22
Tabulka 1 - Procentuální zastoupení jednotlivých složek v lipoproteinové částici chylomikrony VLDL HDL LDL apolipoproteiny 1-2 % 6 10 % 18 22 % 45 55 % triglyceridy 85 95 % 50 65 % 4 8 % 2 7 % cholesterol 3 7 % 20 30 % 51 58 % 18 25 % ostatní 3 6 % 15 20 % 18 24 % 26 32 % Význam apoproteinů spočívá především v zajištění transportu hydrofobních lipidů v plazmě. Dále jsou ještě potřebné pro: syntézu a sekreci specifických lipoproteinů aktivaci enzymů modifikujících lipoproteiny vazbu na specifické receptory na povrchu buněk odstraňujících lipoproteiny z krevního řečiště. Jednotlivé lipoproteinové částice lze klasifikovat např. podle bílkovinné části neboli apolipoproteinu nebo podle zastoupení jednotlivých lipidů v jedné struktuře. Nejčastěji jsou však rozlišovány podle fyzikálně-chemických vlastností. Díky nim se totiž jednotlivé typy lipoproteinů liší svou pohyblivostí v elektrickém poli při provádění elektroforézy na papíře nebo agarózovém gelu nebo svou sedimentací při ultracentrifugaci. Při elektroforetickém dělení zůstávají na startu chylomikrony, následuje frakce beta, prebeta a nejdále doputuje frakce alfa. Schematicky je lipoproteinová částice znázorněna na obr. 6 (21). 23
Obrázek 6 - Schéma lipoproteinové částice (21). Podle ultracentrifugace je dělení lipoproteinů následující: chylomikrony lipoproteiny o velmi nízké hustotě lipoproteiny o střední hustotě lipoproteiny o nízké hustotě lipoproteidy o vysoké hustotě. 24
2.1.3.4. Buněčné adhezní molekuly Adhezní molekuly jsou látky proteinového charakteru, které jsou exprimované na povrchu všech tkání organismu. Nepůsobí pouze jako pasivní lepidlo, ale účastní se také přenosu signálů mezi buňkami a podílí se tak na interakci buněk s okolním prostředím. Adhezivní molekuly se účastní řízení řady fyziologických dějů, jako jsou embryogeneze, buněčný růst a diferenciace, hojení ran, či obnova tkání. Uplatňují se ale také při patologických procesech, kde se např. podílejí na interakcích mezi složkami imunitního systému (5). Podle strukturní vlastnosti je můžeme rozdělit na 4 základní skupiny. Jsou to selektiny, integriny, imnoglobulinová skupina a kadheriny (22). Protože jsme se v této práci věnovali pouze adhezním molekulám VCAM- a ICAM-1 bude následující kapitolka věnována jim. Ig skupina adhezivních molekul je rozsáhlá rodina povrchových buněčných molekul, která představuje 50% všech povrchových molekul leukocytů. Jde o látky glykoproteinového charakteru tvořené opakujícími se Ig doménami z beta řetězců. Zprostředkovávají jak homofilní (vazba adhezivní molekuly v jedné buňce na stejnou molekulu ve druhé), tak heterofilní interakce (vazba adhezivní molekuly v jedné buňce na neidentickou molekulu ve druhé buňce) (23). Patří zde celá řada adhezivních molekul jako antigenně specifické receptory T a B lymfocytů TCR, BCR, koreceptory T lymfocytů CD4 a CD8, které jsou důležité pro jejich správnou funkci při imunitních reakcích. Z hlediska vztahu k ateroskleróze jsou nejvýznamnějšími zástupci vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) a platelet cell adhesion molecule-1 (PECAM-1). VCAM-1, ICAM-1 Struktura a funkce VCAM-1 a ICAM-1 Z hlediska struktury jsou obě adhezivní molekuly transmembránové glykoproteiny obsahující N-konec, sérii Ig domén, transmembránovou oblast a cytoplazmatický konec (obr. 7). 25
DT et al. (23) Obrázek 7: Struktura imunoglobulínové adhezivní molekuly (ICAM-1) podle Price VCAM-1 má 7 extracelulárních domén, přičemž domény 1 a 4 jsou specifická vazebná místa pro vazbu α 4 β 1 integrinu (VLA-4) a někdy pro vazbu α 4 β 7 integrinu (24). ICAM-1 má 5 extracelulárních domén, přičemž domény 1 a 3 jsou specifická vazebná místa pro vazbu α L β 2 integrinu (LFA-1), respektive pro vazbu α M β 2 integrinu (Mac-1), které jsou exprimovány na leukocytech (25). ICAM-1 může interagovat s řadou dalších molekul, jako jsou C3b, fibrinogen a bakteriální lipopolysacharid. Jak VCAM-1 tak ICAM-1 se podílí na stabilizaci vazby leukocytů k endotelu a podílí se tedy na jejich diapedezi. VCAM-1 zřejmě navíc selektivně vychytává mononukleární leukocyty, protože ty na rozdíl od neutrofilů exprimují α 4 integriny. Exprese VCAM-1 a ICAM-1 VCAM-1 i ICAM-1 jsou exprimovány endoteliálními buňkami, makrofágy a hladkosvalovými buňkami. Studie na králících a myších prokázaly, že VCAM-1 je endoteliálními buňkami exprimován ještě před akumulací makrofágů a T lymfocytů to v oblastech které jsou predispoziční ke vzniku lézí, přičemž lokalizace těchto míst je často ovlivněna hemodynamickými vlastnostmi především shear stresem. ICAM-1 je exprimován ve stejných oblastech jako VCAM-1, ale exprese ICAM-1 je pozorována i v oblastech s nízkou pravděpodobností výskytu aterosklerotických lézí (26). U malých aterosklerotických 26
lézí je VCAM-1 i ICAM-1 exprimován především endoteliálními buňkami, přičemž VCAM-1 je exprimován i hladkosvalovými buňkami, které přiléhají k aterosklerotické lézi. U pokročilejších aterosklerotických lézí je VCAM-1 i ICAM-1 exprimován většinou buněk, které se nacházejí v intimě cév. Přesto se ukazuje, že VCAM-1 je exprimován především v oblastech výskytu lézí, zatímco ICAM-1 je exprimován endoteliálními buňkami i mimo aterosklerotickou lézi (27). Exprese těchto adhezivních molekul je ovlivňována řadou faktorů, které se uplatňují i v patogenezi aterosklerózy. Hypercholesterolemie a oxidované LDL a diabetes zvyšují expresi jak ICAM-1, tak VCAM-1 (28). Také kouření, hyperhomocysteinemie, hemodynamický stres (nízký shear stress) zvyšují expresi VCAM-1 a ICAM-1. Exprese obou těchto molekul je také indukována zánětlivými cytokiny jako TNF-α nebo IL-1. Obecně lze tedy konstatovat, že obě tyto adhezní molekuly jsou markery zánětu (29). Obrázek 8: Mechanizmus přestupu leukocytů pře cévní endotel (23). 27
2.2. Vláknina Vlákninou rozumíme nestravitelné zbytky rostlinného původu. Tvoří ji heterogenní směs látek různého chemického složení a biologických účinků. Pod pojem dietní vláknina dnes zařazujeme nestravitelná rezidua rostlinného původu v lidské dietě a nejsou to výhradně jen složky rostlinných buněk. Definice dietní vlákniny podle Americké asociace chemiků cereálií (AACC-American Association of Cereal Chemists), přijatá v roce 2001: Dietní vláknina je tvořena poživatelnou částí rostlinných nebo obdobných sacharidů, které jsou rezistentní trávení a absorpci v lidském tenkém střevě s kompletní nebo částečnou fermentací v tlustém střevě. Dietní vláknina zahrnuje polysacharidy, oligosacharidy, lignin a ostatní podobné rostlinné substance. Ovlivňuje fyziologické děje svým prokinetickým účinkem a vyvolává pozitivní změny hladin krevního cholesterolu a glukózy (30). 2.2.1. Klasifikace vlákniny Vláknina se dělí na vlákninu nerozpustnou ve vodě (IDF insoluble dietary fibre, též tzv. hrubá vláknina). Patří sem lignin, celulóza a určitý podíl hemicelulóz. A vlákninu ve vodě rozpustnou (SDF soluble dietary fibre, též tzv. měkká vláknina), což jsou pektiny, gumy, slizy, hemicelulózy arabinoxylany obilovin, β-glukany ječmene, glukomannany a galaktomannany luštěnin (31). 28
Obrázek 9. Dělení dietní vlákniny 2.2.1.1. Rozpustná vláknina Absorbuje vodu, čímž změkčuje stolici a udržuje obsah střev v pohybu. Také na sebe váže toxické látky a tím dochází k jejich omezenému kontaktu se sliznicí. Mírně snižuje kyselost žaludečního obsahu a zpomaluje jeho vyprazdňování. Naopak zvyšuje viskozitu náplně žaludku a střev, tudíž zpomaluje promíchávaní tohoto obsahu. Omezuje přístup pankreatických amyláz a lipáz k substrátům. Zpomalí se tak průchod střevního obsahu a sníží se difúze živin, váží se minerální látky (zejména ionty Ca 2+, Fe 2+, Cu 2+, Zn 2+ ) a tím se modifikuje jejich dostupnost. Podmínkou je však dostatečný příjem tekutin. Část vázaných kationtů se uvolní při fermentaci v tlustém střevě. Rozpustná vláknina také ovlivňuje příznivě mikroflóru ve střevě (7). Účinek na metabolizmus glukózy a na hladinu cholesterolu Pektiny se nacházejí v pletivech vyšších rostlin a jsou složkami všech druhů ovoce a zeleniny. Více pektinu se nachází v jablkách, rybízu, angreštu, rajčatech, mrkvi a cukrové řepě, méně v třešních, višních, bezinkách, borůvkách. Základní struktura je tvořena lineárním řetězcem D-galakturonové kyseliny, jejíž jednotky jsou do různého stupně (průměrně 70%) esterifikovány methanolem. Jejich obsah v ovocné dužnině je okolo 1%. Pro nerozpustné nativní pektiny buněčných stěn asociovaných s celulózou se používá název protopektiny. Enzymovou hydrolýzou komplexem enzymů zvaných protopektináza se přeměňují na rozpustné nízkomolekulární pektinové látky. 29
Pektin ovlivňuje metabolismus glukózy a snižuje množství cholesterolu v krvi. Účinnější je pektin s vyšším obsahem methoxylových skupin (hrozny, broskve). Nerozpustné pektinové látky jsou příčinou tvrdosti a pevnosti nezralého ovoce a zeleniny (32). 2.2.1.2. Význam vlákniny Dietní vláknina, která dosáhne tlustého střeva, podléhá fermentaci bakteriální flórou za vzniku krátkých mastných kyselin (SCFA short chain fatty acids) kyseliny octové 62%, propionové 25%, máselné 16% a za tvorby CO2, H2 a CH4. Bakteriálním kvašením tak může být metabolizováno až 75% dietní vlákniny, která prochází tlustým střevem (33). Kyselina propiónová má inhibiční účinek na jaterní 3hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreduktázu, klíčový enzym při syntéze cholesterolu. Přídavkem vlákniny ke stravě v experimentu na zvířatech bylo prokázáno snížení aktivity tohoto enzymu. Kvašením pektinu dochází k nejvyšší produkci mastných kyselin s krátkými řetězci (34). Z metabolických a nutričních poruch se nedostatek vlákniny podílí na vzniku obezity, rozvoji diabetu typu 2 a hyperlipidémii. Největší účinek na snížení plazmatického cholesterolu má rozpustná vláknina (např. pektin, guarová guma). Tento pozitivní vliv je vysvětlován vychytáváním žlučových kyselin a jejich vylučováním stolicí, čímž dochází ke zvýšené tvorbě žlučových kyselin z cholesterolu v játrech a k poklesu celkových zásob cholesterolu v organismu. Vláknina mechanismem vazby žlučových kyselin přerušuje jejich enterohepatální cyklus a vede k mírnému poklesu cholesterolémie a ke snížení absorbce tuků z potravy (35). Dietní vláknina také působí na metabolismus sacharidů, přičemž se uplatní vliv vlákniny zpomalením pasáže potravy, inaktivací amylázy a ovlivněním výdeje hormonů GIT. Pektin brzdí absorpci sacharidů z tlustého střeva do krve, čímž upravuje kolísání krevního cukru. Vláknina redukuje sekreci inzulínu tím, že zpomaluje střevní absorpci cukrů. Studie naznačují, že při dietě s vysokým obsahem vlákniny se zvyšuje senzitivita na inzulín. Podle výsledků studie CARDIA (The Coronary Artery Risk Development in Young Adult) lze konstatovat, že dostatečný příjem vlákniny snižuje riziko kardiovaskulárních chorob významněji než změny v množství a druhů lipidů přijímaných v potravě (36). 30
2.2.2. MDOC oxidovaná celulóza Celulóza je polyanhydroglukóza, tvořená jednotkami β-d-glukopyrynózy vázaných vazbou β-1,4 v přímé řetězce. Jemně rozptýlený, bílý nebo krémově bílý až mírně nažloutlý prášek se slabým zápachem po spálení (37). Základem oxidované celulózy je anhydroglukuronová kyselina, která vzniká oxidací primární hydroxylové skupiny vázané na 6. uhlíku β-d-glukopyranózy. Oxidovaná celulóza může být popsána jako náhodný (statistický) kopolymer, který se skládá s anhydroglukózy a kyseliny anhydroglukuronové obecného vzorce, kde n značí stupeň polymerace, x průměrný stupeň oxidace celulózy <0,1>: [(C 6 H 10 O 5 ) 1-x (C 6 H 8 O 6 ) x ] n Když x=0 jedná se o čistou celulózu, x=1 jedná se o plně oxidovanou celulózu. X=0,5 poměr oxidované k čisté celulóze je 1:1 a můžeme ji označit vzorcem: CH 2 OH OH O O OH OH * O O O * OH COOH Oxidovaná celulóza, sodnovápenatá sůl, je nerozpustná v běžných organických rozpouštědlech a ve zředěných minerálních kyselinách. Je částečně rozpustná ve vodě, rozsah rozpustnosti záleží na stupni polymerizace. Je rozpustná ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů a v některých speciálních rozpouštědlech známých jako rozpouštědla celulózy (jako je například Schweizerovo činidlo, roztok amoniakálního oxidu mědi) (38). Předcházející studie potvrdily jisté hypolipidemické účinky MDOC včetně možného mechanizmu účinku. Zatím se ovšem nepodařilo prokázat významné antiaterogenní účinky v cévní stěně (39). n 31
2.3. Myší modely aterosklerózy Myši, jakožto využitelné laboratorní organismy, byly vůči ateroskleróze velmi rezistentní. Při dietě s nízkým obsahem cholesterolu a tukových částic (low-cholesterol, low-fat diet) měli cholesterol na úrovni pod 2,6 mmol/l, převážně obsažený v LDL-frakci a byli bez známek rozvinutí lézí. Nicméně při krmení vysokými dávkami cholesterolu v dietě s vysokým obsahem tuku a s obsahem cholových kyselin (very high cholesterol, high-fat diet containing cholic acid), vystoupil jejich cholesterol k faktoru od 2 do 3, s převahou cholesterolu v non-hdl frakci. Po mnoha měsících této diety se u některých kmenů myší dědila určitá tendence vytvářet zvláštní mateřské pěnové buňky v oblasti aortálního sinu, jako např. u kmenu C57BL/6, zatímco u jiných kmenů tato tendence chyběla (40). Dnes se využívají především různě geneticky upravené kmeny, které vyvíjejí léze buď spontánně (apoe KO myši vyšlechtěné a popsané v roce 1992) nebo po indukci tukovou dietou (LDL receptor KO myši vyšlechtěné a popsané v roce 1993) (41). Kmen myší s cílenou inaktivací apoe, ligandu pro LDL receptor, vyvíjí spontánní hyperlipidémii především VLDL typu a zvýšené cholesterolové hladiny ( 5 g/l) na nízkocholesterolové /nízkotukové dietě. Hladiny cholesterolu jsou 4 až 5-krát vyšší oproti normálu. ApoE KO myši vyvíjejí léze všech fází s morfologickými charakteristikami blízce podobnými člověku na stejných místech cévního stromu (obr. 6). Léze typu tukových proužků se začínají objevovat kolem šestého až osmého týdne věku. Již předtím, kolem čtvrtého až pátého týdne, se však na těchto místech predisponovaných k ateroskleróze nalézá zvýšená endoteliální exprese VCAM-1 (42). LDL R KO myši mají genetický defekt LDL receptoru, což je nejlépe zdokumentovaná příčina vývoje předčasné aterosklerózy u člověka. Pokud jsou udržovány na normální dietě mají jen asi dvakrát zvýšené plasmatické hladiny cholesterolu a vyvíjejí jen malé patologické změny. Pokud jsou však krmeny aterogenní (tukovou/cholesterolovou) dietou vykazují masivní zvýšení hladin plasmatického cholesterolu, poněkud více ve třídě LDL než u apoe KO myší a rychle u nich vznikají signifikantní tukové proužky s lipidy naplněným nekrotickým centrem. Fibrózní léze se nevyvíjejí. Existuje méně publikovaných dat o kinetice vývoje lézí u LDL R KO myší než u apoe KO myší, nicméně léze, které se vyvíjí u obou kmenů, jsou obecně stejné. Vývoj začíná v proximální aortě a rozšiřuje se směrem k aortě distální (43). 32
Obrázek 10. Predispoziční místa vývoje aterosklerotických lézí u apoe KO myší. 1. kořen aorty na úrovni chlopní, 2. malá kurvatura aortálního oblouku, 3. hlavní odstupy aortálního oblouku, 4. rozvětvení karotidy, 5. hlavní odstupy abdominální aorty, 6. bifurkace aorty, 7. rozvětvení iliaky, 8. rozvětvení plicní artérie. Na bázi těchto dvou kmenů bylo vyvinuto a neustále se vyvíjí spousta dalších transgenních či knockout kmenů pro studium genetických závislostí, lipoproteinového metabolismu a vývoje aterosklerotické léze. ApoE/LDLr deficientní myši představují model aterogeneze, který vyvíjí spontánní hypercholesterolemii a aterosklerózu rychleji a výrazněji než u výše zmíněných modelů. Zároveň byly tyto myši již použity při tetování substancí v několika předchozích studiích (44; 45). 33
3. Cíl práce Cílem této rigorźní práce bylo ověřit potenciální hypolipidemické a protizánětlivé účinky MDOC na experimentalním zvířecím modelu, kterým byly apoe/ldl-receptor deficientních myší. K tomu byly sledovány parametry lipidového spektra v krvi a exprese VCAM-1 a ICAM- v cévním endotelu. K hodnocení morfologických nálezů byly použity imunohistochemické a stereologické metody. 34
4. Experimentální část 35
4.1. Zvířata a předepsaná dieta Samice kmene C57BL/6J s dvojitým deficitem apolipoproteinu E a LDL-receptoru, vážící 15 20 gramů, byly zakoupeny v Taconic Europe (Dánsko) a ustájeny ve zvěřinci Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. Ve věku 8 týdnů jim začala být podávána aterogenní dieta (Western type diet) obsahovala 21% tuku (11% nasycených mastných kyselin) a 0,15% cholesterolu po dobu 8 týdnů (kontrolní skupina). V MDOC skupině byly myši krmeny stejnou aterogenní dietou, ke které bylo přidáváno 5% MDOC denně. Každá z myší v MDOC skupině byla chována v samostatné kleci. Dostávaly denně 6 g potravy (ve speciálně upravených granulích) a měly volný přístup k vodě po celou dobu studie. Během experimentu nebyly nalezeny změny tělesné hmotnosti v souvislosti se spotřebou potravy. Na konci experimentu byla zvířata přes noc vylačněna a byla provedena euthanasie předávkováním v parách éteru. Zvířatům byly odebrány ze srdce vzorky krve pro biochemické vyšetření. Dále byly odebrány segmenty tkáně tvořené aortou spolu s horní polovinou srdce. Tyto segmenty se ponořily do OCT media (Leica, Praha, Česká republika), následně byly zmraženy v tekutém dusíku a uskladněny při 80 C. 4.2. Biochemická analýza Celkové koncentrace cholesterolu byly hodnoceny enzymaticky na základě konvenčních diagnostických metod (Lachema, Brno, Česká republika) a spektrofotometrické analýzy (cholesterol v 510 nm, triglyceridy v 540 nm vlnové délky) (ULTROSPECT III, Pharmacia LKB biotechnologie, Uppsala, Švédsko). 4.3. Imunohistochemie Imunohistochemická a stereologická analýza byla provedena v 1 cm aortálního sinu a části aortálního oblouku. Vzorky se ponořily do OCT směsi, následně byly zmrazeny v kapalném dusíku a uloženy v ledničče při - 80 C. Na zmrazovacím mikrotomu byly poté nakrájeny série příčných řezů o tloušťce (7 um) a ty byly přeneseny na sklíčka předem upravené v roztoku želatiny. Řezy se nechaly oschnout a pak se na 20 minut vložily do roztoku acetonu uchovávaného v 20 C. Tímto procesem došlo k fixaci řezů a jejich lepší 36
adhezi na podložní sklíčko. Poté se řezy vložily do 0,3% roztoku peroxidu vodíku v PBS (15 minut), čímž se zablokovala endogenní peroxidázová aktivita. Před inkubací řezů s primární protilátkou bylo nutné ještě zablokovat nespecifická vazebná místa, proto se řezy na 30 minut ponořily do roztoku 10% goat séra v PBS (sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Německo). 1 hodinu se pak inkubovaly s primární protilátkou při pokojové teplotě. Po oplachu v PBS se řezy inkubovaly se sekundární protilátkou goad anti-mouse Ig konjugovaným na peroxidázou označený polymer (DAKO En Vision+TM, Carpinteria, USA). K tomu, aby navázané protilátky mohly být zobrazeny, se použil diaminobenzidin (DAB substrát-chromogen roztok, DAKO, Carpinteria, USA). Pro kontrolní sklíčka byl zvolen stejný postup, ale místo primární protilátky se použil roztok PBS. Byly použity následující primární protilátky: monoklonální protilátka rat anti-mouse CD106 (VCAM-1) zředění 1/100 monoklonální protilátka rat anti-mouse CD54 (ICAM-1) zředění 1/100 Všechny protilátky byly zakoupeny ve firmě BD Pharmingen (California, USA). Pracovní postup EnVision systém 1. sušení tkáňových řezů v termostatu (60min) 2. fixace v acetonu (-20 C; 30min) 3. oschnutí řezů (15min) 4. promytí v PBS (2 x 5 min) 5. aplikace 10% blokujícího zvířecího séra (30 min) 6. aplikace primární protilátky (inkubace 60 min) 7. promytí v PBS (2 x 5 min) 8. promytí v 3% H 2 O 2 (15 min) 9. promytí v PBS (2 x 5 min) 10. aplikace sekundární protilátky (inkubace 30 min) 11. promytí v PBS (2 x 5 min) 12. inkubace s roztokem chromogenu (DAB) (doba inkubace různá pro každou protilátku) 13. oplach řezů v acetonu 37
14. odvodnění řezů (aceton) 15. odvodnění řezů (aceton-xylen 10/1) (3 min) 16. odvodnění řezů (aceton-xylen 1/10) (3 min) 17. odvodnění řezů (xylen) (3 x 2 min) 18. montování řezů do Eukittu 4.3.1. Kvantitativní analýza imunohistochemie a velikost lézí Plochy exprese VCAM-1 a ICAM-1 byly kvantifikovány pomocí stereologických metod (46). Nejprve se nakrájela série řezů o tloušťce 7 μm (0,385 mm dlouhé úseky cévy tvořící tzv. referenční objem). Byl proveden systematický náhodný výběr řezů z referenčního objemu. První řez byl pro každé imunohistochemické barvení vybrán náhodně, a pak se vybral každý pátý řez, takže bylo pro každé barvení použito pět řezů ke stereologickému odhadu. Byla použita metoda bodové testovací mřížky, která se zvolila tak, abychom napočítali více než 200 průsečíků mezi body sítě a pozitivitou (hnědá barva) na jednu cévu (47). Odhadovaná plocha exprese se vypočetla podle vzorce: esta = a P kde parametr a charakterizuje plochu příslušející jednomu testovacímu bodu a P je počet průsečíků mezi body testovací sítě a imunohistochemickým barvením. Fotodokumentace a digitalizace snímků z mikroskopu Olympus BX byla provedena digitální kamerou Pixelink PL-A642 (Vitana Corp., USA) a za pomoci softwaru NIS verze 2.3 (Laboratory Imaging Prague, Česká republika). Stereologická analýza byla hodnocena softwarem PointGrid ELLIPSE (ViDiTo, Slovensko). 4.4. Statistická analýza Všechny hodnoty v grafech jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM (střední chyba průměru) pro 8 zvířat v každé skupině. Ke vzájemnému porovnání parametrů u MDOC a kontrolní skupiny byl použit nepárový T test. Rozdíly mezi skupinami byly statisticky významné v případě, že p α, kde α=0,05. K výpočtu byl použit GraphPad Prism software (verze 5.0). 38
5. Výsledky 39
5.1. Biochemická analýza U všech myší v experimentu byly stanoveny hladiny celkového cholesterolu a jednotlivých lipidových frakcí. Výsledky ukázaly, že podávání MDOC statisticky významně snížilo hladiny celkového cholesterolu, VLDL a navíc statisticky významně zvýšilo hladiny HDL cholesterolu (viz. Obr. 11). Obrázek 11. Lipidový profil u kontrolních a MDOC krmených ApoE/LDL receptor deficientních myší. Podávání MDOC statisticky významně snížilo hladiny celkového, VLDL cholesterolu ( * P 0,05) a zvýšilo hladiny HDL cholesterolu ( * P 0,05). Hodnoty platí pro průměr ± SEM, n = 8. 60 * 40 mmol/l * 20 0 TC VLDL LDL HDL TAG TC VLDL LDL HDL TAG * Kontrolní skupina MDOC skupina 40
5.2. Imunohistochemie 5.2.1. Imunohistochemické barvení VCAM-1 a ICAM-1 v oblasti aortálního sinu U obou skupin zvířat byly pozorovány rozsáhlé aterosklerotické léze v oblasti aortálního sinu a vzestupné aorty. Také exprese VCAM-1 a ICAM-1 byly detekovaná v v kontrolní i MDOC skupině. Exprese VCAM-1 byla pozorována v medii cév pod aterosklerotickými pláty. Dále byla pozorována exprese v aterosklerotických plátech. Silná exprese byla pozorována také na cévním endotelu v oblasti plátu i mimo něj (obr. 12). Barvení VCAM-1 bylo znatelně slabší u zvířat, kterým bylo podáváno MDOC. Exprese ICAM-1 vykazovala podobnou lokalizaci jako u VCAM-1. Přesto ICAM-1 nebyl exprimován buňkami cévní medie. Intenzita barvení se zdála být srovnatelná mezi kontrolní a MDO skupinou (obr. 13). 41
Obrázek 12: Imunohistochemické barvení VCAM-1 u kontrolní (A) a MDOC (B) skupiny zvířat. Silná exprese je pozorována v medii cévy pod aterosklerotickým plátem, v plátu a na cévním endotelu. Podávání MDOC znatelně snížilo expresi VCAM-1 v porovnání s kontrolní skupinou. Zvětšení 200x. A B 42
Obrázek 13: Imunohistochemické barvení ICAM-1 u kontrolní (A) a MDOC (B) skupiny zvířat. Silná exprese byla detekován zejména v plátu a na cévním endotelu. Z obrázku je patrná stejná lokalizace a téměř identická intenzita barvení u obou skupin. Zvětšení 200x. A B 43
5.2.2. Stereologická analýza exprese VCAM-1 a ICAM-1 u ApoE deficientních myší Stereologická analýza imunohistochemického barvení cév ze všech zvířat ukázala, že podávání MDOC signifikantně snížilo expresi VCAM-1 v aterosklerotických plátech ve srovnání s kontrolní skupinou v oblasti aortálního sinu a aortálního oblouku (viz. Obr. 14.) Podávání MDOC však neovlivnilo expresi ICAM-1 v aterosklerotických plátech. (viz obr. 15). Obrázek 14. Plocha VCAM-1 exprese v aortálním sinu a oblouku. Endoteliální exprese VCAM-1 byla po podání MDOC statisticky významně snížena ve srovnání s kontrolní skupinou. 44
Obrázek 15. Plocha ICAM-1 exprese v aortálním sinu a oblouku. Podávání MDOC vedlo pouze k nesignifikantnímu snížení exprese ICAM-1. 45