Protilátky proti Helicobacter pylori (IgG) Návod na použití ELISA testu Objednací číslo Určení Ig-třída Substrát Formát EI 2080-9601 G Helicobacter pylori IgG Ag-potažené mikrotitrační jamky 96 x 01 (96) Princip testu: Kit ELISA test nabízí kvantitativní in-vitro test na lidské IgG protilátky proti Helicobacter pylori. Testovací kit obsahuje osm mikrotitračních proužků, každý s 8 odlomitelnými reagenčními jamkami potaženými antigeny Helicobacter pylori. V prvním reakčním kroku jsou naředěná séra pacientů inkubována v jamkách. V případě pozitivních vzorků, se specifické IgG (rovněž IgA a IgM) protilátky naváží na antigen. V druhém kroku jsou použity enzymově značené protilátky proti lidským IgG protilátkám, které následně katalyzují barevnou reakci. Intenzita zabarvení je úměrná koncentraci protilátek proti Helicobacter pylori. Obsah kitu: - Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky, každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití) - Kalibrační sérum 1, 200 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno tmavě červeně. - Kalibrační sérum 2, 10 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno červeně. - Kalibrační sérum 3, 1 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno světle červeně. - Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno modře. - Negativní sérum (lidské IgG): 1x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno zeleně. - Enzymový konjugát: peroxidasou značené králičí protilátky proti lidským IgG: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Značeno zeleně. - Vzorkový pufr: 1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno světle modře. - Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný) - Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen: tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku. - Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití. 1 N kyselina fosforečná. - Návod k provedení testů - Protokol s hodnotami. Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až +8 o C, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HbsAG, anti-hcv, anti- HIV-1 a anti-hiv-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody.
Příprava a stabilita reagencií Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu. Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a trhnutím otevřete lepící ochranný obal. Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska vytemperovaná na pokojovou teplotu, tím zabráníte zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 o C až +8 o C, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. Kalibrační a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat. Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat. Vzorkový pufr: Připraven k použití Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou. Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 o C až +8 o C. Poznámka: Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 o C a před ředěním promíchejte. Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Zastavovací roztok. Připravený pro užití Ředění séra a vzorků plasmy Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například, přidejte 10 µl séra k 1 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. Poznámka: Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je znovu. Inkubace Inkubace vzorku: 1. Krok. Přeneste 100 µl kalibračního séra, pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých mikrotitračních jamek a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě. Promývání: Vyprázdněte jamky a následně promyjte každou jamku třikrát pomocí 300 µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechte pufr v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu, teprve potom jamku vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů (provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky dnem vzhůru na filtrační papír.
Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou značené anti-lidské IgG) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Promývaní: Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační desky a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový roztok. Měření: Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce mezi 620 a 650 nm za 30 minut od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku. Pipetovací protokol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C1 P4 P12 P20 B C2 P5 P13 P21 C C3 P6 P14 P22 D pos P7 P15 P23 E neg P8 P16 P24 F P1 P9 P17 G P2 P10 P18 H P3 P11 P19 Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem analýzy sér od 24 pacientů (P1 až P24). Kalibrační séra (C1 až C3), pozitivní a negativní kontrolní séra (pos a neg) a všechny vzorky sér od pacientů byly inkubovány každý v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužků. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií. Výpočet výsledků Horní hranice referenčního rozsahu u neinfikovaných osob (cut-off value ) je podle doporučení EUROIMMUN 20 mezinárodních jednotek na mililitr (IU/ml). Hodnoty vyšší, než je tato hranice, se považují jako pozitivní, pod touto hranicí jako negativní. Jak pozitivní, tak negativní kontrolní sérum, slouží jako vnitřní kontrola pro provedení testu, musí být proto zařazeny v každém prováděném testu. Kvalitativní nebo semikvantitativní vyhodnocení: Hodnoty extinkce vzorků sér dosahujících maximálních hodnot séra 2 (10 IU/ml) se považují za pozitivní, séra s hodnotami pod touto hranicí jako negativní. Vedle této kvalitativní interpretace je možné také jemnější vyhodnocení výsledků. Poměry > 1,0 se považují jako pozitivní, poměry < 1,0 jako negativní. Poměry se vypočítají z následujícího vztahu: Extinkce vzorku séra Extinkce kalibračního séra 2 = Poměr
Kvantifikace: Křivka standardů, ze které se odečítá koncentrace protilátek ve vzorcích sér, se sestrojí vynesením hodnot extinkce získaných z měření 3 kalibračních sér, bod po bodu, proti odpovídajícím jednotkám (lineární/lineární). Následující vynesení je příkladem typické kalibrační křivky. Prosím, neužívejte tuto kalibrační křivku k určení koncentrací protilátek v sérech pacientů. Extinction 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 RU / ml Jestliže hodnoty extinkce vzorku leží nad hodnotami standardní křivky, doporučujeme, aby byl vzorek znovu otestován při ředění 1:400. Výsledek v IU/ml získaný ze standardní křivky pro tento vzorek se potom musí vynásobit faktorem 4. Charakteristiky testu Kalibrace: Kalibrace se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) s využitím materiálu třetího mezinárodního jednání o přípravě standardů Světové zdravotnické organizace (WHO). Pro všechny skupiny prováděných testů musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a mezinárodní jednotky určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v hranicích určených pro tyto důležité hodnoty. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a proto se musí opakovat. Vazebná afinita protilátek, stejně tak aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Kalibrační séra se vystaví stejnému vlivu, a to proto, že tyto změny jsou povětšinou zakalkulovány ve výpočtu výsledků. Tyto změny se berou následovně do úvahy a přizpůsobují se časy inkubace substrátu vzhledem k pokojové teplotě: Pokojová teplota 14 o C - 18 o C Pokojová teplota 19 o C - 23 o C Pokojová teplota 24 o C - 30 o C doba inkubace substrátu 18 min doba inkubace substrátu 15 min doba inkubace substrátu 12 min Antigen: Antigen je představován kmenem Lior 1 (Brussels) Helicobacter pylori. Bakteriální kultura je rozbita v alkalickém pufru. Použita antigenní směs je otestována pomocí SDS elektroforézy, jestli obsahuje všechny významné proteiny.
Linearita: Linearita testu byla zkoumána pomocí série ředění sér pacientů s vysokými hladinami koncentrací protilátek. Následující obrázek ukazuje typickou linearitu vzorků zjištěnou na základě 4 sér pacientů. ELISA anti-helicobacter pylori (IgG) vykazuje linearitu měření v oblasti 1 až 500 IU/ml. RU 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 µl Serum / ml Detekční limit: Detekční limit anti-helicobacter pylori ELISA (IgG) je přibližně 1 RU/ml. Reprodukovatelnost: Reprodukovatelnost testu byla zkoumána určením intra- a interměření variačních koeficientů (CV) 3 sér s hodnotami ležícími na různých místech kalibrační křivky. Intra-měření CV jsou založena na 20 stanoveních a inter-měření CV na 4 stanoveních provedených v 6 různých dnech. Intra-měření-variace, n = 20 Sérum Naměřená hodnota CV (%) (Extinkce) 1 0.477 5.1 2 0.823 4.5 3 1.087 4.1 Inter-měření-variace, n = 4x6 Sérum Naměřená hodnota CV (%) (RU/ml) 1 21.5 10.2 2 67.0 9.4 3 98.5 7.3 Klinický význam: První kultura Helicobacter pylori byla z mukózního sliznice žaludku pacienta s chronickou gastritidou získaná v roce 1982. Helicobacter pylori je gram-negativní bakterie spirálovitého tvaru s neobvykle vysokou produkcí ureasy, která se hromadí intacelulárně na luminální straně epiteliálních buněk mukózní sliznice žaludku. Existují dva různé typy: spirálovitě stočený infekční typ a kulovitý, dlouho-žijící typ. Helicobacter pylori je pouze lidským patogenem. Biopsie ukazují kolonizaci převážně sliznice dutiny břišní, řidčeji je pak Helicobacter pylori nalézán v duodenu v případech žaludečních metaplasií. Okolo 50% světové populace je infikováno a epidemiologické studie ukazují, že míra infekce stoupá s věkem. U Helicobacter pylori se předpokládá, že je etiologické agens zodpovědné za gastritidu typu B. Klinické izoláty Helicobacter pylori mohou být rozděleny do dvou typů: kmen Typu I může vylučovat jak cytotoxin (VacA, tak přidružený protein (CagA). Kmeny, které nejsou schopny syntetizovat tento protein patří do Typu II. Zdá se, že infekce typem I je
vysoce patogenní. Klinické symptomy se vyznačují především gastritidou a tvorbou žaludečních vředů. Po kontaktu organismu s Helicobacter pylori mohou být v séru pozorovány protilátky typu IgA, IgG a IgM proti Helicobacter pylori. Specifické protilátky IgM se ztrácí po pár týdnech, zatímco IgA protilátky mohou být detekovány po dlouhou dobu. Poté, co klesne titr IgM protilátek, vzrůstá obvykle titr IgG protilátek a přetrvává po mnoho let. IgA protilátky jsou tvořeny lokálně, ale ne vždy mohou být v séru detekovány. Positivní výsledek na IgA protilátky dobře koreluje s aktivitou gastritidy. Vyšší titr IgG protilátek je známkou chronické infekce. Protilátky proti Helicobacter pylori jsou pozorovány u zhruba 70% pacientů s chronickou aktivní gastritidou a v 60-90% jsou spojeny s žaludečními vředy. Testy na specifické IgG protilátky proti Helicobacter pylori jsou dobrými indikátory celkové eradikace agens, stejně jako monitorování terapie. Signifikantní pokles v titru IgG protilátek po šesti týdnech terapie je známkou jejího úspěchu.