Vybranné interpretace měkkých MS a MS/MS spekter
o. 1- určete MW, vysvětlení izotopů ESI/APCI + [M+H] + 325 () MW=324 1 chlor ( 35 Cl/ 37 Cl=:32) [TEA] + 102 (35) 327 (33) 326 (15) 328 (5) 150 200 250 300 350 400 450 500 ESI/APCI - [M-H] - 323 () [HS 4 ] - 97 (51) 325 (32) 324 (13) 326 (6) 150 200 250 300 350 400 450 500 - šum bude v dalších spektrech pro jednoduchost zanedbán - izotopické píky nebudou většinou zakresleny
o. 2 - určete MW, popište ionty APCI + 150 200 250 300 350 400 450 500 420 [M+H 4 ] + 461 [M+CH 3 C] - D = 2 Úkol: jaké změny očekáváte po přídavku 5 mm octanu amonného do mobilní fáze APCI - [M+H] + 403 () [M+a] + 425 (29) 441 (5) D = 38 [M-H] - 401 () D = 22 [M+K] + MW=402 D = 16 150 200 250 300 350 400 450 500
o. 4 APCI + MW=421 1 brom lichý počet dusíků karboxylová skupina MF obsahuje H 4 CH 3 C 288 (5) 316 (4) [M+H] + 422 () 424 (96) [M+H-C 2 ] + [M+H 4 ] + 380 (2) 378 (2) 439 (5) 441 (5) 150 200 250 300 350 400 450 500 APCI - [CH 3 C] - [M-H-C 2 ] - 59 (51) 378 (22) 376 (22) [M-H] - 420 () 422 (98) 480 (5) [M+CH 3 C] - 482 (5) 150 200 250 300 350 400 450 500 APCI +, MS/MS 422 [M+H-C 2 ] + 378 () 380 (97) [M+H] + 422 (2) 424 (2) 150 200 250 300 350 400 450 500
o. 5 - určete MW ESI + 415 A/ [M+2H] 2+ B/ [M+H] + A/ [M+H] + B/ [2M+H] + A: MW=828 B: MW=414 829 200 300 400 500 600 700 800 900 415.0 A/ 415.0 B/ 829.0 415.5 416.0 416.0 417.0 830.0 831.0
o. 6 - určete MW a další strukturní informace APCI + [M+H] + 451 [M+H- 2 ] + [M+H-] + 405 [M+H-] + 421 435 [M+a] + 150 200 250 300 350 400 450 500 473 [M+H+AC] + 492 MW=450 nitroskupina sudý počet dusíků MF obsahuje acetonitril M -. APCI - 450 150 200 250 300 350 400 450 500
1/ Určete polaritu záznamů. 2/ Určete MW a popište ionty. o. 10 [M+H] + -C 2 H 5 H 28 -C 46 [M-H] - -C 2 H 5 H 46
o. 12 - určete M R a maximum informací APCI + 150 200 250 300 350 400 450 500 APCI - [Br]- 79 81 MW = 407-2 Br, 1 CH - lichý počet dusíků [M+H-C 2 ]+ 326 328 364 366 368 [M+H-C 2 ]+ [M-H]- [M-H-HBr]- 362 364 366 [M+H]+ 410 408 412 408 410 406 [M+H 4 ]+ 425 427 429 150 200 250 300 350 400 450 500 Úkol: nakreslete izotopickou obálku včetně intenzit pro dimerní ion [2M+H]+ [2M+H]+ 815 817 819 821 823
o. 9 - určete MW, popište ionty ESI/APCI + 405 () 149 (32) Ftaláty [M+H] + [M+a] + 427 (29) D = 22 MW=404 D = 16 167 (4) 443 (5) [M+K] + 150 200 250 300 350 400 450 500 [C 8 H 7 4 ] + D = 38 149 167 Výpočet elementárního složení ftalátů: [M+H] + [C 17+8 H 34+7 4 ] + = [C 25 H 41 4 ] + 405 167 = 238 238/14 = 17 = 17xCH 2 = C 17 H 34 M C 25 H 40 4
Příklad interpretace spekter proteinů
Schéma značení fragmentových iontů peptidů (typická písemková otázka) Typické fragmenty pro CID MS/MS Typické fragmenty pro ETD, UVPD x 3 y 3 z 3 x 2 z 2 y 1 y 2 x 1 z 1 R1 R2 R3 R4 H 2 C C C C C C C CH H H H H H H H a 1 b 1 c 1 a 2 c 2 a 3 b 3 b 2 c 3 C-C (a, x); peptidová vazba (b, y); -Ca (c, z)
o. 8 [M+19H] 19+ [M+18H] 18+ 975.6 1029.6 Interpretace spektra? jaký typ látky jde? Jakou technikou změřeno? [M+17H] 17+ 1090.3 R=16 000 [M+20H] 20+ 927.1 [M+16H] 16+ 1158.5 [M+15H] 15+ 1235.8 Zoom 1424.5 až 1426.5 [M+21H] 21+ 883.1 [M+14H] 14+ 1323.8 [M+13H] 13+ 1425.5 Příklad výpočtu MW: A = 1029.6 = (MW + z) / z B = 975.6 = (MW + z + 1) / (z + 1) - řešením vyjde z = 18.05 = 18 A: MW = 1029.6 * 18 18 = 18514.8 B: MW = 975.6 * 19 19 = 18517.4, atd. Změřeno pomocí ESI + Protein MW=18521 Da
Zadání: Určete o jaký typ sloučeniny se jedná a určete její molekulovou hmotnost. Jakou instrumentací bylo změřeno níže uvedené MS spektrum? Protein - Hemoglobin A (a řetězec) MALDI/TF Zoom 15118.5 až 15137.5 R=16 000
Důležitost izotopické distribuce v interpretaci
Výchozí informace: bílá krystalická látka měřeno v ESI - Hodnoty ve spektru odpovídají nejintenzivnějším píkům izotopické distribuce jednotlivých iontů D 58 D 60 D 58 268.80 D 58 [(acl) n +Cl] - D 58 2*Cl 4*Cl 208.85 92.93 94.93 96.92 150.89 152.88 Detaily izotopické distribuce 5*Cl 210.84 212.84 214.84 216.83 D 58 210.84 D 58 560.59 794.42 150.89 D 58 326.76 D 58 D 58 502.63 D 60 618.55 444.67 D 60736.46 970.30 D 58 92.93 384.72 678.50 0 50 200 400 600 800 154.88 268.80 266.80 156.88 270.80 3*Cl 272.79 274.79 U molekul složených z atomů, které nemají M+1 izotop se nevyskytují píky M+1, M+3, atd.
R=35000 Protein v ESI+ [C 769 H 1202 210 218 S 2 +10H] 10+ 1695.71 1695.61 Interpretace izotopické obálky 1696.01 1696.11 1695.91 1696.21 1696.31 1695.81 1696.41 1696.51 D je 0.1 (náboj je tedy 10) 1696.61 1696.71 Protein jednou nabitý [C 769 H 1212 210 218 S 2 +H] + R=35000 16952 16951 16950 16949 16948 16947 16953 16954 16955 D je 1 (náboj je tedy 1) 16956 16957 16958 Klástr AgCl polysacharid R=3000 [(AgCl) 10 Ag] + R=13000 [(C 6 H 10 5 ) 40 +H] D je 1 6486.13 + 1539.64 1541.64 6485.13 (náboj je tedy 1) 6487.13 D je 1 1537.64 1543.63 Chybí izotopy M+1 atd. (náboj je tedy 1) 1535.64 1533.64 1545.63 6484.12 6488.14 6489.14 1547.63 6483.12 6490.14 1549.63
Určete o jaký typ sloučenin se jedná (všechny ionty jsou jednou nabité) D je 44
Interpretace LC/ESI- MS/MS (metabolity léčiv)
Metabolismus xenobiotik Základní funkce metabolismu xenobiotik (látky cizí organismu léčiva, pesticidy, kontaminanty, atd.) je transformace na derivát s vyšší rozpustností ve vodě, který může být snáze eliminován z těla Metabolismus xenobiotik má dva základní kroky: I. fáze reakční změny funkčních skupin: oxidační (hydroxylace, epoxidace) a redukční (redukce karbonylu) reakce, dealkylace na heteroatomu, hydrolýza esterů atd. II. fáze konjugační reakce (např. glukuronidace, sulfatace, glykosylace, reakce s aminokyselinami, metylace atd.) I. fáze II. fáze H H S 3 H Experimentální přístup HPLC/MS v obou módech polarity, správná volba ionizační techniky Určení molekulové hmotnosti: I. fáze APCI, ESI, APPI, II. fáze ESI Identifikace metabolitů je založena na interpretaci MS/MS spekter, retenčního chování (retenční indexy), UV spekter z PDA detektoru, popř. informací z dalších spektrálních technik
Defekty atomových hmotností Element ominal atomic mass [Da] Mass defect [mda] H 1 +7.8 C 12 0 14 +3.1 16-5.1 F 19-1.6 Si 28-23.1 P 31-26.2 S 32-27.9 Cl 35-31.1 Br 79-81.7 I 127-95.5 ejběžnější metabolické reakce I. fáze ominal mass shift [ΔDa] Metabolic reaction (elemental composition change) Exact mass shift [mda] -44 Decarboxylation (-C 2 ) +10.2-18 Alcohol dehydration (-H 2 ) +10.6-14 Demethylation (-CH 2 ) -15.7-2 Ring formation (-H 2 ) -15.7 +2 Ring opening (+H 2 ) +15.7 +14 Hydroxylation and cyclization (+-H 2 ) -20.7 +16 Hydroxylation (+) -5.1 Epoxidation (+) -5.1 xidation (+) -5.1 +34 Epoxidation and hydration (+H 2 2 ) +5.5
ejběžnější metabolické reakce II. fáze ominal mass shift [ΔDa] Conjugation reaction (elemental composition change) Drug functional group Exact mass shift [mda] +14 Methylation (+CH 2 ) H 2, H, SH +15.7 +42 Acetyl conjugation (+C 2 H 2 ) H 2, HH 2, S 2 H 2, H +10.6 +57 Glycine conjugation (+C 2 H 3 ) CH +21.5 +79 Phosphorylation (+P 3 ) H -41.5 +80 Sulfation (+S 3 ) H 2, S 2 H 2, H -43.2 +162 Glucosylation (+C 6 H 10 5 ) H, CH +52.8 +176 Glucuronidation (+C 6 H 8 6 ) H +32.1 +220 Indirect carbamate glucuronidation of amines (+C 7 H 8 8 ) H 2 + C 2 +21.9 +306-X Glutathione conjugation halide substitution (-X+C 10 H 16 6 3 S) Halide (X) +76.0 +305 Glutathione conjugation via epoxidation (+C 10 H 15 6 3 S) Aromatic +68.2 V review celkem popsáno 54 metabolických reakcí I. fáze a 25 reakcí II. fáze M. Holčapek, L. Kolářová, M. obilis, Anal. Bioanal. Chem, 216 (2008) 1962
Retence v závislosti na polaritě relativní retence typ metabolizace 0.3 0.9 většina metabolitů (např. hydroxylace, redukce ketonu, dealkylace, glukuronidace, sulfatace, atd.) > 1 např. -oxidace, hydrogenace, b-oxidace, -H 2 (tvorba kruhu), -H 2 (dehydratace alkoholu)
jaké metabolity se jedná? H MW=363 -demethylace ba metabolity mají stejné elementární složení - D 31 jejich rozlišení na základě retence (standardy) t CH 3 H 2 R = 21.1 min MS/MS spekter výchozí léčivo D 14 MW=377 t R =21.7 min D 14 MS/MS 378 D 45 (CH 3 ) 2 H ba metabolity mají stejné elementární složení - jejich rozlišení na základě retence (standardy) nebo MS/MS -demethylace MW=363 H t R =13.8 min D 45 (CH 3 ) 2 H
jaké metabolity se jedná? MW=393 -oxidace t R = 23.4 min D 28 + 61 D 61 (CH 3 ) 2 H výchozí léčivo D 16 MW=377 D 16 t R =21.7 min MS/MS 378 D 45 (CH 3 ) 2 H ba metabolity mají stejné elementární složení - jejich rozlišení na základě retence (standardy) nebo MS/MS hydroxylace MW=393 t R =13.7 min D 45 (CH 3 ) 2 H H
Zadání: V LC/HR-MS záznamu vzorku plasmy potkana, kterému bylo perorálně podáno léčivo dimefluron (C 23 H 23 4 ) byly nalezeny dva metabolity o stejném elementárním složení C 28 H 31 10. jaké metabolity se jedná? (UV spektra výchozí látky a léčiva jsou naprosto odlišná). Fáze I: redukce karbonylu C 28 H 31 10 C 6 H 8 6 = DC 22 H 23 4 D-C demethylace - C 23 H 23 4 Fáze II: glukuronidace 542.2021 [M+H] +, t R = 10.6 min H D 176 C 6 H 8 6 D 194 C 6 H 10 7 H + GLU 542.2013 [M+H] +, t R =15.7 min H CH 2 CHHCH 3 D 57 D 194 C 6 H 10 7 + GLU D 176 C 6 H 8 6 H
Zadání: V LC/HR-MS záznamu vzorku plasmy potkana, kterému bylo perorálně podáno léčivo dimefluron (C 23 H 23 4 ) byly nalezeny dva metabolity (MW=541). a základě HR-MS měření různé elementární složení (viz níže). jaké metabolity se jedná? 1. C 28 H 31 10 2. C 29 H 35 9 542.2021 [M+H] +, t R =10.6 min 1) Fáze I: demethylace, red. karbonylu 2) Fáze I: red. karbonylu H Fáze II: glukuronidace Fáze II: glukosylace D 176 C 6 H 8 6 výchozí léčivo H + GLU D 194 C 6 H 10 7 D 180 C 6 H 12 6 H H glukosylace 542.2375 [M+H] +, t R = 13.6 min CH 2 H H D 162 C 6 H 10 5
Výchozí zadání: V LC/HR-MS záznamu vzorku plasmy potkana, kterému bylo perorálně podáno léčivo benfluron (C 21 H 19 2 ) byl nalezen metabolit o elementárním složení C 21 H 21 6 S. jaký metabolit se jedná? C 21 H 21 6 S S 3 = DC 21 H 21 3 DH 2, - C 21 H 19 2 Fáze I: hydroxylace, redukce karbonylu t R =15.8 min. M=C 21 H 21 6 S Fáze II: sulfatace I. D 80 S 3 H S C 21 H 19 2 H H H nebo II. H S H Kdyby byly 2* místo S, M+2 izotop by měl 4.3 D 71 (CH 3 ) 2 HCH=CH 2 D 45 (CH 3 ) 2 H ESI + - MS/MS (416) D 80 S 3 D 98 H 2 S 4
Retence v závislosti na polaritě H CH H relativní retence typ metabolizace H 0.3 0.9 většina metabolitů (např. hydroxylace, redukce ketonu, dealkylace, glukuronidace, sulfatace, atd.) > 1 např. -oxidace, hydrogenace, b-oxidace, -H 2 (tvorba kruhu), -H 2 (dehydratace alkoholu) b-oxidace M2 -H 2 (M6) (tvorba laktonu) R. Jirásko, a kol. Anal. Bioanal. Chem, 405 (2013) 7181.
atorvastatin M=558 Význam měření tandemových spekter H CH H D 160 ESI - MS/MS of 557 D 119 D 160 F D 119 D 104 H b-oxidace M=498 b-oxidace + hydroxylace M=514 ESI - D 119 MS/MS of 497 D CH D CH D F F ESI - D 135 MS/MS of 513 H H H D D 119 D 135
Význam měření tandemových spekter M=574, C 33 H 35 2 6 F = atorvastatin + (kde proběhla oxidace?) H CH H D 135 MS/MS of 573 D 160 F H + + ESI - MS/MS of 573 D 160 + struktury fragmentových iontů D 119 134 nebo F 278 F 294 CH 3 C D 58 CH 3 MS/MS of 573 D 160
Další příklady interpretace MS a MS/MS
o. 18 - identifikujte! 46 62 APCI - 50AC/W 2 CH 2 CH 2 2 C CH 2 2 CH 2 2 MW=316 pentrit 50 150 200 250 300 350 400 APCI - 50AC/W + 5 mm H 4 Cl [M+Cl] - 351 353 50 150 200 250 300 350 400 ápověda: jde o hlavní složku původního pardubického produktu ápověda 2:... nejde o hmotnostní spektrum perníku:-)
Důležitost vysokého rozlišení a MS/MS -87 MS/MS (834) -180-162 -183-59 -18 Lipid Prekurzorový ion Typická neutrální ztráta PS 38:4 834.5246 [M+a] + D 87 (C 3 H 5 2 ) PC 40:6 834.6013 [M+H] + D 59 (C 3 H 9 ) D 183 (C 5 H 14 4 P) HexCer 42:1 834.6795 [M+a] + D 162 (C 6 H 10 5 ) D 180 (C 6 H 12 6 )
Příklad identifikace degradačních produktů
o. 15 identifikujte degradační produkty Výchozí informace: barvivo C.I. Direct Red 7 bylo elektrolyticky degradováno za redukčních podmínek, vzniklé produkty byly analyzovány pomocí HPLC/MS Úkol: identifikujte produkty a navrhněte reakční mechanismus degradace ESI- () 355 H 2 H 3 C CH 3 H 2 Výchozí barvivo C.I. Direct Red 7 (C 34 H 28 8 6 S 2 ) S 3 H (52) 711 (10) 733 S 3 H 200 300 400 500 600 700 800 ESI- Degradační produkt A () 237 H 2 H 2 APCI+ Degradační produkt B () 245 H 3 C CH 3 S 3 H H 2 H 2 (12) 286 150 200 250 300 150 200 250 300
o. 15 identifikujte degradační produkty barvivo C.I. Acid Yellow 9 bylo elektrochemicky degradováno v acl kvůli čistění odpadních vod, HPLC/ESI-MS záporný mód, v základním skenu převládal ion, ze kterého bylo následně automaticky měřeno MS/MS spektrum H 3 S MS/MS 356 Acid Yellow M R =357 171 248 S 3 H H 2 292 276 HPLC 184 356 150 200 250 300 A B C 12.9 MS/MS 172 Produkt A 108 MS/MS 173 Produkt B H 3 S H 2 H3 S H 155 109 80 155 172 80 173 50 150 200 50 150 200
o. 15 identifikujte degradační produkty barvivo C.I. Acid Yellow 9 bylo elektrochemicky degradováno v acl kvůli čistění odpadních vod, HPLC/ESI-MS záporný mód, v základním skenu převládal ion, ze kterého bylo následně automaticky měřeno MS/MS spektrum H 3 S MS/MS 356 Acid Yellow M R =357 171 248 S 3 H H 2 292 276 HPLC 184 356 150 200 250 300 A B C 12.9 MS/MS 191 Produkt C 127 64 80 129 H 3 S 191 193 50 150 200 Cl
o. 15 shrnutí výsledků barvivo C.I. Acid Yellow 9 bylo elektrochemicky degradováno v acl kvůli čistění odpadních vod, HPLC/ESI-MS záporný mód, v základním skenu převládal ion, ze kterého bylo následně automaticky měřeno MS/MS spektrum H 3 S 4H +,4e - H 2 H 3 S H 2 H 2 H 2 S 3 H Cl -, ClH. H 2 S 3 H Cl -, ClH. H 3 S Cl Cl -, ClH. H 3 S H Cl -, ClH. H 3 S Cl H 2 4H +,4e - Cl H 3 S H 2 H 2 H 3 S Cl H Cl -, ClH. S 3 H Cl -, ClH. Cl -, ClH. H 3 S Cl H 2 4H +,4e - Cl H 3 S H 2 H 2 H 3 S Cl H Cl S 3 H Cl Cl Reference: Rapid Commun. Mass Spectrom. 20 (2006) 2807
Typické zkouškové otázky základní termíny vč. typů iontů a hmotností iontů, význam izotopů v hmotnostní spektrometrii, vysvětlit na příkladech, dusíkové pravidlo (EI versus měkké) vysvětlit základní principy ionizačních technik: EI, CI, ESI, APCI, APPI, MALDI určení M R proteinů pomocí ESI, fragmentace proteinů jaký je rozdíl mezi EI spektry a spektry měřenými měkkými ionizačními technikami, vysvětlit na modelovém příkladu vysvětlit základní fyzikální principy hmotnostních analyzátorů: magnetický analyzátor s dvojí fokusací iontů, Q, iontová past (sférická vs. lineární), TF (včetně použití reflektronu, zpožděné extrakce iontů a QqTF uspořádání), rbitrap, ICR-MS co je to tandemová hmotnostní spektrometrie a MS n, k čemu se používá, typy fragmentací co je to hmotnostně spektrometrické zobrazování (jaké ionizace), a jaké jsou jeho aplikace základní princip spektrometrie iontové pohyblivosti a jaké jsou její aplikace jak byste správně provedli kvantitativní měření pomocí HPLC/HR-MS a HPLC/MS (QqQ), význam interního standardu, validace jaké kroky jsou důležité při identifikaci neznámé látky pomocí hmotnostní spektrometrie důležité parametry (ne)ovlivňující MS spektra při LC/MS (požadavky na mobilní fázi apod.) jakými způsoby lze provést kalibraci hmotnostní stupnice a u jakých přístrojů je zvláště důležitá vysvětlit princip a praktické využití GC/MS a HPLC/MS pro jaký typ látek je možné techniky využít, jak budete volit ionizační techniku podle typu analytu (na čem bude volba záviset) základní pravidla interpretace EI hmotnostních spekter, základní typy fragmentací pravidla interpretace EI spekter a spekter měřených měkkými ionizačními technikami