DEMEDITEC Bordetella pertussis IgA ELISA Kat. č. DEBPT02 Návod k použití soupravy VÝROBCE: Demeditec Diagnostics GmbH Lise-Meitner-Straße 2 D-24145 Kiel (Germany), tel: +49 (0)431/71922-0, fax. +49 (0)431/71922-55, email: info@demeditec.de, www.demeditec.com DISTRIBUTOR: VIDIA spol.s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, Česká republika, tel.: 261 090 565, www.vidia.cz NÁZEV SOUPRAVY: DEMEDITEC Bordetella pertussis IgA ELISA je ELISA souprava pro detekci a kvantitativní stanovení lidských IgA protilátek proti Bordetella pertussis v séru a plazmě. POUŽITÍ: DEMEDITEC Bordetella pertussis IgA ELISA je souprava určená pro detekci a kvantitativní stanovení specifických IgA protilátek proti Bordetella pertussis v séru a plazmě. Jsou možné i další aplikace v jiných tělních tekutinách a mohou být vyžádány od technické podpory DEMEDITECu. Lékařská zpráva nemůže být založena pouze na laboratorních výsledcích. Navíc je nutné brát v úvahu historii pacienta a další testy. OBECNÉ INFORMACE: Černý kašel je onemocnění dýchacích cest, které je způsobeno bakterií Bordetella pertussis. Infekce se přenáší vzduchem kapénkovou infekcí. Gramnegativní kokobacil produkuje řadu biologicky aktivních molekul. V průběhu patogeneze nebo v průběhu procesu imunizace proti dávivému kašli se objevují různé sloučeniny a také vykazují odlišné působení. Charakterizovány byly pertussis toxin (PT), filamentózní hemaglutinin (FHA) a různé lipopolysacharidy (LPS). Černý kašel je vysoce nakažlivý (míra infekce neočkovaných členů domácnosti byla stanovena více než 90%) a může způsobit vážná onemocnění, a to zejména u velmi malých dětí. V letech 1980 až 1989 bylo z 10 749 pacientů mladších jednoho roku 69% přivezeno do nemocnice, 22% trpělo zápalem plic, 0,9% vykazovalo encefalopatii a 0,6% zemřelo. U starších dětí a dospělých (včetně již očkovaných osob) mohou být infekce pozorovány nespecifikovaným zánětem průdušek nebo zánětem horních dýchacích cest. Dokonce jsou poměrně časté i asymptomatické případy. Serologická odpověď doprovázející onemocnění nebo imunizaci pertussovou vakcínou byla měřena aglutinačními testy, precipitiny, fixací komplementu a imunoenzymatickou metodou (ELISA). ELISA testy, ve kterých je Bordetella antigen (obsahující toxin, FHA a LPS a standardizován v U/mL) vázán na pevný nosič, jsou citlivé, snadno proveditelné a mohou být použity jak ke stanovení seropozitivity s jedním vzorkem séra, tak i k určení nedávné infekce Bordetellou stanovením IgM a IgA. PRINCIP TESTU: DEMEDITEC Bordetella pertussis IgA testovací souprava je založena na principu enzymové imunoanalýzy (ELISA). Antigen Bordetella je předem navázán na povrch jamek mikrotitrační destičky. Zředěné sérum pacienta nebo standardy (ready-to-use) se pipetují do jamek mikrotitrační destičky. Dochází k vazbě mezi IgA protilátkami v séru a imobilizovaným Bordetella antigenem. Po jedné hodině inkubace při laboratorní teplotě se destička promyje zředěným promývacím roztokem, aby se odstranil nenavázaný materiál. Pak se přidá konjugát protilátky proti lidskému IgA s 1
peroxidázou (ready-to-use) a inkubuje se po dobu 30 minut. Po dalším promytí se pipetuje roztok se substrátem (TMB) a inkubuje se po dobu 20 minut, kdy dojde k vyvolání modré barvy v jamkách. Vývoj barvy se ukončí přidáním stop roztoku, který změní barvu z modré na žlutou. Výsledná barva se měří spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Koncentrace protilátek IgA, je přímo úměrná intenzitě barvy. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY, UPOZORNĚNÍ: Pouze k in vitro použití! Nejezte ani nepolykejte! Během testu nejezte, nepijte a nekuřte, dodržujte Správnou laboratorní praxi. Všechna séra a plazma byly testovány na přítomnost HBsAG, HIV a HCV a výsledky testů byly negativní. V průběhu testu používejte ochranné rukavice a s reagenciemi nakládejte jako s potencionálně infekčním materiálem. Rozlitá séra a roztoky musí ošetřeny dezinfekčním roztokem (např. 5% chlornanem sodným) a musí být řádně zlikvidovány. Před zahájením testu vytemperujte všechny reagencie na laboratorní teplotu (18 až 25 C). Před pipetováním opatrně všechny reagencie důkladně promíchejte jemným otáčením nebo poklepáním. Vyvarujte se vytvoření pěny silným třepáním. Pipetujte v konstantních časových intervalech, aby všechny jamky mikrotitrační destičky měly stejné podmínky. Při pipetování roztoků z lahviček je třeba dbát, aby se uzávěry nekontaminovaly a nedošlo k možnému zaměnění. Obsah lahviček je obvykle citlivý na oxidaci a lahvičky by tedy měly být otevírány pouze po krátkou dobu. Aby se zabránilo kontaminaci jednotlivých roztoků, je potřeba používat jednorázové pipetovací špičky. Nepoužívejte reagencie ze souprav s jinou šarží, nemohou se mezi sebou zaměnit. Všechny reagenci je potřeba používat před uplynutím exspirační doby. V souladu se Správnou laboratorní praxí nebo ISO9001 by všechny používané laboratorní přístroje měly být pravidelně kontrolovány a kalibrovány. To se týká především mikrolitrových pipet a promývacího a čtecího zařízení ELISA destiček. Zabraňte kontaktu kůže, očí a sliznic s reagenciemi především se stop roztokem a roztokem substrátu, protože mohou způsobit podráždění nebo poleptání, existuje i riziko intoxikace. OBSAH SOUPRAVY: Komponenty Objem/množství Mikrotitrační destička potažená antigenem Bordetella pertussis Standardy: Kalibrátor A (negativní kontrola) Kalibrátor B (cut-off standard) Kalibrátor C (slabě pozitivní kontrola) Kalibrátor D (pozitivní kontrola) Konjugát enzymu Substrát Stop roztok Roztok na ředění vzorků Promývací roztok (10x koncentrovaný) 12x8 jamek 15 ml 15 ml 15 ml 60 ml 60 ml Plastový sáček 1 2
Soupravu skladujte při 2 8 C. Nepoužívejte po exspiraci soupravy, kterou najdete na obalu této soupravy. Vytemperujte před použitím všechny komponenty na laboratorní teplotu (18-25 C). Po použití destičku znovu uzavřete, uzávěry lahviček znovu nasaďte a pevně uzavřete; soupravu uchovávejte při teplotě 2-8 C. Po prvním otevření použijte soupravu během tří měsíců. Naředěný promývací roztok může být uchován 4 týdny při 2-8 C Mikrotitrační destička 12 odlamovatelných stripů s 8 jamkami potaženými antigenem Bordetella pertussis (kompletní bakteriální antigen, sérotypy 1,2,3). Připraveno k použití (ready-to-use). Kalibrátor A (negativní konrola), roztok proteinu ředěný roztokem PBS. Neobsahuje IgA protilátky proti Bordetella. Přídavek 0,02% a methylisothiazolonu a 0,02% bromonitrodioxanu. Připraveno k použití (ready-to-use). Kalibrátor B (cut-off standard), lidské sérum ředěné roztokem PBS Obsahuje nízkou koncentraci IgA protilátky proti Bordetella. Přídavek 0,02% a methylisothiazolonu a 0,02% bromonitrodioxanu. Připraveno k použití (ready-to-use). Kalibrátor C (slabě pozitivní kontrola), lidské sérum ředěné roztokem PBS Obsahuje středně vysokou koncentraci IgA protilátky proti Bordetella. Přídavek 0,02% a methylisothiazolonu a 0,02% bromonitrodioxanu. Připraveno k použití (ready-to-use). Kalibrátor D (pozitivní kontrola), lidské sérum ředěné roztokem PBS Obsahuje vysokou koncentraci IgA protilátky proti Bordetella. Přídavek 0,02% a methylisothiazolonu a 0,02% bromonitrodioxanu. Připraveno k použití (ready-to-use). Konjugát enzymu 15 ml, proti lidskému IgA konjugovaný s HRP (králičí), v roztoku obsahující proteiny. Připraveno k použití (ready-to-use). Substrát 15 ml, TMB (tetramethylbenzidin). Připraveno k použití (ready-to-use). Stop roztok 15 ml, 0,5M roztok kyseliny. Připraveno k použití (ready-to-use). Roztok na ředění vzorků 60 ml, PBS/BSA roztok. Přídavek 0.1 % azidu sodného. Připraveno k použití (ready-to-use). Promývaci roztok 60 ml, PBS + Tween 20, 10x koncentrovaný. Výsledná koncentrace: naředit 1 díl roztoku + 9 dílů destilované vody. Pokud se v průběhu skladování v chladu začnou srážet krystaly, koncentrát se zahřeje se na 37 C po dobu 15 minut. Plastový sáček Uzavíratelný sáček na skladování nepoužitých stripů. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: 1. Multikanálové a jednokanálové pipety pro pipetování 5 μl, 100 μl a 500 μl 2. Spektrofotometr (reader) pro čtení absorbance mikrodestiček při 450 nm 3. Promývací zařízení na mikrodestičky 4. Zkumavky na ředění vzorků séra 5. Deionizovaná voda 6. Opakovaně použitelné černé víko pro zakrytí destičky (k dispozici na vyžádání u Demeditec Diagnostics GmbH) 3
ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ: Pro stanovení může být použito sérum nebo plazma (EDTA, heparin). Sérum se oddělí srážením a centrifugací krve, která je asepticky odebrána napíchnutím žíly. Vzorky séra nebo plazmy mohou být skladovány v chladničce (4-8 C) po dobu 48 hodin. Pro delší skladování by měla být uchovávány při -20 C. Vzorky by neměly být opakovaně zmraženy a rozmraženy. Lipemické, hemolytické nebo bakteriálně kontaminované vzorky mohou způsobit falešně pozitivní nebo falešně negativní výsledky. Pro otestování vzorků (ne standardů) musí být vzorky ředěny 1:101 roztokem na ředění vzorků (readyto-use) (např. 5 ul séra + 500 ul roztoku na ředění vzorků). PRACOVNÍ POSTUP: 1. Příprava reagencí: Promývací roztok: Před použitím nařeďte 1díl + 9 dílů destilované vody. Pokud se v průběhu skladování v chladu začnou srážet krystaly, koncentrát se zahřeje se na 37 C po dobu 15 minut. Pro spolehlivý výsledek se doporučuje přísné dodržování protokolu. Za jakékoli změny nebo úpravy je odpovědný uživatel. Před použitím vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu, neměla by ale být ponechány při této teplotě déle, než je nezbytně nutné. Standardy a vzorky by měly být testovány jako dublety. Standardní křivka by měla být stanovena s každým testem. Nepoužité stripy mikrotitrační destičky vraťte do plastového sáčku a skladujete je na suchém místě při teplotě 4-8 C. 2. Pracovní postup: (1) Připravte si dostatečné množství jamek mikrotitrační destičky pro standardy, kontroly a vzorky v dubletu, a také i pro samotný substrát (blank). (2) Do připravených jamek mikrotitrační destičky předejte 100 µl ředěných vzorků (1:101), standardů (ready-to-use) a příslušných kontrol. Nechte jednu jamku volnou na samotný substrát (blank). (3) Zakryjte destičku víkem pro opakované použití a inkubujte při laboratorní teplotě 60 minut. (4) Vyprázdněte jamky destičky (vyklopením nebo odsátím) a přidejte 300 µl naředěného promývacího roztoku. Tento postup opakujte celkem třikrát. Zbytky promývacího pufru poté odstraníte jemným vyklepnutím destičky na kus látky. (5) Do každé jamky pipetujte 100 µl konjugátu (ready-to-use). Nechte jednu jamku prázdnou pro samotný substrát (blank). (6) Zakryjte víkem pro opakované použití a inkubujte při laboratorní teplotě 30 minut. (7) Vyprázdněte jamky destičky (vyklopením nebo odsátím) a přidejte 300 µl naředěného promývacího roztoku. Tento postup opakujte celkem třikrát. Zbytky promývacího pufru poté odstraníte jemným vyklepnutím destičky na kus látky. (8) Do každé jamky pipetujte 100 µl substrátu (ready-to-use). Tentokrát pipetujte i do prázdné jamky nechané pro samotný substrát (blank). (9) Zakryjte destičku víkem pro opakované použití a inkubujte při laboratorní teplotě 20 minut. (10) Pro ukončení reakce pipetujte do každé jamky 100 µl stop roztoku (ready-to-use). Pipetujte i do jamky se samotným substrátem (blank). (11) Po důkladném promíchání a otření spodní části destičky změřte absorpci při vlnové délce 450 nm (případně při referenční vlnové délce 620 nm). Zbarvení je stabilní po dobu nejméně 60 minut. 4
VÝPOČET VÝSLEDKŮ: Získaná OD standardů (osa y, lineární) jsou vyneseny proti jejich koncentraci (x-osa, logaritmická) buď na semilogaritmickém papíře nebo pomocí automatizované metody. Proložení křivky získáte pomocí parametrů cubic spline, 4 parameter logistics nebo Logit-Log. Pro výpočet standardní křivky použijte signál každého ze standardů (může být přitom vynechána hodnota, která leží zjevně mimo křivku a použita jediná přijatelnější hodnota). Koncentraci vzorků pak lze vyčíst ze standardní křivky. Bylo vzato v úvahu počáteční ředění při odečítání výsledků z grafu. Výsledky vzorků ve vyšším ředění musí být vynásobeny faktorem zředění. Vzorky mající koncentrace vyšší než nejvyšší standard se musí ředit, jak je popsáno v odstavci "Pracovní postup", a musí být znovu testovány. Typická kalibrační křivka (Příklad. Nepoužívejte pro kalibraci!) Standard U/ml Hodnota OD A (negativní kontrola) 1 0,031 B (cut-off kontrola) 10 0,489 C (slabě pozitivní kontrola) 20 0,822 D (pozitivní kontrola) 50 1,634 Interpretace výsledků U/ml Hodnota OD < 8 negativní 8-12 nerozhodné > 12 pozitivní Samotné výsledky by neměly být jediným důvodem pro všechny terapeutické důsledky. Musí být v korelaci s ostatními klinickými pozorováními a diagnostickými testy. Očekávané hodnoty In-house studie zjevně zdravých jedinců ukázala následující výsledky: Ig isotyp n Interpretace pozitivní nerozhodný negativní IgA 87 20,5 % 20,5 % 59,0 % CHARAKTERISTIKY TESTU: Bordetella pertusis ELISA IgA Opakovatelnost (intra-assay) 6,2 % Reprodukovatelnost (inter-assay) 8,9 % Přesnost mezi šaržemi (inter-lot) 2,0 4,9 % Analytická citlivost 1,0 U/mL Recovery 108 120 % Linearita 73 100 % Cross-reaktivita Interference Klinická specificita 92 % Klinická citlivost 94 % Žádná cross-reaktivita s: RSV, Adenovirus a Parainfluenza IgG. Neinterferuje s bilirubinem do 0,3 mg/ml, hemoglobinem do 8,0 mg/ml a triglyceridy do 5 mg/ml 5
LITERATURA: 1. Chodorowska, M. et al. ELISA test used for serologic diagnosis of Pertussis. Med. Dosw. Microbiol., 48: 15 (1996). 2. Finger, H. et al. Serological diagnosis of whooping cough. Dev. Biol. Stand., 610: 331 (1985). 3. Granström, G. et al. Specific Immunoglobulin A to bordetella pertussis antigen. J. Clin. Microbiol. 26: 869 (1988). 4. Kuno-Sakai, H. et al.: A simple and sensitive ELISA of antibodies to Pertussis antigens. Vacine 10: 350 (1992). 5. Nagel, J. et al.: Improved serodiagnosis of whooping cough caused by Bordetella pertussis. Dev. Biol. Stand. 610: 325 (1985). 6. Reizenstein, E. et al.: Comparison of five calculation modes for antibody ELISA against Pertussis. J. Immunol. Methods 183: 279 (1995). 7. Sato, Y. et al.: An improved ELISA system for the measurement of IgG antibodies against pertussis. Dev. Biol. Stand. 73: 167 (1991). 8. Steketee, R. W. et al.: A comparison of laboratory and clinical methods for diagnosing pertussis. J. Infect. Dis. 157: 441 (1988). 6