HercepTest pro Dako Autostainer

HercepTest pro Dako Autostainer Kód č. K5207 20. vydání Pro účely imunocytochemického barvení. Souprava je určena k provedení 50 testů (100 sklíček). (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 1/52

Obsah Strana Použití 4 Souhrn a vysvětlení - prs 5 Pozadí 5 Charakteristiky 5 Princip metody - prs 5 Činidla - prs 6 Dodávané materiály 6 Potřebný materiál, který není součástí dodávky 7 Skladování - prs 7 Příprava vzorku - prs 8 Řezy zalité v parafínu 8 Zpracování tkání před barvením 8 Bezpečnostní opatření - prs 9 NÁVOD K POUŽITÍ - prs 10 A. Příprava činidel 10 A.1 Vyhledávací roztok epitopu 10 A.2 Promývací pufr 10 A.3 Roztok substrát-chromogen (DAB) 10 A.4 Kontrastní barvivo 11 A.5 Montovací médium 11 B. Postup barvení prováděný pomocí přístroje Autostainer 11 B.1 Poznámky k postupu 11 B.2 Protokol barvení 12 Kontrola kvality - prs 13 Interpretace zabarvení - prs 15 Omezení - prs 18 Všeobecná omezení 18 Specifická omezení výrobků 19 Charakteristiky účinnosti - prs 19 Pozadí 19 Srovnávací studie 20 Srovnání s klinickou výzkumnou studií (CTA) 20 Věrohodnost 20 Reprodukovatelnost 21 Imunoreaktivita 22 Řešení problémů - prs 23 Souhrn a vysvětlení - žaludek 26 Pozadí 26 Charakteristiky 26 Princip metody - žaludek 26 Činidla - žaludek 27 Dodávané materiály 27 Potřebný materiál, který není součástí dodávky 28 Skladování - žaludek 29 Příprava vzorku - žaludek 29 Řezy zalité v parafínu 29 Zpracování tkání před barvením 29 Bezpečnostní opatření - žaludek 30 NÁVOD K POUŽITÍ - žaludek 31 A. Příprava činidel 31 A.1 Vyhledávací roztok epitopu 31 A.2 Promývací pufr 31 A.3 Roztok substrát-chromogen (DAB) 32 A.4 Kontrastní barvivo 32 A.5 Montovací médium 32 (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 2/52

B. Postup barvení prováděný pomocí přístroje Autostainer 32 B.1 Poznámky k postupu 32 B.2 Protokol barvení 33 Kontrola kvality - žaludek 34 Interpretace zabarvení - žaludek 37 Omezení - žaludek 40 Všeobecná omezení 40 Specifická omezení výrobků 40 Charakteristiky účinnosti - žaludek 41 Pozadí 41 Reprodukovatelnost 43 Imunoreaktivita 46 Řešení problémů - žaludek 47 Reference 50 Vysvětlivky k symbolům 52 (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 3/52

Použití K použití v diagnostice in vitro. HercepTest je semikvantitativní imunocytochemický test ke stanovení hyperexprese proteinu HER2 v tkáních karcinomu prsu zpracovaných běžným způsobem pro histologické vyšetření a tkáních rakoviny pacientů s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení, fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. HercepTest je určen jako pomůcka v hodnocení pacientů, u kterých byla zvažována léčba prostředkem Herceptin (trastuzumab), (viz příbalový leták k výrobku Herceptin ). POZNÁMKA, pouze pro rakovinu prsu: Všichni pacienti účastnící se klinických zkoušek s Herceptinem byli vybráni pomocí zkušební imunocytochemické klinické studie (CTA). Žádný pacient účastnící se těchto studií nebyl vybrán pomocí testu HercepTest. Test HercepTest byl porovnán se studií CTA na nezávislé skupině vzorků a byl shledán jako vhodný k dosažení přijatelných souhlasných výsledků. Současný vztah testu HercepTest ke klinickému výsledku Herceptin nebyl zjišťován. POZNÁMKA, pouze pro rakovinu žaludku: Všichni pacienti ve studii BO18255 (ToGA) fáze III, sponzorované společností Hoffmann-La Roche, byli vybráni na základě použití Dako HercepTest (IHC) a Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Studie prokázala klinické využití obou testů při hodnocení stavu HER2 u pacientů s inoperabilním, lokálně pokročilým, rekurentním a/nebo metastazujícím adenokarcinomem žaludku nebo gastroezofageální junkce. Pro tento kit s kódem č. K5207 byly objemy reagencií upraveny speciálně pro použití s přístrojem Autostainer. Adenokarcinom žaludku, včetně gastroezofageálního spojení, je v tomto dokumentu uváděn také jako rakovina žaludku. Aplikace pro rakovinu prsu, viz strany 5-25. Aplikace pro rakovinu žaludku, viz strany 26-50. Důležitá informace: Povšimněte si rozdílů u tkáně rakoviny prsu a tkáně rakoviny žaludku, zejména v části Interpretace zabarvení. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 4/52

Rakovina prsu Souhrn a vysvětlení - prs Pozadí Lidský gen HER2 (rovněž nazýván jako ERBB2 nebo NEU) kóduje protein často označovaný jako protein HER2 nebo p185 HER2. Protein HER2 je membránový tyrozinkinázový receptor s homologií s receptorem epidermálního růstového faktoru (EGFR nebo HER1) (1-8). Protein HER2 je normální komponenta, exprimována mnoha typy epiteliálních buněk (8). U části pacientů s rakovinou prsu je protein HER2 hyperexprimován jako součást procesu maligní transformace a progrese tumoru (9). Hyperexprese proteinu HER2 na povrchu buněk rakoviny prsu znamená, že se může jednat o cíl terapie protilátkou. Herceptin (trastuzumab) je lidská monoklonální protilátka (10), která se vysokou afinitou váže na protein HER2 a prokázalo se, že inhibuje proliferaci lidských rakovinných buněk hyperexprimujících protein HER2 in vitro a in vivo (11-13). Charakteristiky HercepTest byl vyvinut s cílem vytvořit alternativu ke zkušební výzkumné metodě CTA používané v klinických studiích s Herceptinem. Účinnost testu HercepTest pro determinaci hyperexprese proteinu HER2 byla vyhodnocena nezávislou studií srovnávající výsledky testu HercepTest a studie CTA na 548 vzorcích rakoviny prsu, z nichž ani jeden nepocházel od pacientů zařazených do klinických studií s Herceptinem. Výsledky vykazují 79 % shodu mezi výsledky těchto dvou zkoušek na těchto tkáňových vzorcích. Shoda údajů rovněž naznačuje, že hodnota 3+ výsledků testu HercepTest odpovídala s vysokou pravděpodobností pozitivním hodnotám ve studii CTA, což by vyhovovalo zadávacím kritériim zkoušky (2+ nebo 3+). Výskyt hodnoty 2+ v testu HercepTest nekoreluje také s výsledky studie CTA. Asi 42 % (53/126) výsledků 2+ testu HercepTest bylo negativních za použití CTA (0 1+), což nedovoluje zařazení do klinických zkoušek s Herceptinem. HercepTest se interpretuje pro hyperexpresi proteinu HER2 jako negativní (intenzita zabarvení 0 a 1+), slabě pozitivní (intenzita zabarvení 2+) a silně pozitivní (intenzita zabarvení 3+). HercepTest není vhodný k provádění prognóz pacienta a lékaře a nebyl pro tento účel ověřen. Princip metody - prs HercepTest obsahuje činidla potřebné pro úplnou imunocytochemickou metodu barvení ve dvou krocích pro vzorky zpracované běžným způsobem, zalité v parafínu. Po inkubaci primární králičí protilátkou proti lidskému proteinu HER2 využívá tato souprava předem připravené vizualizační reagens Visualization Reagent založené na dextranové technologii. Toto reagens obsahuje molekuly sekundárního kozího anti-králičího imunoglobulinu i molekuly křenové peroxidázy navázané na společný hlavní řetězec dextranového polymeru, a tak eliminuje nutnost sekvenční aplikace vazby protilátky a konjugátu peroxidázy. Křížová reakce vizualizačního reagens s lidskými imunoglobuliny a s fetálním telecím sérem byla odstraněna absorpcí v pevné fázi. Enzymatická přeměna následně přidaného chromogenu vede k vytvoření viditelného reakčního produktu v místě antigenu. Vzorek pak lze obarvit kontrastním barvivem a zakrýt krycím sklíčkem. Výsledky se pak interpretují pomocí světelného mikroskopu. Podložní skla s kontrolními vzorky obsahují k vyhodnocení barvících cyklů tři linie lidských buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 0, 1+ a 3+. Intenzita zabarvení těchto linií buněk koreluje s počtem receptorů na jednu buňku. HercepTest, Kód č. K5207, lze použít k automatizovanému barvení pomocí přístroje Autostainer. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 5/52

Rakovina prsu Činidla - prs Dodávané materiály Materiály v níže uvedeném seznamu postačí na 50 testů (50 podložních skel inkubovaných primární protilátkou na protein HER2 a 50 podložních skel inkubovaných odpovídající reagencií pro negativní kontrolu). Počet testů vychází z použití 200 µl činidla na jeden tkáňový řez (22 mm x 22 mm) z laviček č. 1, 2, 3 a 4 a roztoku substrát-chromogen (DAB). Kit obsahuje dostatek materiálů na maximálně 15 samostatných cyklů barvení. Lahvička č. Množství 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L Popis Peroxidase-Blocking Reagent: 3% peroxid vodíku s obsahem 15 mmol/l azidu sodného (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Afinitně izolovaná protilátka k okamžitému použití. Dodává se v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mol/l NaN 3, ph 7,2, který obsahuje stabilizující protein Imunogen: Syntetický C-koncový fragment (intracytoplazmatická část) proteinu HER2 navázaný na KLH (keyhole limpet hemocyanin). Specificita: protein HER2. Purifikační metoda: Protilátka je afinitně izolovaná pomocí imobilizovaného peptidu proteinu HER2. Visualization Reagent: Dextranový polymer konjugovaný s křenovou peroxidázou a afinitně izolovanými kozími anti-králičími imunoglobuliny. Dodává se v Tris-HCl pufru, který obsahuje stabilizující protein a antimikrobiální činidlo. Negative Control Reagent: Imunoglobulinová frakce normálního králičího séra při odpovídající koncentraci proteinu jako primární protilátka k proteinu HER2. Dodává se v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mol/l NaN 3, ph 7,2, který obsahuje stabilizující protein DAB Buffered Substrate: Substrátový pufrový roztok, ph 7,5, který obsahuje < 0,1% peroxidu vodíku, stabilizátory, posilovače a antimikrobiální prostředek. DAB Chromogen: 5 % 3,3'-diaminobenzidin v tetrahydrochloridovém chromogenovém roztoku. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citrátový pufr s detergentem. Wash Buffer (10x): Tris/HCl pufr s detergentem a antimikrobiálním činidlem. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 6/52

Rakovina prsu 3 x 5 podložní skla Control Slides: Každé podložní sklo obsahuje tři linie buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu představující různé úrovně exprese proteinu HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) a SK-BR-3 (3+). Podložní skla s kontrolními vzorky byla tepelně opracována, aby se zlepšila přilnavost vzorků ke sklům. Každé další tepelné zpracování podložních skel s kontrolními vzorky za účelem zlepšení přilnavosti řezů ke sklům může ohrozit výsledky barvení. POZNÁMKA: Všechny reagencie, včetně roztoku k vyhledávání epitopu a promývacího pufru, jsou připraveny speciálně pro použití s tímto testem. Aby test proběhl správně, nesmí být tyto reagencie ničím nahrazeny, s výjimkou promývacího pufru, místo něhož je možné použít produkt Dako s kódem č. S3006. Potřebný materiál, který není součástí dodávky Hydroxid amonný, 15 mol/l, zředěný na 37 mmol/l Kontrastní barvivo: Hematoxylin, například Mayerův hematoxylin rozpustný ve vodě, Dako Kód č. S3301 (viz NÁVOD K POUŽITÍ, A.4) Krycí sklíčka Destilovaná nebo deionizovaná voda (voda k promývání) Sušička, schopná udržovat teplotu nejvýše 60 C Etanol, bezvodý a 95% Světelný mikroskop (zvětšení objektivu 4 40x) Kapalina pro fixaci preparátu, například Dako Faramount, Kód č. S3025 nebo Glycergel, Kód č. C0563 Pozitivní a negativní tkáně k použití pro kontrolu průběhu (viz část Kontrola kvality) Sklíčka SuperFrost Plus, potažená poly-l-lysinem nebo silanizovaná sklíčka Dako Silanized Slides, Kód č. S3003 (viz Příprava vzorků) Barvící nádoby nebo lázně Časový spínač (umožňující intervaly 2 40 minut) Vodní lázeň s víkem (schopná udržovat roztok na vyhledávání epitopu při teplotě 95 99 C) Xylen, toluen nebo substituty xylenu Produkt K5207 byl speciálně navržen pro použití se systémem pro imunologické barvení Autostainer, Kód č. S3400. Informace o potřebných součástech tohoto systému najdete v návodu k použití k přístroji Autostainer. Skladování - prs Skladujte při 2 8 C. Nepoužívejte soupravu po datu exspirace vytištěném na obalu. Pokud se reagencie skladují za jiných podmínek, než jaké jsou uvedeny v příbalovém letáku, musí uživatel provést jejich kontrolu (14a, 14b). Pozor kontrolní sklíčka musí být také skladována při 2 8 C. Neexistují žádné známky toho, že by tyto produkty byly nestabilní. Proto je nutno provádět pozitivní a negativní kontroly současně s pacientovými vzorky. Pokud se objeví neočekávaná změna barvy, kterou nelze vysvětlit odchylkami laboratorních postupů a máte-li podezření na jakýkoli problém s HercepTest, kontaktujte neprodleně oddělení Technické podpory Dako. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 7/52

Rakovina prsu Příprava vzorku - prs Se vzorky pro biopsii je nutno nakládat tak, aby byla zachována tkáň pro imunocytochemické barvení. U všech vzorků by se měly používat standardní způsoby zpracování tkáně (15). Řezy zalité v parafínu Tkáně uchovávané v neutrálním pufrovaném formalínu nebo v Bouinově fixativu jsou vhodné pro zpracování a zalití v parafínu běžným způsobem. Například vzorky z biopsie by měly být nařezány na části s tloušťkou 3 nebo 4 mm a na dobu 18 24 hodin fixovány neutrálním pufrovaným formalínem. Tkáně se poté dehydrují s použitím alkoholů a xylenu a infiltruje se do nich roztavený parafín o teplotě nepřesahující 60 C. Správně zafixované a zalité tkáně s expresí proteinu HER2 zůstanou zachovány po neomezeně dlouhou dobu, pokud budou před řezáním a fixací na sklíčka uchovány v chladu (15 25 C) (15, 16). Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988 (Zákon o zdokonalení klinických laboratoří z roku 1998) od profesionálních uživatelů ve Spojených státech vyžaduje v 42 CFR 493.1259(b) aby bylo dodrženo následující: Laboratoř musí uchovávat barvená podložní skla nejméně 10 let od data testu a bločky vzorků nejméně dva roky od data testu (16). Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce 4 5 µm, namontovat na podložní skla a usušit na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin (nebo až do jejich uschnutí) nebo při 37 C přes noc nebo při 60 C po dobu hodiny. UPOZORNĚNÍ: Nadměrné zahřívání po dobu delší než jedna hodina při teplotě 60 C může způsobit výrazné snížení nebo ztrátu specifické, s HER2 související, imunoreaktivity (17). V zájmu zachování antigennosti se musí řezy tkání namontované na podložních sklech (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine nebo silanizovaná skla) barvit do 4 6 týdnů od řezání, pokud se skladují při pokojové teplotě (20 25 C) (18). Podložní skla požadovaná pro vyho dnocení proteinu HER2 a ověření přítomnosti nádoru se musí připravovat současně. Doporučuje se vytvořit minimálně 5 podložních skel, 1 sklo na přítomnost tumoru, 2 skla pro vyhodnocení proteinu HER2 (jedno sklo pro inkubaci s lahvičkou č. 2 a jedno sklo pro inkubaci s lahvičkou č. 4) a 2 záložní skla. Použití testu HercepTest TM u odvápněných tkání dosud nebylo ověřeno a nedoporučuje se. Další podrobné informace o přípravě vzorků naleznete v dokumentu společnosti Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) a v odkazech 15 a 16. Zpracování tkání před barvením Pro optimální účinnost zkoušky musí být použita metoda vyhledávání specifického epitopu v 10 mol/l citrátovém pufru. Vyhledávací roztok epitopu je dodáván v soupravě HercepTest. Postup spočívá v ohřátí tkáňových řezů fixovaných na sklíčka ponořená v citrátovém pufru 10 mmol/l (20) v kalibrované vodní lázni schopné zachovávat požadovanou teplotu odmaskovacího roztoku (v rozmezí 95 99 C). Laborat oře sídlící ve vyšších nadmořských výškách musí stanovit nejlepší metodu k udržování potřebné teploty vodní lázně. Vyhledávání cíle musí probíhat ve vodní lázni. Jiné metody zahřívání byly testovány, ale neposkytly reprodukovatelné výsledky. Bezprostředně po ukončení vyhledávání cíle zahajte proceduru barvení. Odchylky od opsaného postupu mohou vést k nesprávným výsledkům. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 8/52

Rakovina prsu Bezpečnostní opatření - prs 1. K použití v diagnostice in vitro. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Lahvička 1, reagens blokující eroxidázu, obsahuje 3 % peroxidu vodíku. Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. 4. Ampule 6, chromogen DAB, obsahuje 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride a má označení: H350 H341 P201 P280 P308 + P313 P405 P501 Nebezpečí Může vyvolat rakovinu. Podezření na genetické poškození. Před použitím si obstarejte speciální instrukce. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. Skladujte uzamčené. Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními nařízeními. Práce s tímto výrobkem není obecně povolena osobám mladším 18 let. Uživatelé musí být řádně proškoleni co se týče správného pracovního postupu, nebezpečných vlastností produktu a nutných bezpečnostních opatření. Další informace najdete v příslušném Bezpečnostním listu (SDS). 5. Lahvička 8, Wash Buffer (10x), obsahuje 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propan-1,3- diolhydrochlorid a 0.1-<0.2% 5-brom-5-nitro-1, 3-dioxan. Může způsobit alergickou reakci. Wash Buffer (10x) je označen: Varování H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Způsobuje vážné podráždění očí. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 6. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN 3 ), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože se koncentrace azidu sodného ve výrobku neklasifikuje jako nebezpečná, mohou usazeniny NaN 3 reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy těchto kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množství vody, aby nedocházelo k usazování azidů kovů v potrubí (21, 22). 7. Lahvička 2, 3 a 4 obsahuje materiály živočišného původu. Jako u každého výrobku biologického původu je nutno dodržovat řádná bezpečnostní opatření. 8. S biologickými vzorky před a po fixaci a se všemi ostatními materiály, které s nimi přijdou do styku, je nutno manipulovat jako s potenciálně infekčním materiálem a je nutno je likvidovat s souladu s bezpečnostními opatřeními (23). Nikdy nenabírejte reagencie do pipety ústy a zamezte kontaktu reagencií a vzorků s kůží a sliznicemi. Jestliže se reagencie dostanou do kontaktu s citlivými oblastmi, omyjte je dostatečným množstvím vody. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 9/52

Rakovina prsu 9. Minimalizujte mikrobiální kontaminaci reagencií, aby nevzniklo nespecifické zabarvení. 10. Nedodržení inkubační doby, teploty nebo metody může vést k chybným výsledkům. Nadměrné sušení po dobu delší než jedna hodina při teplotě 60 C může způsobit výrazné snížení nebo ztrátu specifické, s HER2 související, imunoreaktivity (17). 11. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může způsobit ztrátu zabarvení antigenu. 12. Všechny reagencie, včetně roztoku k vyhledávání epitopu a promývacího pufru, jsou připraveny speciálně pro použití s tímto testem. Aby test proběhl správně, neměly by být ničím nahrazovány, s výjimkou promývacího pufru, kde je možné použít produkt s kódem č. S3006. 13. Vizualizační reagens a chromogen DAB mohou být v případě vystavení působení intenzivního světla negativně ovlivněny. Neskladujte složky systému ani neprovádějte barvení při silném světle, například při přímém slunečním světle. 14. Používejte osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. Další informace naleznete v Bezpečnostním listu o materiálech (SDS). 15. Rezidua parafínu mohou vést k falešně negativním výsledkům. 16. Použití jiných než doporučených objemů činidel může mít za následek ztrátu viditelnosti imunologické reakce HER2. Jestliže ohraničený tkáňový řez není zcela pokryt 3 kapkami (100 µl) činidla, musí se přidat další 3 kapky. NÁVOD K POUŽITÍ - prs A. Příprava činidel Je vhodné připravit před barvením následující činidla: A.1 Vyhledávací roztok epitopu Rozřeďte před započetím plánovaného barvícího postupu dostatečné množství roztoku, lahvička 7 (roztok k vyhledávání cíle x 10) v poměru 1:10 pomocí destilované nebo deionizované vody. Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Rozředěný roztok zlikvidujte, pokud je zakalený. A.2 Promývací pufr Pro krok promývání rozřeďte dostatečné množství roztoku, lahvička 8 (promývací pufr x 10) v poměru 1:10 pomocí destilované nebo deionizované vody. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Pufr zlikvidovat, pokud je zakalený. Autostainer je naprogramován tak, aby tkáňové řezy proplachoval po použití blokovací reagencie pro peroxidázu a roztok chromogenního substrátu. Při tomto proplachování se musí použít buď destilovaná nebo deionizovaná voda nebo promývací pufr. Všechny ostatní promývací kroky vyžadují použití promývacího pufru. A.3 Roztok substrát-chromogen (DAB) Přidáním 11 kapek (25 30 µl na jednu kapku) chromogenu DAB z lahvičky 6 do jedné lahvičky 5 obsahující pufrovaný substrát DAB (11 ml) a promícháním připravíte roztok substrát-chromogen. Připravený roztok chromogenního substrátu (DAB) je stabilní po dobu přibližně 5 dnů, pokud se skladuje při 2 8 C. Před použitím je nutné tento roztok pečlivě promíchat. Případná přítomnost sraženiny v roztoku neovlivní kvalitu barvení. POZNÁMKA: Barva DAB Chromogenu v lahvičce 6 se může lišit od čiré až po světle levandulovou. Barva nemá vliv na výsledky dosažené s tímto produktem. Řeďte prosím v souladu s postupem uvedeným v příbalovém letáku. Přidání příliš velkého množství DAB chromogenu do DAB pufrového substrátu způsobí poškození pozitivního signálu. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 10/52

Rakovina prsu A.4 Kontrastní barvivo Zabarvený výsledný produkt barvicí reakce DAB není rozpustný v alkoholu ani ve vodě. Použijte hematoxylinové kontrastní barvivo a upravte intenzitu barvení hematoxylinem na podobnou úroveň, jaká je popsána v příručce HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Příručka k interpretaci zabarvení při testu HercepTest rakovina prsu) společnosti Dako. Můžete použít hematoxylin, ať už alkoholický nebo rozpustný ve vodě například Mayerův hematoxylin Dako, Kód č. S3301. Po kontrastním barvení hematoxylinem vždy provádějte důkladné propláchnutí v destilované nebo deionizované vodě, poté ponořte tkáňové řezy do lázně s 37 mmol/l vodného roztoku amoniaku (viz sekci B.2, krok 3). Vodný roztok amoniaku (37 mmol/l) se připraví smícháním 2,5 ml koncentrovaného (15 mmol/l) hydroxidu amonného s 1 litrem destilované nebo deionizované vody. Nespotřebovaný vodný roztok amoniaku 37 mmol/l může být skladován při pokojové teplotě (20 25 C) v dobře uzavřené lahvi po dobu až 12 měsíců. A.5 Montovací médium Doporučuje se bezvodé, permanentní montovací médium. Vodní montáž je však také přípustná. V takovém případě doporučujeme použít fixační vodný roztok Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Kód č. S3025 nebo fixační roztok Glycergel Mounting Medium, Kód č. C0563. Glycergel před použitím zkapalněte ohřátím na přibližně 40 (± 5) C. B. Postup barvení prováděný pomocí přístroje Autostainer B.1 Poznámky k postupu Uživatel by si měl tyto pokyny pozorně přečíst a před použitím se seznámit se všemi součástmi a nástroji (viz část Bezpečnostní opatření). Před imunologickým barvením nechte všechna činidla vytemperovat na pokojovou teplotu (20 25 C). I všechny inkubace je třeba provádět při pokojové teplotě. Při vkládání sklíček do přístroje Autostainer a v průběhu postupu barvení nenechte tkáňové řezy vyschnout. Suché řezy tkání mohou vykazovat zvýšení nespecifického zabarvení. Je-li postup barvení přerušen, podložní skla je třeba ponechat v pufrové lázni po inkubaci primární protilátky po dobu až jedné hodiny při pokojové teplotě (20 25 C), aby nebyla ovlivněna účinnost barvení. Deparafinizace a rehydratace: Před barvením musí být podložní skla s tkáněmi zbavena parafínu, aby se odstranilo médium, ve kterém je tkáň zalita, a aby mohla být rehydratována. Zajistěte úplné odstranění parafínu. Přítomnost zbytků zalévacího média způsobí zvýšené nespecifické zabarvení. Tento krok by měl být prováděn při pokojové teplotě (20 25 C). 1. Umístěte sklíčka do xylénové lázně a inkubujte po dobu 5 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 2. Vyklepejte přebytečnou tekutinu a vložte sklíčka na 3 (±1) minuty do absolutního etanolu. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 3. Odklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 95% etanolu po dobu 3 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 4. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do destilované nebo deionizované vody na minimálně 30 sekund. Začněte postup barvení, jak je popsáno v části B.2, krok 1, Vyhledávání epitopu. Roztoky xylenu a alkoholu je nutno vyměnit po 40 podložních sklech. Místo xylenu lze použít toluen nebo substituty xylenu, například Histoclear. POZNÁMKA: Činidla a návody dodané v této soupravě byly navrženy pro optimální účinnost. Další ředění činidel nebo změna inkubačních teplot může vést k nesprávným nebo nesouhlasným výsledkům. Rozdíly v zpracování tkání a v technických postupech v laboratoři uživatele mohou znehodnotit výsledky studie pro použití vybraných pacientů pro terapii s Herceptinem. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 11/52

B.2 Protokol barvení Provádí se při pokojové teplotě, 20 25 C. Rakovina prsu Krok 1: Vyhledávání epitopu Naplňte barvicí nádoby, např. nádoby Coplin naředěným roztokem pro vyhledávíni epitopu (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.1). Vložte barvící nádobky s obsahem odmaskovacího roztoku do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a roztok vyhledávání epitopu na 95 99 C. Roztok pro vyhledávání epitopu se po zahřátí zakalí. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a aby nedocházelo k odpařování. Ponořte řezy vyvážené při pokojové teplotě do předehřátého roztoku Epitope Retrieval Solution v nádobách na barvení. OHŘEJTE VODNÍ LÁZEŇ A ODMASKOVACÍ ROZTOK OPĚT NA 95 99 C. Inkubujte po dobu 40 (±1) minut při 95 99 C. Vyjměte celou nádobku se sklíčky z vodní lázně. Nechte sklíčka po dobu 20 (±1) minut zchladnout v odmaskovacím roztoku při pokojové teplotě. Dekantujte odmaskovací roztok a propláchněte řezy promývacím pufrem (viz NÁVOD K POUŽITÍ, sekce A.2). Pro docílení optimální účinnosti máčejte řezy v promývacím pufru po dobu 5 20 minut po vyhledávání epitopu a před barvením. POZNÁMKA: Roztok vyhledávání epitopu je určen pouze pro jednu aplikaci. Nepoužívejte opakovaně. Krok 2: Postup pro barvicí automat 1. Pro požadované časy programu a objemy reagencií použijte Autostainerem generovanou mapu automatického programu HercepTest (konkrétní objemy jsou uvedeny v bodu 4 níže). 2. Umístěte ampule na reagencie Autostaineru do stojanu na reagencie podle mapy reagencií vygenerované programem. 3. Vložte sklíčka do Autostaineru podle mapy sklíček vygenerované počítačem. 4. Nastavte program a spusťte program HercepTest. Následuje nákres programového cyklu: Opláchnout 200 µl reagencie pro blokování peroxidázy 5 minut Opláchnout 200 µl primárního anti-her2 proteinu (nebo reagencie negativní kontroly) 30 minut Opláchnout 200 µl vizualizační reagencie 30 minut Opláchnout Opláchnout Přepnout 200 µl roztoku chromogenního substrátu (DAB) 10 minut Po kroku se substrát-chromogenem opláchněte sklíčka v deionizované vodě POZNÁMKA: Barvicí automat hardwarové verze 01 proplachuje sklíčka v pufru. Z tohoto důvodu je třeba sklíčka po vyjmutí z automatu propláchnout v deionizované vodě. Krok 3: Kontrastní barvení (návod pro hematoxylin) (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 12/52

Vyjměte sklíčka z Autostaineru a obarvěte je v hematoxylinu podle níže uvedeného postupu. Rakovina prsu Ponořte sklíčka do lázně s hematoxylinem. Inkubujte 2 5 minut, v závislosti na koncentraci použitého hematoxylinu. Opatrně opláchněte ve vodní lázni reagenční kvality. Ujistěte se, že jste odstranili všechen zbývající hematoxylin. Nepovinné: Namočte sklíčka 10x do vodného roztoku amoniaku 37 mmol/l (viz sekci A.4). Opláchněte opatrně podložní skla v lázni s destilovanou nebo deionizovanou vodou na 2 5 minut. POZNÁMKA: V závislosti na délce inkubace a koncentraci použitého hematoxylinu bude výsledkem kontrastního barvení světlé až tmavě modré zabarvení buněčných jader. Přílišné nebo neúplné kontrastní zabarvení může ohrozit správnou interpretaci výsledků. Krok 4: Montáž Doporučuje se bezvodé, permanentní montovací médium. Vodní montáž je však také přípustná. Vzorky lze fixovat a přiklopit krycím sklíčkem s využitím kapaliny pro fixaci preparátu na bázi vody, jako je například Dako Faramount, Kód č. S3025 nebo Glycergel, Kód č. C0563. POZNÁMKA: Podložní skla lze číst, kdykoli je to vhodné. Pokud jsou však podložní skla po dobu více než jednoho týdne zakryta vodným montážním médiem a vystavena intenzivnímu světlu, může dojít k určitému vyblednutí. Z důvodu minimalizace vyblednutí skladujte podložní skla ve tmě a při pokojové teplotě (20 25 C). Kontrola kvality - prs Odchylky od doporučených postupů fixace tkání, zpracování a zalévání v laboratoři uživatele mohou způsobit výraznou variabilitu výsledků, která si kromě používání podložních skel s kontrolními vzorky dodaných společností Dako navíc vyžádá pravidelné provádění vlastních kontrol. V USA se řiďte pravidly pro kontrolu kvality certifikačního programu pro imunohistochemii Společností amerických patologů (College of American Pathologists CAP). Další informace můžete najít i ve schválených směrnicích pro zajištění jakosti CLSI (dříve NCCLS) (24) a v literatuře pod číslem 25. Tabulka 1. Účel každodenní kontroly kvality. Tkáň: Fixována a zpracována jako vzorek pacienta Specifická protilátka a sekundární protilátka Nespecifická protilátka* nebo pufr a stejná sekundární protilátka, která byla použita pro specifickou protilátku Pozitivní kontrola: Tkáň nebo buňky obsahující cílový antigen, který je třeba detekovat (může se nacházet ve tkáni pacienta). Ideální kontrola je jednou týdně pozitivní barvení tkáně nejcitlivější na degradaci protilátky nebo antigenu. Řídí všechny kroky analýzy. Ověřuje reagens a postupy použité pro barvení proteinu HER2. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Negativní kontrola: Tkáně nebo buňky, které by měly být negativní (mohou se nacházet ve tkáni pacienta nebo tkáni pro pozitivní kontrolu). Detekce neplánované křížové reaktivity protilátky s buňkami nebo buněčnými složkami. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Tkáň pacienta Detekce specifického zabarvení. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 13/52

Rakovina prsu Podložní skla s kontrolním vzorkem dodávaná společností Dako. Pouze postup kontrolního barvení * Sérum ze stejných druhů jako specifická protilátka, není však zaměřeno proti stejnému cílovému antigenu. K detekci nespecifické vazby protilátky, např. vazby Fc části protilátky ke tkáni. Podložní sklo s kontrolními vzorky (dodávané): Každé dodané podložní sklo s kontrolními vzorky obsahuje tři slisované linie lidských buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 0, 1+ a 3+. V každém barvícím cyklu by se mělo barvit jedno podložní sklo. Hodnocení linií buněk na podložních sklech s kontrolními vzorky dodanými společností Dako rozhoduje o platnosti cyklu barvení. Tkáň pro pozitivní kontrolu: Kontrolní vzorky by měly být čerstvé fixované vzorky z pitvy/biopsie/operace zpracované a zalité co nejdříve stejným způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta. Pozitivní kontroly tkáně jsou známkou správně připravených tkání a použití správných metod barvení. Pro každou sadu testovacích podmínek by měla být v každém cyklu barvení použita jedna tkáň pro pozitivní kontrolu. U tkání použitých pro pozitivní kontroly tkáně by se mělo projevit slabé pozitivní zabarvení, aby mohly tkáně detekovat mírné změny v citlivosti primární protilátky. Podložní skla s kontrolními vzorky dodané s touto soupravou nebo různě zpracované vzorky ze vzorku (vzorků) pacienta ověřují pouze činnost reagencie, ale neověřují přípravu tkáně. Pro tkáň použitou pro pozitivní kontrolu použijte dříve zjištěný protein HER2, 2+ hyperexprimující invazivní (infiltrující) lidskou tkáň karcinomu prsu. POZNÁMKA: Známé tkáně pro pozitivní kontrolu by měly být používány pouze ke sledování správné funkce zpracovaných tkání a testovacích reagencií, NIKOLIV jako pomůcka k formulaci specifické diagnózy vzorků pacienta. Pokud se při pozitivních kontrolách tkáně neprojeví příslušné pozitivní zabarvení, je nutno považovat výsledky pacientových vzorků za neplatné. Tkáň pro negativní kontrolu: Při každém barvícím cyklu používejte fixovanou tkáň pro negativní kontrolu (o níž víme, že je protein HER2 negativní) zpracovanou a zalitou identickým způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta, aby byla ověřena specificita primární protilátky a aby se projevilo specifické zabarvení pozadí. Tračník, játra nebo štítná žláza jsou vyhovující jako tkáně pro negativní kontrolu. Rozmanitost různých typů buněk, které se nacházejí ve většině řezů tkání, nabízí vnitřní oblasti pro negativní kontrolu (to by měl ověřit uživatel). Normální prsní kanálky mohou sloužit jako vnitřní negativní kontroly. Pokud se objeví specifické zabarvení tkáně pro negativní kontrolu nebo ve vnitřní oblasti tkáně pro negativní kontrolu, je nutné výsledky pacientských vzorků považovat za neplatné a test se musí opakovat. Reagencie nespecifické negativní kontroly: Použijte dodané reagens pro negativní kontrolu místo primární protilátky s řezem každého vzorku pacienta a vyhodnoťte tak nespecifické zabarvení a umožněte lepší interpretaci specifického zabarvení v oblasti antigenu. Inkubační doba činidla pro negativní kontrolu by měla odpovídat inkubační době primární protilátky. Ověření testu: Před prvním použitím protilátky nebo barvicího systému v diagnostické metodě by měl uživatel ověřit specificitu protilátky tak, že ji vyzkouší u několika sérií v laboratoři dostupných tkáních se známou imunocytochemickou charakteristikou účinnosti, které představují známé pozitivní a negativní tkáně. Seznamte se s postupy pro kontrolu kvality popsanév této části příbalového letáku a s požadavky pro kontrolu kvality programu CAP Certification Program for Immunohistochemistry nebo CLSI (dříve NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). Tyto postupy pro kontrolu kvality musí být provedeny vždy, když se změní šarže protilátky nebo když se změní parametry testu. Pro ověření testu jsou vhodné karcinomy prsu se známými intenzitami zabarvení od 0-3+ proteinu HER2 a negativní tkáně, např. tračník, játra nebo štítná žláza. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 14/52

Rakovina prsu Interpretace zabarvení - prs Pro stanovení hyperexprese proteinu HER2 by měla být vyhodnocována intenzita a vzor pouze membránového zabarvení pomocí škály uvedené v tabulce 2. Vyhodnocení podložních skel by měl provádět patolog pomocí světelného mikroskopu. Pro vyhodnocení imunocytochemického barvení a jeho ohodnocení je vhodné zvětšení objektivu 10x. Použití zvětšení objektivu 20 40x je vhodné pro potvrzení skóre. Cytoplazmatické zabarvení by se mělo považovat za nespecifické zabarvení a nemělo by být zahrnováno do hodnocení intenzity membránového zabarvení (8). Další informace o pomůckách při diferenciaci zabarvení 0, 1+, 2+ a 3+ a reprezentativní obrázky intenzity zabarvení naleznete v příručce HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Příručka k interpretaci zabarvení při testu HercepTest rakovina prsu) společnosti Dako. Hodnoceny by měly být pouze vzorky pacientů s karcinomem prsu. V případě výskytu karcinomu in situ a invazivního karcinomu ve stejném vzorku se hodnotí pouze invazivní komponenta. Tabulka 2. Kritéria intenzity barvení buněčné membrány. Barvící vzor Nebylo pozorováno žádné zbarvení nebo bylo pozorováno membránové zbarvení v méně než 10 % nádorových buněk Nejasné / sotva znatelné membránové zbarvení bylo zjištěno ve více než 10 % nádorových buněk. Buňky byly zabarveny pouze na části své membrány Slabé až střední úplné membránové zabarvení bylo pozorováno ve více než 10 % nádorových buněk Silné úplné membránové zabarvení bylo pozorováno ve více než 10 % nádorových buněk Skóre (Hlášení ošetřujícímu lékaři) 0 1+ 2+ 3+ Hodnocení hyperexprese proteinu HER2 (Hlášení ošetřujícímu lékaři) Negativní Negativní Slabě pozitivní Silně pozitivní HercepTest se interpretuje pro hyperexpresi proteinu HER2 jako negativní (intenzita zabarvení 0 a 1+), slabě pozitivní (intenzita zabarvení 2+) a silně pozitivní (intenzita zabarvení 3+). HercepTest není vhodný k provádění prognóz pacienta a lékaře a nebyl pro tento účel ověřen. Aby barvící cyklus byl platný a aby bylo možno uskutečnit semikvantitativní zkoušku intenzity zabarvení vzorku tkáně, je třeba podložní skla pro každý barvící cyklus testovat v pořadí uvedeném v tabulce 3. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 15/52

Rakovina prsu Tabulka 3. Pořadí hodnocení podložních skel. Pořadí čtení skel 1. Podložní sklo s kontrolními vzorky obsahující tři buněčné linie Zdůvodnění Přítomnost hnědého zabarvení membrány buněk 3+ (proužkování) SK-BR-3 kontrolní buněčné linie 3+, částečné hnědé proužky 1+ MDA-175 kontrolní buněčné linie a žádné zabarvení 0 MDA-231 kontrolní buněčné linie označuje, že je zkouška platná. V malém až středním počtu buněk slabě pozitivní 1+ MDA-175 kontrolní buněčné linii je přítomno tečkované a nesouvislé membránové zabarvení. V této buněčné linii lze pozorovat také bodové imunologické zabarvené v cytoplazmě Golgiho oblasti. Přítomnost hnědého zabarvení v MDA-231 kontrolní buněčné linii O (negativní na barvení proteinem HER2) označuje, že během zkoušky zde bylo nespecifické zabarvení. Výsledky zkoušky mohou být v důsledku přílišného zabarvení neplatné. 2. Podložní sklo s tkání pro pozitivní kontrolu Mělo by se objevit hnědé membránové zabarvení. Zabarvení cytoplazmy a negativních tkání by nemělo být silnější než 1+. 3. Podložní sklo s tkání pro negativní kontrolu NEPŘÍTOMNOST specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost křížové reaktivity sady s buňkami / částmi buněk. Pokud se projeví specifické membránové zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. 4. Podložní sklo s tkání pacienta zabarvené pomocí činidla pro negativní kontrolu. 5. Podložní sklo s tkání pacienta zabarvené pomocí primární protilátky. Nepřítomnost specifického membránového zbarvení potvrzuje specifické značení cílového antigenu primární protilátkou. Jiné než hnědé zabarvení vyskytující se v cytoplazmě vzorků zpracovaných reagencií pro negativní kontrolu, například v pojivové tkáni, leukocytech, erytrocytech nebo v nekrotické tkání by se mělo považovat za nespecifické zabarvení pozadí a mělo by být hlášeno v kapitole komentáře v datovém listu. Když je ve vzorku zjištěna hyperexprese proteinu HER2, projeví se to jako hnědé proužky nacházející se na buněčné membráně nádorových buněk zpracovaných primární protilátkou. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 16/52

Rakovina prsu 1. Podložní sklo s kontrolními vzorky (dodávané): Nejprve je třeba prozkoumat kontrolní sklíčko obarvené HercepTest, které potvrdí správnou funkčnost všech reagencií. Přítomnost hnědého produktu reakce (3,3 -diaminobenzidin, DAB) na membráně buňky indikuje pozitivní reaktivitu. Přítomnost hnědého zabarvení membrány buněk po celém obvodu (proužkování) v SK-BR-3 kontrolní buněčné linii 3+, částečné hnědé proužky v MDA-175 kontrolní buněčné linii 1+ a žádné zabarvení v MDA-231 0 kontrolní buněčné linii označuje, že je zkouška platná. Jestliže jakákoli kontrolní buněčná linie neodpovídá těmto kritériím, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. 2. Tkáň pro pozitivní kontrolu: Jako další je třeba zkontrolovat podložní sklo se vzorky pro pozitivní kontrolu. Toto podložní sklo ověřuje, zda fixační metoda a vyhledávání epitopu jsou účinné. K interpretaci výsledků použijte intaktní buňky, protože nekrotické a degenerované buňky se často zabarvují nespecificky (26). Zabarvení by mělo být pozorováno v nádorových buňkách jako hnědé zabarvení membrány buněk. Hnědé zabarvení cytoplazmy a negativních tkání na vzorku by nemělo být silnější než skóre intenzity zabarvení 1+. 3. Tkáň pro negativní kontrolu: Sklíčka s tkání pro negativní kontrolu je nutno otestovat po tkáni pro pozitivní kontrolu, abychom ověřili specificitu značení cílového antigenu primární protilátkou. Nepřítomnost specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost křížové reaktivity sady s buňkami / částmi buněk. Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Negativní podíly tkání pro pozitivní kontrolu mohou být také použity jako tkáň pro negativní kontrolu, ale toto musí být uživatelem ověřeno. Je třeba mít na zřeteli, že slabou reakci (intenzita zabarvení 0 1+) lze pozorovat u většiny normálních epiteliálních tkání. Vhodné tkáně pro negativní kontrolu zahrnují: tračník, játra a štítnou žlázu. Pokud se vyskytne nespecifické zabarvení, bude difúzní. Sporadické zabarvení pojivové tkáně lze také pozorovat v řezech z tkání příliš fixovaných formalínem. 4 + 5. Tkáň pacienta: Vzorky pacienta zabarvené během testu HercepTest zkontrolujte jako poslední. Intenzitu pozitivního zabarvení je nutno posuzovat v kontextu jakéhokoli nespecifického zabarvení pozadí reagencií pro negativní kontrolu. Jako u každého imunocytochemického testu, negativní výsledek znamená, že antigen nebyl detekován, nikoli, že antigen není v testovaných buňkách / tkáni přítomen. Další informace o imunoreaktivitě testu HercepTest naleznete v kapitolách Souhrn a vysvětlení, Omezení a Charakteristiky účinnosti. Další doporučení k interpretaci výsledků barvení během testu HercepTest Většina metastatických karcinomů prsu testovaných na hyperexpresi proteinu HER2 dávala skóre 0 nebo 3+. Zatímco většina těchto případů je zcela jasná, malé procento vzorků s intenzitou 1+ a 2+ se může zdát těžko interpretovatelné. K interpretaci zabarvení pro HercepTest ve vaší laboratoří použijte následující pokyny. K ověření účinnosti zkoušky je třeba vyhodnotit kontrolní buněčné linie. Vyhodnoťte podložní skla pro pozitivní a negativní kontrolu. Pro první vyhodnocení se doporučuje barvení vzorků tkání hematoxylinem a eozinem (H&E). (Nádor nemusí být zjevný, díváte-li se na vzorek barvený testem HercepTest. Patologové vyžadují pro ověření přítomnosti tumoru sklíčko s tkání obarvenou H a E.). Test HercepTest TM je třeba provést na párovém řezu (sériový řez) ze stejného parafínového bloku vzorku. Nejdříve vyhodnoťte řezy barvené na hyperexpresi proteinu HER2 s nejmenším zvětšením. Většina pozitivních případů bude zřetelná již při malém zvětšení. Ke stanovení procenta pozitivních nádorových buněk je třeba použít dobře uchovávané a barvené oblasti vzorku. Obecně by skóre případů mělo být zjevné při malém zvětšení. Rozhodujete-li při malém zvětšení případy mezi hodnotami 1+/2+, obvykle je třeba zvolit hodnotu 1+. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 17/52

Rakovina prsu K ověření membránového zabarvení použijte zvětšení objektivu 20 40x. Omezení - prs Všeobecná omezení 1. Imunocytochemie je diagnostický proces obsahující více kroků, který vyžaduje specializované vyškolení ve výběru vhodných reagencií, výběru tkání, fixaci a zpracování; přípravě imunocytochemického podložního skla a interpretaci výsledku zabarvení. 2. Zabarvení tkáně závisí na manipulaci s tkání a na jejím zpracováním před barvením. Nesprávná fixace, zmražení, rozmražení, umývání, sušení, zahřívání, řezání neb kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může vést ke vzniku artefaktů, zachycení protilátky nebo falešně negativním výsledkům. Výsledky mohou být nekonzistentní v důsledku použití různých metod fixace a zalití nebo v důsledku vnitřních nepravidelností v tkáni. 3. Přílišné nebo neúplné kontrastní zabarvení může ohrozit správnou interpretaci výsledků. 4. Klinická interpretace jakéhokoli pozitivního zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být vyhodnocena v kontextu klinického projevu, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoli zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být doplněna morfologickými studiemi a řádnými kontrolami a také dalšími diagnostickými testy. Za interpretaci barveného preparátu zodpovídá kvalifikovaný patolog, který zná použité protilátky, reagencie a použité metody. Barvení se musí provádět v certifikované, licencované laboratoři s příslušným oprávněním a pod dohledem patologa zodpovědného za hodnocení barvených podložních skel a zaručení adekvátnosti pozitivních a negativních kontrol. 5. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy B, které obsahují povrchový antigen (HBsAg) hepatitidy B, mohou s křenovou peroxidázou vykazovat nespecifické zabarvení (27). 6. Reagencie mohou vykazovat neočekávané reakce v dříve netestovaných typech tkání. Možnost neočekávaných reakcí ve skupinách testovaných tkání nelze zcela vyloučit v důsledku biologické variability exprese antigenu v novotvarech nebo jiných patologických tkáních (28). Se zdokumentovanými neočekávanými reakcemi se obraťte na oddělení Technické podpory Dako. 7. Falešně pozitivní výsledky se mohou vyskytovat v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo produktů reakce se substrátem. Mohou být také způsobeny aktivitou pseudoperoxidázy (erytrocyty) a endogenní aktivitou peroxidázy (cytochrom C) (28). 8. Postup barvení se provádí při teplotě okolí v rozmezí 20 25 C. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 18/52

Rakovina prsu Specifická omezení výrobků 1. Antigen přítomný v MDA-175 kontrolní buněčné linii 1+ může být po určité době degradován. Posuzujte výsledky podložních skel s kontrolními vzorky ve spojení s datem exspirace podložních kontrolních skel. Negativní zabarvení buněk MDA-175 může znamenat pouze degradaci podložních skel s kontrolními vzorky. Podložní skla s kontrolními vzorky musí být skladována při 2 8 C. 2. Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny degradací antigenu v tkáních, ke které může po určité době docházet. Vzorky by měly být barveny do 4 6 týdnů od montáže tkání na podložní skla, pokud jsou skladovány při pokojové teplotě (20 25 C) (29). 3. Pro dosažení optimálních a opakovatelných výsledků potřebuje protein HER2 tepelně indukované vyhledávání cíle, pokud jsou tkáně běžným způsobem fixovány (neutrální pufrovaný formalín nebo Bouinovo fixativum) a zality v parafínu. Tato předběžná úprava se musí dokončit před začátkem celého postupu barvení. Další pokyny najdete v sekci Příprava vzorků, Úprava vzorků před barvením. 4. Tepelně indukované vyhledávání epitopu proteinu HER2 musí být prováděno pouze v kalibrované vodní lázni. Jiné metody zahřívání byly testovány, ale neposkytly reprodukovatelné výsledky. 5. Nenahrazujte reagencie soupravy reagenciemi z jiných čísel šarží nebo ze souprav od jiných výrobců. Jedinou výjimkou je promývací pufr Wash Buffer, který může být nahrazen pufrem Dako Wash Buffer, Kód č. S3006. 6. Z hodnocení cytoplazmatického zabarvení by se mohly získat falešně negativní výsledky. Při interpretaci výsledků posuzujte pouze intenzitu membránového zabarvení. 7. Barvení linií kontrolních buněk by mělo být použito pouze pro ověření postupu barvení a nemělo by se používat pro hodnocení reakce barvení v tkáňových řezech. 8. Silné fokální zabarvení (3+), tj. občas lze pozorovat aktivní body. To může být výsledek nerovnoměrné fixace nebo zpracování tkáně. Doporučuje se imunologické barvení druhého tkáňového bloku ze stejného vzorku. 9. Použití testu HercepTest na vzorcích fixovaných jinými fixačními prostředky než neutrálním pufrovaným formalínem nebo Bouinovým fixativem dosud nebylo ověřeno. 10. Normální epitel v prsní tkáni by se měl barvit mezi 0 a 1+. Je-li pozorováno barvení normálního epitelu výše než 1+, test je třeba opakovat. Připomínáme, že normální epitely tonzily a jícnu se mohou zabarvit až do intenzity 2+. Charakteristiky účinnosti - prs Pozadí Klinické studie (CTA) použité k vyhledání vhodných pacientů pro klinické studie s Herceptinem sloužily hodnotícím účelům a již nejsou k dispozici. Test HercepTest byl vyvinut za účelem porovnání se studií CTA. Bezpečnost účinnosti Herceptinu byla hodnocena v náhodně uskutečněné klinické studii a v rozsáhlé, veřejné studii (viz příbalový leták Herceptinu ). Všichni pacienti vybraní do klinických studií s Herceptinem vykázali během imunocytochemického testování provedeného pomocí CTA v centrální laboratoři hyperexpresi proteinu HER2. Léčba Herceptin připadala v úvahu u pacientů, jejichž tumor vykazoval skóre 2+ a 3+ overexprese proteinu HER2 (na základě škály 0-3+, kde 3+ představuje nejvyšší hodnotu). Podskupina analýz výsledku z těchto studií dává předpoklad, že pacienti, jejichž tkáně jsou silně pozitivní (3+) na hyperexpresi proteinu HER2 mohou mít z léčby Herceptinem větší přínosy, než pacienti, jejichž tkáně jsou slabě pozitivní (2+). Stupeň hyperexprese proteinu HER2 je potencionálně důležitým prediktorem účinnosti léčby Herceptinem. Protože žádný z pacientů (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 19/52

Rakovina prsu účastnící se studie s přípravkem Herceptin nebyl vybrán pomocí HercepTest, korelace mezi stupněm pozitivity a pravděpodobností přínosu léčby přípravkem Herceptin není známa. Srovnávací studie K specifikaci testu HercepTest byly provedeny dvě studie. 1) Srovnání s klinickou výzkumnou studií (CTA). 2) Kontrola přesnosti srovnáním s pěti dalšími studiemi. Srovnání s klinickou výzkumnou studií (CTA) K identifikaci vhodných pacientů pro léčbu přípravkem Herceptin byl porovnán HercepTest se studií CTA, bylo použito 274 na protein HER2 pozitivních (2+ nebo 3+) a stejný počet na protein HER2 negativních vzorků rakovinných tkání prsu Tabulka 4 ukazuje výsledky v diagramu 2 x 2, přičemž hodnoty 0 a 1+ byly považovány za negativní a 2+ a 3+ byly pozitivní. Tabulka 4. Shoda 2 x 2 studie HercepTest s klinickou studií CTA (počet vzorků). Klinická výzkumná studie Pozitivní Negativní Celkem HercepTest Pozitivní 216 59 275 Negativní 58 215 273 Celkem 274 274 548 Shoda: 79 % (76 82 %) 95 % interval spolehlivosti. Celková binární shoda testu HercepTest se studií CTA byla 79 % (431/548), s 95 % dvoustranným intervalem spolehlivosti 76 82 %. Dvacet jedna procent (21 %) výsledků bylo u těchto dvou metod nesouhlasných. Výsledky studie HercepTest se hodnotí podle škály 0-3+ a pro overexpresi proteinu HER2 jsou interpretovány jako negativní (intenzita zbarvení 0 a 1+), slabě pozitivní (intenzita zbarvení 2+) a silně pozitivní (intenzita zbarvení 3+). Tabulka 5. Shoda 3 x 3 studie HercepTest s klinickou studií CTA. Klinická výzkumná studie 3+ 2+ 0-1+ Celkem HercepTest 3+ 107 36 6 149 2+ 16 57 53 126 0-1+ 8 50 215 273 Celkem 131 143 274 548 Shodný projev 3 x 3 znamená, že hodnota 3+ u testu HercepTest s vysokou pravděpodobností odpovídá pozitivnímu výsledku ve studii CTA, což odpovídá kriteriím zadání pro zkoušku s Herceptinem (2+ nebo 3+). Výskyt hodnoty 2+ v testu HercepTest nekoreluje také s výsledky studie CTA. Asi 42 % (53/126) výsledků 2+ testu HercepTest bylo negativních za použití CTA (0 1+), což nedovoluje zařazení do klinických zkoušek s Herceptinem. Věrohodnost HercepTest byl rovněž testován na 2 mikroskopických sklech obsahujících tkáňové řezy zalité v parafínu ze 168 nádorů prsu. Nádory byly již specifikovány pomocí pěti různých metod ke stanovení amplifikace genu HER2 a hyperexprese proteinu HER2, včetně testu Southern blot v laboratoři uživatele, fluorescence in situ hybridizace (FISH) pro amplifikaci DNA, analýz RNA pomocí Northern blot, testu Western blot a imunocytochemie (ICC) na zmražených tkáních (29). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 20/52

Rakovina prsu Tabulka 6. Srovnání studie HercepTest s kombinovanými výsledky (OE) testů amplifikace genu a overexprese proteinu HER2. Klasifikace referenčních OE + - Celkem HercepTest + 43 0 43-26 99 125 Celkem 69 99 168 Shoda v pozitivitě 43/69 = 62 % Shoda v negativitě: 99/99 = 100% Výsledky vykazují 85 % (142/168) úroveň shody (95 % interval spolehlivosti 78 89 %) mezi pozitivitou (2+ a 3+) a negativitou (0 a 1+) intenzity barvení pomocí testu HercepTest. Žádný ze vzorků negativních v 5 různých metodách nebyl pozitivní v testu HercepTest, přičemž sloučené výsledky těchto 5 různých metod vykázaly vyšší počet pozitivních případů. Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost intra-run Reprodukovatelnost intra-run byla testována v jedné laboratoři s 5 vzorky různých hodnot ICC intenzity zabarvení. Každý vzorek byl spouštěn trojmo v randomizované a zaslepené úpravě. Protokol je určen pro automatické barvení. Všechny vzorky vykázaly 100 % opakovatelné výsledky. Reprodukovatelnost inter-run Reprodukovatelnost inter-run testovali ve třech laboratořích po dobu 4 dnů s 5 randomizovanými a zaslepenými vzorky různých hodnot intenzity barvení ICC pomocí automatizované metodologie. Vynikající reprodukovatelnost byla zjištěna, co se týče pozitivních versus negativních výsledků (0 a 1+ versus 2+ ad 3+) s výjimkou dvou vzorků v jedné laboratoři, které se pohybovaly mezi 1+ a 2+. 100 % reprodukovatelnost byla u vzorků 2+ a 3+. Reprodukovatelnost mezi laboratořemi Reprodukovatelnost mezi laboratořemi byla testována ve třech geograficky oddělených laboratořích s 40 stejnými randomizovanými a zaslepenými vzorky různých hodnot ICC zabarvení. Čerstvé řezy byly odeslány do jednotlivých testovacích laboratoří za účelem automatického barvení a vyhodnocení patologem. Procentuální shoda se mezi laboratořemi pohybovala od 83% do 90 % u dichotomického určení pozitivní/negativní, kde 0 byla negativní a 2+ a 3+ byly pozitivní na hyperexpresi proteinu HER2. V porovnání s výsledky dosaženými v referenční laboratoři prostřednictvím studie CTA, bylo 12,5 % (15/120) porovnávaných výsledků odlišných u určení negativní (0 nebo 1+) a pozitivní (2+ nebo 3+). Dále bylo 10 % (12/120) odlišných případů mezi hodnotami 2+ a 3+. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 21/52

Rakovina prsu Imunoreaktivita Tabulka 7 shrnuje imunoreaktivitu testu HercepTest s doporučeným panelem normálních tkání. Všechny tkáně byly fixovány formalinem a zality do parafínu. Barvení bylo provedeno pomocí reagencií HercepTest dle návodu na příbalovém letáku. Tabulka 7. Shrnutí reaktivity HercepTest u normálních tkání. Typ tkáně (počet testovaných) Tkáň nadledvinek (3) Kostní dřeň (3) Mozek/Cerebellum (3) Mozek/Cerebrum (3) Prsní tkáň (3) Děložní čípek (3) Tlusté střevo (3) Jícen (3) Srdce (3) Ledviny (3) Játra (3) Plíce (3) Buňky mezotelu (3) Vaječníky (3) Pankreas (3) Příštítná tělíska (3) Periferní nerv (3) Hypofýza (3) Prostata (3) Slinná žláza (3) Kosterní sval (3) Kůže (3) Tenké střevo (3) Slezina (3) Žaludek (3) Varle (3) Brzlík (3) Štítná žláza (3) Tonzila (3) Děloha (3) Zabarvení pozitivního prvku tkáně a vzor zabarvení Prsní žláza (2 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk) Epiteliální buňky (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk, membrána a cytoplazma, granulární) Epiteliální buňky folikulu (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk, membrána a cytoplazma) Skvamózní epitel (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk. 2 ze 3 tkání, intenzita barvení 2+, 10 20 % buněk, membrána a cytoplazma) Endometriální tkáň (2 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, 30 60 % buněk, cytoplazma, granulární) Zaznamenané zabarvení ve všech tkáních bylo membránové, pokud není uvedeno jinak. Všechny tři vzorky z každého typu tkáně měly stejnou intenzitu zabarvení, pokud není uvedeno jinak. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 22/52

Rakovina prsu Řešení problémů - prs Postup nápravy najdete v sekci Řešení problémů již dříve zmiňované příručce (19) Dako. Objevíte-li neobvyklé zbarvení, kontaktujte oddělení Technické podpory Dako. Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 1. Nedochází k barvení podložních skel. 2. Podložní skla jsou slabě zabarvena. 1a. Chyba programování. Reagencie nebyly použity ve správném pořadí 1b. Ampule s reagenciemi nebyly zavedeny na správná místa ve stojanu na reagencie 1c. Nedostatečné množství činidla v reagenční lahvičce 1d. Azid sodný v promývacím roztoku. 1e. Nadměrné zahřívání namontovaných tkáňových řezů před deparafinací a tepelně indukovaném vyhledávání antigenu může vést ke ztrátě viditelné HER2 imunoreaktivity. 2a. Nepřiměřené vyhledávání epitopu. 2b. Nepřiměřené inkubační doby reagencií 2c. Byl použit nevhodný způsob fixace 2d. Nadměrné zahřívání namontovaných tkáňových řezů před deparafinací a tepelně indukovaným vyhledávání antigenu může způsobit výrazné snížení viditelné HER2 imunoreaktivity 2e. Bylo aplikováno nedostatečné množství činidla 1a. Zkontrolujte systémovou mřížku, zda bylo spuštění barvení správně nastaveno 1b. Zkontrolujte správnost umístění ampulí s reagenciemi podle mapy reagencií 1c. Před zahájením cyklu se ujistěte, že je v reagenčních lahvičkách dostatek činidel. Potřebné objemy najdete v mapě reagencií 1d. Používejte čerstvý promývací pufr bez azidu dodaný se soupravou. 1e. Nechejte tkáňové řezy uschnout na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin nebo až do jejich uschnutí. Alternativně je možné je sušit přes noc při 37 C nebo při 60 C po dobu maximálně jedné hodiny. Sušení tkáňových řezů při zvýšené teplotě se smí provádět pouze v kalibrované troubě s rovnoměrným rozložením tepla (17). 2a. Zkontrolujte, zda roztok pro vyhledávání epitopu byl zahříván na 95 99 C po celou dobu 40 minut a zda chladnul po dobu dalších 20 minut 2b. Přečtěte si pokyny k postupu barvení. 2c. Zkontrolujte, zda není tkáň pacienta příliš fixována a zda je použit schválený fixační prostředek. 2d. Nechejte tkáňové řezy uschnout na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin nebo až do jejich uschnutí. Alternativně je možné je sušit přes noc při 37 C nebo při 60 C po dobu maximálně jedné hodiny. Sušení tkáňových řezů při zvýšené teplotě se smí provádět pouze v kalibrované troubě s rovnoměrným rozložením tepla (17). 2e. Zkontrolujte velikost tkáňového řezu (22 mm x 22 mm) a množství aplikovaného činidla. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 23/52

3. Nadměrné zbarvení pozadí sklíček 4. Tkáň se odděluje od podložních skel 5. Příliš silné specifické zbarvení 3a. Parafín není zcela odstraněn 3b. K montáži řezů na podložní skla byly použity škrobové přísady. 3c. Sklíčka nebyla důkladně opláchnuta 3d. Při barvení došlo k vysušení řezů 3e. Při zakládání do přístroje Autostainer došlo k vysušení řezů 3f. Byl použit nevhodný způsob fixace 3g. Nespecifická vazba reagencií k tkáni 4a. Použití nesprávných podložních skel 5a. Byl použit nevhodný způsob fixace 5b. Byl použit nesprávný zdroj tepla pro vyhledávání epitopu, např. pára, mikrovlnná trouba nebo autokláv 5c. Inkubační doby reagencie jsou příliš dlouhé 5d. Byl použit nesprávný promývací roztok Rakovina prsu 3a. Používejte čerstvé čisté roztoky postupujte podle návodu uvedeného v části B.1 3b. Pro lepení řezů na podložní skla nepoužívejte žádné přísady. Mnoho přísad imunologicky reaguje 3c. Před spuštěním cyklu zkontrolujte, zda je přístroj Autostainer řádně naprimován. Zkontrolujte, zda je k dispozici dostatečné množství pufru pro celý cyklus. Použijte čerstvé roztoky pufrů a promývacích činidel 3d. Zkontrolujte, zda se na podložní skla nanáší odpovídající množství činidla. Zkontrolujte, zda je Autostainer spuštěn s uzavřeným krytem a zda není vystaven nadměrnému teplu nebo průvanu. 3e. Zajistěte, aby řezy při zavádění a před zahájením spuštění zůstaly vlhké. 3f. Zkontrolujte, zda bylo použito doporučené fixativum. Jiná fixativa mohou zapříčinit přílišné zabarvení pozadí. 3g. Zkontrolujte, zda je vzorek dobře fixován nebo zda se u něj nevyskytuje nekróza 4a. Použijte silanizovaná sklíčka, například Dako Silanized Slides, Kód č. S3003, SuperFrost Plus nebo sklíčka potažené poly-l-lysinem 5a Dohlédněte, aby byly použity pouze schválené způsoby fixace. 5b. Dohlédněte, aby byla použita vodní lázeň pro vyhledávání epitopu 5c. Přečtěte si pokyny k postupu barvení. 5d. Používejte pouze promývací roztok doporučený pro použití s touto soupravou. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 24/52

6. Slabé zabarvení podložního skla s kontrolní linií buněk 1+. 6a. Následoval nesprávný protokol vyhledávání epitopu. 6b. Neproběhla reakce s roztokem substrát-chromogenu (DAB). 6c. Degradace podložního skla s kontrolním vzorkem. Rakovina prsu 6a. Ponořte sklíčka do předehřátého odmaskovacího roztoku. Zahřejte roztok pro vyhledávání epitopu zpšt na 95 99 C a zahřívejte po celou dobu 40 minut 6b. Dodržujte inkubační dobu přesně 10 minut. Dohlédněte, aby do pufrovaného sustrátu DAb byla přidána pouze jedna kapka DAB chromogenu 6c. Zkontrolujte datum exspirace soupravy a podmínky pro skladování soupravy vytištěné na obalu. 7. Roztok pro vyhledávání epitopu se po zahřátí zakalí. 7. Po zahřátí se roztok zakalí. 7. To je normální a nemá to žádný vliv na kvalitu zabarvení. 8. Roztok pro vyhledávání epitopu je po uchovávání kalný (před zahřáním). 8. Roztok byl uchováván nesprávně nebo vypršelo datum jeho použitelnosti. 8. Zkontrolujte datum exspirace soupravy a podmínky pro uchovávání soupravy vytištěné na obalu. Roztok pro vyhledávání epitopu zlikvidujte. POZNÁMKA: Pokud nelze problém přisoudit jedné z výše uvedených příčin nebo pokud se nepodaří doporučeným postupem dosáhnout nápravy, kontaktujte prosím oddělení Technické podpory Dako. Další informace o postupech barvení a přípravě vzorků najdete v již zmíněné příručce (Handbook 18) Dako, v publikaci Atlas of Immunohistology (30) a v příručce Immunoperoxidase Techniques. Practical Approach to Tumor Diagnosis (Praktický přístup k diagnóze nádorů) (31). (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 25/52

Rakovina žaludku Souhrn a vysvětlení - žaludek Pozadí Lidský gen HER2 (rovněž nazýván jako ERBB2 nebo NEU) kóduje protein často označovaný jako protein HER2 nebo p185 HER2. Protein HER2 je membránový tyrozinkinázový receptor s homologií s receptorem epidermálního růstového faktoru (EGFR nebo HER1) (1-8). Protein HER2 je normální komponenta, exprimována mnoha typy epiteliálních buněk (8). Nadměrná exprese proteinu HER2 a amplifikace genu HER2 v rakovině žaludku byla prokázána v řadě studií (32). Pozitivitu HER2 je možné prokázat buď metodou IHC nebo FISH u 20 % pacientů (32). Předklinické studie in vitro a in vivo prokázaly, že trastuzumab (Herceptin ) je účinný u různých typů rakoviny žaludku, a proto jejich výsledky vedly k zahájení několika klinických studií (32-36). Ve studii BO18255, ToGA, fáze III, byli HER2-pozitivní pacienti s inoperabilním, lokálně pokročilým, rekurentním a/nebo metastazujícím adenokarcinomem žaludku nebo gastroezofageální junkce randomizováni do skupin léčených 5-FU nebo kapecitabinem a cisplatinou, buď v monoterapii, nebo v kombinaci s trastuzumabem. Statisticky významný přínos vyjádřený celkovou dobou přežití (overall survival, OS) byl prokázán u pacientů léčených kombinovanou léčbou trastuzumabem a chemoterapií (37, 38). Trastuzumab je lidská monoklonální protilátka, která se vysokou afinitou váže na protein HER2 a prokázalo se, že inhibuje proliferaci lidských rakovinných buněk hyperexprimujících protein HER2 in vitro a in vivo (33-36). Charakteristiky Kvůli zařazení do studie ToGA byl stav HER2 ověřen u 3803 pacientů. V této studii byla hodnocena overexprese proteinu HER2 pomocí IHC (HercepTest, Dako) a amplifikace genu HER2 metodou FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako). Platných výsledků testu bylo dosaženo u 3665 vzorků testovaných buď pomocí IHC, nebo metodou FISH a u 3280 vzorků testovaných oběma metodami. Výsledky studie ToGA ukázaly, že 22,1 % pacientů s pokročilým karcinomem žaludku bylo podle stanovení metodou IHC nebo FISH HER2-pozitivních, a to podle definice kritérií výběru ToGA HER2 (38). Více informací ohledně použití výrobku HercepTest při hodnocení pacientů, u kterých je zvažována léčba trastuzumabem, naleznete v příbalové informaci pro Herceptin. Princip metody - žaludek HercepTest obsahuje činidla potřebné pro úplnou imunocytochemickou metodu barvení ve dvou krocích pro vzorky zpracované běžným způsobem, zalité v parafínu. Po inkubaci primární králičí protilátkou proti lidskému proteinu HER2 využívá tato souprava předem připravené vizualizační reagens Visualization Reagent založené na dextranové technologii. Toto reagens obsahuje molekuly sekundárního kozího anti-králičího imunoglobulinu i molekuly křenové peroxidázy navázané na společný hlavní řetězec dextranového polymeru, a tak eliminuje nutnost sekvenční aplikace vazby protilátky a konjugátu peroxidázy. Křížová reakce vizualizačního reagens s lidskými imunoglobuliny a s fetálním telecím sérem byla odstraněna absorpcí v pevné fázi. Enzymatická přeměna následně přidaného chromogenu vede k vytvoření viditelného reakčního produktu v místě antigenu. Vzorek pak lze obarvit kontrastním barvivem a zakrýt krycím sklíčkem. Výsledky se pak interpretují pomocí světelného mikroskopu. Podložní skla s kontrolními vzorky obsahují k vyhodnocení barvících cyklů tři linie lidských buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 0, 1+ a 3+. Intenzita zabarvení těchto linií buněk koreluje s počtem receptorů na jednu buňku. HercepTest, Kód č. K5207, lze použít k automatizovanému barvení pomocí přístroje Autostainer. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 26/52

Rakovina žaludku Činidla - žaludek Dodávané materiály Materiály v níže uvedeném seznamu postačí na 50 testů (50 podložních skel inkubovaných primární protilátkou na protein HER2 a 50 podložních skel inkubovaných odpovídající reagencií pro negativní kontrolu). Počet testů vychází z použití 200 µl činidla na jeden tkáňový řez (22 mm x 22 mm) z lahviček č. 1, 2, 3 a 4 a roztoku substrát-chromogen (DAB). Kit obsahuje dostatek materiálů na maximálně 15 samostatných cyklů barvení. Lahvička č. Množství 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L Popis Peroxidase-Blocking Reagent: 3% peroxid vodíku s obsahem 15 mmol/l azidu sodného (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Afinitně izolovaná protilátka k okamžitému použití. Dodává se v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mol/l NaN 3, ph 7,2, který obsahuje stabilizující protein Imunogen: Syntetický C-koncový fragment (intracytoplazmatická část) proteinu HER2 navázaný na KLH (keyhole limpet hemocyanin). Specificita: protein HER2. Purifikační metoda: Protilátka je afinitně izolovaná pomocí imobilizovaného peptidu proteinu HER2. Visualization Reagent: Dextranový polymer konjugovaný s křenovou peroxidázou a afinitně izolovanými kozími anti-králičími imunoglobuliny. Dodává se v Tris-HCl pufru, který obsahuje stabilizující protein a antimikrobiální činidlo. Negative Control Reagent: Imunoglobulinová frakce normálního králičího séra při odpovídající koncentraci proteinu jako primární protilátka k proteinu HER2. Dodává se v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mol/l NaN 3, ph 7,2, který obsahuje stabilizující protein DAB Buffered Substrate: Substrátový pufrový roztok, ph 7,5, který obsahuje < 0,1% peroxidu vodíku, stabilizátory, posilovače a antimikrobiální prostředek. DAB Chromogen: 5 % 3,3'-diaminobenzidin v tetrahydrochloridovém chromogenovém roztoku. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citrátový pufr s detergentem. Wash Buffer (10x): Tris/HCl pufr s detergentem a antimikrobiálním činidlem. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 27/52

3 x 5 podložní skla Rakovina žaludku Control Slides:Každé podložní sklo obsahuje tři linie buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu představující různé úrovně exprese proteinu HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) a SK-BR-3 (3+). Podložní skla s kontrolními vzorky byla tepelně opracována, aby se zlepšila přilnavost vzorků ke sklům. Každé další tepelné zpracování podložních skel s kontrolními vzorky za účelem zlepšení přilnavosti řezů ke sklům může ohrozit výsledky barvení. POZNÁMKA: Všechny reagencie, včetně roztoku k vyhledávání epitopu a promývacího pufru, jsou připraveny speciálně pro použití s tímto testem. Aby test proběhl správně, nesmí být tyto reagencie ničím nahrazeny, s výjimkou promývacího pufru, místo něhož je možné použít produkt Dako s kódem č. S3006. Potřebný materiál, který není součástí dodávky Hydroxid amonný, 15 mol/l, zředěný na 37 mmol/l Kontrastní barvivo: Hematoxylin, například Mayerův hematoxylin rozpustný ve vodě, Dako Kód č. S3301 (viz NÁVOD K POUŽITÍ, A.4) Krycí sklíčka Destilovaná nebo deionizovaná voda (voda k promývání) Sušička, schopná udržovat teplotu nejvýše 60 C Etanol, bezvodý a 95 % Světelný mikroskop (zvětšení objektivu 4 40x) Montážní médium, například Dako Faramount, Kód č. S3025 nebo Glycergel, Kód č. C0563 Pozitivní a negativní tkáně k použití pro kontrolu průběhu (viz část Kontrola kvality) Sklíčka SuperFrost Plus, potažená poly-l-lysinem nebo silanizovaná sklíčka Dako Silanized Slides, Kód č. S3003 (viz Příprava vzorků) Barvící nádoby nebo lázně Časový spínač (umožňující intervaly 2 40 minut) Vodní lázeň s víkem (schopná udržovat roztok na vyhledávání epitopu při teplotě 95 99 C) Xylen, toluen nebo substituty xylenu Produkt K5207 byl speciálně navržen pro použití se systémem pro imunologické barvení Autostainer, Kód č. S3400. Informace o potřebných součástech tohoto systému najdete v návodu k použití k přístroji Autostainer. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 28/52

Skladování - žaludek Skladujte při 2 8 C. Rakovina žaludku Nepoužívejte soupravu po datu exspirace vytištěném na obalu. Pokud se reagencie skladují za jiných podmínek, než jaké jsou uvedeny v příbalovém letáku, musí uživatel provést jejich kontrolu (14a, 14b). Pozor kontrolní sklíčka musí být také skladována při 2 8 C. Neexistují žádné známky toho, že by tyto produkty byly nestabilní. Proto je nutno provádět pozitivní a negativní kontroly současně s pacientovými vzorky. Pokud se objeví neočekávaná změna barvy, kterou nelze vysvětlit odchylkami laboratorních postupů a máte-li podezření na jakýkoli problém s HercepTest, kontaktujte neprodleně oddělení Technické podpory Dako. Příprava vzorku - žaludek Se vzorky s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení z biopsie, excize a resekce, je nutno nakládat tak, aby byla zachována tkáň pro imunocytologické barvení. U všech vzorků by se měly používat standardní způsoby zpracování tkáně (15). Při testování malých vzorků biopsie zajistěte pro hodnocení IHC intaktní morfologii nádoru a přítomnost dostatečného množství nádorových buněk. Jestliže se provádí analýza s HercepTest na vzorcích biopsie, je pro docílení věrohodného výsledku stavu HER2 potřeba analyzovat vzorky biopsie z více (7-8) oblastí nádoru. Řezy zalité v parafínu Pouze tkáně uchovávané v neutrálním pufrovaném formalínu a zalité v parafínu jsou vhodné k použití. Řezy by se měly nařezat do bloků o tloušťce 3 nebo 4 mm a měly by se fixovat po dobu 18 24 hodin v neutrálním pufrovaném formalínu. Ve studii ToGA byly vzorky z biopsie fixovány po dobu 6 8 hodin (odkazy na studii, viz (37)). Tkáně se poté dehydrují s použitím alkoholů a xylenu a infiltruje se do nich roztavený parafín o teplotě nepřesahující 60 C. Správně zafixované a zalité tkáně s expresí proteinu HER2 zůstanou zachovány po neomezeně dlouhou dobu, pokud budou před řezáním a fixací na sklíčka uchovány v chladu (15 25 C) (15, 16). Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988 (Zákon o zdokonalení klinických laboratoří z roku 1998) od profesionálních uživatelů ve Spojených státech vyžaduje v 42 CFR 493.1259(b) aby bylo dodrženo následující: Laboratoř musí uchovávat barvená podložní skla nejméně 10 let od data testu a bločky vzorků nejméně dva roky od data testu (16). Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce 4 5 µm, namontovat na podložní skla a usušit na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin (nebo až do jejich uschnutí) nebo při 37 C přes noc nebo při 60 C po dobu hodiny. UPOZORNĚNÍ: Nadměrné zahřívání po dobu delší než jedna hodina při teplotě 60 C může způsobit výrazné snížení nebo ztrátu specifické, s HER2 související, imunoreaktivity (17). V zájmu zachování antigennosti se musí řezy tkání namontované na podložních sklech (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine nebo silanizovaná skla) barvit do 4 6 týdnů od řezání, pokud se skladují při pokojové teplotě (20 25 C) (18). Podložní skla požadovaná pro vyho dnocení proteinu HER2 a ověření přítomnosti nádoru se musí připravovat současně. Doporučuje se vytvořit minimálně 5 podložních skel, 1 sklo na přítomnost tumoru, 2 skla pro vyhodnocení proteinu HER2 (jedno sklo pro inkubaci s lahvičkou č. 2 a jedno sklo pro inkubaci s lahvičkou č. 4) a 2 záložní skla. Použití testu HercepTest TM u odvápněných tkání dosud nebylo ověřeno a nedoporučuje se. Další podrobné informace o přípravě vzorků naleznete v dokumentu společnosti Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) a v odkazech 15 a 16. Zpracování tkání před barvením Pro optimální účinnost zkoušky musí být použita metoda vyhledávání specifického epitopu v 10 mol/l citrátovém pufru. Vyhledávací roztok epitopu je dodáván v soupravě HercepTest. Postup spočívá v ohřátí tkáňových řezů fixovaných na sklíčka ponořená v citrátovém pufru 10 mmol/l (20) v kalibrované vodní lázni schopné zachovávat požadovanou teplotu (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 29/52

Rakovina žaludku odmaskovacího roztoku (v rozmezí 95 99 C). Laboratoře sídlící ve vyšších nadmořských výškách musí stanovit nejlepší metodu k udržování potřebné teploty vodní lázně. Vyhledávání cíle musí probíhat ve vodní lázni. Jiné metody zahřívání byly testovány, ale neposkytly reprodukovatelné výsledky. Bezprostředně po ukončení vyhledávání cíle zahajte proceduru barvení. Odchylky od opsaného postupu mohou vést k nesprávným výsledkům. Bezpečnostní opatření - žaludek 1. K použití v diagnostice in vitro. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Lahvička 1, reagens blokující eroxidázu, obsahuje 3 % peroxidu vodíku. Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. 4. Ampule 6, chromogen DAB, obsahuje 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride a má označení: H350 H341 P201 P280 P308 + P313 P405 P501 Nebezpečí Může vyvolat rakovinu. Podezření na genetické poškození. Před použitím si obstarejte speciální instrukce. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. Skladujte uzamčené. Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními nařízeními. Práce s tímto výrobkem není obecně povolena osobám mladším 18 let. Uživatelé musí být řádně proškoleni co se týče správného pracovního postupu, nebezpečných vlastností produktu a nutných bezpečnostních opatření. Další informace najdete v příslušném Bezpečnostním listu (SDS). 5. Lahvička 8, Wash Buffer (10x), obsahuje 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propan-1,3- diolhydrochlorid a 0.1-<0.2% 5-brom-5-nitro-1, 3-dioxan. Může způsobit alergickou reakci. Wash Buffer (10x) je označen: Varování H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Způsobuje vážné podráždění očí. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 6. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN 3 ), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože se koncentrace azidu sodného ve výrobku neklasifikuje jako nebezpečná, mohou usazeniny NaN 3 reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy těchto kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množství vody, aby nedocházelo k usazování azidů kovů v potrubí (21, 22). 7. Lahvička 2, 3 a 4 obsahuje materiály živočišného původu. Jako u každého výrobku biologického původu je nutno dodržovat řádná bezpečnostní opatření. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 30/52

Rakovina žaludku 8. S biologickými vzorky před a po fixaci a se všemi ostatními materiály, které s nimi přijdou do styku, je nutno manipulovat jako s potenciálně infekčním materiálem a je nutno je likvidovat s souladu s bezpečnostními opatřeními (23). Nikdy nenabírejte reagencie do pipety ústy a zamezte kontaktu reagencií a vzorků s kůží a sliznicemi. Jestliže se reagencie dostanou do kontaktu s citlivými oblastmi, omyjte je dostatečným množstvím vody. 9. Minimalizujte mikrobiální kontaminaci reagencií, aby nevzniklo nespecifické zabarvení. 10. Nedodržení inkubační doby, teploty nebo metody může vést k chybným výsledkům. Nadměrné sušení po dobu delší než jedna hodina při teplotě 60 C může způsobit výrazné snížení nebo ztrátu specifické, s HER2 související, imunoreaktivity (17). 11. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může způsobit ztrátu zabarvení antigenu. 12. Všechny reagencie, včetně roztoku k vyhledávání epitopu a promývacího pufru, jsou připraveny speciálně pro použití s tímto testem. Aby test proběhl správně, neměly by být ničím nahrazovány, s výjimkou promývacího pufru, kde je možné použít produkt s kódem č. S3006. 13. Vizualizační reagens a chromogen DAB mohou být v případě vystavení působení intenzivního světla negativně ovlivněny. Neskladujte složky systému ani neprovádějte barvení při silném světle, například při přímém slunečním světle. 14. Používejte osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. Další informace naleznete v Bezpečnostním listu o materiálech (SDS). 15. Rezidua parafínu mohou vést k falešně negativním výsledkům. 16. Za účelem přesné interpretace výsledků s HercepTest na obarvených vzorcích adenokarcinomu žaludku, včetně gastroezofageálního spojení z biopsie, se doporučuje použít shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk. Shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk sestává z 5 propojených nádorových buněk obarvených na HER2. 17. Vzhledem k heterogenní povaze vzorků rakoviny žaludku z biopsie, je pro docílení věrohodného výsledku potřeba provést HER2 IHC testování na vzorcích biopsie z více (7 8) oblastí nádoru. 18. Použití jiných než doporučených objemů činidel může mít za následek ztrátu viditelnosti imunologické reakce HER2. Jestliže ohraničený tkáňový řez není zcela pokryt 3 kapkami (100 µl) činidla, musí se přidat další 3 kapky. 19. Doporučuje se testovat více než jeden tkáňový blok z resekce rakoviny žaludku, pokud vzorek vykazuje vysokou heterogenitu (41). NÁVOD K POUŽITÍ - žaludek A. Příprava činidel Je vhodné připravit před barvením následující činidla: A.1 Vyhledávací roztok epitopu Rozřeďte před započetím plánovaného barvícího postupu dostatečné množství roztoku, lahvička 7 (roztok k vyhledávání cíle x 10) v poměru 1:10 pomocí destilované nebo deionizované vody. Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Rozředěný roztok zlikvidujte, pokud je zakalený. A.2 Promývací pufr Pro krok promývání rozřeďte dostatečné množství roztoku, lahvička 8 (promývací pufr x 10) v poměru 1:10 pomocí destilované nebo deionizované vody. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Pufr zlikvidovat, pokud je zakalený. Autostainer je naprogramován tak, aby tkáňové řezy proplachoval po použití blokovací reagencie pro peroxidázu a roztok chromogenního substrátu. Při tomto proplachování se musí (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 31/52

Rakovina žaludku použít buď destilovaná nebo deionizovaná voda nebo promývací pufr. Všechny ostatní promývací kroky vyžadují použití promývacího pufru. A.3 Roztok substrát-chromogen (DAB) Přidáním 11 kapek (25 30 µl na jednu kapku) chromogenu DAB z lahvičky 6 do jedné lahvičky 5 obsahující pufrovaný substrát DAB (11 ml) a promícháním připravíte roztok substrátchromogen. Připravený roztok chromogenního substrátu (DAB) je stabilní po dobu přibližně 5 dnů, pokud se skladuje při 2 8 C. Před použitím je nutné tento roztok pečlivě promíchat. Případná přítomnost sraženiny v roztoku neovlivní kvalitu barvení. POZNÁMKA: Barva DAB Chromogenu v lahvičce 6 se může lišit od čiré až po světle levandulovou. Barva nemá vliv na výsledky dosažené s tímto produktem. Řeďte prosím v souladu s postupem uvedeným v příbalovém letáku. Přidání příliš velkého množství DAB chromogenu do DAB pufrového substrátu způsobí poškození pozitivního signálu. A.4 Kontrastní barvivo Zabarvený výsledný produkt barvicí reakce DAB není rozpustný v alkoholu ani ve vodě. Použijte hematoxylinové kontrastní barvivo a upravte intenzitu barvení hematoxylinem na podobnou úroveň, jaká je popsána v příručce HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer (Příručka k interpretaci zabarvení při testu HercepTest rakovina žaludku) společnosti Dako. Můžete použít hematoxylin, ať už alkoholický nebo rozpustný ve vodě například Mayerův hematoxylin Dako, Kód č. S3301. Po kontrastním barvení hematoxylinem vždy provádějte důkladné propláchnutí v destilované nebo deionizované vodě, poté ponořte tkáňové řezy do lázně s 37 mmol/l vodného roztoku amoniaku (viz sekci B.2, krok 3). Vodný roztok amoniaku (37 mmol/l) se připraví smícháním 2,5 ml koncentrovaného (15 mmol/l) hydroxidu amonného s1 litrem destilované nebo deionizované vody. Nespotřebovaný vodný roztok amoniaku 37 mmol/l může být skladován při pokojové teplotě (20 25 C) v dobře uzavřené lahvi po dobu až 12 měsíců. A.5 Montovací médium Doporučuje se bezvodé, permanentní montovací médium. Vodní montáž je však také přípustná. V takovém případě doporučujeme použít fixační vodný roztok Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Kód č. S3025 nebo fixační roztok Glycergel Mounting Medium, Kód č. C0563. Glycergel před použitím zkapalněte ohřátím na přibližně 40 (± 5) C. B. Postup barvení prováděný pomocí přístroje Autostainer B.1 Poznámky k postupu Uživatel by si měl tyto pokyny pozorně přečíst a před použitím se seznámit se všemi součástmi a nástroji (viz část Bezpečnostní opatření). Před imunologickým barvením nechte všechna činidla vytemperovat na pokojovou teplotu (20 25 C). I všechny inkubace je třeba provádět při pokojové teplotě. Při vkládání sklíček do přístroje Autostainer a v průběhu postupu barvení nenechte tkáňové řezy vyschnout. Suché řezy tkání mohou vykazovat zvýšení nespecifického zabarvení. Je-li postup barvení přerušen, podložní skla je třeba ponechat v pufrové lázni po inkubaci primární protilátky po dobu až jedné hodiny při pokojové teplotě (20 25 C), aby nebyla ovlivněna účinnost barvení. Deparafinizace a rehydratace: Před barvením musí být podložní skla s tkáněmi zbavena parafínu, aby se odstranilo médium, ve kterém je tkáň zalita, a aby mohla být rehydratována. Zajistěte úplné odstranění parafínu. Přítomnost zbytků zalévacího média způsobí zvýšené nespecifické zabarvení. Tento krok by měl být prováděn při pokojové teplotě (20 25 C). 1. Umístěte sklíčka do xylénové lázně a inkubujte po dobu 5 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 2. Vyklepejte přebytečnou tekutinu a vložte sklíčka na 3 (±1) minuty do absolutního etanolu. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 32/52

Rakovina žaludku 3. Odklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 95% etanolu po dobu 3 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 4. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do destilované nebo deionizované vody na minimálně 30 sekund. Začněte postup barvení, jak je popsáno v části B.2, krok 1, Vyhledávání epitopu. Roztoky xylenu a alkoholu je nutno vyměnit po 40 podložních sklech. Místo xylenu lze použít toluen nebo substituty xylenu, například Histoclear. POZNÁMKA: Činidla a návody dodané v této soupravě byly navrženy pro optimální účinnost. Další ředění činidel nebo změna inkubačních teplot může vést k nesprávným nebo nesouhlasným výsledkům. Rozdíly v zpracování tkání a v technických postupech v laboratoři uživatele mohou znehodnotit výsledky studie pro použití vybraných pacientů pro terapii s Herceptinem. B.2 Protokol barvení Provádí se při pokojové teplotě, 20 25 C. Krok 1: Vyhledávání epitopu Naplňte barvicí nádoby, např. nádoby Coplin naředěným roztokem pro vyhledávíni epitopu (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.1). Vložte barvící nádobky s obsahem odmaskovacího roztoku do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a roztok vyhledávání epitopu na 95 99 C. Roztok pro vyhledávání epitopu se po zahřátí zakalí. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a aby nedocházelo k odpařování. Ponořte řezy vyvážené při pokojové teplotě do předehřátého roztoku Epitope Retrieval Solution v nádobách na barvení. OHŘEJTE VODNÍ LÁZEŇ A ODMASKOVACÍ ROZTOK OPĚT NA 95 99 C. Inkubujte po dobu 40 (±1) minut při 95 99 C. Vyjměte celou nádobku se sklíčky z vodní lázně. Nechte sklíčka po dobu 20 (±1) minut zchladnout v odmaskovacím roztoku při pokojové teplotě. Dekantujte odmaskovací roztok a propláchněte řezy promývacím pufrem (viz NÁVOD K POUŽITÍ, sekce A.2). Pro docílení optimální účinnosti máčejte řezy v promývacím pufru po dobu 5 20 minut po vyhledávání epitopu a před barvením. POZNÁMKA: Roztok vyhledávání epitopu je určen pouze pro jednu aplikaci. Nepoužívejte opakovaně. Krok 2: Postup pro barvicí automat 1. Pro požadované časy programu a objemy reagencií použijte Autostainerem generovanou mapu automatického programu HercepTest (konkrétní objemy jsou uvedeny v bodu 4 níže). 2. Umístěte ampule na reagencie Autostaineru do stojanu na reagencie podle mapy reagencií vygenerované programem. 3. Vložte sklíčka do Autostaineru podle mapy sklíček vygenerované počítačem. 4. Nastavte program a spusťte program HercepTest. Následuje nákres programového cyklu: Opláchnout 200 µl reagencie pro blokování peroxidázy 5 minut Opláchnout 200 µl primárního anti-her2 proteinu (nebo reagencie negativní kontroly) 30 minut Opláchnout 200 µl vizualizační reagencie 30 minut (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 33/52

Opláchnout Opláchnout Přepnout 200 µl roztoku chromogenního substrátu (DAB) 10 minut Rakovina žaludku Po kroku se substrát-chromogenem opláchněte sklíčka v deionizované vodě POZNÁMKA: Barvicí automat hardwarové verze 01 proplachuje sklíčka v pufru. Z tohoto důvodu je třeba sklíčka po vyjmutí z automatu propláchnout v deionizované vodě. Krok 3: Kontrastní barvení (návod pro hematoxylin) Vyjměte sklíčka z Autostaineru a obarvěte je v hematoxylinu podle níže uvedeného postupu. Ponořte sklíčka do lázně s hematoxylinem. Inkubujte 2 5 minut, v závislosti na koncentraci použitého hematoxylinu. Opatrně opláchněte ve vodní lázni reagenční kvality. Ujistěte se, že jste odstranili všechen zbývající hematoxylin. Nepovinné: Namočte sklíčka 10x do vodného roztoku amoniaku 37 mmol/l (viz sekci A.4). Opláchněte opatrně podložní skla v lázni s destilovanou nebo deionizovanou vodou na 2 5 minut. POZNÁMKA: V závislosti na délce inkubace a koncentraci použitého hematoxylinu bude výsledkem kontrastního barvení světlé až tmavě modré zabarvení buněčných jader. Přílišné nebo neúplné kontrastní zabarvení může ohrozit správnou interpretaci výsledků. Krok 4: Montáž Doporučuje se bezvodé, permanentní montovací médium. Vodní montáž je však také přípustná. Vzorky lze fixovat a přiklopit krycím sklíčkem s využitím kapaliny pro fixaci preparátu na bázi vody, jako je například Dako Faramount, Kód č. S3025 nebo Glycergel, Kód č. C0563. POZNÁMKA: Podložní skla lze číst, kdykoli je to vhodné. Pokud jsou však podložní skla po dobu více než jednoho týdne zakryta vodným montážním médiem a vystavena intenzivnímu světlu, může dojít k určitému vyblednutí. Z důvodu minimalizace vyblednutí skladujte podložní skla ve tmě a při pokojové teplotě (20 25 C). Kontrola kvality - žaludek Odchylky od doporučených postupů fixace tkání, zpracování a zalévání v laboratoři uživatele mohou způsobit výraznou variabilitu výsledků, která si kromě používání podložních skel s kontrolními vzorky dodaných společností Dako navíc vyžádá pravidelné provádění vlastních kontrol. V USA se řiďte pravidly pro kontrolu kvality certifikačního programu pro imunohistochemii Společností amerických patologů (College of American Pathologists CAP). Další informace můžete najít i ve schválených směrnicích pro zajištění jakosti CLSI (dříve NCCLS) (24) a v literatuře pod číslem 25. Tabulka 8. Účel každodenní kontroly kvality. Tkáň: Fixována a zpracována jako vzorek pacienta Pozitivní kontrola: Tkáň nebo buňky obsahující cílový antigen, který je třeba detekovat (může Specifická protilátka a sekundární protilátka Řídí všechny kroky analýzy. Ověřuje reagens a postupy použité pro barvení proteinu HER2. Nespecifická protilátka* nebo pufr a stejná sekundární protilátka, která byla použita pro specifickou protilátku Detekce nespecifického zabarvení pozadí. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 34/52

Rakovina žaludku se nacházet ve tkáni pacienta). Ideální kontrola je jednou týdně pozitivní barvení tkáně nejcitlivější na degradaci protilátky nebo antigenu. Negativní kontrola: Tkáně nebo buňky, které by měly být negativní (mohou se nacházet ve tkáni pacienta nebo tkáni pro pozitivní kontrolu). Detekce neplánované křížové reaktivity protilátky s buňkami nebo buněčnými složkami. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Tkáň pacienta Detekce specifického zabarvení. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Podložní skla s kontrolním vzorkem dodávaná společností Dako. Pouze postup kontrolního barvení * Sérum ze stejných druhů jako specifická protilátka, není však zaměřeno proti stejnému cílovému antigenu. K detekci nespecifické vazby protilátky, např. vazby Fc části protilátky ke tkáni. Podložní sklo s kontrolními vzorky (dodávané): Každé dodané podložní sklo s kontrolními vzorky obsahuje tři slisované linie lidských buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 0, 1+ a 3+. V každém barvícím cyklu by se mělo barvit jedno podložní sklo. Hodnocení linií buněk na podložních sklech s kontrolními vzorky dodanými společností Dako rozhoduje o platnosti cyklu barvení. Tkáň pro pozitivní kontrolu: Kontrolní vzorky by měly být čerstvé fixované vzorky z pitvy/biopsie/operace zpracované a zalité co nejdříve stejným způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta. Pozitivní kontroly tkáně jsou známkou správně připravených tkání a použití správných metod barvení. Pro každou sadu testovacích podmínek by měla být v každém cyklu barvení použita jedna tkáň pro pozitivní kontrolu. U tkání použitých pro pozitivní kontroly tkáně by se mělo projevit slabé pozitivní zabarvení, aby mohly tkáně detekovat mírné změny v citlivosti primární protilátky. Podložní skla s kontrolními vzorky dodané s touto soupravou nebo různě zpracované vzorky ze vzorku (vzorků) pacienta ověřují pouze činnost reagencie, ale neověřují přípravu tkáně. Jako ideální tkáň pro pozitivní kontrolu použijte dříve zjištěný protein HER2, 2+ hyperexprimující tkáň adenokarcinomu žaludku, včetně gastroezofageálního spojení. POZNÁMKA: Známé tkáně pro pozitivní kontrolu by měly být používány pouze ke sledování správné funkce zpracovaných tkání a testovacích reagencií, NIKOLIV jako pomůcka k formulaci specifické diagnózy vzorků pacienta. Pokud se při pozitivních kontrolách tkáně neprojeví příslušné pozitivní zabarvení, je nutno považovat výsledky pacientových vzorků za neplatné. Tkáň pro negativní kontrolu: Při každém barvícím cyklu používejte fixovanou tkáň pro negativní kontrolu (o níž víme, že je protein HER2 negativní) zpracovanou a zalitou identickým způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta, aby byla ověřena specificita primární protilátky a aby se projevilo specifické zabarvení pozadí. Tračník, játra nebo štítná žláza jsou vyhovující jako tkáně pro negativní kontrolu. Rozmanitost různých typů buněk, které se nacházejí ve většině řezů tkání, nabízí vnitřní oblasti pro negativní kontrolu (to by měl ověřit uživatel). Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Reagencie nespecifické negativní kontroly: Použijte dodané reagens pro negativní kontrolu místo primární protilátky s řezem každého vzorku pacienta a vyhodnoťte tak nespecifické zabarvení a umožněte lepší interpretaci specifického zabarvení v oblasti antigenu. Inkubační doba činidla pro negativní kontrolu by měla odpovídat inkubační době primární protilátky. Ověření testu: Před prvním použitím protilátky nebo barvicího systému v diagnostické metodě by měl uživatel ověřit specificitu protilátky tak, že ji vyzkouší u několika sérií v laboratoři dostupných tkáních se známou imunocytochemickou charakteristikou účinnosti, které představují známé pozitivní a negativní tkáně. Seznamte se s postupy pro kontrolu kvality popsané v této části příbalového letáku a s požadavky pro kontrolu kvality programu CAP Certification Program for Immunohistochemistry nebo CLSI (dříve NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). Tyto postupy pro kontrolu kvality musí být provedeny vždy, když se (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 35/52

Rakovina žaludku změní šarže protilátky nebo když se změní parametry testu. Pro ověření testu jsou vhodné adenokarcinomy žaludku, včetně gastroezofageálního spojení, se známými intenzitami zabarvení od 0 3+ proteinu HER2 a negativní tkáně, např. tračník, játra nebo štítná žláza. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 36/52

Rakovina žaludku Interpretace zabarvení - žaludek Pro stanovení hyperexprese proteinu HER2 by měla být vyhodnocována intenzita a vzor pouze membránového zabarvení pomocí škály uvedené v tabulce 9. Vyhodnocení podložních skel by měl provádět patolog pomocí světelného mikroskopu. Pro vyhodnocení imunocytochemického barvení a jeho ohodnocení je vhodné zvětšení objektivu 10x. Použití zvětšení objektivu 5 40x je vhodné pro potvrzení skóre. Cytoplazmatické zabarvení by se mělo považovat za nespecifické zabarvení a nemělo by být zahrnováno do hodnocení intenzity membránového zabarvení (8). Další informace o pomůckách při diferenciaci zabarvení 0, 1+, 2+ a 3+ a reprezentativní obrázky intenzity zabarvení naleznete v HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer (Příručka k interpretaci zabarvení při testu HercepTest rakovina žaludku) společnosti Dako. Hodnotí se pouze vzorky pacientů s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení. V případě výskytu metaplazie tenkého střeva a adenokarcinomu žaludku ve stejném vzorku se hodnotí pouze komponenta adenokarcinomu žaludku. K interpretaci výsledků obarvených vzorků z biopsie s HercepTest se doporučuje shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk. Shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk sestává z 5 propojených nádorových buněk obarvených na HER2. Tabulka 9. Interpretace a vyhodnocení imunohistochemického barvení HER2 Skóre Vzorky z operace Barvící vzor Vzorky z biopsie Barvící vzor Hodnocení nadměrní exprese HER2 0 V < 10 % nádorových buněk nebyla pozorována žádná reaktivita nebo žádná membránová reaktivita V žádné nádorové buňce (nebo <5 ve shluku) nebyla pozorována žádná reaktivita nebo žádná membránová reaktivita Negativní 1+ Nejasné / sotva znatelné membránové zbarvení bylo zjištěno ve 10 % nádorových buněk; buňky byly reaktivní pouze na části své membrány Shluk nádorových buněk ( 5 buněk) s nejasným / sotva znatelným membránovým zbarvením bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk Negativní 2+ Slabé až střední úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení ve 10 % nádorových buněk Shluk nádorových buněk ( 5 buněk) slabým až středním úplným, bazolaterálním nebo laterálním, membránovým zabarvením bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk Neprůkazné 3+ Silné úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení ve 10 % nádorových buněk Shluk nádorových buněk ( 5 buněk) se silným úplným, bazolaterálním nebo laterálním, membránovým zabarvením bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk Pozitivní Pokyny vycházející z poznatků Hofmann et al. (40). HercepTest se interpretuje pro hyperexpresi proteinu HER2 jako negativní (intenzita zabarvení 0 a 1+ ), slabě pozitivní (intenzita zabarvení 2+ ) a silně pozitivní (intenzita zabarvení 3+). HercepTest není vhodný k provádění prognóz pacienta a lékaře a nebyl pro tento účel ověřen. Aby barvící cyklus byl platný a aby bylo možno uskutečnit semikvantitativní zkoušku intenzity zabarvení vzorku tkáně, je třeba podložní skla pro každý barvící cyklus testovat v pořadí uvedeném v tabulce 10. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 37/52

Rakovina žaludku Tabulka 10. Pořadí hodnocení podložních skel. Pořadí čtení skel 1. Podložní sklo s kontrolními vzorky obsahující tři buněčné linie Zdůvodnění Přítomnost hnědého zabarvení membrány buněk 3+ (proužkování) SK-BR- 3 kontrolní buněčné linie 3+, částečné hnědé proužky 1+ MDA-175 kontrolní buněčné linie a žádné zabarvení 0 MDA-231 kontrolní buněčné linie označuje, že je zkouška platná. V malém až středním počtu buněk slabě pozitivní 1+ MDA-175 kontrolní buněčné linii je přítomno tečkované a nesouvislé membránové zabarvení. V této buněčné linii lze pozorovat také bodové imunologické zabarvené v cytoplazmě Golgiho oblasti. Přítomnost hnědého zabarvení v MDA-231 kontrolní buněčné linii O (negativní na barvení proteinem HER2) označuje, že během zkoušky zde bylo nespecifické zabarvení. Výsledky zkoušky mohou být v důsledku přílišného zabarvení neplatné. 2. Podložní sklo s tkání pro pozitivní kontrolu Mělo by se objevit hnědé membránové zabarvení. Zabarvení cytoplazmy a negativních tkání by nemělo být silnější než 1+. 3. Podložní sklo s tkání pro negativní kontrolu NEPŘÍTOMNOST specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost křížové reaktivity sady s buňkami / částmi buněk. Pokud se projeví specifické membránové zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. 4. Podložní sklo s tkání pacienta zabarvené pomocí činidla pro negativní kontrolu. 5. Podložní sklo s tkání pacienta zabarvené pomocí primární protilátky. Nepřítomnost specifického membránového zbarvení potvrzuje specifické značení cílového antigenu primární protilátkou. Jiné než hnědé zabarvení vyskytující se v cytoplazmě vzorků zpracovaných reagencií pro negativní kontrolu, například v pojivové tkáni, leukocytech, erytrocytech nebo v nekrotické tkání by se mělo považovat za nespecifické zabarvení pozadí a mělo by být hlášeno v kapitole komentáře v datovém listu. Když je ve vzorku zjištěna hyperexprese proteinu HER2, projeví se to jako hnědé proužky nacházející se na buněčné membráně nádorových buněk zpracovaných primární protilátkou. 1. Podložní sklo s kontrolními vzorky (dodávané): Nejprve je třeba prozkoumat kontrolní sklíčko obarvené HercepTest, které potvrdí správnou funkčnost všech reagencií. Přítomnost hnědého produktu reakce (3,3 -diaminobenzidin, DAB) na membráně buňky indikuje pozitivní reaktivitu. Přítomnost hnědého zabarvení membrány buněk po celém obvodu (proužkování) v SK-BR-3 kontrolní buněčné linii 3+, částečné hnědé proužky v MDA-175 kontrolní buněčné linii 1+ a žádné zabarvení v MDA-231 0 kontrolní buněčné linii označuje, že je zkouška platná. Jestliže jakákoli kontrolní buněčná linie neodpovídá těmto kritériím, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. 2. Tkáň pro pozitivní kontrolu: Jako další je třeba zkontrolovat podložní sklo se vzorky pro pozitivní kontrolu. Toto podložní sklo ověřuje, zda fixační metoda a vyhledávání epitopu jsou účinné. K interpretaci výsledků použijte intaktní buňky, protože nekrotické a degenerované buňky se často zabarvují nespecificky (26). Zabarvení by mělo být pozorováno v nádorových buňkách jako hnědé zabarvení membrány buněk. Hnědé zabarvení cytoplazmy a negativních tkání na vzorku by nemělo být silnější než skóre intenzity zabarvení 1+. 3. Tkáň pro negativní kontrolu: Sklíčka s tkání pro negativní kontrolu je nutno otestovat po tkáni pro pozitivní kontrolu, abychom ověřili specificitu značení cílového antigenu primární protilátkou. Nepřítomnost specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost křížové reaktivity sady s buňkami / částmi buněk. Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Negativní podíly tkání pro pozitivní kontrolu mohou být také použity jako tkáň pro negativní kontrolu, ale toto musí být uživatelem ověřeno. Je třeba mít na zřeteli, že slabou reakci (intenzita zabarvení 0-1+) lze pozorovat u většiny normálních epiteliálních tkání. Vhodné tkáně pro negativní kontrolu zahrnují: tračník, játra a štítnou žlázu. Pokud se vyskytne nespecifické zabarvení, bude difúzní. Sporadické zabarvení pojivové tkáně lze také pozorovat v řezech z tkání příliš fixovaných formalínem. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 38/52

Rakovina žaludku 4 + 5. Tkáň pacienta: Vzorky pacienta zabarvené během testu HercepTest zkontrolujte jako poslední. Intenzitu pozitivního zabarvení je nutno posuzovat v kontextu jakéhokoli nespecifického zabarvení pozadí reagencií pro negativní kontrolu. Jako u každého imunocytochemického testu, negativní výsledek znamená, že antigen nebyl detekován, nikoli, že antigen není v testovaných buňkách / tkáni přítomen. Další informasce o imunoreaktivitě testu HercepTest naleznete v kapitolách Souhrn a vysvětlení, Omezení a Charakteristiky účinnosti. Další doporučení k interpretaci výsledků barvení během testu HercepTest Adenokarcinomy žaludku, včetně gastroezofageálního spojení testované na hyperexpresi proteinu HER2 dávala skóre 0 až 3+. Zatímco případy se skóre 0 nebo 3+ jsou zcela jasné, malé procento zbývajících vzorků s intenzitou 1+ a 2+ se může zdát těžko interpretovatelné. K interpretaci zabarvení pro HercepTest ve vaší laboratoří použijte následující pokyny. K ověření účinnosti zkoušky je třeba vyhodnotit kontrolní buněčné linie. Vyhodnoťte podložní skla pro pozitivní a negativní kontrolu. Pro první vyhodnocení se doporučuje barvení vzorků tkání hematoxylinem a eozinem (H&E). (Nádor nemusí být zjevný, díváte-li se na vzorek barvený testem HercepTest. Patologové vyžadují pro ověření přítomnosti tumoru sklíčko s tkání obarvenou H a E.). Test HercepTest TM je třeba provést na párovém řezu (sériový řez) ze stejného parafínového bloku vzorku. Nejdříve vyhodnoťte řezy barvené na hyperexpresi proteinu HER2 s nejmenším zvětšením. Většina pozitivních případů bude zřetelná již při malém zvětšení. Pro případy se skóre 1+ použijte k ověření membránového zabarvení zvětšení objektivu 40x. Pro případy se skóre 2+ použijte k ověření membránového zabarvení zvětšení objektivu 10 20x. Vzorky z operace Ke stanovení procenta pozitivních nádorových buněk je třeba použít dobře uchovávané a barvené oblasti vzorku. Jestliže většina nádorových buněk vykazuje úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení, je skóre barvení 2+ nebo 3+. Je-li úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení silné intenzity ve více než 10 % nádorových buněk ve vzorcích z oparace, skóre vzorku je 3+. Je-li úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení slabé až střední intenzity ve více než nebo rovno 10 % nádorových buněk ve vzorcích z oparace, skóre vzorku je 2+. Jestliže je více než nebo 10 % nádorových buněk ve vzorcích z oparace zabarveno pouze v časti své membrány, s nejasnou / sotva znatelnou intenzitou, je skóre vzorku 1+. Jestliže méně než 10 % nádorových buněk ve vzorcích z operace má zabarvení, bez ohledu na vzorec zabarvení (např. kompletní, bazolaterální nebo laterální nebo část membrány), je skóre 0. Jestliže není viditelné žádné zabarvení, skóre vzorků z operace je 0. Vzorky z biopsie Shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk sestává z 5 propojených nádorových buněk obarvených na HER2. Jestliže se zde nachází shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk, které vykazují úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení, skóre vzorků z biopsie je 3+, bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 39/52

Rakovina žaludku Jestliže se zde nachází shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk, které vykazují slabě až středně úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení, skóre vzorků z biopsie je 2+, bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk. Jestliže se zde nachází shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk, které vykazují nejasné / sotva znatelné membránové zbarvení a jsou zabarveny pouze v části své membrány, skóre vzorků z biopsie je 1+, bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk. Jestliže není viditelné žádné zabarvení, skóre vzorků z biopsie je 0. Jestliže není pozorováno žádné membránové zabarvení (bez ohledu na intenzitu zabarvení) u méně než 5 nádorových buněk v shluku, skóre vzorků z biopsie je 0. Omezení - žaludek Všeobecná omezení 1. Imunocytochemie je diagnostický proces obsahující více kroků, který vyžaduje specializované vyškolení ve výběru vhodných reagencií, výběru tkání, fixaci a zpracování; přípravě imunocytochemického podložního skla a interpretaci výsledku zabarvení. 2. Zabarvení tkáně závisí na manipulaci s tkání a na jejím zpracováním před barvením. Nesprávná fixace, zmražení, rozmražení, umývání, sušení, zahřívání, řezání neb kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může vést ke vzniku artefaktů, zachycení protilátky nebo falešně negativním výsledkům. Výsledky mohou být nekonzistentní v důsledku použití různých metod fixace a zalití nebo v důsledku vnitřních nepravidelností v tkáni. 3. Přílišné nebo neúplné kontrastní zabarvení může ohrozit správnou interpretaci výsledků. 4. Klinická interpretace jakéhokoli pozitivního zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být vyhodnocena v kontextu klinického projevu, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoli zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být doplněna morfologickými studiemi a řádnými kontrolami a také dalšími diagnostickými testy. Za interpretaci barveného preparátu zodpovídá kvalifikovaný patolog, který zná použité protilátky, reagencie a použité metody. Barvení se musí provádět v certifikované, licencované laboratoři s příslušným oprávněním a pod dohledem patologa zodpovědného za hodnocení barvených podložních skel a zaručení adekvátnosti pozitivních a negativních kontrol. 5. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy B, které obsahují povrchový antigen (HBsAg) hepatitidy B, mohou s křenovou peroxidázou vykazovat nespecifické zabarvení (27). Reagencie mohou vykazovat neočekávané reakce v dříve netestovaných typech tkání. Možnost neočekávaných reakcí ve skupinách testovaných tkání nelze zcela vyloučit v důsledku biologické variability exprese antigenu v novotvarech nebo jiných patologických tkáních (28). Se zdokumentovanými neočekávanými reakcemi se obraťte na oddělení Technické podpory Dako. 6. Falešně pozitivní výsledky se mohou vyskytovat v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo produktů reakce se substrátem. Mohou být také způsobeny aktivitou pseudoperoxidázy (erytrocyty) a endogenní aktivitou peroxidázy (cytochrom C) (28). 7. Postup barvení se provádí při teplotě okolí v rozmezí 20 25 C. Specifická omezení výrobků 1. Antigen přítomný v MDA-175 kontrolní buněčné linii 1+ může být po určité době degradován. Posuzujte výsledky podložních skel s kontrolními vzorky ve spojení s datem exspirace podložních kontrolních skel. Negativní zabarvení buněk MDA-175 může znamenat pouze degradaci podložních skel s kontrolními vzorky. Podložní skla s kontrolními vzorky musí být skladována při 2 8 C. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 40/52

Rakovina žaludku 2. Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny degradací antigenu v tkáních, ke které může po určité době docházet. Vzorky by měly být barveny do 4 6 týdnů od montáže tkání na podložní skla, pokud jsou skladovány při pokojové teplotě (20 25 C) (29). 3. Pro dosažení optimálních a opakovatelných výsledků potřebuje protein HER2 tepelně indukované vyhledávání cíle, pokud jsou tkáně běžným způsobem fixovány (neutrální pufrovaný formalín) a zality v parafínu. Tato předběžná úprava se musí dokončit před začátkem celého postupu barvení. Další pokyny najdete v sekci Příprava vzorků, Úprava vzorků před barvením. 4. Tepelně indukované vyhledávání epitopu proteinu HER2 musí být prováděno pouze v kalibrované vodní lázni. Jiné metody zahřívání byly testovány, ale neposkytly reprodukovatelné výsledky. 5. Nenahrazujte reagencie soupravy reagenciemi z jiných čísel šarží nebo ze souprav od jiných výrobců. Jedinou výjimkou je promývací pufr Wash Buffer, který může být nahrazen pufrem Dako Wash Buffer, Kód č. S3006. 6. Z hodnocení cytoplazmatického zabarvení by se mohly získat falešně negativní výsledky. Při interpretaci výsledků posuzujte pouze intenzitu membránového zabarvení. 7. Barvení linií kontrolních buněk by mělo být použito pouze pro ověření postupu barvení a nemělo by se používat pro hodnocení reakce barvení v tkáňových řezech. 8. Silné fokální zabarvení (3+), tj. občas lze pozorovat aktivní body. To může být výsledek nerovnoměrné fixace nebo zpracování tkáně. Doporučuje se imunologické barvení druhého tkáňového bloku ze stejného vzorku. 9. Použití testu HercepTest na vzorcích fixovaných jinými fixačními prostředky než neutrálním pufrovaným formalínem dosud nebylo ověřeno. 10. Připomínáme, že normální epitely tonzily a jícnu se mohou zabarvit až do intenzity 2+. 11. Je nutno se vyvarovat použití rozdrcených vzorků rakoviny žaludku a interpretace uměle vzniklého zabarvení v blízkosti bioptického okraje. Charakteristiky účinnosti - žaludek Pozadí Bezpečnost a účinnost trastuzumabu (Herceptin ) byla prokázána v klinické studii (zkouška ToGA) (38, 39). Studie byla navržená jako otevřená, randomizovaná, multicentrická studie fáze III u HER2-pozitivních pacientů s inoperabilním, lokálně pokročilým, rekurentním a/nebo metastazujícím adenokarcinomem žaludku nebo gastroezofageální junkce. Pro zkoušku ToGA byla definována pozitivita HER2 jako buď IHC-pozitivní (3+) (HercepTest, Dako) a/nebo pozitivní v HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Po začlenění do studie byli pacienti randomizováni do skupiny léčené chemoterapií (5-FU nebo capecitabin a cisplatin) nebo chemoterapií plus trastuzumabem. Hlavním hlediskem úspěšnosti léčby bylo cekové přežití (overall survival, OS). V této studii bylo randomizováno celkem 594 pacientů, 584 pacientů dostávalo studiový lék a bylo zahrnuto do skupiny kompletních analýz (full analyses set, FAS). Z hlediska hlavního cíle studie byla kombinovaná léčba chemoterapie a trastuzumabu statisticky významně lepší než léčba samotnou chemoterapií. Median OS se zvýšil z 11,1 měsíců na 13,8 měsíců (p=0,0046) s mírou rizika 0,74 (95 % CI: 0,60-0,91). Kaplan-Meierovy křivky přežití (OS) jsou zobrazeny na obrázku 1. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 41/52

Rakovina žaludku Pravděpodobnost přežití 1,0 0,9 0,8 0,7 Log-rank test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Čas (měsíce) Č. vlevo Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Léčebná skupina Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Obrázek 1. Kaplan-Meierova křivka OS (n=584). Jakmile byla k dispozici data, byly provedeny předem určené exploratorní analýzy podskupin podle stavu HER2. Následně byly definovány dvě nové podskupiny HER2 na základě skóre IHC: Skupina 1 (skupina s nízkou expresí HER2): Skupina 2 (skupina s vysokou expresí HER2): IHC 0/FISH+ a IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ a IHC 3+ včetně IHC 3+ / FISH+ nebo FISH- nebo FISH bez výsledku (n=446) Po následném opakování primární analýzy celkového přežití u skupiny s vysokou expresí HER2 (n=446) byl přínos kombinované léčby dokonce vyšší. Median OS ve skupině pacientů léčených kombinací chemoterapie a trastuzumabu se zvýšil na 16 měsíců v porovnání k 11,8 měsícům u pacientů léčených samotnou chemoterapií. Míra rizika se v této analýze snížila na 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Kaplan-Meierovy křivky přežití (OS) pro skupinu s vysokou expresí HER2 jsou zobrazeny na obrázku 2. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 42/52

Rakovina žaludku Pravděpodobnost přežití 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Čas (měsíce) Č. vlevo Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Léčebná skupina Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Obrázek 2. Kaplan-Meierova křivka OS pro skupinu s vysokou expresí HER2 (n=446). Zkouška ToGA prokázala, že kombinace testování IHC a FISH je prediktivní pro účinek kombinované léčby chemoterapií a trastuzumabem, avšak podle následných exploratorních analýz se zdá, že pacienti s vyšší úrovní exprese proteinu HER2 (IHC2+/FISH+ a IHC3+) z toho více profitují. To je možné vysvětlovat faktem, že protein je cílem léčby trastuzumabem. Další informace o zkoušce ToGA naleznete v příbalové informaci pro Herceptin. Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost intra-run Reprodukovatelnost intra-run byla testována v jedné laboratoři s 3 vzorky různých hodnot IHC intenzity zabarvení. Každý vzorek byl spouštěn trojmo. Protokol je určen pro automatické barvení. Všechny vzorky vykázaly 100 % opakovatelné výsledky. Reprodukovatelnost intra-run byla testována v jedné laboratoři s 11 vzorky různých hodnot IHC intenzity zabarvení. Každý vzorek byl spouštěn trojmo. Protokol je určen pro manuální barvení. Všechny vzorky vykázaly 100 % opakovatelné výsledky. Reprodukovatelnost mezi cykly a mezi laboratořemi: Analýzy s HercepTest 60 různých vzorků rakoviny žaludku získaných z oblasti žaludku nebo gastroezofageálního spojení představujících chirurgické resekce a biopsie byly prováděny po dobu pěti různých dnů na třech různých pracovištích provádějících studii. Těchto 60 vzorků ve studii bylo rovnoměrně rozděleno do tří kategorií stavu HER2. Šest patologů provedlo celkem 2 040 hodnocení stavu HER2. Shoda mezi dny (negativní, nejasné, pozitivní) byla v rozsahu 83,1 % až 98,3 %. Ve 47 z 60 možných porovnání byla shoda 90,0 % a více. Tabulka 11 uvádí specifické příklady porovnání mezi jednotlivými dny s průměrnou shodou 91,2 %, 92,5 % a 92,5 % pro tato tři pracoviště. Shoda mezi pracovišti byla 82,7 %, 75,0 % a 88,0 %, v případě porovnávání mezi dvěma pracovišti (viz Tabulka 12). V souladu s exaktním testem Fishera, nebyly výsledky mezi pracovišti rozdílné. Shoda mezi jednotlivými hodnotiteli na každém místě byla 88,0 %, 83,6 % a 81,0 % pro všechna tři studijní pracoviště (tabulka 13). Analýzy HercepTest se vzorky rakoviny žaludku na třech studijních pracovištích prokázaly dobrou shodu mezi hodnotiteli, pokud se týče hodnocení mezi dny, místy i hodnotiteli. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 43/52

Rakovina žaludku Table 11. Celková shoda v procentech, mezi dny - subset 12 z 60 porovnání Hodnotitel 1 Hodnotitel 2 Průměrná shoda CI95 LL 1 shoda CI95 LL 1 shoda Pracoviště 1 Pracoviště 2 Pracoviště 3 1. den oproti 2. dnu 85,0 74,4 93,3 84,9 3. den oproti 4. dnu 93,3 84,9 93,3 84,9 1. den oproti 2. dnu 95,0 87,3 83,1 72,0 3. den oproti 4. dnu 96,7 89,7 95,0 87,3 1. den oproti 2. dnu 90,0 80,5 91,7 82,7 3. den oproti 4. dnu 96,7 89,7 91,7 82,7 91,2 92,5 92,5 1 CI95 LL: nižší limit intervalu spolehlivosti 95 %. Tabulka 12. Celková shoda v procentech, mezi pracovišti Shoda CI95 LL 1 Průměrná shoda 1. pracoviště oproti 2. pracovišti 1. pracoviště oproti 3. pracovišti 2. pracoviště oproti 3. pracovišti 1. den oproti 1. dnu 83,3 72,4 2. den oproti 2. dnu 85,0 74,4 3. den oproti 3. dnu 85,0 74,4 4. den oproti 4. dnu 81,7 70,5 5. den oproti 5. dnu 78,3 66,7 1. den oproti 1. dnu 80,0 68,6 2. den oproti 2. dnu 73,3 61,2 3. den oproti 3. dnu 78,3 66,7 4. den oproti 4. dnu 68,3 55,9 5. den oproti 5. dnu 75,0 63,0 1. den oproti 1. dnu 88,3 78,5 2. den oproti 2. dnu 86,7 76,4 3. den oproti 3. dnu 90,0 80,5 4. den oproti 4. dnu 86,7 76,4 5. den oproti 5. dnu 88,3 78,5 1 CI95 LL: nižší limit intervalu spolehlivosti 95 %. 82,7 75,0 88,0 (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 44/52

Rakovina žaludku Tabulka 13. Shoda mezi pozorovateli v procentech Shoda CI 95 LL 1 shoda Průměrná Pracoviště 1 Pracoviště 2 Pracoviště 3 Den 1 91,7 82,7 Den 2 91,7 82,7 Den 3 93,3 84,9 Den 4 83,3 72,4 Den 5 80,0 68,6 Den 1 86,4 76,0 Den 2 83,3 72,4 Den 3 83,3 72,4 Den 4 83,3 72,4 Den 5 81,7 70,5 Den 1 80,0 68,6 Den 2 78,3 66,7 Den 3 80,0 68,6 Den 4 78,3 66,7 Den 5 90,0 80,5 1 CI95 LL: nižší limit intervalu spolehlivosti 95 %. 88,0 83,6 81,0 (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 45/52

Rakovina žaludku Imunoreaktivita Tabulka 14 shrnuje imunoreaktivitu testu HercepTest s doporučeným panelem normálních tkání. Všechny tkáně byly fixovány formalinem a zality do parafínu. Barvení bylo provedeno pomocí reagencií HercepTest dle návodu na příbalovém letáku. Tabulka 7. Shrnutí reaktivity HercepTest u normálních tkání. Typ tkáně (počet testovaných) Tkáň nadledvinek (3) Kostní dřeň (3) Mozek/Cerebellum (3) Mozek/Cerebrum (3) Prsní tkáň (3) Děložní čípek (3) Tlusté střevo (3) Jícen (3) Srdce (3) Ledviny (3) Játra (3) Plíce (3) Buňky mezotelu (3) Vaječníky (3) Pankreas (3) Příštítná tělíska (3) Periferní nerv (3) Hypofýza (3) Prostata (3) Slinná žláza (3) Kosterní sval (3) Kůže (3) Tenké střevo (3) Slezina (3) Žaludek (3) Varle (3) Brzlík (3) Štítná žláza (3) Tonzila (3) Děloha (3) Zabarvení pozitivního prvku tkáně a vzor zabarvení Prsní žláza (2 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk) Epiteliální buňky (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk, membrána a cytoplazma, granulární) Epiteliální buňky folikulu (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk, membrána a cytoplazma) Skvamózní epitel (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk. 2 ze 3 tkání, intenzita barvení 2+, 10 20 % buněk, membrána a cytoplazma) Endometriální tkáň (2 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, 30 60 % buněk, cytoplazma, granulární) Zaznamenané zabarvení ve všech tkáních bylo membránové, pokud není uvedeno jinak. Všechny tři vzorky z každého typu tkáně měly stejnou intenzitu zabarvení, pokud není uvedeno jinak. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 46/52

Rakovina žaludku Řešení problémů - žaludek Postup nápravy najdete v sekci Řešení problémů již dříve zmiňované příručce (19) Dako. Objevíte-li neobvyklé zbarvení, kontaktujte oddělení Technické podpory Dako. Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 1. Nedochází k barvení podložních skel. 1a. Chyba programování. Reagencie nebyly použity ve správném pořadí 1b. Ampule s reagenciemi nebyly zavedeny na správná místa ve stojanu na reagencie 1c. Nedostatečné množství činidla v reagenční lahvičce 1d. Azid sodný v promývacím roztoku. 1e. Nadměrné zahřívání namontovaných tkáňových řezů před deparafinací a tepelně indukovaném vyhledávání antigenu může vést ke ztrátě viditelné HER2 imunoreaktivity. 1a. Zkontrolujte systémovou mřížku, zda bylo spuštění barvení správně nastaveno 1b. Zkontrolujte správnost umístění ampulí s reagenciemi podle mapy reagencií 1c. Před zahájením cyklu se ujistěte, že je v reagenčních lahvičkách dostatek činidel. Potřebné objemy najdete v mapě reagencií 1d. Používejte čerstvý promývací pufr bez azidu dodaný se soupravou. 1e. Nechejte tkáňové řezy uschnout na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin nebo až do jejich uschnutí. Alternativně je možné je sušit přes noc při 37 C nebo při 60 C po dobu maximálně jedné hodiny. Sušení tkáňových řezů při zvýšené teplotě se smí provádět pouze v kalibrované troubě s rovnoměrným rozložením tepla (17). 2. Podložní skla jsou slabě zabarvena. 2a. Nepřiměřené vyhledávání epitopu. 2b. Nepřiměřené inkubační doby reagencií 2c. Byl použit nevhodný způsob fixace 2d. Nadměrné zahřívání namontovaných tkáňových řezů před deparafinací a tepelně indukovaným vyhledávání antigenu může způsobit výrazné snížení viditelné HER2 imunoreaktivity. 2e. Bylo aplikováno nedostatečné množství činidla 2a. Zkontrolujte, zda roztok pro vyhledávání epitopu byl zahříván na 95 99 C po celou dobu 40 minut a zda chladnul po dobu dalších 20 minut 2b. Přečtěte si pokyny k postupu barvení. 2c. Zkontrolujte, zda není tkáň pacienta příliš fixována a zda je použit schválený fixační prostředek. 2d. Nechejte tkáňové řezy uschnout na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin nebo až do jejich uschnutí. Alternativně je možné je sušit přes noc při 37 C nebo při 60 C po dobu maximálně jedné hodiny. Sušení tkáňových řezů při zvýšené teplotě se smí provádět pouze v kalibrované troubě s rovnoměrným rozložením tepla (17). 2e. Zkontrolujte velikost tkáňového řezu (22 mm x 22 mm) a množství aplikovaného činidla. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 47/52

3. Nadměrné zbarvení pozadí sklíček 4. Tkáň se odděluje od podložních skel 5. Příliš silné specifické zbarvení 3a. Parafín není zcela odstraněn 3b. K montáži řezů na podložní skla byly použity škrobové přísady. 3c. Sklíčka nebyla důkladně opláchnuta 3d. Při barvení došlo k vysušení řezů 3e. Při zakládání do přístroje Autostainer došlo k vysušení řezů 3f. Byl použit nevhodný způsob fixace 3g. Nespecifická vazba reagencií k tkáni 4a. Použití nesprávných podložních skel 5a. Byl použit nevhodný způsob fixace 5b. Byl použit nesprávný zdroj tepla pro vyhledávání epitopu, např. pára, mikrovlnná trouba nebo autokláv 5c. Inkubační doby reagencie jsou příliš dlouhé 5d. Byl použit nesprávný promývací roztok Rakovina žaludku 3a. Používejte čerstvé čisté roztoky postupujte podle návodu uvedeného v části B.1 3b. Pro lepení řezů na podložní skla nepoužívejte žádné přísady. Mnoho přísad imunologicky reaguje 3c. Před spuštěním cyklu zkontrolujte, zda je přístroj Autostainer řádně naprimován. Zkontrolujte, zda je k dispozici dostatečné množství pufru pro celý cyklus. Použijte čerstvé roztoky pufrů a promývacích činidel 3d. Zkontrolujte, zda se na podložní skla nanáší odpovídající množství činidla. Zkontrolujte, zda je Autostainer spuštěn s uzavřeným krytem a zda není vystaven nadměrnému teplu nebo průvanu. 3e. Zajistěte, aby řezy při zavádění a před zahájením spuštění zůstaly vlhké. 3f. Zkontrolujte, zda bylo použito doporučené fixativum. Jiná fixativa mohou zapříčinit přílišné zabarvení pozadí. 3g. Zkontrolujte, zda je vzorek dobře fixován nebo zda se u něj nevyskytuje nekróza 4a. Použijte silanizovaná sklíčka, například Dako Silanized Slides, Kód č. S3003, SuperFrost Plus nebo sklíčka potažené poly-l-lysinem 5a Dohlédněte, aby byly použity pouze schválené způsoby fixace. 5b. Dohlédněte, aby byla použita vodní lázeň pro vyhledávání epitopu 5c. Přečtěte si pokyny k postupu barvení. 5d. Používejte pouze promývací roztok doporučený pro použití s touto soupravou. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 48/52

6. Slabé zabarvení podložního skla s kontrolní linií buněk 1+. 6a. Následoval nesprávný protokol vyhledávání epitopu. 6b. Neproběhla reakce s roztokem substrát-chromogenu (DAB). 6c. Degradace podložního skla s kontrolním vzorkem. Rakovina žaludku 6a. Ponořte sklíčka do předehřátého odmaskovacího roztoku. Zahřejte roztok pro vyhledávání epitopu zpšt na 95 99 C a zahřívejte po celou dobu 40 minut 6b. Dodržujte inkubační dobu přesně 10 minut. Dohlédněte, aby do pufrovaného sustrátu DAb byla přidána pouze jedna kapka DAB chromogenu 6c. Zkontrolujte datum exspirace soupravy a podmínky pro skladování soupravy vytištěné na obalu. 7. Roztok pro vyhledávání epitopu se po zahřátí zakalí. 7. Po zahřátí se roztok zakalí. 7. To je normální a nemá to žádný vliv na kvalitu zabarvení. 8. Roztok pro vyhledávání epitopu je po uchovávání kalný (před zahřáním). 8. Roztok byl uchováván nesprávně nebo vypršelo datum jeho použitelnosti. 8. Zkontrolujte datum exspirace soupravy a podmínky pro uchovávání soupravy vytištěné na obalu. Roztok pro vyhledávání epitopu zlikvidujte. POZNÁMKA: Pokud nelze problém přisoudit jedné z výše uvedených příčin nebo pokud se nepodaří doporučeným postupem dosáhnout nápravy, kontaktujte prosím oddělení Technické podpory Dako. Další informace o postupech barvení a přípravě vzorků najdete v již zmíněné příručce (Handbook 19) Dako, v publikaci Atlas of Immunohistology (30) a v příručce Immunoperoxidase Techniques. Practical Approach to Tumor Diagnosis (Praktický přístup k diagnóze nádorů) (31). (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 49/52

Reference 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230:1132-9. 2. King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229:974-6. 3. Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82:6497-501. 4. Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986;319:230-4. 5. Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985;229:976-8. 6. Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature 1986;319:226-30. 7. Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990;45:457-61. 8. Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990;5:953-62. 9. Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990;2:992-1003. 10. Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an anti-p185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:4285-9. 11. Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989;9:1165-72. 12. Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37:255-63. 13. Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58:2825-31. 14. a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003. b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, 1992. 15. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; 1980. 16. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press; 1981. 17. Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6,119-22. 18. DakoCytomation California Inc., Data on file. 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fifth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2009. 20. Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996;4:201-7. 21. "Procedures for decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides", Department of Health, Education, and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD, 1976. 22. "Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts." Center for Disease Control Manual Guide: Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA, April 30, 1976. 23. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005. 24. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 50/52

25. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92:836-43. 26. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14:767-71. 27. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980;73:626-32. 28. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194-9. 29. Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994;54:2771-7. 30. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986:16-27. 31. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986. 32. Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78:26-33. 33. Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: 273-278. 34. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: 681-685. 35. Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: 795-805. 36. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: 89-95. 37. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastroesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet 2010. 38. Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52:797-805. 41. Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: 2070-2079. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 51/52

Vysvětlivky k symbolům Katalogové číslo Teplotní rozmezí od do Číslo šarže Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) In Vitro diagnostický zdravotnický prostředek Křehké, zacházejte opatrně Použitelné do Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Viz návod k použití Lze použít pro <n> testů Výrobce Výrobce Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Dánsko Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 Distributor v USA Dako North America, Inc. 6392 Via Real Carpinteria, California 93013, USA Tel. 805/566-6655 Bezplatná linka: 800/235-5743 Objednávky Tel. 800/235-5763 Fax 805/566-6688 Technická podpora: Tel. 800/424-0021 HercepTest a Herceptin jsou ochranné známky společnosti Genentech, Inc., držitelem licence je společnost Dako Denmark A/S a F. Hoffmann-La Roche Ltd. (129265-001) P04455CZ_01_K520721-2/2016.05 str. 52/52