Kultivační metody stanovení mikroorganismů
Základní rozdělení půd Syntetická, definovaná media, jednoduché sloučeniny, známé sloţení Komplexní media, vycházejí z ţivočišných nebo rostlinných tkání a pletiv, často jsou opracovány enzymy. Pepton, trypton Selektivní media, upřednostňují určitou skupinu mikrobů, VČŢL, OGYE Diferenciální media dovolují rozlišení mezi různými bakteriemi. McConkey agar reaguje na tvorbu kyselin, chromogenní media.
Příprava kultivačních půd Výběr nádobí ideální sklo, měděné a zinkové nádoby se nesmějí pouţívat, velká mnoţství nerezové nádoby Úprava ph vzhledem ke kolísavému ph destilované vody je doporučena kontrola i u půd, které podle údajů výrobce mají ph upravené. phmetry nutno kalibrovat. Úprava se provádí 0,1 M NaOH nebo 0,1 M HCl. Objem se tak postatně nemění, korelace na teplotu! Plnění nádob vyuţitelná je vţdy jen polovina objemu nádoby. Uzávěry baněk nejlepší jsou zátky z buničité vaty, ručně zhotovené. Uzávěry zkumavek ke krátkodobým testům jsou pouţitelné kovové uzávěry, pro kultivaci vţdy jen vatové.
Příprava standardních půd Naváţka jednotlivých komponent soli, zdroj C, agar Naváţka hotové směsi kontrola vah Součásti půdy se přenesou do čisté baňky, doplní se destilovanou vodou, po promíchání 10-15 min před sterilací - bobtnání agaru. Baňka se uzavře vatovou zátkou + obal z kovové folie ochrana proti vlhkosti. Dobře se označí. Sterilace v autoklávu neprodluţovat doporučenou dobu.
Sterilizace ţivných půd Propařování Kochův hrnec 100 o C Nutnost vyšších teplot tlaková sterilizace v autoklávu 121 o C, tlak 0,1-0,15 Mpa, 15-20 min Tyndalizace záhřev na 57 o C, 1 h opakuje se 8x vţdy po 24 h Sterilace filtrací membránové filtry, vitaminy, AK, apod.
Ztuţování ţivných půd Ţelatina bílkovina, rychlý rozklad Agar polysacharid, odolný k mikrobiálním enzymům Petri misky, šroubovací lahvičky Šikmé agary (zkumavky) Rozlévání půd aseptické podmínky laminární boxy Automatické rozlévání půd velké laboratoře.
Typy ţivných půd Tekuté: a) komplexní bujony, sladina, mléko, corn-steep liquor, výluhy zeleniny b) definované směs solí, přídavek aminokyselin, Pevné: oba typy + přídavek ztuţující látky Kultivační půdy slouţí k namnoţení mikroorganismů Diagnostické půdy slouţí k určování mikroorganismů Selektivní půdy potlačují některé skupiny mikroorganismů jiné zvýhodňují
Sterilace chromogenních půd Obsahuje termosensitivní sloţky, nelze autoklávovat Půda se pouze zahřeje va vodní lázni (100 o C), aby se ztekutil agar. Doba se musí kontrolovat podle údajů výrobce. Obvykle max. 15 min Tyto půdy nelze skladovat. Okamţité pouţití.
Kontrola sterilizace Od kaţdého media odlít 1 kontrolní misku-inkubace v termostatu. Po 2 dnech odečíst. Kontrola pomocí bakteriálních spor: spory jsou naneseny na chromatografickém papíru. Po skončené sterilizaci se prouţek vyjme z obalu a přenese se do zkumavky se sterilním bujonem. Inkubace 30-35 o C po 7 dní. Tvorba zákalu špatná sterilizace. Nutnost provádět kontrolu bez sterilizace. THERMO * SPOR Bacillus stearothermophilus, kontrola autoklávů 10 4-10 7 /prouţek PUMILUS * SPOR Bacillus pumilus, kontrola ionizačního záření, 10 5-10 8 /prouţek
Skladování ztuţených půd Sterilní ztuţené půdy skladujeme buď v baňkách (čím větší objem, tím delší trvanlivost), nebo nalité na miskách a zkumavkách. Standardní půdy (PCA, sladinový agar) lze 1 aţ 2x varem ztekutit a pouţít. Agarem ztužené půdy nesmí zmrznout. Petri misky s půdou během skladování v chladničce vysychají. Maximální doba skladování 1 týden platí pro laboratoře s GLP. Čerstvě připravené půdy pro očkování roztěrem je nutno předsušit. Obvykle sušárna 60 o C 10-20 min.
Typy kultivačních půd Dle konzistence Tekuté půdy (masopeptonový bujon,mléko, ) Pomnoţovací Dle růstu nelze rozlišit jednotlivé bakt. druhy Pevné půdy (ztuţené agarem, ţelatinou, ) Izolované kolonie (diagnostika pouhým okem) Dle účelu Základní (univerzální) půdy
Typy kultivačních půd Základní (universální) kultivační půdy Rozmnoţují se na nich velké skupiny MO Selektivní kultivační půdy Zvýhodňují růst určité (cílové) skupiny MO ze vzorku (často v potravinářské mikrobiologii) Selektivní činitelé (přídavky ke sloţkám základních kultivačních půd)
Typy kultivačních půd 2 Diagnostické kultivační půdy Vyuţívají se pro identifikaci příslušných MO Zviditelnění určité (biochemické)vlastnosti (např. změna barvy)
Sloţky základních půd (I) Zdroje dusíku (peptony, bílkovinné hydrolyzáty, AK) Proteolytické enzymy - k produkci charakteristických peptonů hydrolytickým štěpením proteinů (papain, pankreatin, pepsin) Zdroje proteinů: maso, kasein, keratin, sója, Zdroje energie Glukóza, sloučeniny, které jsou zároveň zdrojem C Pufrovací soli (rozpustné fosforečnany, acetáty, ) Pro udrţení stabilní hodnoty ph
Sloţky základních půd (II) Minerální soli a kovy Fosfáty, sulfáty, Ca, Mg, Fe, Mn a stopové prvky V odpovídajících hladinách zlepšují růst MO Růstové faktory (vitamíny, krev, sérum, NADH, ) Esenciální pro růst MO se zvláštními poţadavky Nemají vţdy výhradně úlohu ve výţivě (izolace) Ţelatinační činidla (agar, ţelatina, gumy) Agar převládající činidlo, poskytuje pevný matrix pro vizualizaci rostoucích kolonií MO
Selektivní činitelé (I) (selektivní kultivační půdy) Anorganické soli Chlorid lithný účinný proti G- a enterokokům Tetrathionan účinný proti G+ a koliformním bakt. Azid sodný účinný proti G- Barviva Akridinová a trifenylmetanová barviva Výjimečná bakteriostatická síla Krystalová violeť, brilantní a malachitová zeleň
Selektivní činitelé (II) (selektivní kultivační půdy) Povrchově aktivní látky V r. 1905 prvně pouţita do kult. půdy ţluč Sloţky ţluči, ţlučové soli, další povrchově aktivní sloučeniny (sulfát kys. laurové, Tergitol) Antibiotika (ATB) Umoţňují cílenou selektivitu (mnoho různých ATB, spektrum účinnosti, mechanismus účinku)
Sloţky diagnostických půd Indikační barviva Neutrální červeň, bromokrezolový purpur, Pro indikaci ph změn vlivem rostoucího MO Specifické substrátové indikátory Chromogeny, fluorogeny Působí jako substráty pro specifické enzymy Barevná změna způsobená činností enzymů
Podmínky inkubace ph (pufrovací soli) Důleţité pro optimální funkci ostatních sloţek Selektivně (vhodné pro růst cílových MO) Teplota Optimální teplota růstu Selektivní inkubační teplota (rychlý růst cílových MO, omezený růst ostatních druhů) Plynné prostředí (přítomnost/nepřítomnost kyslíku) Důleţité pro dosaţení optimálních podmínek pro cílové MO Regulováno (nádoba, styčná plocha, přídavek red. l.)
Resuscitace mikroorganismů Stresované MO - Patogeny v potravinách mohou být poškozeny (technologie výrobního procesu) Obtíţná detekce (citlivost k selektivním činidlům, nízkým hladinám reaktivních forem kyslíku (ROS) Přídavek sloţek k potlačení toxicity selektivních činidel a ROS Výběr půdy a metod, které umoţní kompletní resuscitaci před vystavením selektivním činidlům
Typy kultivačních metod Dvě kategorie kultivačních metod pro detekci patogenů v potravinách Kvantitativní metody Zjišťování počtu mikrobiálních buněk Kvalitativní metody Přítomnost/nepřítomnost
Typy kultivací Aerobní kultivace mikroorganismů standardní termostaty s optimální teplotou pro dany druh, kultivace submersní (tekuté medium) zajištění přívodu kyslíku nebo povrchové Petri misky Anaerobní kultivace anaerostat, přívod inertních plynů (N 2, CO, ), tekuté kultivační medium před inokulací se probublává dusíkem, misky se obalují folií Mikroaerofilní kultivace - anaerostat, tvorba modifikované atmosféry,
Rozdíl mezi celkovým počtem a počtem ţivých mikroorganismů
Kvantitativní metody Počet ţivotaschopných buněk cílových druhů v určitém vzorku můţe být zjištěn pomocí: Roztěrové metody (typicky 100 μl inokula) Roztírání zředěné suspenze hokejkou na agarovou půdu Přelivové metody (typicky 1 ml inokula) Rozmíchání mikrob. směsi do roztavené půdy Zřeďování, lití desek Metody MPN (Most probable number) Vhodná pro vzorky s nízkým obsahem MO Méně přesná Nejčastěji pro stanovení koliformních bakt. Odhad s vyuţitím paralelních kultur
Kultivační metody Metoda plotnová je používána pro průkaz (kvalita) nebo stanovení počtu (kvantita) určitých skupin, rodu nebo druhu bakterií Výhody vysoká citlivost - REFERENČNÍ METODA (ISO, EN) Nevýhody dlouhá doba do dosažení výsledků kvantita je vyjádřena jako CFU (KTJ) ne počtem bakterií
Dva různé postupy izolace a kvantifikace mikroorganismů
Různé typy kolonií celkový počet
Desítkové ředění bakterií
Ukázky čárkovaní izolace kolonií předpoklad pro identifikaci
Kvalitativní metody Důkaz daného MO Čtyři stupně kvalitativních kultivačních metod pro detekci patogenů v potravinách: Primární obohacení Selektivní obohacení Nanášení na misku Potvrzení
Kvalitativní metody Jen málo selektivních a diagnostických půd je zcela specifických. Potvrzení můţe být dosaţeno řadou biochemických a antigenních testů nebo analýzou nukleových kyselin. PCR, ELISA
Kultivační metody Variantou klasické kultivační metody pro stanovení počtu (kvantita) určitých skupin nebo rodu bakterií jsou Spirálová plotnová metoda Petrifilmy Hygikulty
Inokulace Petri filmu
Pozitivní průkaz koliformních bakterií
Vyhodnocování Hygicultu
Spirálová plotnová metoda
Spirálová inokulace
Most probable number counts - MPN Jedná se o metodu zjišťování počtu živých mikroorganismů ze vzorků s nízkou kontaminací. Používá se kultivace ve vhodném tekutém mediu ve třech různých ředěních, např. Navážka 10 g, 1,0 g a 0,1 g. Medium musí dát jasnou odpověď, zda je nárůst pozitivní.
Most probable number counts
Most probable number counts
Výpočet MPN Vzorek syrového hamburgeru byl asepticky nakrájen a naváţen. Porce byly vloţeny do nádob s nabohacovacím mediem (PPV) uţívaním pro izolaci rodu Salmonella. Celý ISO protokol byl proveden z kaţdé baňky, počet baněk ze kterých byly izoláty potvrzeny jako Salmonella byl získán následujícím způsobem: Mnoţství hamburgeru vloţeného do 20 g 2,0 g 0,2 g kaţdé baňky s PPV počet baněk ze kterých byla S. 3 3 1 izolovaná Výpočet mnoţství S. na 1 g Z tabulky 3-3-1 ukazuje, ţe průměrně 4.6 bakterií (Salmonella) bylo inokulováno do kaţdé ze středního souboru baněk t.j.ty, které byly inokulovány 2 gramy hamburgeru. Jestliţe 4.6 bylo ve 2 gramech hamburgeru, je to rovno 2.3 v 1 gram.