Obecná mykologie GENETIKA HUB (základní principy a metody) Petr Pikálek Úvod Houby jsou významným modelem pro genetická studia. Oproti prokaryotickým baktériím jsou poznatky získané genetickým studiem hub bezproblematicky extrapolovatelné i na ostatní vyšší eukaryotické organismy. Houby, ač eukaryotické, jsou po všech stránkách typickými mikroorganismy, a lze je tudíţ studovat pomocí jednoduchých bakteriologických metod, technik a postupů. Jsou proto z experimentálního hlediska obecně velmi dobře přístupné. Přednosti hub pro genetické studium jsou následující: 1/ obecně jednoduchá stavba těla houbových organismů, s nepříliš sloţitou diferenciací jejich tkání a orgánů, zaloţená na jednotném hyfovém uspořádání, která na rozdíl od vyšších diferencovaných Eukaryot umoţňuje poměrně jednoduchou biochemickou i fyziologickou analýzu 2/ produkce početných souborů produktů meiotického dělení, tzn.meiospor, v nichţ je moţno s dostatečnou statistickou průkazností provádět genetickou segregační analýzu 3/ haploidní stav chromozómových souborů v jejich buněčných jádrech, přetrvávající povětšinou po převaţující část jejich ţivotního cyklu, a umoţňující jednoduchou a okamţitou registraci fenotypového projevu i recesívních alel sledovaných genů. Uvedené přednosti mají, samozřejmě, u různých taxonomických skupin hub svá určitá omezení. U deuteromycetů, např., nejsou produkovány meiospory, a genetická analýza je omezena výhradně na genetické studium mitoticky vznikajících konidiospor. U oomycetů, např., převaţuje v jejich ţivotním cyklu diploidní, a nikoli haploidní stav jejich buněčného jádra (haploidní stav jader je omezen pouze na buňky jejich specializovaných gamet, zoospor), a tyto houby tudíţ představují skupinu biologicky velmi blízkou vyšším eukaryotickým organismům, tzn. rostlinám a ţivočichům. Houby jsou z tohoto hlediska velice různorodou skupinou organismů, u nichţ je při genetickém studiu nezbytné vţdy respektovat jejich specifické biologické, a zejména jejich reprodukční zvláštnosti. Biologická různorodost různých skupin hub se projevuje jiţ na úrovni nukleoplazmatických vztahů uvnitř hyfových buněk. Mnohé houby, resp.některá stádia jejich ţivotního cyklu, obsahují ve svých hyfových buňkách vţdy po jednom jediném buněčném jádru, a takové mycelium se nazývá monokaryotické. Mnohé houby však zcela běţně obsahují ve svých hyfových buňkách více jader, a z tohoto hlediska je pak jejich mycelium polykaryotické. Pokud jsou tato jádra ve všech hyfových buňkách genotypově identická, pak se takové mycelium označuje jako homokaryotické, pokud jsou buněčná jádra v buňkách hyf genotypově rozdílná, je takové mycelium heterokaryotické. Mnohé basidiomycety obsahují v určitém stádiu svého ţivotního cyklu ve svých hyfových buňkách zákonitě vţdy po dvou buněčných jádrech, a takové mycelium se pak označuje jako dikaryotické (jedná se o specifickou funkční obdobu diploidie).
Významná je i schopnost buněčných jader u některých skupin hub migrovat z jedné hyfové buňky do druhé. Podstatná je v tomto ohledu stavba buněčných hyf, zda se jedná o hyfy s buněčnými přepáţkami (a zda jsou v těchto buněčných přepáţkách obsaţeny póry, skrze něţ mohou buněčná jádra procházet - u basidiomycetů, např., je zákonitá migrace buněčných jader z jedné buňky do druhé zajišťována existencí sloţitých pórových struktur v buněčných přepáţkách jejich mycelia, tzv.dolipórů), či zda jsou hyfy bez buněčných přepáţek, a představují pak tzv.sifonální, vysoce polykaryotické mycelium. Klasická fenotypová hybridologická genetická analýza potomstev po kříţení genotypově různých kmenů u různých skupin hub pak musí respektovat všechny tyto uvedené rozmanité biologické skutečnosti (obr.1). Genetické studium hub přispělo velice významným způsobem ke kvalitativnímu rozvoji obecně genetických poznatků ve 40. letech tohoto století. Právě s ohledem na svoje experimentální studium biochemických aktivit vláknitého askomycetu Neurospora crassa mohli v roce 1940 Beadle a Tatum vyslovit svůj fenomenální závěr, ţe primární činností genů je řízení produkce specifických enzymů (hypotéza "jeden gen = jeden enzym"). Tento postulát, dodnes platný, mimořádně významným způsobem přispěl k současnému chápání funkce a podstaty genetické informace. V roce 1925 publikovali Nadson a Fillipov ve Sborníku Akademie věd Sovětského svazu, bohuţel rusky a v azbuce, tudíţ bez podstatnější světové odezvy, výsledky svých pokusů s vláknitým askomycetem Neurospora crassa, na nějţ působili rentgenovým zářením. Toto záření vyvolávalo u daného organismu vznik dědičných změn v jeho vlastnostech, čímţ zmínění autoři jako vůbec první badatelé dokázali, ţe genetickou informaci ţivých organismů lze působením vnějších faktorů měnit. Nadson a Fillipov tak o tři roky "předběhli" amerického genetika Mullera, který prováděl podobné genetické experimenty u banánové mušky Drosophila melanogaster, s podobnými výsledky, které publikoval aţ v roce 192 (anglicky, a tudíţ s nepoměrně větším vědeckým ohlasem neţli Nadson a Fillipov). Muller za jejich zveřejnění a interpretaci získal jako jeden z prvních genetiků Nobelovu cenu, a stal se tak - na rozdíl od jmenovaných sovětských vědců Nadsona a Fillipova - celosvětově respektovaným badatelem v oblasti studia experimentální mutageneze. Ani v dnešní době rozvoje molekulární biologie a molekulární genetiky neztratily houby nic ze svojí atraktivity výhodného experimentálního modelu. Významné je v tomto směru zejména genetické studium dřevokazných hub, a to zejména pro apriorní moţnost vyuţití poznatků o geneticko-biochemických aktivitách těchto hub pro nejrůznější praktické účely (biotechnologické zpracování hmoty dřevních či jiných lignocelulózních odpadů, vyuţití biodegradačních schopností těchto hub ve farmaceutickém průmyslu, při biotransformaci steroidních sloučenin, při ekologicky "čistém" odstraňování škodlivin z ţivotního prostředí apod.). Nezanedbatelné však není ani genetické studium ostatních skupin hub - houby jako producenti široké škály nejrůznějších hospodářsky vyuţitelných látek typu primárních i sekundárních metabolitů (např.organických kyselin, aminokyselin, vitamínů, enzymaticky účinných látek, antibiotik apod.) tvoří základ soudobého mikrobiologického průmyslu. Právě proto houby i dnes stojí v popředí zájmu nejenom aplikovaného, ale i teoretického výzkumu.
Genetické aspekty sexuální reprodukce u hub Pro různé taxonomické skupiny hub jsou charakteristické jejich různé sexuálně reprodukční cykly (obr.2). Z obecně biologického hlediska je v této souvislosti vysoce zajímavé, ţe tyto různé ţivotní cykly hub doslova "kopírují" ţivotní cykly fylogeneticky různých fylogeneticky "vyšších" taxonomických skupin organismů jak rostlinné, tak ţivočišné říše: 1/ Houby asexuální (Deuteromycetes, Fungi imperfecti). Ţivotní cyklus těchto hub zcela postrádá diploidní fázi (jádra těchto hub jsou po celou dobu ţivotního cyklu striktně haploidní), a v důsledku toho není součástí jejich ţivotního cyklu ani meióza. Rozmnoţují se asexuálně, buď vegetativně fragmentací hyf svých mycélií nebo prostřednictvím mitoticky vznikajících asexuálních rozmnoţovacích buněk, konidií (konidiospor). 2/ Houby sexuální haploidní (např. některé kvasinky, Endomycetes, nebo mnohé vláknité askomycety). Buněčná jádra v jejich buňkách jsou po celou dobu trvání jejich ţivotního cyklu haploidní. Diploidní fáze - po splynutí haploidních jader, tzn. po karyogamii - je omezena na jedinou buňku, jejíţ diploidní jádro se okamţitě meioticky dělí za vzniku haploidních gamet, meiospor. Meióza diploidního jádra navazuje bezprostředně na jeho vznik, není tedy od vzniku diploidního jádra nijak časově oddálena. 3/ Houby sexuální haploidní s vloženou dikaryotickou fází (mnohé druhy ze skupiny Basidiomycetes). Buněčná jádra těchto hub jsou po celou dobu trvání jejich ţivotního cyklu striktně haploidní, diploidní fáze - po karyogamii haploidních jader - je omezena na jedinou buňku, jejíţ diploidní jádro se okamţitě meioticky dělí za vzniku haploidních meiospor. Karyogamii však u těchto hub předchází plasmogamie (resp.somatogamie), splynutí buněk vzájemně kompatibilních mycélií, po níţ daná houba existuje ve formě dikaryotického mycélia - po určitou dobu ţivotního cyklu hyfové buňky takových hub obsahují standardně a charakteristicky vţdy po dvou haploidních jádrech, jejich mycelium je tudíţ dikaryotické. Rovněţ u tohoto typu hub meióza navazuje bezprostředně na karyogamii. 4/ Houby sexuální haplo-diploidní (např. některé kvasinky, Endomycetes). Buňky takových hub obsahují po určitou část ţivotního cyklu haploidní buněčná jádra, avšak po karyogamii mohou buňky těchto hub existovat vpodstatě neomezeně s jádry diploidními (v diplofázi). Za vhodných reprodukčně fyziologických podmínek se pak tato diploidní jádra dříve či později meioticky rozdělují za vzniku haploidních meiotických produktů, meiospor. Tyto houby mohou tudíţ existovat jak ve formě haploidních buněk, tak ve formě diploidních buněk. Meióza je časově "oddálena" od procesu karyogamie. 5/ Houby sexuální diploidní (např. třída Oomycetes). Mycelium těchto hub existuje po převáţnou část jejich ţivotního cyklu ve formě buněk s diploidními buněčnými jádry, haploidní fáze - po meiotickém rozdělení diploidních buněčných jader - je omezena pouze a výhradně na vznikající gamety, meiospory. Ty okamţitě splývají s následným bezprostředním splynutím jejich haploidních buněčných jader za vzniku diploidního mycélia. Tato skupina hub svým ţivotním cyklem zcela odpovídá vyšším eukaryotickým organismům, tzn. rostlinám či ţivočichům. Meióza je u nich významně časově (ale i prostorově) oddálena od procesu karyogamie.
Z uvedeného přehledu vyplývá, ţe sexuální reprodukce hub má vţdy tři nezbytné a charakteristické stupně, kterými jsou plasmogamie (splynutí cytoplasmatického obsahu dvou různých buněk), karyogamie (splynutí dvou buněčných jader obsaţených ve společné cytoplasmě), a konečně meióza (redukční rozdělení vzniklého diploidního jádra za vzniku dceřiných jader haploidních - ta je provázena díky svému mechanismu, jak je známo, i genotypovým rozrůzněním meiotických produktů). Za v pravém slova smyslu sexuální je tudíţ moţno povaţovat pouze takové houby, součástí jejich ţivotních cyklů jsou vţdy všechny tři uvedené charakteristiky Plasmogamie můţe mít u různých taxonomických skupin hub různou podobu. Můţe k ní docházet přímou fúzí specializovaných gamet (např. dvou zoospor u oomycetů), splynutím gamety s gametangiem (např. mikrokonidiospory trichogynem protoperitécia u askomycetu Neurospora crassa), nebo splynutím dvou gametangií (např. u endomycetů, budeme-li povaţovat jejich buňky za potenciální výtrusnice). Všechny tyto formy plasmogamie se označují jako gametogamie. U basidiomycetů je však plasmogamie realizována cytoplasmatickou fúzí somatických buněk hyf jejich vegetativního mycelia, tedy buněk bez jakéhokoli vztahu k produkci gamet. Taková plasmogamie se nazývá somatogamií. Z hlediska genotypové kontroly karyogamie se houby rozdělují na dvě geneticky významně odlišné skupiny - na houby homomiktické (homothalické), a na houby heteromiktické (heterothalické). U homomiktických hub nejsou jádra buněk v jejich myceliálních hyfách nijak genotypově pohlavně rozlišena. Ke karyogamii můţe dojít splynutím jakékoli dvojice haploidních buněčných jader. Kompletní sexuální ţivotní cyklus homomiktických hub se tudíţ můţe realizovat z jedné jediné buňky. Kterákoli dvě mitoticky vznikající (a tudíţ genotypově identická) dceřiná jádra uvnitř buněk příslušného mycelia spolu mohou - za vhodných reprodukčně fyziologických podmínek - splývat, dát tak vznik jádru diploidnímu, které se pak buď bezprostředně, nebo časově oddáleně opět meioticky dělí. Z obecně genetického hlediska se homomiktické houby rozmnoţují autogamicky (samooplozením). U heteromiktických hub však existuje genotypově podmíněný pohlavní heteromorfismus. Kompletním sexuálním ţivotním cyklem mohou tyto houby projít pouze tehdy, dojde-li k plasmogamii buněk pohlavně rozdílných mycélií, a rovněţ karyogamie je moţná pouze a výhradně splynutím genotypově pohlavně rozdílných buněčných jader. Heteromiktické houby se tudíţ rozmnoţují alogamicky. Pohlavně rozdílné formy (kmeny) téhoţ heteromiktického houbového druhu se označují jako párovací typy (z angl. mating types). Přední český mykolog druhé poloviny 20.století prof.cejp pro jejich pohlavní rozdíly pouţíva termínu "pohlavní ladění". U rozdílných párovacích typů nelze, samozřejmě, hovořit o pohlaví ve smyslu pohlavních rozdílů u vyšších Eukaryotů s typickou anatomickou a morfologickou pohlavní dvojtvárností, tedy o "samčím" či "samičím" pohlaví. Genotypové rozdíly mezi párovacími typy nemají za následek rozdílný fenotypový projev na morfologické úrovni, různé párovací typy heteromiktických hub se od sebe svým morfologickým vzhledem nijak neliší. Jejich rozdílné párovací genotypy jsou však při vzájemném zkříţení nezbytné pro uskutečnění všech sexuálně morfogenetických procesů Specifita párovacího genotypu je podmíněna genotypovou specifitou příslušných párovacích faktorů. Nejedná se o geny v pravém slova smyslu, nýbrţ o sloţitější genetické struktury (těsně vázané skupiny genů, tzv.genové klastry), zaujímající na chromozómech podstatně rozsáhlejší oblasti, neţli by odpovídalo jednoduchým genům.
U řady heteromiktických hub (např. u endomycetů či vláknitých askomycetů) jsou rozdíly mezi jejich různými párovacími typy dány genotypovými rozdíly v jediném párovacím faktoru. Ten se pak obvykle označuje jako tzv. A-faktor, a jeho různé "alely" se označují symboly A a a, nebo A a alfa, nebo prostě + (plus) a - (mínus). Takové heteromiktické houby se nazývají dimiktické či bipolárně heterothalické. Ke kompletní realizaci ţivotního cyklu můţe u těchto hub dojít pouze tehdy, dojde-li ke kontaktu buněk s odlišnými párovacími genotypy (tzn. jedna z nich obsahuje ve svém jádře párovací faktor A, a druhá párovací faktor a). Jedině tehdy je moţná plasmogamie, karyogamie a následná meióza s produkcí meiospor. U kvasinek podrobné molekulárně genetické studium povahy párovacího A-faktoru ukázalo, ţe za párovací vlastnosti odpovídá určitá oblast na jednom z kvasinkových chromozómů, která je však do určité míry variabilní, a to v tom smyslu, ţe - velmi zjednodušeně řečeno - představuje jenom jakousi "schránku", do níţ můţe být libovolně vloţena specifická párovací "kazeta" (tzn. chromozomální úsek s "alelou" A nebo s "alelou" a). V genotypové výbavě kaţdé kvasinkové buňky jsou obsaţeny obě příslušné párovací "kazety", a párovací specifita daného párovacího typu tedy závisí na tom, která z obou "kazet" je momentálně "zasunuta" do zmíněné "schránky". Součástí aktuální determinace typu párovacího faktoru je tudíţ transpozice (přemísťování) různých chromozomálních oblastí. Tento tzv. kazetový model uspokojivě vysvětluje relativně často popisované situace, kdy se uvnitř buněčných populací jednoho specifického párovacího typu heteromiktických druhů kvasinek neočekávaně realizuje sexuální reprodukce bez přítomnosti buněk opačného párovacího typu, a to přitom ve frekvencích, které vylučují moţnost vysvětlit vznik buněk opačného párovacího typu cestou spontánní mutageneze. Za objasnění podstaty zmíněného kazetového modelu genotypového podkladu párovacího dimorfismu u kvasinek se v konci sedmdesátých let 20.století do značné míry zaslouţil maďarský genetik slovenského původu Szipicki (a v této souvislosti stojí za zmínku, ţe vůbec prvními, kdo popsali heteromiktický způsob rozmnoţování u kvasinek, byli v r.1918 čeští badatelé Kruis a Šatava). U jiných heteromiktických hub (např. u heteromiktických basidiomycetů) jsou rozdíly mezi párovacími typy podmíněny genotypovými rozdíly ve dvou párovacích faktorech. Ty se pak standardně nazývají A-faktor a B-faktor. Tento typ genetické kontroly párovacích rozdílů se označuje jako diaforomiktický nebo tetrapolárně heterothalický. Ke kompletní realizaci ţivotního cyklu u těchto hub je nezbytný kontakt buněk mycélií, lišících se "alelickou" specifitou v obou zmíněných párovacích faktorech Obecně se tedy úplný ţivotní cyklus, zahrnující sexuální reprodukci, realizuje pouze při kontaktu párovacích typů o párovacích genotypech AB x ab nebo Ab x ab. Ve skutečnosti je zde však situace mnohem sloţitější. Jak dokázali v konci 60. a v začátku 70.let Raper a jeho spolupracovníci z Harvardské univerzity v Bostonu (Massachusetts, USA) svými studiemi u druhu Schizophyllum commune, u heteromiktických basidiomycetů jsou oba dva volně kombinovatelné párovací faktory tvořeny vţdy dvěma samostatnými, poměrně těsně, avšak nikoli úplně vázanými chromozomálními oblastmi. Tyto oblasti (nazývané v genetické literatuře z tehdejších let nesprávně "alelami") se označují jako A-alfa* a A-beta*, a B-alfa* a B-beta*. Za specifitu příslušného párovacího faktoru, jak typu A, tak typu B, odpovídá vţdy celkové "nastavení" obou jeho oblastí. Ve všech čtyřech oblastech u obou párovacích faktorů byl nalezen mnohonásobný mnohotný alelismus, tzn. ţe díky mutačnímu procesu existují poměrně rozsáhlé řady "alelicky" rozdílně specifických oblastí alfa* i beta* jak u A-faktoru, tak u B- faktoru. Vzájemně kompatibilní jsou přitom při sexuální reprodukci všechny párovací typy, které se jakkoli genotypově liší ve specifitě obou párovacích faktorů. V důsledku to tedy znamená, ţe u těchto heteromiktických basidiomycetů existují desítky (či spíše stovky) genotypově rozdílných,
a tudíţź vzájemně kompatibilních párovacích typů. V ţádném případě u nich tudíţ neexistuje analogie kříţení "samečka" se "samičkou", rozdílných "pohlaví" zde existuje obrovsky rozsáhlá řada. Téměř výhradním modelem pro genetické studium kontroly sexuální reprodukce u diaforomiktických hub se stal dřevokazný basidiomycet Schizophyllum commune. Všechny dále uváděné skutečnosti proto ilustrují genetický podklad diaforomiktické kontroly sexuální reprodukce právě u tohoto stopkovýtrusného druhu. Experimentálním studiem vzájemné kompatibility rozsáhlé řady geografických ras druhu S. commune, izolovaných z nejrůznějších oblastí Spojených států amerických, ukázali jiţ v roce 1958 Raper a Miles, ţe u tohoto dřevokazného basidiomycetu existuje minimálně 9 různě specifických oblastí A-alfa* a minimálně 32 různě specifických oblastí A-beta* (v jejich všech různých kombinacích tedy 288 různě specifických "alel" A-faktoru!), a obdobně minimálně 9 různě specifických oblastí B-alfa* a 9 různě specifických oblastí B-beta* (tedy celkem 81 různě specifických "alel" B-faktoru!). Mezi nositeli různě specifických "alelických kombinací" A-faktoru a B-faktoru pak tedy ve zmíněném souboru přírodních izolátů existovalo celkem 288 x 81 = 23 328 rozdílných vzájemně kompatibilních plodných spojení. Raper a Miles však izolovali další a další geografické rasy S.commune, a studiem jejich vzájemné křiţitelnosti pak následně poukázali na existenci nejméně 450 rozdílných "alel" A- faktoru a nejméně 95 rozdílných "alel" B-faktoru. Počet moţných vzájemně kompatibilních spojení u uvedeného basidiomycetu tak jiţ tehdy vzrostl na teoretické číslo 42 750 plodných kombinací. Různě specifické "alely" A-faktoru i B-faktoru u S.commune se od sebe v genetické symbolice odlišují pouze číselnými indexy (tzn. faktor A 1, faktor A 2 apod., obdobně faktor B 1, faktor B 2 atd.). Řady různě specifických "alel" jak A-faktoru, tak B-faktoru rozšiřuje vedle jejich mutačního rozrůznění ještě navíc moţnost rekombinací mezi jejich oblastmi na příslušných chromozómech. Síla vazby mezi chromozomálními oblastmi alfa* a beta* jak u A-faktoru, tak u B-faktoru, je sice poměrně značná, nicméně při obrovských souborech produkovaných meiospor je pravděpodobnost procesu crossing-over právě v chromozomálních úsecích mezi oblastmi A-alfa* a A-beta*, a obdobně mezi oblastmi B-alfa* a B-beta*, a tudíţ vzniku meiotických produktů s rekombinovanými párovacími faktory nezanedbatelná. Vedle mutačního tlaku jsou to tedy i genetické rekombinace, které jsou při dané struktuře A- faktoru i B-faktoru významným zdrojem jejich obrovské genetické variability. A-faktor i B-faktor u S.commune představují shluky regulačních genů, díky jejichţ funkci jsou pak "spouštěny" všechny další a další geny, jejichţ funkce je nezbytná pro zajištění hladkého průběhu sexuálně morfogenetických procesů. Tímto termínem se označují všechny biochemické, fyziologické, ale i anatomicko-morfologické pochody, umoţňující plasmogamii, karyogamii, a následně pak i meiózu. Při kontaktu hyf dvou postupně se vzájemně prorůstajících myceliálních kolonií je v první řadě důleţité, zda antigenní struktura povrchu buněk rozdílných mycélií umoţňuje jejich vzájemné plasmatické spojení, plasmogamii. Za tuto sexuálně morfogenetickou funkci odpovídá B-faktor. Pokud mají kontaktovaná mycélia ve svých párovacích genotypech rozdílně specifické "alely" B-faktoru, pak dochází k masívnímu splývání mezi buňkami obou mycélií v celé šíři kontaktu jejich myceliálních kolonií. Pokud však obsahují jejich párovací genotypy geneticky shodný typ B-faktoru, pak k fyzickému kontaktu buněk obou rozdílných myceliálních kolonií prakticky vůbec nedochází, hyfy rozdílných myceliálních kolonií vzájemně neprorůstají, a obě myceliální kolonie rostou "odděleně" vedle sebe, "odpuzují se".
Při kultivaci na agarové půdě na Petriho miskách lze pozorovat ostrou hranici mezi oběma myceliálními koloniemi, tzv. baráţ. Plasmogamie na čáře kontaktu dvou vzájemně kompatibilních párovacích typů myceliálních kolonií vede ke vzniku dikaryotických buněk. Obě původně monokaryotické myceliální kolonie se dikaryotizují, a to tak, ţe se jádra jednoho párovacího typu ve vzniklých dikaryotických buňkách mitoticky dělí, a příslušná dceřiná jádra pak postupně pronikají přes dolipóry v hyfových septech do dalších a dalších hyfových buněk myceliální kolonie opačného párovacího typu. Touto migrací jader se tak celá společná myceliální kolonie postupně dikaryotizuje. Za migraci jader a pravidelnou dikaryotizaci odpovídá A-faktor. Pokud se kontaktují buňky mycélií se shodným typem A-faktoru (avšak rozdílným typem B-faktoru), dochází sice k plasmogamii, ale vázne migrace jader, a tudíţ i vznik dikaryotického mycélia.ź Při kultivaci na agarové půdě je u druhu S.commune důsledkem kontaktu mycélií takto vzájemně inkompatibilních párovacích typů vznik společné myceliální kolonie s velmi řídkým "vodnatelným" mycéliem (transparentní, tzv. flat-mycélium) Při kontaktu myceliálních kolonií vzájemně plně kompatibilních párovacích typů (tzn. genotypově rozdílných ve specifitě jak A-faktoru, tak B-faktoru, při tzv.legitimním párování) dochází k plošné plasmogamii, a migrací jader pak i k postupné plné dikaryotizaci celé společné myceliální kolonie. Zatímco původní monokaryotické kolonie jsou označovány za primární mycelium, pro rozrůstající se dikaryotickou myceliální kolonii se uţívá termínu sekundární mycelium. U druhu S.commune se při kultivaci na agarové půdě tyto typy mycélií od sebe vzájemně významně morfologicky odlišují. Primární mycélium je obvykle velmi bohaté na vzdušné hyfy, a jeho kolonie se rozrůstá souměrně a pravidelně. Okraje typicky "načechrané" kolonie primárního mycélia jsou hladké a pravidelné. Sekundární mycélium se naproti tomu rozrůstá ne zcela pravidelně, má "koţovitý" charakter (mechanická soudrţnost jeho hyf je neporovnatelně vyšší, neţli u primárního mycélia), kolonie bývá tvarově nesouměrná a okraje takové myceliální kolonie jsou zřetelně nepravidelné. Makromorfologické uspořádání různých typů myceliálních kolonií při legitimním i ilegitimním párování u S.commune na agarové ţivné půdě je znázorněno na obr. 3. Ve formě sekundárního, dikaryotického mycélia můţe heteromiktický basidiomycet existovat vpodstatě po neomezenou dobu, kdy se rozmnoţuje buď vegetativně, rozrůstáním myceliálních hyf, popř. jejich fragmentací, nebo u některých druhů i prostřednictvím nepohlavně se tvořících mitospor (konidií). Za vhodných reprodukčně fyziologických podmínek se pak v tomto sekundárním mycéliu vytvářejí základy plodnic, následně dochází k více či méně výrazné morfologické diferenciaci a specializaci hyfových pletiv, k tvorbě morfologicky charakteristických plodnic a v nich k vytváření výtrusorodé roušky, hyménia. V terminálních buňkách hymeniálních hyf, basidiích, pak dochází ke karyogamii dosud haploidních jader za vzniku jádra diploidního, a k jeho bezprostřednímu meiotickému rozdělení za vzniku haploidních basidiospor. Proces tvorby plodnic a meiospor se nazývá fruktifikace. Typická sekundárně myceliální kolonie druhu S.commmune na agarové půdě, s charakteristickým "věncem" resupinátních plodnic, je znázorněna na obr. 4. U řady basidiomycetů nelze u rozdílných typů jejich myceliálních kolonií sledovat tak typické makromorfologické rozdíly, jaké byly zmíněny ve vztahu k víceméně modelovému druhu S.commune. Rozdíly mezi jejich primárním a sekundárním mycéliem je pak moţno studovat pouze na mikroskopické úrovni. Charakteristickým znakem sekundárního, dikaryotického mycélia je v takovém případě především existence zvláštních útvarů na na rozhraních mezi jednotlivými hyfovými buňkami, tzv.přezek (angl. clamp-connections, viz obr. 5).
Přezky zřejmě slouţí k pravidelné a rovnoměrné distribuci dceřinných jader při dělení terminálních hyfových buněk dikaryotického mycélia. Rozdělení terminální hyfové buňky sekundárního mycélia předchází konjugované mitotické rozdělení obou jejích haploidních jader. Jejich pravidelná a přesná distribuce do obou vznikajících dceřiných hyfových buněk, tzn. do nové apikální a subapikální hyfové buňky, je podmínkou uchování existence dikaryotického, a přitom heterokaryotického mycélia. V procesu tvorby přezek je prvním "krokem" utvoření jakéhosi bočního buněčného výběţku, který vzniká v návaznosti na synchronní mitotické rozdělení obou jader přítomných v terminální hyfové buňce. Zatímco se dceřinná jádra jedné ze vznikajících dceřinných jaderných dvojic v terminální hyfové buňce volně rozestupují, jedno z jader druhé dceřinné dvojice vniká do bočního buněčného výběţku. Zmíněný boční buněčný výběţek se zakřivuje a "přikládá" zpět k buněčné stěně terminální hyfové buňky, přitom se v oblasti jeho tvorby začíná v původní terminální hyfové buňce vytvářet buněčná přepáţka (septum). Ta odděluje nově vzniklou terminální buňku (obsahující po jednom z obou vznikajících dceřiných jader z obou příslušných jaderných dvojic), a buňku subterminální, obsahující v daném okamţiku pouze jedno jádro ze dvou vznikajících dceřinných jaderných dvojic - druhé je uzavřeno ve zmíněném bočním buněčném výběţku. V místě přiloţení a fyzického kontaktu bočního buněčného výběţku k buněčné stěně subterminální buňky pak dochází k lýze buněčné stěny této buňky, k jejímu plasmatickému propojení s buněčným výběţkem terminální buňky, a k následnému vniknutí dceřinného jádra z tohoto výběţku do cytoplasmy subterminální buňky. Rovněţ oblast buněčného výběţku je pak oddělena od terminální buňky vytvořením následné, poněkud šikmo zaloţené buněčné přepáţky. Je tak zaručeno, ţe jak nově vznikající terminální, tak subterminální hyfové buňky obsahují vždy po jednom z obou genotypově rozdílných jader. Jak jiţ bylo řečeno, přezky tedy zajišťují zachování dikaryoze a zároveň i nezbytné heterokaryoze v hyfách sekundárního mycélia. Mikroskopicky prokazatelná přítomnost přezek na povrchu hyf studované myceliální kolonie je tedy důkazem toho, ţe se jedná o mycélium sekundární (na hyfách primárního, monokaryotického mycélia se přezky nikdy nevyskytují). Schématické znázornění průběhu sexuální morfogeneze u heteromiktických basidiomycetů je znázorněno na obr. 6. Pokud se pro kříţení vzájemně kompatibilních párovacích typů studovaných basidiomycetů pouţijí kmeny se vhodnými a jednoduše detegovatelnými genetickými markery (signálními znaky), je moţné podle časového i prostorového postupu "šíření" těchto markerů v rozrůstající se společné myceliální kolonii sledovat i rychlost migrace jader a postupné dikaryotizace této kolonie. Na obr. 7 je znázorněno kříţení dvou vzájemně kompatibilních kmenů druhu S.commune, z nichţ jeden je senzitívní, a druhý naopak rezistentní vůči účinku proteosyntetického inhibitoru cykloheximidu (senzitivita je dominantním znakem). Na běţnou agarovou ţivnou půdu je do středu Petriho misky zaočkován rezistentní kmen, a po dvoudenním rozrůstání jeho myceliální kolonie je k okraji této mikrokolonie přiočkován kmen senzitívní. Postupné následné rozrůstání myceliálních kolonií obou kmenů vede k brzkému fyzickému kontaktu jejich hyf, ke vzniku dikaryotických buněk, a migrací jader k postupné dikaryotizaci nyní jiţ společné dále a dále se rozrůstající myceliální kolonie. V pravidelných časových intervalech jsou pak ze stále stejných míst této kolonie odebírány vzorky mycelia a očkovány na selektívní ţivnou půdu se zmíněným inhibitorem, zároveň však je v těchto myceliálních vzorcích mikroskopicky zjišťována přítomnost přezek. Porovnání údajů v obou tabulkových schématech na následném obr. 8 pak jednoznačně dokazuje kauzální vztah mezi postupnou dikaryotizací a postupnou ztrátou rezistence k cykloheximidu. Metody genetické analýzy u hub
S ohledem na svou početní rozsáhlost jsou genotypově segregující soubory meiospor, tzn. meiotických produktů sexuálně se reprodukujících hub, velice vhodným a metodicky dobře přístupným objektem pro genetickou hybridologickou analýzu. Konkrétní metodický přístup při jejím provádění však musí respektovat jiţ zmíněné zvláštnosti sexuální reprodukce u různých skupin hub. Metodicky i interpretačně jednodušší je genetická analýza u heteromiktických hub. Ty díky svému genotypovému pohlavnímu rozlišení na vzájemně kompatibilní párovací typy umoţňují provádět záměrná a cílená kříţení obdobně, jako je tomu při záměrných kříţeních rostlin či ţivočichů. Meiospory u heteromiktických hub vznikají meiotickým dělením diploidních jader, která mohou vznikat pouze a výhradně v heterokaryotických mycéliích, a to karyogamií haploidních jader s rozdílnými genotypy. Meiotické produkty heteromiktických hub jsou tudíţ vţdy potomky pocházejícími z genetického spojení obou výchozích geneticky rozdílných rodičů. U homomiktických hub, u nichţ ţádné genotypov rozdílné párovací typy neexistují, jsou naproti tomu meiospory tvořeny meiotickým dělením diploidních jader, která mohou i v heterokaryotických mycéliích vznikat karyogamií jak genotypově rozdílných, tak genotypově shodných haploidních jader. Genetická analýza je zde tudíţ vţdy podmíněna metodickou moţností rozlišení meiotických produktů jednoho i druhého uvedeného typu. 1/ Genetická analýza u heteromiktických hub bez moţnosti analyzovat odděleně produkty meiotického dělení jednotlivých diploidních jader: Soubory meiospor jsou získávány jako soubory produktů meiotických dělení všech dělících se diploidních jader najednou, tzn. jako jeden celek (např. soubory basidiospor u heteromiktických basidiomycetů). Genetická analýza v těchto případech vychází z principů běţného hybridologického rozboru, tak jak se provádí při genetické analýze u rostlin a u ţivočichů. Je tedy zaloţena na prostém statistickém vyhodnocení mendelovských segregačních zákonitostí. Pokud se tedy kříţením dvou vzájemně kompatibilních kmenů odlišujících se od sebe ve dvou fenotypových znacích (např. ve schopnosti produkce dvou různých aminokyselin X a Y) získá soubor potomků se statisticky stejně frekventovaným zastoupením všech čtyř moţných fenotypových kombinací, znamená to, ţe geny podmiňující tyto sledované fenotypové znaky leţí v různých chromozómech, a jsou tudíţ volně kombinovatelné (vyjádřeno s pomocí genotypových symbolů tedy XY x xy = 1 XY : 1 Xy : 1 xy : 1 xy). Pokud jsou však některé z fenotypových kombinací v souboru potomků zastoupeny statisticky průkazně častěji, je v závislosti na konkrétním frekvenčním uspořádání daného segregačního poměru nezbytné testovat moţnost uplatnění genových interakcí, nebo genové vazby a její síly. 2/ Genetická analýza u heteromiktických hub, u nichţ existuje moţnost analyzovat odděleně produkty meiotického dělení jednotlivých diploidních jader: Soubor produktů meiotického rozdělení diploidního jádra se obecně označuje jako meiotická tetráda, tento typ genetické analýzy se proto nazývá tetrádová analýza. Je moţno ji provádět např. u askomycetů, u nichţ lze izolovat jednotlivé asky, a v nich obsaţené askospory geneticky studovat jako samostatné tetrádové soubory. Podle prostorového rozmístění askospor v ascích se rozlišují tzv.uspořádané a neuspořádané tetrády. V uspořádaných tetrádách jsou askospory seřazeny lineárně za sebou. Je tomu tak proto, ţe směr dělení při obou po sobě následujících meiotických děleních (tzn.jak heterotypického, tak homeotypického) je shodný, dceřiná jádra se rozestupují stejným směrem.
To na základě fenotypového rozboru dané tetrády umoţňuje posoudit, zda při meiotickém rozchodu párů homologických chromozómů v diploidním jádře, které je ve studovaném genotypu heterozygotní, dochází k segregaci příslušných dominantních a recesívních alel jiţ v heterotypickém, nebo aţ v homeotypickém dělení. Frekvence uplatnění jedné či druhé eventuality závisí na pravděpodobnosti vzniku crossing-overu v oblasti mezi lokusem daného genu a centromérou příslušného chromozómu. Je tudíţ funkcí vzdálenosti mezi daným genem a centromérou - čím je tato vzdálenost kratší, tím je pravděpodobnost crossing-overu v dané chromozomální oblasti niţší, a tím častěji dochází k segregaci příslušných dominantních a recesívních alel jiţ v heterotypickém dělení (v heterotypickém dělení se chromozómy daného homologického páru od sebe rozcházejí nerekombinované, aniţ by v dané chromozomální oblasti došlo ke genetické rekombinaci a vzájemné nesesterské výměně chromatidových fragmentů). Důsledky rozchodu v dané oblasti nerekombinovaných (či naopak rekombinovaných) chromozómů jsou znázorněny na obr. 9. Pokud se při meióze v oblasti mezi daným genovým lokusem a centromérou crossingover neuplatní, vznikají heterotypickým dělením dceřiná jádra, z nichţ jedno má na chromatidách příslušného chromozómu pouze dominantní alely, a druhé naopak pouze recesívní alely (tedy stav 1 A : 1 a). Jejich následným rozdělením v následujícím homeotypickém dělení ve stejném směru vzniká lineárně za sebou seřazená čtveřice haploidních jader, z nichţ vţdy dvě vzájemně sousedící jádra obsahují dominantní alely, a další dvě vzájemně sousedící jádra recesívní alely (tedy uspořádání 1 A : 1 A : 1 a : 1 a, obvykle označované jako uspořádání 2 : 2). Asky s takto seřazenými askosporami se označují jako nerekombinantní tetrády. Dojde-li při meióze v oblasti mezi daným genovým lokusem a centromérou ke crossing-overu, jeho důsledkem je skutečnost, ţe se v anafázi heterotypického dělení od sebe rozcházejí rekombinované homologické chromozómy, tvořené vţdy jednou chromatidou a dominantní alelou a druhou chromatidou s recesívní alelou (k segregaci dominantních a recesívních alel tudíţ v heterotypickém dělení nedochází!). Při následném homeotypickém dělení pak vznikají dvojice dceřiných jader, z nichţ vţdy jedno obsahuje dominantní, a druhé recesívní alelu (tedy uspořádání 1 A : 1 a : 1 A : 1 a, označované obvykle jako uspořádání 1 : 1 : 1 : 1). Asky s takto seřazenými askosporami se označují jako rekombinantní tetrády. Bylo jiţ uvedeno, ţe frekvence rekombinantních tetrád odpovídá pravděpodobnosti, s níţ dochází v chromozomální oblasti mezi daným genovým lokusem a centromérou ke crossing-overu, a je tedy funkcí vzdálenosti mezi nimi. Stanovením relativní četnosti výskytu rekombinantních tetrád v analyzovaném souboru lze tudíţ zároveň i stanovit relativní vzdálenost daného chromozómového lokusu od centroméry, a tímto způsobem postupovat při sestavování genetických map příslušných chromozómů. U většiny askomycetů se homeotypickým dělením vzniklá haploidní jádra ještě jednou mitoticky rozdělují, takţe v asku je výsledně obsaţeno osm askospor. I tyto asky představují "tetrády", v nichţ vţdy dvě a dvě vzájemně sousedící askospory jsou při genetické analýze povaţovány za jediný "produkt" meiotického dělení. Principy tetrádové analýzy u askomycetů s uspořádanými asky je moţné vizuálně mikroskopicky velice názorně demonstrovat na příkladu kříţení dvou kmenů druhu Neurospora crassa, z nichţ jeden produkuje pigmentované spory a druhý nepigmentované (pigmentace spor, P, je dominantním znakem). Karyogamií haploidních jader heterokaryonta vzniká diploidní jádro s heterozygotním genotypem Pp. To se meioticky (s následnou mitózou) dělí za vzniku osmi askospor, které jsou v ascích seřazeny lineárně za sebou. Nerekombinantní asky mají uspořádání 4 P : 4 p, rekombinantní asky pak uspořádání 2 P : 2 p : 2 P : 2 p (nebo 2 P : 2 p : 2 p : 2 P, nebo 2 p : 2 P : 2 P : 2 p, podle aktuálního směru meiotického rozchodu
homologických chromozómů s příslušnými dominantními a recesívními alelami). Mikroskopický obraz nerekombinantních a rekombinantních asků při sledování zmíněného fenotypového znaku je schématicky znázorněn na obr. 10. Při sledování biochemických či fyziologických znaků a vlastností je nezbytné izolovat jednotlivé askospory, a ty dále testovat na schopnost sledované funkce na různých selektivních ţivných půdách (obr. 11). U hub s neuspořádanými meiotickými tetrádami, u nichţ meiospory nejsou ve sporangiu seřazeny lineárně za sebou a jejich prostorové rozmístění je víceméně náhodné, sice nelze studovat sílu vazby mezi genovými lokusy a příslušnými chromozomálními centromérami, lze však u nich sledovat vazbové vztahy mezi dvěma různými genovými lokusy. Princip tohoto typu tetrádové analýzy je moţné ilustrovat na následujících příkladech: a/ Diploidní jádro heterozygotní ve dvou genových lokusech AaBb se meioticky dělí, přičemţ kaţdý ze sledovaných genových lokusů leţí na různém páru homologických chromozómů (sledované geny jsou volně kombinovatelné). Heterotypickým dělením vznikají dvě dceřiná haploidní jádra o genotypech buď AB a ab, nebo Ab a ab, a následným homeotypickým dělením se pak tato jádra dále zdvojují. Vznikající tetrády meiotických produktů mají tudíţ uspořádání 2 AB : 2 ab, nebo 2 Ab : 2 ab. Protoţe se v nich vyskytují vţdy pouze dvě různé genotypové kombinace, označují se tyto tetrády jako dikrátní, a podle toho, zda tyto genotypové kombinace odpovídají genotypu výchozích rodičovských kmenů či nikoli, označují se tyto tetrády jako dikrátní parentální (DP) nebo dikrátní neparentální (DNP). Při volné kombinovatelnosti sledovaných alelických párů je vznik obou těchto typů tetrád stejně pravděpodobný, oba tyto typy tetrád tudíţ vznikají ve statisticky průkazně shodné frekvenci (v segregačním poměru 1 : 1). b/ Oba sledované genové lokusy leţí na shodném páru homologických chromozómů, jsou tedy ve vzájemné genové vazbě. Pokud při meiotickém dělení nedojde v chromozomální oblasti mezi nimi ke crossing-overu, v heterotypické anafázi se tyto chromozómy rozcházejí nerekombinované, s původním (tzn.rodičovským) uspořádáním alel obou genů - vznikají tedy jen dikrátní parentální tetrády. Případný vznik dikrátních neparentálních tetrád je moţný pouze tehdy, jestliţe se v chromozomální oblasti mezi oběma vázanými genovými lokusy uplatní dvojitý crossing-over, a to výhradně komplementární typ dvojitého crossing-overu. Taková moţnost sice obecně můţe přicházet v úvahu, je však velmi málo pravděpodobná. Pokud se tedy v analyzovaném souboru tetrád dikrátní neparentální tetrády vyskytnou, je jejich frekvence vţdy statisticky vysoce průkazně niţší, neţli frekvence tetrád dikrátních parentálních. Dojde-li ke crossing-overu mezi uvaţovanými vzájemně vázanými lokusy, bude výsledkem takového meiotického dělení tetrakrátní tetráda, s uspořádáním 1 AB : 1 Ab : 1 ab : 1 ab (T). Frekvence vzniku tetrakrátních tetrád závisí na pravděpodobnosti (a v důsledku tudíţ četnosti) uplatnění crossing-overu v dané chromozomální oblasti, a je tedy funkcí relativní vzdálenosti mezi sledovanými dvěma genovými lokusy (obr. 12). Při genetické analýze meiotického potomstva hub, produkujících neuspořádané tetrády, tedy v první řadě sledujeme, zda jsou frekvence dikrátních parentálních i neparentálních tetrád statisticky průkazně shodné. Pokud tomu tak je, svědčí to o volné kombinovatelnosti sledovaných genových lokusů. Pokud je frekvence dikrátních parentálních tetrád statisticky průkazně vyšší neţli dikrátních neparentálních, je to naopak důkazem
vzájemné vazby sledovaných lokusů, a v takovém případě pak podle frekvence tetrakrátních (rekombinantních) tetrád usuzujeme na sílu jejich vazby. Tetrakrátní tetrády mohou vznikat i při volné kombinovatelnosti sledovaných lokusů, a to jako důsledek uplatnění crossing-overu buď mezi jedním lokusem a centromérou chromozómu, na němţ tento lokus leţí, nebo mezi druhým lokusem a centromérou příslušného chromozómu. Tyto eventuality však nelze od sebe rozlišit, obě mají stejný důsledek. Jestliţe tedy zjistíme stejnou četnost dikrátních parentálních a dikrátních neparentálních tetrád, potom stanovení četnosti tetrakrátních tetrád jiţ nemá ţádný význam. Pokud však zjistíme výrazně vyšší četnost tetrád dikrátních parentálních (oproti dikrátním neparentálním), je stanovení četnosti tetrakrátních tetrád z hlediska genetické analýzy významné a prioritní. 3/ Genetická analýza u homomiktických hub: Jak jiţ bylo uvedeno, zásadním metodickým problémem genetické analýzy u heterokaryotických "kříţenců" homomiktických hub je odlišení potomstev vzniklých meiotickým dělením diploidních jader po karyogamii genotypově shodných či naopak genotypově rozdílných haploidních jader, přičemţ smysluplná je právě analýza druhého typu souborů meiotických produktů. Jedním z moţných a pravděpodobně nejschůdnějších způsobů je automatická selekce rekombinantních potomků. Lze ji vyuţít tehdy, jestliţe jsou oba výchozí homokaryotické rodičovské kmeny, z nichţ kříţením následně vzniká heterokarytické mycélium, nějak vhodně geneticky "označeny", tzn.jsou-li nositeli takových signálních znaků (markerů), které automatickou selekci umoţňují. Takovými markery mohou být např.různé biochemické defekty (příslušné auxotrofní kmeny jsou schopny růst jen na tzv.kompletní ţivné půdě či na definovaným způsobem doplněné minimální ţivné půdě - na prosté minimální půdě bez příslušného výţivového doplňku nerostou) či rezistence k nejrůznějším inhibitorům (jako selekční systém zde pak slouţí kombinace ţivných půd bez příslušného inhibitoru a s inhibitorem). Pokud jsou tedy jako výchozí rodiče pouţity např.auxotrofní kmeny, z nichţ kaţdý je defektní v jiné biochemické funkci, mohou na selektivní minimální ţivné půdě růst pouze ti jejich meiotičtí potomci, u nichţ došlo ke vzájemné komplementaci rodičovských dysfunkcí. Tak tomu můţe být pouze u těch meiotických produktů, které vznikají dělením heterozygotních diploidních jader, tedy těch, která u heterokaryonta vznikají karyogamií genotypově různých haploidních jader výchozích rodičovských kmenů. Karyogamie haploidních jader pocházejících shodně buď jen od jednoho, nebo naopak jen od druhého rodiče, vedou ke vzniku diploidních jader, jejichţ genotyp pro jednu nebo druhou rodičovskou dysfunkci je vţdy homozygotní. Meiotické produkty dělení takových jader tudíţ na selektivní ţivné půdě nejsou schopny růst. Pro moţnost jednoduché a přehledné interpretace výsledků kříţení je při uváděné metodě genetické analýzy nezbytné, aby oba rodičovské markery byly vzájemně volně kombinovatelné. Jednodušším přístupem je metoda třífaktorového křížení, při němţ se sledují vazbové vztahy mezi třemi genovými lokusy. Dva z nich vţdy představují jiţ zmíněné volně kombinovatelné rodičovské markery, a sleduje se tudíţ, zda onen třetí lokus je vůči oběma markerům nezávislý (a je s nimi rovněţ volně kombinovatelný) či zda je s některým z rodičovských markerů ve vzájemné vazbě a jak silná je tato vazba.
Podobným způsobem lze postupovat i při poněkud sloţitějším čtyřfaktorovém křížení. Při tomto přístupu se sledují vazbové vztahy mezi čtyřmi genovými lokusy zároveň. Dva z těchto lokusů opět představují volně kombinovatelné rodičovské markery, nezbytné pro automatickou selekci rekombinantních potomků, a u dalších dvou se zjišťuje jejich nezávislost či naopak vazba jak na některý z markerů, tak mezi sebou navzájem. Pro snazší pochopení tohoto přístupu lze uvést následující příklad: Při čtyřbodovém kříţení se sledují vzájemné vazbové vztahy mezi geny A, B, X a Y. Rodičovskými markery jsou geny A a B, resp. - na fenotypové úrovni - biochemické dysfunkce podmíněné nefunkčností jejich recesívních alel a a b. Geny X a Y řídí vznik dalších fenotypových znaků, jejichţ ztrátu či změnu v důsledku např.mutačního vzniku jejich nefunkčních recesívních alel x a y lze rovněţ při fenotypové analýze sledovat. Dejme tomu, ţe genotyp jednoho z výchozích rodičovských kmenů je AbXy, a ţe tento kmen kříţíme s druhým rodičem, jehoţ genotyp je abxy. V meiotickém potomstvu heterokaryonta /AbXy + abxy/ _můţe vznikat šestnáct různých genotypů, a to ABXY, ABXy, ABxY, ABxy, AbXY, AbXy, AbxY, Abxy, abxy, abxy, abxy, abxy, abxy, abxy, abxy a abxy. Z nich však, díky automatické selekci na rodičovské markery, budou moci růst na selektivní ţivné půdě pouze rekombinantní potomci o genotypech ABXY, ABXy, AbxY a ABxy. Při volné kombinovatelnosti všech čtyř sledovaných genů je pravděpodobnost vzniku všech čtyř uvedených rekombinantních genotypových kombinací stejná, a proto vznikají všechny ve statisticky průkazně stejné frekvenci (segregační poměr 1 : 1 : 1 : 1). Je-li však některý z genů X či Y vázán na některý z rodičovských markerů A či B, jsou-li oba geny X a Y vázány na jeden z rodičovských markerů zároveň, či jsou-li geny X a Y vzájemně vázány, ale přitom jsou volně kombinovatelné jak s jedním, tak s druhým rodičovským markerem, potom se kaţdá z těchto situací projeví charakteristickými frekvenčními změnami ve fenotypovém segregačním poměru (obr. 13). Genetická analýza souboru rekombinantních potomků pak spočívá v matematickém vyhodnocení podílů jejich relativních četností. 4/ Genetická analýza u asexuálních hub: Při genetické analýze u asexuálních hub lze vyuţít podobný princip, jaký byl zmíněn v souvislosti s homomiktickými houbami, rozdíl však spočívá v tom, ţe asexuální houby neprodukují meiospory, a ţe se u nich tudíţ provádí analýza v souborech nepohlavně vznikajících mitospor. Podstatou metody je parasexuální hybridizace asexuálních hub, při níţ vzniká heterokaryotické mycélium produkující mitospory. Pokud se na selektivní ţivnou půdu vyočkují dostatečně hustě konidie dvou různých rodičovských kmenů, obsahujících takové genetické markery, které neumoţňují ţádnému z rodičovských kmenů růst na dané selektivní půdě samostatně (např.auxotrofní kmeny s rozdílnými biochemickými defekty, jako selektivní ţivná půda pak můţe slouţit tzv.minimální půda), pak při tomto hustém "výsevu" při klíčení konidií a vzniku myceliálních mikrokolonií můţe dojít k náhodným somatogamiím mezi buňkami hyf obou rozdílných rodičovských kmenů. Vzniká tak heterokaryotické mycélium, jehoţ buňky obsahují ve společné cytoplasmě genotypově rozdílná rodičovská buněčná jádra. Zatímco rodičovské homokaryotické myceliální mikrokolonie nejsou schopny se na selektivní půdě rozrůstat, heterokaryotické myceliální kolonie toho schopny jsou, protoţe rozdílné rodičovské "dysfunkce" jsou u nich přítomností obou typů jader vzájemně komplementovány. Kontrola heterokaryoze takové rozrůstající se myceliální kolonie je velmi jednoduchá - pokud takové mycélium produkuje jednojaderné konidiospory, pak je v těchto konidiosporách obsaţeno vţdy jádro buď jednoho nebo druhého rodičovského typu (tedy s jednou či druhou signální "dysfunkcí"), a takové konidie - na rozdíl od mycélia, které je produkuje - nejsou schopny vyklíčit a rozrůstat se na dané selektivní půdě V daném heterokaryotickém mycéliu však můţe, náhodně, dojít i ke karyogamii v jeho buňkách obsaţených genotypově rozdílných
rodičovských jader. Vznikají tak z hlediska daných signálních znaků heterozygotní diploidní jádra. Konidie obsahující taková heterozygotní diploidní jádra pak jsou schopny klíčit a růst na selektivní ţivné půdě. Vzniklá heterozygotní diploidní jádra se i nadále dělí výhradně mitoticky (u asexuálních hub se meióza neuplatňuje). Při následných mitózách těchto jader však můţe s relativně velkou pravděpodobností docházet k různých "chybám" a pro běţnou mitózu neobvyklým jevům. Jedním z takových jevů můţe být např. mitotický crossing-over. Párové uspořádání homologických chromozómů můţe podmínit jejich náhodné synapse, při nichţ se pak můţe uskutečnit i vzájemná výměna jejich chromatidových fragmentů. Jedním z fenotypových důsledků mitotického crossing-overu můţe být i skutečnost, ţe ve vznikajících konidiosporách mohou mít jejich diploidní jádra rekombinantní uspořádání alel sledovaných rodičovských markerů, které těmto diploidním konidiím znemoţní růst na dané selektivní ţivné půdě. Sledování frekvence mitotických crossing-overů mezi určitými dvěma chromozomálními lokusy lze vyuţít ke stanovení síly vazby a ke genetickému mapování obdobně, jako u sexuálních organismů. Jiným důsledkem mitotického dělení diploidních jader v heterokaryotickém mycéliu asexuálních hub mohou být "chyby" v mitotickém rozchodu dceřiných chromozómů, jejich non-disjunkce, a následně pak chybění některých chromozómů ve vznikajících dceřiných jádrech. Postupně tak dochází k aneuploidizaci původně diploidních jader aţ zpátky k výchozímu haploidnímu stavu. Rovněţ sledování náhlé fenotypové "ztráty" určitého markeru, zejména ve vztahu k jiným sledovaným markerům, je moţno vyuţít pro stanovení lokalizace příslušných genů do jednotlivých chromozómů a ke genetickému mapování. Metoda parasexuální hybridizace je schématicky znázorněna na obr. 14. Metoda parasexuální hybridizace je vyuţívána nejenom při genetické analýze vláknitých asexuálních hub, ale je podstatou genetického rozboru i při indukované fúzi jakýchkoli fungálních protoplastů a vzniku jejich hybridních produktů. Tento postup se dnes hojně vyuţívá např.při buněčném inţenýrství u kvasinek. Doporučená literatura: Bainbridge B.W.: Genetics of Microbes. Chapman & Hall, New York 1987. Bennett J.W., Lasure L.L. (eds): Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, London 1985. Bennett J.W., Lasure L.L. (eds): More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, London 1991. Brown T.A.: Genetics, A Molecular Approach. Chapman & Hall, Singapore 1993. Burnett J.H.: Mycogenetics. J.Wiley & Sons, London 1975. Fincham J.R.S., Day P.R.: Fungal Genetics. F.A.Davis Co., Philadelphia 1963. Hartl D.L.: Genetics. Jones & Bartlett, Boston 1994. Hrubý K.: Genetika. Nakl.ČSAV, Praha 1961. Nečásek J.: Genetika hymenomycet. Biologické listy 34, 66-95, 1969.