Speciální mikrobiologie Bakterie rodu Staphylococcus lze podle schopnosti produkce enzymu plazmakoagulázy rozdělit na koaguláza pozitivní a koaguláza negativní druhy. Nejvýznamnějším zástupcem koaguláza pozitivních stafylokoků se schopností koagulovat králičí plasmu je S. aureus, dále je do této skupiny řazen S. intermedius a některé kmeny S. hyicus. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus je nejvýznamnějším druhem rodu Staphylococcus (čeleď Staphylococcaceae). Morfologie jedná se o grampozitivní fakultativně anaerobní, nepohyblivé koky. Buňky mají velikost okolo 1 µm a nejčastěji vytváří hroznovité shluky, mohou být i uspořádány jednotlivě, v párech či tetrádách. Jsou nepohyblivé, netvoří spory ani pouzdro (pouze někdy omezeně). S. aureus produkuje zlatožlutý pigment na krevním agaru může způsobovat úplnou hemolýzu. Je katalázapozitivní, zkvašuje manitol. Faktory virulence virulence S. aureus je hodnocena na základě schopnosti produkce velkého množství biologicky aktivních látek, které se dělí do tří skupin: adhezivní faktory, propagační a transportní faktory a ochranné faktory a toxiny. K adhezivním faktorům patří plazmakoaguláza (volná koaguláza) a clumping (shlukovací) faktor, které způsobují polymeraci rozpustného fibrinogenu na fibrin, a dále několik produktů polysacharidové podstaty obvykle označovaných jako sliz, které umožňují bakteriím vázat se na vhodný povrch a hrají významnou roli při tvorbě biofilmů. Do skupiny propagačních a transportních faktorů se řadí hemolyziny. Typické kmeny S. aureus produkují α-hemolyzin projevující se úplnou hemolýzou beranních erytrocytů v krevním agaru po 18-ti hodinové inkubaci při 37 C. Ochranné faktory a toxiny jsou toxické exoproteiny, které chrání stafylokoky před obrannými mechanismy člověka (např. Panton-Valentinův leukocidin) nebo jsou původci toxikóz exfoliativní toxiny (ETs), toxin syndromu toxického šoku (TSST-1) a stafylokokové enterotoxiny (SEs). Stafylokokové enterotoxiny (SEs) jsou zodpovědné za vyvolání alimentárního onemocnění. SEs vznikají v potravině jako metabolické produkty při množení S. aureus. Jejich značení SEA SEU koresponduje s označením genů sea - seu. Schopnost produkovat SEs je prokázána u 50 60 % kmenů S. aureus. Je známo pět tzv. klasických stafylokokových enterotoxinů SEA, SEB, SEC (SEC1, SEC2, SEC3), SED, SEE nejčastěji zodpovědných za vznik alimentární intoxikace. Kultivace
stafylokoky rostou na běžných půdách, rozmezí teplot 7-46 C a v širokém rozmezí ph (4,2-9,3). Inkubace za aerobních podmínek při 37 C po dobu 24-48 hod. Je relativně odolný sušení. Minimální hodnota aktivity vody pro jeho množení je 0,86. S. aureus je tolerantní k vyššímu obsahu NaCl v prostředí (10 15 %). Jeho růst omezuje přítomnost jiné mikroflóry, proto se dobře množí např. v tepelně opracovaných výrobcích. S. aureus produkuje zlatožlutý pigment na krevním agaru může způsobovat úplnou hemolýzu. Je katalázapozitivní, zkvašuje manitol. SEs jsou v potravině produkovány při teplotách 10-46 C, ph 4,5 9,6 a minimální vodní aktivitě 0,87. Díky svému složení a struktuře jsou SEs velice stabilní a odolné vůči působení proteolytických enzymů pepsinu, trypsinu, chymotrypsinu, reninu a papainu. SEs jsou termostabilní a k jejich inaktivaci zpravidla dochází při 100 C až za 30 minut. Patogenita S. aureus je komenzálem teplokrevných živočichů a člověka. Vyskytuje se na sliznicích respiračního ústrojí, především v nosní a ústní dutině, na pokožce, v intestinálním a urogenitálním traktu. Je také součástí běžné mikroflóry vemene. Hlavním zdrojem kontaminace syrového mléka jsou klinické a subklinické stafylokokové mastitidy. S. aureus přirozeně osidluje kůži a oblast nosohltanu lidí a zvířat. Při oslabení imunitního systému hostitele je schopen vyvolat různá onemocnění kožní záněty, alimentární onemocnění, pneumonie, osteomyelitidy, syndrom toxického šoku, syndrom opařené kůže, abscesy, bakteriální endokarditidy a sepse. Za vznik jednoho z nejčastějších onemocnění z potravin typu alimentární intoxikace stafylokokové enterotoxikózy jsou zodpovědné stafylokokové enterotoxiny (SEs). Příznaky onemocnění stafylokoková enterotoxikóza se projevuje nevolností, zvracením, bolestmi břicha, průjmem (bez horečky) a bolestmi hlavy. Příznaky onemocnění se objevují za 1-6 hodin po konzumaci potravin a odezní zpravidla za 24 hodin. Infekční dávka S. aureus pro zdravého jedince je minimálně 10 5 KTJ.g -1 a koncentrace toxinu v potravině 1 ng.g -1. S. aureus je nejčastějším původcem hnisání povrchových či operačních ran a popálenin. Infikovanou ránou se dostává do regionálních mízních uzlin, které se zanítí (lymphadenitis) a odtud se dostává do krve a může způsobit sepsi. Riziková potravina potraviny mohou být kontaminovány druhem S. aureus pocházejícím ze zvířat, prostředí nebo lidí v průběhu výrobního procesu především pracovními nástroji a pracovníky potravinářských provozů. Největší riziko kontaminace je u potravin s vysokým podílem ruční práce. S. aureus se pomnožuje v potravinách ponechaných delší dobu při pokojové teplotě.
Nejčastěji bývají stafylokoky kontaminovány: mléko, mléčné výrobky, cukrářské výrobky, pekařské produkty s náplní lahůdky, pudinky a salátové dresinky, saláty z vajec, ryb, těstovin, brambor maso, masné výrobky, nakládaná masa, ryby a mořské plody, zvěřina drůbež, vejce. Diagnostika pro stanovení S. aureus v potravinách se používají živná média obsahující selektivní složky inhibující růst doprovodných mikroorganismů, např. 5,5 10 % NaCl, azid sodný, teluričitan draselný, chlorid lithný či některá antibiotika polymyxin, neomycin. Diagnostickou složkou je většinou vaječný žloutek, příp. fibrinogen a králičí plazma. Podle ČSN ISO 6888-1 (1999) je pro izolaci koaguláza pozitivních stafylokoků používán Baird-Parker agar, kde S. aureus vytváří charakteristické černé kolonie (redukce teluričitanu), které jsou obklopeny zónou projasnění, která je výsledkem působení lecitinázy na suplement žloutkovou emulzi. ČSN EN ISO 6888-2 (1999) doporučuje pro vyšetření potravin (kde se předpokládá kontaminace stafylokoky vytvářejícími na B-P agaru atypické kolonie či průvodní mikroflórou, která může znesnadnit odečet kolonií) použití agarové půdy s králičí plasmou a fibrinogenem (RPF agar). Koaguláza pozitivní stafylokoky na této půdě vytvářejí černé, šedé nebo dokonce bílé malé kolonie obklopené zónou precipitace, která indikuje koagulázovou aktivitu. K detekci přítomnosti klasických SEs (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) v potravinách jsou běžně používány imunologické metody: reverzní pasivní latexová aglutinace (detekuje konkrétní typ SEA SED), Elisa metoda (detekuje SEA SEE jako sumu nebo lze i detekovat konkrétní typ) metoda ELFA (detekuje SEA SEE pouze jako sumu, které jsou dostupné formou komerčně vyráběných imunologických testů. Stanovení počtu S. aureus v potravinách
Metody využívané při konfirmaci, identifikaci a typizaci Spolu s typickou morfologií a pigmentací kolonií se posuzuje tvorba hemolýzy na krevním agaru. Přítomnost extracelulárního enzymu-volné koagulázy se prokazuje reakcí s fibrinogenem králičí plazmy, která se projeví tvorbou chuchvalců, sraženin či úplným ztuhnutím plazmy ve zkumavce. Další typickou reakcí pro S. aureus je průkaz přítomnosti vázané koagulázy (clumping faktoru). Jde o povrchový protein, který reaguje s fibrinogenem králičí plazmy a mění jej na fibrin, což se projevuje shlukováním buněk stafylokoků a tvorbou okem viditelných vloček na podložním sklíčku. Clumping faktor lze také prokázat užitím komerčně dostupných latex-aglutinačních souprav (např. Dryspot Staphytest Plus). Za použití molekulárně-biologických metod (např. PCR s využitím specifických primerů) lze nejen detekovat a identifikovat druh S. aureus, ale i prokazovat přítomnost genů kódujících tvorbu stafylokokových enterotoxinů a dalších faktorů virulence a také genů kódujících rezistenci k antimikrobiálním látkám (např. MRSA kmeny). Terapie lokalizované infekce: léčba chirurgická (odstranění hnisu a cizího tělesa) a lokální antibiotikum (mupirocin). K léčbě se používají makrolidy, linkosamidy, kotrimoxazol, aminoglykosidy, chinolony. S aureus je rezistentní na
penicilin (mají schopnost produkce penicilinasy kódované plasmidem) methicilin (MRSA): podstatou rezistence na methicilin či oxacilin je přítomnost genu meca, který kóduje pozměněný druh penicilin vázajícího proteinu PBP2a, který si zachovává svou enzymatickou činnost a na peniciliny se neváže. Tento enzym funguje jako transpeptidáza (tzn. podílí se na syntéze peptidoglykanu buněčné stěny bakterie), není však inhibován meticilinem a dalšími penicilinovými antibiotiky. Preventivní opatření řádné ošetření ran, důsledná hygiena při operacích a v nemocnicích redukce zdrojů S. aureus v okolí pacientů kvalitní vstupní surovina (maso bez hnisavých abscesů) pracovníci bez zánětlivých procesů na kůži, se zánětem horních cest dýchacích osobní hygiena (časté mytí rukou, desinfekce, výměna pracovního oděvu) čištění a desinfekce pracovních nástrojů, přístrojů a zařízení chladírenské skladování surovin dlouhodobě neuchovávat tepelně opracované (ohřáté) potraviny dostatečný ohřev pokrmů při kuchyňském zpracování S. aureus na agaru Baird-Parker
Kolonie S. aureus na krevním agaru s hemolýzou http://foodmicrobiologee.blogspot.cz/2012_08_01_archive.html http://www.wikiskripta.eu/index.php/soubor:staphylococcus_aureus-krevni_agar-deta Dokument byl vytvořen: 13. 09. 2019 11:36:15 Zdroj: http://web2.mendelu.cz/af_291_projekty2/vseo/